Untitled - Roche Trasplantes

DRUG
Edificio Vértice Antonio López, 249 - 1º
28041 - MADRID
ISBN Obra completa: 84-96305-20-1
ISBN Quinto volumen: 978-84-96724-14-3
D.L.:
©2007 DRUG FARMA S.L.
Reservados todos los derechos. Ninguna parte de esta publicación puede ser reproducida sin el permiso escrito del titular del Copyright.
Esta publicación se ha realizado con la colaboración de Roche Farma.

ÍNDICE
Introducción 7
M. Arias
Early diagnosis of chronic allograft nephropathy
by means of protocol biopsies 13
J. Chapman
Diagnóstico precoz del rechazo subclínico
mediante biopsias de protocolo 31
F. J. Moreso
Protocol biopsies and the diagnosis of humoral rejection 51
M. Mengel
Adaptación glomerular evaluada mediante biopsias
de protocolo 71
X. Fulladosa
3

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
Biopsia de protocolo: aspectos técnicos y seguridad 91
R. Palomar
Biopsias de protocolo en el diseño de ensayos clínicos 105
D. Serón
4

ÍNDICE DE AUTORES
COORDINADOR GENERAL
Manuel Arias Rodríguez
Jefe de Servicio y Catedrático de Nefrología
Hospital Universitario Marqués de Valdecilla (Santander)
COORDINADORES DEL VOLUMEN V
Manuel Arias Rodríguez
Jefe de Servicio y Catedrático de Nefrología
Hospital Universitario Marqués de Valdecilla (Santander)
Daniel Serón Micas
Servicio de Nefrología
Hospital Universitari de Bellvitge (L’Hospitalet de Llobregat, Barcelona)
AUTORES
Jeremy Chapman OAM, MD, FRACP, FRCP
Centre for Transplant and Renal Research
Millennium Institute, University of Sydney
Westmead Hospital, Westmead (New South Wales, Australia)
Xavier Fulladosa Oliveras
Servicio de Nefrología
Hospital Universitari de Bellvitge (L’Hospitalet de Llobregat, Barcelona)
Michael Mengel
Institute for Pathology
Medizinische Hochschule Hannover (Hannover, Alemania)
5

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
Francesc Josep Moreso Mateos
Servicio de Nefrología
Hospital Universitari de Bellvitge
(L’Hospitalet de Llobregat, Barcelona)
Rosa Palomar Fontanet
Servicio de Nefrología
Hospital Universitario Marqués de Valdecilla (Santander)
6

BIOPSIA DE PROTOCOLO
EN EL TRASPLANTE RENAL:
¿HERRAMIENTA CLÍNICA
O DE INVESTIGACIÓN?
M. Arias
El seguimiento clínico del trasplante renal se basa fundamentalmente en el análisis de
la creatinina sérica y/o del filtrado glomerular generalmente por estimación mediante
fórmulas. Se sabe que este método diagnóstico es insuficiente y que no se correlaciona
bien con la situación real del injerto. La otra opción posible es la realización de
biopsias de protocolo en pacientes estables y asintomáticos, mientras no se desarrollen
test de monitorización inmunológica fáciles de efectuar, reproducibles y válidos
para el diagnóstico.
Existe una enorme variación entre Unidades de Trasplante Renal en su consideración
de las biopsias de protocolo, esto es, si deben ser usadas en la práctica clínica de rutina
o seguir siendo un instrumento de investigación en centros seleccionados.
La aproximación a este dilema depende de muchos factores que incluyen desde los
regímenes de inmunosupresión que se utilizan, la participación en ensayos clínicos
controlados de forma limitada o masiva, hasta los recursos disponibles. Ni que decir
tiene que los considerandos sobre la seguridad y el partido que se saque a la prueba
diagnóstica en los Departamentos de Anatomía Patológica son decisivos para la toma
de decisión. Finalmente, se trataría de un análisis de costo-beneficio que relacionaría
el número de eventos tratables diagnosticados y los injertos salvados en relación con
el costo económico y de inconvenientes y complicaciones para el paciente.
Las biopsias con aguja para el seguimiento del trasplante renal, guiadas mediante
ecografía con pistola automática y realizadas por personal experimentado, ofrecen un
riesgo muy bajo de pérdida del injerto y un mínimo riesgo de morbilidad. Como se
describe en este volumen de Biblioteca de Trasplantes Siglo XXI, la complicación más
7

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
frecuente y molesta es la hematuria macroscópica con obstrucción o no del uréter,
siendo excepcionales las complicaciones más graves cuando se realiza la técnica según
las anteriores reglas expuestas. Parece generalmente aceptado que el riesgo es
algo mayor cuando se practican biopsias por indicación clínica y cuando se utilizan
agujas de un tamaño mayor del número 18.
Pero una de las mayores contraindicaciones para la biopsia de protocolo al igual que
para la biopsia de indicación es no obtener una información clínica útil para tomar decisiones:
la información histológica obtenida debe reflejar adecuadamente la situación
de actividad inmunológica o afectación tóxica que de alguna manera proporcione
la base para el cambio terapéutico. Esta información se ve dificultada por la existencia
o no de nefropatólogo, o al menos un patólogo interesado y entrenado en la
patología del trasplante renal, la variabilidad de la muestra y las diferencias entre observadores.
No hay que olvidar que el rechazo celular leve-moderado es un proceso focal y que la
interpretación de los patólogos puede diferir, sobre todo cuando se utiliza una escala
de valoración como es la clasificación de Banff.
Por otro lado, el otro gran criterio a parte de la seguridad es la utilidad clínica de la
biopsia. Lógicamente, este aspecto se valora en tanto en cuanto se detecte patología
o, en una valoración más exigente, se detecte patología que sea modificable por una
posible intervención terapéutica. La aparición del rechazo subclínico en el trasplante
es absolutamente dependiente del tiempo desde la intervención: es máximo en el primer
mes y cae lentamente a lo largo del primer año. Existe una variación sustancial
en la frecuencia que se ha publicado de rechazo subclínico que, probablemente, se relaciona
con esta variación en el momento de la realización de la biopsia, pero también
en las características inmunológicas o étnicas de los receptores y de la inmunosupresión
utilizada en cada Unidad.
Lo que resulta evidente actualmente es que la inmunosupresión es un condicionante
a la hora de indicar biopsias de protocolo para la búsqueda diagnóstica de rechazo clínico,
ya que la influencia del régimen inmunosupresor es decisiva, como se ha demostrado
tanto en los trabajos clásicos del grupo australiano de Nankivell y
Chapman como en las comunicaciones más recientes del Congreso Mundial de
Boston de julio del 2006, realizadas por David Rush, pionero de las biopsias de protocolo.
Rush ha llegado a afirmar que la utilización de tacrolimus disminuye tanto la incidencia
de esta complicación o de este diagnóstico que no estaría justificada la
biopsia de protocolo para buscar esta afectación en pacientes que siguen el tratamiento
expuesto. Por otra parte, la aparición de una patología inesperada puede ser
importante y hay que considerar la posibilidad de la cada vez más emergente infección
por el virus BK.
8

INTRODUCCIÓN
Pero, independientemente de que el rechazo subclínico esté condicionado por el
régimen utilizado, otro aspecto importante –y no del todo resuelto– es si una vez
observada la infiltración celular en el injerto estable esto es significativo de daño
actual o futuro, y si esta manifestación histológica y su posible modificación por la
intervención terapeútica tiene incidencia o no en la supervivencia del paciente y
del injerto a largo plazo. Existe muy poca experiencia en estudios controlados que
analicen si el tratamiento o no del rechazo subclínico diagnosticado por biopsia de
protocolo se sigue de una mejoría después de aplicar un tratamiento, y hay que referirse
casi siempre a las publicaciones iniciales de David Rush y Shisido, en las
que la rama tratada con corticoides comparada con la rama no biopsiada y no tratada
tenía una mejor evolución.
Por lo tanto, la biopsia de protocolo es una clarísima situación de balance riesgo-beneficio
en la que hay que colocar en el platillo de la balanza del beneficio la posibilidad
de mejorar el daño histológico, la supervivencia del injerto y del paciente, y los
beneficios indirectos como reducir la inmunosupresión si se excluye el rechazo subclínico,
la posible estratificación del riesgo inmunológico con la graduación de la inmunosupresión
y el descubrimiento de diagnósticos no sospechados como glomerulonefritis
recurrente, nefrotoxicidad por anticalcineurínicos o infección viral del tipo
de la infección por virus BK.
Como cabe esperar, este balance también depende del procedimiento en sí mismo
y del riesgo de complicaciones, que son difíciles de comparar con el beneficio absoluto
obtenido del tratamiento del rechazo subclínico, porque no está bien cuantificado;
las estimaciones se basan, en general, en el trabajo de Rush, en el que transcurridos
cuatro años los pacientes a los que se les realizaron biopsias de protocolo
presentaron 17 pérdidas de injerto menos por cada 100 pacientes. Si aplicamos
aquí el NNT (número necesario de pacientes a tratar para obtener el beneficio) para
prevenir una pérdida de injerto a los cuatro años, habría que incluir en el seguimiento
por biopsia de protocolo a seis pacientes siempre haciendo el cálculo de la prevalencia
de rechazo subclínico de la época de la ciclosporina, aproximadamente un
30%. No obstante, en la actualidad, el factor confundente para calcular este beneficio
es la prevalencia descendente del rechazo agudo y del rechazo subclínico con la
inmunosupresión actual que, con tacrolimus y MMF, se estima en un 2,6% de rechazo
subclínico y un 11% de rechazo borderline a los tres meses en receptores de
raza blanca y de donante vivo.
Lo más generalmente aceptado es que la vigilancia mediante biopsias de protocolo
es ética y clínicamente aceptable en Unidades de Trasplante en determinadas circunstancias,
como la función retrasada del injerto que precisa diálisis, pacientes hipersensibilizados,
trasplantes ABO incompatibles o cuando se está utilizando un
end-point subrogado en los ensayos clínicos controlados.
9

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
Siguiendo de nuevo a Nankivell y Chapman en una publicación reciente, podemos
decir que existen tres posibles estrategias que las Unidades de Trasplante tienen
que considerar: no realizar biopsias de protocolo, efectuar biopsias sólo en pacientes
de alto riesgo o seguir un protocolo universal en todos los pacientes de la serie.
En cuanto a la primera, se trata de la posición que han adoptado hasta el momento
la mayoría de las Unidades de Trasplante Renal del mundo, que asumen que el rechazo
subclínico es poco importante y puede ignorarse, o bien que es relevante pero
que se puede controlar mediante altas dosis de esteroides o aumentando la terapéutica
inmunosupresora. Los aspectos negativos de esta inmunosupresión incluirán
un aumento de la nefropatía BK, infecciones nosocomiales y, probablemente,
un incremento de los trastornos linferoproliferativos postrasplante. Sin embargo,
evita los problemas de aceptación de esta técnica por parte del paciente cuando se
encuentra asintomático, los costes económicos y de organización y, además, es
acorde con las reglas para el seguimiento de los pacientes trasplantados editadas
en el año 2000, que exponen que se requieren más datos antes de indicar de una
forma generalizada la biopsia de protocolo.
La biopsia, en algunas situaciones, precisa realizar una selección de cuáles son los
pacientes de alto riesgo y llevarla a cabo en algunos momentos determinados con un
intervalo desde luego menor que las biopsias de protocolo seriadas generalizadas.
Esto supone que es más económica y tiene claras desventajas como la selección de
los pacientes y la definición de alto riesgo, que puede ser difícil o arbitraria. Esta selección
se basa en que el rechazo subclínico puede ocurrir con mayor frecuencia y
ser más severo que en los pacientes de riesgo normal o bajo; es muy clara cuando
se eligen pacientes de extremo riesgo inmunológico; mientras que, en situaciones
intermedias, esta predicción es mucho más imperfecta.
La decisión de aplicar una política de generalización y convertir la biopsia de protocolo
en un estándar de seguimiento –lógicamente, incluyendo excepciones o contraindicaciones,
como cuando hay un campo quirúrgico infectado o una obstrucción
del sistema urinario, o bien el paciente está anticoagulado– tiene claras ventajas en
la apreciación del rechazo subclínico no sospechado, ayuda a la toma de decisiones
terapéuticas y descubre patologías encubiertas; sin embargo, presenta evidentes
desventajas respecto del coste, el consumo de recursos y los inconvenientes para
los pacientes, a pesar de que por cada procedimiento el coste y el riesgo no son excesivos.
De cualquier forma, la decisión de aplicar de una forma más o menos generalizada
las biopsias de protocolo en la rutina clínica exige unos criterios previos que tienen
que seguirse estrictamente en la opinión de autores con tanta experiencia como los
del grupo australiano.
10

INTRODUCCIÓN
PRERREQUISITOS PARA JUSTIFICAR LA BIOPSIA
DE PROTOCOLO DE RUTINA COMO HERRAMIENTA
DIAGNÓSTICA DEL RECHAZO SUBCLÍNICO
EN EL TRASPLANTE RENAL
(Nankivell BJ, Chapman JR. American Journal of Transplantation 2006)
1. Que la biopsia percutánea con aguja presente un bajo riesgo de pérdida del injerto y un bajo
riesgo de morbilidad.
2. Que los resultados histológicos sean válidos y reflejen de forma adecuada la actividad inmunológica
subclínica. Esto implica que:
a. Se tengan en cuenta la variabilidad biológica y los errores de muestra en las biopsias individuales.
b. El tamaño de la muestra sea adecuado para el diagnóstico.
c. Los scores utilizados por los patólogos utilicen una herramienta estandarizada, como la
clasificación de Banff.
d. Los resultados falsos negativos y positivos sean clínicamente aceptables.
3. Que la incidencia del rechazo subclínico sea suficientemente frecuente para justificar los
esfuerzos diagnósticos.
4. Que el rechazo subclínico demuestre que es perjudicial para el injerto cuando se mira la
función del injerto a largo plazo como daño histológico o por la disminución de la supervivencia
del injerto.
5. Si se demuestra rechazo subclínico, que exista un tratamiento seguro y efectivo para revertirlo.
6. Que el control del rechazo subclínico conduzca a un beneficio neto para el receptor, que
puede ser: directo pero diferido, como la mejoría del daño histológico, de la función del injerto
o del paciente; o indirecto, como la posibilidad de reducir la inmunosupresión porque
no hay rechazo subclínico o porque se descubren diagnósticos fortuitos potencialmente
tratables como el virus BK o la nefrotoxicidad por anticalcineurínicos.
7. Que el riesgo-beneficio esté justificado en la mayoría de los receptores para ese grupo determinado.
8. Que exista un consenso clínico para la utilización de los recursos necesarios.
11

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA
1. Nankivell BJ, Chapman JR. The significance of subclinical rejection and the value of
protocol biopsies. American Journal of Transplantation 2006; 6: 2006-2012.
2. Rush D, Nickerson P, Gough J, McKenna R, Grimm P, Cheang M, Trpkov K, Solez K,
Jeffery J. Beneficial effects of treatment of early subclinical rejection: a randomized
study. J Am Soc Nephrol 1998; 9: 2129-34.
3. Rush D. No benefit of protocol biopsies in renal transplant patients receiving
Tacrolimus and Mycophenolate Mofetil: a multicentre randomized study.
Transplantation 2006; 82 (1): abstract 843.
4. Shishido S, Asanuma H, Nakai H, Mori Y, Satoh H, Kamimaki I, et al. The impact of repeated
subclinical acute rejection on the progression of chronic allograft nephropathy.
J Am Soc Nephrol 2003; 14 (4): 1046-52.
5. Scholten EM, Rowshani AT, Cremers S, Bemelman FJ, Eikmans M, van Kan E, Mallat
MJ, Florquin S, Surachno J, ten Berge IJ, Bajema IM, de Fijter JW. Untreated rejection
in 6-month protocol biopsies is not associated with fibrosis in serial biopsies or
with loss of graft function. J Am Soc Nephrol 2006; 17: 2622-2632.
12

EARLY DIAGNOSIS OF CHRONIC
ALLOGRAFT NEPHROPATHY
BY MEANS OF PROTOCOL
BIOPSIES
J. Chapman
ROLE OF PROTOCOL BIOPSY EARLY
AFTER TRANSPLANTATION
The term “protocol biopsy” implies, in the context of renal transplantation, that biopsy
is undertaken as a result of a pre-determined protocol and not because of a clinical event
that has lead to the “need” for biopsy. The two processes have lead to very different
answers over the years of development of renal transplantation. The clinically driven
biopsy leads to a self-perpetuating result. Since biopsy is only performed at times of renal
dysfunction, the results lead to the ability to distinguish between different causes of
dysfunction –which essentially means distinguishing types of acute rejection from each
other and from acute calcineurin inhibitor toxicity, or rare cases of pyelonephritis or vascular
catastrophe. The clinically driven biopsy has not allowed distinction between the
appearance of the kidney in times of acute dysfunction and times of stable function. It
has been illuminating, and still remains surprising to some, that the histological data
derived from protocol biopsies taken at times of stable function show a similar range of
appearances to clinical biopsies. It has also required protocol biopsies to understand that
the functional changes in renal allografts dramatically underestimate the severity of the
pathological damage.
This chapter reviews the principles upon which the data are accrued from renal allograft
biopsies specifically to understand the evolution of chronic allograft nephropathy (1, 2). It
is possible to use these data to build and then test a model for understanding the pa-
13

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
thophysiology of chronic destruction of the renal transplant and the linkage between the
underlying pathology and the observed functional changes.
THE RISK OF GRAFT COMPLICATIONS
In order to justify the use of protocol or surveillance percutaneous needle-core biopsies
they must yield a low risk of complications including graft loss and morbidity such as admission
to hospital and hemorrhage. A variety of reports of the risk of major complications
including substantial bleeding, macroscopic hematuria with ureteric obstruction, peritonitis
or graft loss is approximately 1% (3-5). Minor complication include macroscopic
hematuria in 3.5%, perirenal hematomas 2.5%, asymptomatic arterio-venous fistulas
7.3% and vasovagal reactions 0.5% (5).
Loss of the graft after protocol biopsy is in the region of 0.03%, based on various reports
where the losses are recorded as: 0 from 2,127 biopsies (4), 1 from 1,171 (5), 0 of 328
(6), 0 from 1,037 (3), 0 from 961 biopsies (7), 0 from 277 (8), and 1 from 151 (9).
The risk of renal allograft biopsy is increased when needles larger that 18G are used
(6); when the biopsy is undertaken for clinical indications (presumably because the indication
demands higher risks, or the graft is essentially unstable prior to the biopsy);
and when the kidney is in an intraperitoneal position. Safety of protocol biopsies should
thus be maximized through use of a skilled operator; mandatory ultrasound guidance
immediately prior to biopsy to identify any unsuspected lesions such as urinary obstruction
or an arterio-venous fistula; and use of an automated spring loaded gun mechanism
rather than a manual cannula and trocar. Some operators suggest the use of
a 16-gauge needle (10) and a single pass, rather than the 18-gauge needle favoured
by many units but with more than one needle core sample (5). Certain exclusion criteria
are also required to ensure that inappropriate risks are not taken. Table I details
inclusion and exclusion criteria that should be considered prior to protocol biopsy. It
would be appropriate for all of the inclusion criteria to be required to be met, but exclusion
should require only a single criterion to be met. This is a conservative position
designed to reduce the morbidity of the procedure undertaken with a lower yield of
therapeutic decision making than occurs with acute clinically indicated biopsies. In particular,
the use of ultrasound not only localises the kidney accurately, but also identifies
potential sources of complication, the commonest of which is partial ureteric obstruction.
RELIABILITY OF PROTOCOL HISTOLOGY RESULTS
How good is the biopsy as a sample of the kidney? The reliability of a given result is related
to the amount of tissue obtained and to the variability if the histological finding within
the kidney. Clearly very patchy events are seen with less reliability than homogeneous
14

EARLY DIAGNOSIS OF CHRONIC ALLOGRAFT NEPHROPATHY
BY MEANS OF PROTOCOL BIOPSIES
Table I. Inclusion and exclusion criteria for protocol needle core biopsy.
Inclusion criteria
Deceased donor kidney allograft
Informed consent
Approved clinical trial or standard clinical practice
Ultrasound examination available
Skilled biopsy operator
Exclusion criteria
Bleeding disorder
Use of anticoagulants including heparin, warfarin and aspirin
Anatomical variation of graft position (e.g., overlying bowel)
Anatomical variation of graft (e.g., arterio-venous malformation)
Urinary obstruction
Requirement for sedation to undertake biopsy
Previous complication from biopsy
To undertake protocol biopsy all of the inclusion criteria must be met and none
of the exclusion criteria can be met.
ones. Early and mild hyalinosis of the arterioles thus depends upon sampling sufficient
arterioles and on hitting one with hyalinosis. Severe cellular ejection on the other hand is
a diffuse process that can be seen throughout the kidney and can even be reliably implied
on a section of medulla rather than cortex.
The best study of reproducibility of the Banff schema was undertaken by Furness et
al. (11). The histologists eye is clearly quite inconsistent when assessing the area of involvement
of a biopsy and may miss rare events such as occasional lymphocyte invasion
of a tubule. The exact grading of tubulitis may thus be inaccurate and when missed
may lead to change in the overall diagnosis of rejection status. Individual pathologists
appear to be more consistent internally than when compared with each other, and in the
Furness study remained rather resistant to change of their readings despite feedback
on their results relative to the mean. Comparison of results between two centres found
reasonable agreement for acute rejection diagnoses in another study (12) with a kappa
statistic of 0.77 for agreement on the diagnosis of acute rejection. Veronese demonstrated
similar levels of agreement for acute rejection (0.47 – 0.72) but borderline rejection
and fine grading of borderline rejection and individual Banff quantifiers was not so
good (13).
15

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
A recent analysis of the reproducibility of the reading of arteriolar hyalinosis demonstrates
the problem nicely (14). In this study the authors compared two protocols for reading
–the standard Banff schema and a new schema developed by Mihatsch. The reproducibility
of the new schema was better than the standard Banff schema (kappa statistic 0.67
versus 0.52 comparing 45 biopsies from 38 patients), but the information derived from
the readings was less informative. In the new schema, reproducibility was improved
through reduction of the frequency with which intermediate scoring grades were used.
The number of times when scores of 1 and 2 were used dropped from 64 using Banff to
24 with the new system. This meant that biopsies were scored as 0 or 3 most of the
time, which is little better than a binary decision of present/absent.
The essence of the problem is thus to find the balance between multiple grades of distinction
for a given event such as tubulitis or tubular atrophy, which extracts maximum
amounts of information from the biopsy, and simple grading systems which are highly
reproducible but uninformative. The compromise that is represented by the current Banff
schema, does at least have widespread application across transplant programs and through
many clinical trials. It is important to recognize that it remains limited by the degree of
reproducibility at the margins and could suffer further refinement with benefit. The areas
of contention remain, for example, the relevance of cellular infiltrate in areas of fibrosis.
The current schema requires these to be ignored, but that leads to the potential for variability
in interpretation of exactly what constitutes an area of fibrosis in which the infiltrate
is to be ignored. Fortunately, the schema is under continuous revision and improvement,
so it is reasonable to hold the view that, despite the areas of poor reproducibility, the
Banff schema for the interpretation of renal allograft pathology is the best that we have
available.
DEFINITIONS AND A MODEL OF CAN
Understanding the complexity of the entity of chronic allograft nephropathy (CAN) has
taken many years, since unlike acute rejection, it cannot be easily identified clinically, is
multifactorial in origin and evolves over years and not days or hours. The reliability and
sensitivity of serum creatinine measurement contributed substantially to the ability to
diagnose and treat acute rejection in the early years of transplantation and is still one of
the most reliable tools that we use in the clinic to identify patients in need of further investigation
and change in management during the first few weeks after a renal transplant.
Since the serum creatinine is also a fairly reliable indicator of chronic graft failure,
as demonstrated by studies examining creatinine at one year as a predictor of graft loss,
it has been natural to assume that monitoring the serum creatinine will identify grafts at
risk from chronic graft failure and CAN. Experience has, however, taught us that this strategy
does not, on the whole, allow identification of CAN at a stage when intervention can
substantially alter the course of events. It is central to the understanding of CAN to realise
why this is the case. It is also central to any strategies that might be effective in the
16

EARLY DIAGNOSIS OF CHRONIC ALLOGRAFT NEPHROPATHY
BY MEANS OF PROTOCOL BIOPSIES
early identification and treatment of CAN. Our current model of CAN also demonstrates
why treatment is not a very effective strategy and why prevention of CAN has to be the
goal of all transplant units.
CAN is a diagnosis that has been arrived at through the pathologist’s microscope, rather
than the clinic. Papers from the 1970’s through to the mid 1990’s commonly used
the term “chronic rejection” to describe the clinical phenomenon of slowly and inexorably
rising serum creatinine. Indeed this term can be found in papers from the
past five years still loosely applied to chronic graft failure (15). It is important to understand
the difference between the starting points for each of these terminologies
and the consequent confusions that apply when one term is used interchangeably
with the other.
The term “CAN” arose from the Banff series of pathology conferences driven by such
pathologists as Kim Solez, Robert Colvin, Michael Mihatsch, Daniel Serón and Lorraine
Racusen (1). CAN is thus defined histologically, restricted to the renal allograft and is independent
of aetiology (16). The original intent of the definition was to bring some order
into the chaotic descriptions that were available for a chronically damaged allograft.
Unfortunately there remains some opportunity for confusion since the underlying aetiology
may also be discernable in the biopsy specimen, such as calcineurin inhibitor (CNI)
nephrotoxicity and through the addition to the diagnostic features of some facets with
presumed immunological aetiology. Ample opportunity to confuse has been added by
those who describe pre-transplant donor renal biopsies as having CAN –clearly an absurdity.
The features of CAN that are identified and scored in the Banff schema are tubular
atrophy (Banff: ct) and interstitial fibrosis (Banff: ci). This should not be taken to mean
that CAN is comprised of just these two appearances, nor that these are actually the
most relevant to physiological, functional or prognostic indicators. It is simply that these
two features are the most reliable, diffuse and easily visible changes in the biopsy, not
subject to the vagaries of small samples that plague any definition relying on patchy
changes in vessels or glomeruli. CAN grading from I to III simply identifies the proportion
of the biopsy that is affected by these changes. It is unfortunate that the scoring of
the chronic Banff “qualifiers” do not, in the current version, tie in well to the CAN grading.
A revised version of the schema, with a name change to chronic sclerosing allograft
nephropathy, may help us in the future. At the present time: CAN grade I requires ci1,
ct1; CAN grade II requires moderate changes (ci2/ct2, or ci1/ct2, or ci2/ct1); while grade
III requires severe changes (ci3/ct3, or ci2/ct3, or ci3/ct2). If there are none of the
changes of “chronic rejection” such as vascular changes with disruption of the elastica,
inflammatory cells in the fibrotic intima and proliferation of myofibroblasts in the intima,
the grade of CAN is qualified with an “a”, but if these changes are present then
it is rates “b”.
17

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
The ground on which we have been able to build models of CAN is thus from histology
and not from the clinical environment. Studies of biopsies taken in an attempt to diagnose
clinical events are also uselessly misleading since they are biased by the clinical
overlay that comes with the decision to undertake the biopsy. It is thus only from protocol
biopsy studies that one can really build the conceptual models with which to test therapeutic
interventions.
Reports of long term protocol renal allograft biopsy series were scarce until the past five
years or so. The longest series was published from our group in Sydney (REF JASN 66-79)
in which 120 recipients of simultaneous pancreas and kidney transplant recipients were
biopsied at 0, 3 and 12 months and then annually thereafter to ten years. Our series, like
that from the Mayo Clinic (17) which was predominantly from living donor transplants, started
with normal kidneys from young donors and very short cold ischemia times. We had
previously published a shorter series of protocol biopsies taken from deceased donor grafts,
which thus included the impact of preceding donor disease (9,18), while others have described
the different impacts of varied immunosuppressive regimens (19-23).
Chronic allograft nephropathy is the final common pathway of different causes of renal
allograft damage. That damage may have started in the hypertensive donor or through
cold ischaemia and reperfusion injury, through acute rejection, acute or chronic CNI nephrotoxicity
and from sub-clinical rejection. It may be possible in a single biopsy to discern
the relative influences of some of these factors, but in severe cases the biopsy is as
uninformative as the “end stage kidney” that we are familiar with from native renal diseases.
Our current working model is shown in Figure 1 and described below. We believe that it
provides the foundation for understanding not only CAN, but also the relationships between
the histological appearances and the clinical perspectives (2). The new genomic
techniques for elucidating changes at the molecular level may also potentially be inculcated
into explaining the model and the early evolution of CAN.
Subclinical rejection
Fibrosis of the kidney occurs in two separate phases (68), two thirds develops quite rapidly
during the first year, with a slow and progressive accumulation beyond that time.
Interestingly the interstitial fibrosis exceeds the tubular atrophy suggesting that it is related
to more than simply the damage of tubules. The two strongest contenders for this effect
are ischaemia-reperfusion injury and acute allograft immune response –acute rejection.
In the Hannover protocol series of 258 patients (22) biopsied at 6, 12 and 16 weeks,
CAN was present in 70 (37%) and absent in 120 at 26 weeks. The significant risk factors
for CAN were receiving a deceased donor kidney, long cold ischaemia and acute rejection.
In the Westmead series acute tubular necrosis was predictive for CAN and the use
18

EARLY DIAGNOSIS OF CHRONIC ALLOGRAFT NEPHROPATHY
BY MEANS OF PROTOCOL BIOPSIES
Transplant
Chronic donor disease
Acute donor disease
Ischaemia
Arteriosclerosis
Arteriolar hyalinosis
Tubular atrophy
Interstitial fibrosis
Acute rejection
CNI toxicity
Glomerular sclerosis
Rising creatinine
Subclinical rejection/chronic humoral rejection
GRAFT LOSS
Figure 1. Model for the understanding the time dependent and inter-related features of
chronic allograft nephropathy.
of mycophenolate mofetil compared with azathioprine reduced CAN (7). Sub-clinical rejection
was also a cause of interstitial fibrosis at twelve months (18) and CAN (25) in two
independent series of
biopsies, the first in deceased
donors of kidneys
and the second in deceased
donors of simultaneous
kidney pancreas
transplants. The confirmation
that subclinical rejection
causes CAN, may
lead to the conclusion
that this phenomenon explains
the immune related
risk factors for both
CAN and long term graft
survival. Sub-clinical rejection
is commonest in
low intensity immunosuppressive
regimens
and early after transplantation
(Figure 2). It is per-
Mean Banff score
1.5
1
0.5
0
0 1 2 3 4 5 6-7
Years after transplantation
Interstitial
inflammation
Tubulitis
Figure 2. Prevalence of acute interstitial infiltration and tubulitis
in protocol biopsies of renal allografts up to ten years
post-transplantation.
19

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
sistent in sequential biopsies in only a small percentage, but in this group of patients it
halves the measured GFR in only 18 months (25). In a formal randomised controlled trial
of detection and treatment of early subclinical rejection, Rush and his colleagues demonstrated
a beneficial effect in terms of reduction of interstitial fibrosis and tubular
atrophy at six months (26). More modern immunosuppressive regimens, including both
tacrolimus and mycophenolate mofetil, have reduced the incidence of subclinical rejection
and also the power to demonstrate the efficacy of treating subclinical rejection (27).
The Banff schema does not at present recognize inflammation in areas of fibrosis and
thus assumes that this infiltrate has no predictive value since the damage has been done.
There are now several series that demonstrate that this is not true and that sub-clinical
inflammation in areas of fibrosis are indeed associated with the presence of increased fibrosis
in subsequent biopsies (28,29).
Taken together, these data clearly support the view that inflammatory cells in renal allografts
cause long term damage even in the absence of acute deterioration in graft function
(30-36). In fact it is possible to support the contention that the damage is done because
there is no associated rise in creatinine, allowing it to go undiagnosed and thus untreated.
CNI nephrotoxicity
The impact of CNI nephrotoxicity is the other major contender implicated in the development
of CAN. It is possible to recognize chronic CNI toxicity and CAN as separate histological
entities and some have argued that this should always be the case (37). In the
two year protocol biopsies from the US multicenter trial comparing cyclosporine and tacrolimus
(19), both the rate of development and the severity of CAN and chronic CNI toxicity
were indistinguishable between tacrolimus, and the two formulations of cyclosporine
(38). In the Westmead series chronic CNI toxicity was identified in biopsies by the
presence of at least two of: striped interstitial fibrosis; arteriolar hylainosis; and tubular
micro-calcification. It was an almost universal finding by ten years after transplantation.
Interstitial fibrosis and tubular atrophy are highly correlated and progress rapidly in the
first year, thereafter progressing slowly but inexorably up to ten years and beyond.
Arteriolar hyalinosis
Arteriolar hyalinosis was present in 75% of patients by ten years. While implantation biopsies
may detect arteriolar hyalinosis in elderly, diabetic or hypertensive donors, in the series
of young donors of simultaneous kidney pancreas transplants that we reported, arteriolar
hyalinosis first appeared, sometimes transiently in the first three to six months
(38). Early changes were correlated with higher trough concentrations of cyclosporine
and by preceding episodes of acute CNI toxicity. The longer term and permanent appearance
of chronic CNI changes by five years post-transplant, was associated with higher
20

EARLY DIAGNOSIS OF CHRONIC ALLOGRAFT NEPHROPATHY
BY MEANS OF PROTOCOL BIOPSIES
long term cyclosporine dosage with a cut off point at a maintenance dose of about 5 mg/
kg/day. The histological appearance that is classically described is of a nodular hyaline
change in the wall of renal arterioles (14). In our data, however, this classical change often
gave way to more diffuse change with narrowing of the lumen and evidence of glomerular
ischaemia. The question thus arises as to whether the arteriolar change may be
associated with hypertension or with diabetes in our series. We were able to dispel these
two possibilities since treated hypertension succeeded the appearance of arteriolar hyalinosis
and did not preceed it as would be expected if it had a role in aetiology, also 60%
of hypertensive and 68% of normotensive patients had arteriolar changes. With respect
to the possibility of an effect from diabetes, the simultaneous glucose tolerance test performed
with each protocol biopsy showed identical glucose handling in those with and
those without arteriolar changes (38).
Glomerular disease
The final pathway for damage to the nephron is exhibited through glomerulosclerosis,
with which irreversible loss of glomerular and nephron function occurs. Glomerular filtration
rate is also closely linked to the glomerular sclerosis, especially as the number of
functioning nephrons falls and glomerular hyperfiltration capacity is exceeded. There are
at least three different mechanisms of destruction and pathologies that can be discerned
in transplant glomeruli.
Recurrent glomerulonephritis
Occurs at different frequencies in different diseases and may account for a significant
number of graft failures, such as in focal and segmental glomerular sclerosis (FSGS), or
be essentially irrelevant such as in systemic lupus erythematosus (SLE) (15). No more
will be said here about recurrent disease except to note that an increase in proteinuria
by >500 mg/day or an absolute excretion rate of >1,500 mg/day are a reliable guide to the
need for a diagnosis of the glomerular pathology (39), except possibly in patients treated
with sirolimus or everolimus.
Chronic transplant glomerulopathy
In which the earliest signs, seen on electron microscopy include splitting of the basement
membrane. This may be associated with the deposition of C4d and chronic antibody
mediated damage to the glomerulus (40). It has been well accepted since the 1960’s
that antibody to HLA mediates hyperacute and forms of acute rejection. Transplant glomerulopathy
was recognised as early as 1963 with enlarged glomeruli, mesangial matrix
expansion, changes in mesangial cells and splitting of both the glomerular and peritubular
basement membranes (41). Perhaps lulled into a false sense of security by the improvement
in crossmatching techniques, or perhaps by the confounding factors sur-
21

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
rounding the presence of anti-HLA antibody at the time of and subsequent to chronic allograft
failure, it has taken many years to piece together the events that surround chronic
humoral rejection. The turning point has come with the development of reliable techniques
to detect the complement component C4d on the membrane of endothelial cells in
the allograft and engagement with the Banff schema (42). Anti-HLA antibody is now
known to predict a poor long term outcome (43) and the immune consequence of antibody
binding to complement on the endothelial cell surface to preceed transplant glomerulopathy
(44). Experimental evidence is now also linking these phenomena perhaps
explaining one of the underlying mechanisms for vascular disease in the allograft (45).
The recent demonstration of antibody to agrin –a component of the glomerular basement
membrane– may explain the poor correlations between anti-HLA antibody and glomerulopathy
(46). Transplant glomerulopathy is clearly identified as a cause for long term graft
loss (47).
Ischaemic glomerular sclerosis
Associated with other features of chronic allograft nephropathy, seen progressively from
three or four years post-transplantation (48). In the early post-transplant period glomerular
loss is associated with generalised ischaemic damage but is quite restricted in extent,
at least in younger donors. The later and more significant phase of glomerular loss follows
as a consequence of earlier interstitial fibrosis and arteriolar hyalinosis (48). The severity
of interstitial fibrosis at one year correlated with the severity of glomerulosclerosis
at four and five years, but even grafts with no interstitial fibrosis eventually developed
glomerulosclerosis. A second factor influencing glomerular destruction was shown to be
the severity of arteriolar hyalinosis, with substantial increases in the percentage of sclerosed
glomeruli for each grade increase in Banff designated arteriolar hyalinosis. These
factors are familiar from prognostic studies in native renal diseases such as IgA nephropathy
and it should come as little surprise to see the influence apparent in transplanted
kidneys. Thus glomerulosclerosis is associated with both the results of acute and untreated
subclinical rejection, perhaps accounting for the correlations between chronic graft
loss and early acute rejection noted in the 1980’s and 1990’s, as well as with indices of
CNI nephrotoxicity, especially arteriolar hyalinosis.
Prevalence of chronic allograft nephropathy
The prevalence of CAN may only be determined from protocol biopsy of unselected patients.
All studies that report the prevalence of CAN based upon functional indices or selected
histology driven by clinical indications dramatically underestimate the true prevalence.
There is no doubt that the prevalence of CAN depends upon many factors including
the donor age, indices of ischaemia and rejection, and upon the immunosuppression
used. One controlled study of cyclosporine compared to tacrolimus showed a prevalence
of CAN at two years to be 72.3% and 62.0% at two years respectively (19). The
22

EARLY DIAGNOSIS OF CHRONIC ALLOGRAFT NEPHROPATHY
BY MEANS OF PROTOCOL BIOPSIES
prevalence was correlated with prior acute rejection episodes, acute nephrotoxicity and
with donor age.
The Westmead series showed what was to some a remarkably high prevalence of CAN,
with almost all grafts affected by CAN grade I by two years, and around 50% with CAN
grade III by ten years (7) (Figure 3).
Figure 3. Prevalence of chronic allograft nephropathy diagnosed
on protocol biopsy by the Banff criteria in 120 simultaneous
kidney pancreas transplant recipients.
Steroid avoidance and use of either sirolimus or mycophenolate mofetil with tacrolimus
lead to 20% grade II and III CAN at only 12 months in both African Americans and non-
African Americans, similar
to the Westmead data
using predominantly cyclosporine
therapy (49).
Moreso et al. showed an
even higher prevalence
of CAN with 175 of 435
(40%) of grafts affected
by six months (29). The
precise estimate of CAN
grade after at different times
after transplantation
varies with the study and
to a certain extent also
with the histologist, but
the important and common
theme is that the level
of pathological impact
is substantially underestimated
by the serum
creatinine and other functional
measures in all studies. It is thus our contention that it is necessary to intervene
early if one is to reduce the level of histological chronic allograft nephropathy.
Utility of diagnosing and detecting CAN early
One could legitimately ask the question: is it worth making the diagnosis of CAN? Is there
a therapeutic utility to making the diagnosis? Is it possible to either reverse or prevent
deterioration in the histology once the diagnosis has been made? These questions are
all predicated on therapeutic nihilism which dictates that once the damage has been done
it cannot be undone. There is some justice in this approach, since sclerosed glomeruli
will not spring back to life and atrophic tubules will not regenerate to normal morphology
and function. The only conclusion that one can make is that therapy designed to halt the
23

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
progression of disease and therapy designed to remove the aetiological agents would
have to be effective to justify the intervention.
The options available for prevention of graft damage are: treatment of subclinical rejection;
reversal of and prevention of further CNI nephrotoxicity, especially arteriolar hyalinosis;
prevention of ischaemia and selection of a younger donor. The latter strategies will
not help after the transplant but there is evidence that treatment of subclinical rejection
and switch from CNI based immunosuppression can make a difference.
Treatment of subclinical rejection
The diagnosis of subclinical rejection and the repeated and reliable demonstration of a
correlation between subclinical cellular infiltrates and subsequent graft fibrosis, does
not prove that it is possible to treat subclinical rejection with benefit. It was thus important
to see proof of this hypothesis in a single centre study from Canada (26). In this
study Rush and his colleagues randomised half of the patients to protocol biopsy and
treatment of subclinical rejection and the other half to treatment based upon clinical indices
only. Interstitial fibrosis and tubular atrophy scores on biopsy at six months and
serum creatinine at 24 months were statistically significantly superior in the protocol
biopsy group, thus proving the hypothesis. In our own series, published recently, it was
demonstrated that treatment of subclinical rejection diagnosed on one month protocol
biopsy, eliminated differences in chronic fibrosis and tubular atrophy at three months,
between those with and without subclinical rejection at one month (50). While this cohort
study again does not constitute formal proof of the utility of treating subclinical rejection,
it is encouraging that this therapy did seem to eliminate chronic damage which
we have otherwise seen consistently for the past 15 or more years. A more recent formal
trial by the Canadian group with a number of other North American centres has been
reported in abstract form in 2006, but failed to demonstrate an impact because of the
low incidence of subclinical rejection when using immunosuppression based upon tacrolimus
and mycophenloate mofetil (27). Interestingly there was a higher than expected
level of interstitial fibrosis in that study –perhaps exchanging subclinical rejection for
CNI nephrotoxicity.
In conclusion, the weight of evidence favours the diagnosis and treatment of subclinical
rejection, especially when using lower intensity immunosuppressive regimens, as a strategy
for reducing chronic allograft nephropathy.
Avoidance of CNI nephrotoxicity
One strategy for avoidance of nephrotoxicity is to avoid these agents entirely and a
number of studies have attempted to do that by using combinations of sirolimus or everolimus
with mycophenolate mofetil and steroids with induction using a monoclonal
24

EARLY DIAGNOSIS OF CHRONIC ALLOGRAFT NEPHROPATHY
BY MEANS OF PROTOCOL BIOPSIES
anti-Il2 receptor antibody (51). An alternative strategy has been studied since the early
1980’s, notably early conversion from a calcineurin inhibitor based regimen to one which
eliminates the CNI after three, six or twelve months. It is not in the scope of this chapter
to identify and review these studies which others have accomplished in formal metaanalyses
(52, 53), but it is important to note that one of the more recent studies using
sirolimus and corticosteroids as maintenance therapy was accompanied by protocol
biopsies (54). In this study biopsies at implantation, 12 and 36 months were studied in
a subset of patients that provided biopsy material at each time point. The most interesting
feature of this study was that the group in which the CNI was eliminated had
resolution of tubular atrophy between 12 and 36 months, without increased interstitial
fibrosis. Thus the total CADI index of chronic damage was unchanged in the sirolimus
treated patients, suggesting that the strategy might hold out some hopes for long term
improvement in CAN, if effective and applicable clinical regimens can be developed to
avoid the CNI’s.
Future opportunities
Clearly, very early diagnosis of events that may subsequently damage the graft might
increase the effectiveness of interventions. The possibility that gene events will predict
histology has been borne out in early studies from a number of groups including our
own. Vitalone at the World Transplant Congress in Boston in July 2006 (55), presented
data derived from Gene Microarrays demonstrating that genes associated with both
CAN and rejection “turn on” –i.e., produce mRNA– earlier than the histological changes
were apparent. If this is borne out in other laboratories and in other series of patients,
it may offer a way of predicting the patients in whom intervention would be especially
valuable.
SUMMARY
Chronic Allograft Nephropathy is the syndrome that has come to plague renal transplantation
as the cause of most graft losses. It has been evident for as long as we have been
transplanting the kidney, but in the early days it was overshadowed by acute rejection
and mis-interpreted as an entirely immune related phenomenon termed “chronic rejection”.
It has been the source of most concern to clinical transplant programs for the past
ten years, but the long term nature of the syndrome has meant that it has not been an
easy target for research. Paradoxically, the pharmaceutical industry –which has the most
to gain from long term use of particular agents– is most unlikely to fund the research trials
that we will need to prove which are the best treatment options. Long term investments
in this area are likely to be superseded before they have produced any answers. We are
thus left with the individual transplant centre studies, implied answers from long term
cohort studies using older pharmaceutical agents and new molecular genomic and proteomic
technologies that have yet to deliver on their promise.
25

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
REFERENCES
1. Racusen LC, Solez K, Colvin RB, Bonsib SM, Castro MC, Cavallo T, et al. The Banff
97 working classification of renal allograft pathology. Kidney Int 1999; 55 (2): 713-23.
2. Chapman JR, O’Connell PJ, Nankivell BJ. Chronic Renal Allograft Dysfunction. JASN
2005; 16 (10): 3015-26.
3. Wilczek HE. Percutaneous needle biopsy of the renal allograft. A clinical safety evaluation
of 1129 biopsies. Transplantation 1990; 50 (5): 790-97.
4. Furness PN, Philpott CM, Chorbadjian MT, Nicholson ML, Bosmans JL, Corthouts BL,
et al. Protocol biopsy of the stable renal transplant: a multicenter study of methods
and complication rates. Transplantation 2003; 76 (6): 969-73.
5. Schwarz A, Gwinner W, Hiss M, Radermacher J, Mengel M, Haller H. Safety and adequacy
of renal transplant protocol biopsies. Am J Transplant 2005; 5 (8): 1992-6.
6. Vidhun J, Masciandro J, Varich L, Salvatierra O Jr., Sarwal M. Safety and risk stratification
of percutaneous biopsies of adult-sized renal allografts in infant and older pediatric
recipients. Transplantation 2003; 76 (3): 552-7.
7. Nankivell BJ, Borrows RJ, Fung CL, O’Connell PJ, Allen RD, Chapman JR. The natural
history of chronic allograft nephropathy. N Engl J Med 2003; 349 (24): 2326-3.
8. Shapiro R, Randhawa P, Jordan ML, Shapiro R, Randhawa P, Jordan ML, et al. An
analysis of early renal transplant protocol biopsies – the high incidence of subclinical
tubulitis. Am J Transplant 2001; 1 (1): 47-50.
9. Nankivell BJ, Fenton-Lee CA, Kuypers DR, Cheung E, Allen RD, O’Connell PJ, et al.
Effect of histological damage on long-term kidney transplant outcome. Transplantation
2001; 71 (4): 515-23.
10. Nicholson ML, Wheatley TJ, Doughman TM, White SA, Morgan JD, Veitch PS, et al.
A prospective randomized trial of three different sizes of core-cutting needle for renal
transplant biopsy. Kidney Int 2000; 58 (1): 390-5.
11. Furness PN, Taub N. International variation in the interpretation of renal transplant
biopsies: report of the CERTPAP Project. Kidney Int 2001; 60 (5): 1998-2012.
12. Gough J, Rush D, Jeffery J, Nickerson P, McKenna R, Solez K, et al. Reproducibility
of the Banff schema in reporting protocol biopsies of stable renal allografts. Nephrol
Dial Transplant 2002;17 (6):1081-84.
13. Veronese FV, Manfro RC, Roman FR, Edelweiss MI, Rush DN, Dancea S, et al.
Reproducibility of the Banff classification in subclinical kidney transplant rejection.
Clin Transplant 2005; 19 (4): 518-21.
14. Sis B, Dadras F, Khoshjou F, Cockfield S, Mihatsch MJ, Solez K. Reproducibility studies
on arteriolar hyaline thickening scoring in calcineurin inhibitor-treated renal allograft
recipients. Am J Transplant 2006; 6: 1444-50.
15. Briganti EM, Russ GR, McNeil JJ, Atkins RC, Chadban SJ. Risk of renal allograft loss
from recurrent glomerulonephritis. New Eng J Med 2002; 347: 103-9.
16. Nankivell BJ, Chapman JR, Gruenewald SM. Detection of chronic allograft nephropathy
by quantitative doppler imaging. Transplantation 2002: 74: 90-6.
26

EARLY DIAGNOSIS OF CHRONIC ALLOGRAFT NEPHROPATHY
BY MEANS OF PROTOCOL BIOPSIES
17. Fernando GC, Griffin MD, Grande JP, Lager DJ, Gloor JM, Velosa JA, Larson TS, Stegall
MD. Development of chronic allograft nephropathy (CAN) in low risk kidney transplant
recipients. Am J Transplant 2004; 4 (S8): 278.
18. Kupypers DR, Chapman JR, O’Connell PJ, Allen RDM, Nankivell BJ. Predictors of renal
transplant histology at three months. Transplantation 1999; 67: 1222-30.
19. Solez K, Vincenti F, Filo R. Histopathological findings from 2-year protocol biopsies from
a US multicenter kidney transplant trial comparing tacrolimus versus cyclosporine: a
report of the FK506 kidney transplant study group. Transplantation 1998; 66: 1736-40.
20. Mota A, Arias M, Taskinen EI, Paavonen T, Brault Y, Legendre C, Claesson K, Castagneto
M, Campistol JM, Hutchison B, Burke JT, Yilmaz S, Hayry P, Neylan JF. Sirolimusbased
therapy following early cyclosporine withdrawal provides significantly improved
renal histology and function at 3 years. Am J Transplant 2004 Jun; 4: 953-61.
21. Merville P, Berge F, Deminiere C, Morel D, Chong G, Durand D, Rostaing L, Mourad
G, Potaux L. Lower incidence of chorinc allograft nephropathy at 1 year post-transplantation
in patients treated with Mycophenolate mofetil. Am J Transplant 2004; 4:
1769-75.
22. Schwarz A, Mengel M, Gwinner W, Radermacher J, Hiss, Kreipe H, Haller H. Risk
factors for chronic allograft nephropathy after renal transplantation: a protocol biopsy
study. Kidney Int 2005; 67: 341-8.
23. Flechner SM, Kurian SM, Solez K, Cook DJ, Burke JT, Rollin H, Hammond JA,
Whisenant T, Lanigan CM, Head SR, Salomon DR. De novo kidney transplantation
without the use of calcineurin inhibitors preserves renal structure and function at two
years. Am J Transplant 2004; 4: 1776-85.
24. Nankivell BJ, Borrows RJ, Fung CL-S, O’Connell PJ, Chapman JR, Allen RDMA. Delta
analysis of post transplantation tubulointerstitial damage. Transplantation 2004; 78:
434-41.
25. Nankivell BJ, Borrows RJ, Fung CL-S, O’Connell PJ, Allen RDMA, Chapman JR. Natural
history, risk factors, and impact of subclinical rejection in kidney transplantation.
Transplantation 2004; 78: 242-9.
26. Rush D, Nickerson P, Gough J, McKenna R, Grimm P, Cheang M, Trpkov K, Solez K,
Jeffery J. Beneficial effects of treatment of early subclinical rejection: a randomized
study. J Am Soc Nephrol 1998; 9: 2129-34.
27. Rush D. No benefit of protocol biopsies in renal transplant patients receiving Tacrolimus
and Mycophenolate Mofetil: a multicentre randomized study. Transplantation 2006:
82 (1) abstract 843.
28. Choi BS, Shin MJ, Shin SJ, Kim YS, Choi YJ, Kim YS, et al. Clinical significance of an
early protocol biopsy in living-donor renal transplantation: ten-year experience at a single
center. Am J Transplant 2005; 5 (6): 1354-60.
29. Moreso F, Ibernon M, Goma M, Carrera M, Fulladosa X, Hueso M, Gil-Vernet S, Cruzado
JM, Torras J, Grinyó JM, Serón D. Subclinical rejection associated with chronic allograft
nephropathy in protocol biopsies as a risk factor for late graft loss. Am J Transplant
2006 Apr; 6 (4): 747-52.
27

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
30. Birk PE, Stannard KM, Konrad HB, Blydt-Hansen TD, Ogborn MR, Cheang MS, et al.
Surveillance biopsies are superior to functional studies for the diagnosis of acute and
chronic renal allograft pathology in children. Pediatr Transplant 2004; 8 (1): 29-38.
31. Miyagi M, Ishikawa Y, Mizuiri S, Aikawa A, Ohara T, Hasegawa A. Significance of subclinical
rejection in early renal allograft biopsies for chronic allograft dysfunction. Clin
Transplant 2005; 19 (4): 456-65.
32. Nickerson P, Jeffery J, Gough J, Grimm P, McKenna R, Birk P, et al. Effect of increasing
baseline immunosuppression on the prevalence of clinical and subclinical rejection:
a pilot study. Journal of the American Society of Nephrology 1999; 10 (8):
1801-5.
33. Gloor JM, Cohen AJ, Lager DJ, Grande JP, Fidler ME, Velosa JA, et al. Subclinical rejection
in tacrolimus-treated renal transplant recipients. Transplantation 2002; 73 (12):
1965-8.
34. Kanetsuna Y, Yamaguchi Y, Toma H, Tanabe K. Histological evaluation of renal allograft
protocol biopsies in the early period and 1 year after transplantation. Clin Transplant
2003; 17 Suppl. 10: 25-9.
35. Shishido S, Asanuma H, Nakai H, Mori Y, Satoh H, Kamimaki I, et al. The impact of
repeated subclinical acute rejection on the progression of chronic allograft nephropathy.
J Am Soc Nephrol 2003; 14 (4): 1046-52.
36. Serón D, Moreso F, Bover J, Condom E, Gil-Vernet S, Canas C, et al. Early protocol
renal allograft biopsies and graft outcome. Kidney Int 1997; 51 (1): 310-6.
37. Colvin RB. Chronic allograft nephropathy. N Engl J Med 2003; 349: 2288-90.
38. Nankivell BJ, Borrows RJ, Fung CL-S, O’Connell PJ, Chapman JR, Allen RDMA.
Calcineurin inhibitor nephrotoxicity: longitudinal assessment by protocol histology.
Transplantation 2004; 78: 557-65.
39. Myslak M, Amer H, Morales P, Fidler ME, Gloor JM, Larson TS, Stegall MD, Cosio
FG. Interpreting post-transplant proteinuria in patients with proteinuria pre-transplant.
Am J Transplant 2006; 6: 1660-85.
40. Regele H, Bohmig GA, Habicht A, Gollowitzer D, Schillinger M, Rockenschaub S,
Watschinger B, Kerjaschki D, Exner M. Capillary deposition of complement split product
C4d in renal allografts is associated with basement membrane injury in peritubular
and glomerular capillaries: a contribution of humoral immunity to chronic allograft
rejection. J Am Soc Nephrol 2002 Sep; 13 (9): 2371-80.
41. Hamburger J, Crosnier J, Dormont J. Observations in patients with a well tolerated
homotransplant kidney: possibility of a new secondary disease. Ann N Y Acad Sci
1964; 120: 558-77.
42. Racusen L, Colvin RB, Solez K, Mihatsch MJ, Halloran PF, Campbell PM, Cecka MJ,
Cosyns JP, Demetris AJ, Fishbein MC, Fogo A, Furness P, Gibson IW, Glotz D, Hayry P,
Hunsickern L, Kashgarian M, Kerman R, Magil AJ, Montgomery R, Morozumi K, Nickleit
V, Randhawa P, Regele H, Serón D, Seshan S, Sund S, Trpkov K. Antibody-mediated rejection
criteria – an addition to the Banff ’97 classification of renal allograft rejection. Am
J Transplant 2003; 3: 708-14.
28

EARLY DIAGNOSIS OF CHRONIC ALLOGRAFT NEPHROPATHY
BY MEANS OF PROTOCOL BIOPSIES
43. Lee PC, Terasaki PI, Takemoto SK, Lee PH, Hung CJ, Chen YL, Tsai A, Lei HY. All chronic
rejection failures of kidney transplants were preceded by the development of HLA
antibodies. Transplantation 2002; 74: 1192-4.
44. Bohmig GA, Exner M, Habicht A, Schillinger M, Lang U, Kletzmayr J, Saemann MD, Horl
WH, Watschinger B, Regele H. Capillary C4d deposition in kidney allografts: a specific
marker of alloantibody-dependent graft injury. J Am Soc Nephrol 2002; 13: 1091-9.
45. Jin YP, Jindra PT, Gong KW, Lepin EJ, Reed EF. Anti-class I antibodies activate endothelial
cells and promote chronic rejection. Transplantation 2005; 79: S19-S21.
46. Joosten SA, Sijpkens YWJ, van Ham V, Trouw LA, van der Vlag J, van den Heuval B, van
Kooten C, Paul LC. Antibody response against the glomerular basement membrane protein
agrin in patients with transplant glomerulopathy. Am J Transplant 2005; 5: 383-93.
47. Suri DL, Tomlanovich Sj, Olsen JL, Meyer TW. Transplant glomerulopathy as a cause
of late graft loss. Am J Kidney Dis 2000; 35: 674-680.
48. Nankivell BJ, Borrows RJ, Fung CL-S, O’Connell PJ, Allen RDMA, Chapman JR.
Evolution and pathophysiology of renal-transplant glomerulosclerosis. Transplantation
2004; 78: 461-8.
49. Anil Kumar MS, Moritz MJ, Saaed MI, Heifets M, Sustento-Reodica N, Fyfe B, Kumar
A. Avoidance of chronic steroid therapy in african american kidney transplant
recipients monitored by surveillance biopsy: 1-year results. Am J Transplant 2005
Aug; 5 (8): 1976-85.
50. Kee TY-S, Chapman JR, O’Connell PJ, Fung CL-S, Allen RDM, Kable K, Vitalone MJ,
Nankivell BJ. Treatment of subclinical rejection diagnosed by protocol biopsy of kidney
transplants. Transplantation 2006; 82: 36-42.
51. Flechner SM, Friend PJ, Brockmann J, Ismail HR, Zilvetti M, Goldfarb D, Modlin C,
Mastroianni B, Savas K, Devaney A, Simmonds M, Cook DJ. Alemtuzumab induction
and sirolimus plus mycophenolate mofetil maintenance for CNI and steroid-free kidney
transplant immunosuppression. Am J Transplant 2005 Dec; 5: 3009-14.
52. Mulay AV, Hussain N, Fergusson D, Knoll GA. Calcineurin inhibitor withdrawal from
sirolimus-based therapy in kidney transplantation: a systematic review of randomized
trials. Am J Transplant 2005; 5: 1748-5.
53. Kaiskie JASN meta Kasiske BL, Chakkera HA, Louis TA, Ma JZ. A meta-analysis of
immunosuppression withdrawal trials in renal transplantation. J Am Soc Nephrol 2000;
11: 1910-7.
54. Mota A, Arias M, Taskinen EI, Paavonen T, Brault Y, Legendre C, Claesson K, Castagneto
M, Campistol JM, Hutchison B, Burke JT, Yilmaz S, Hayry P, Neylan JF. Rapamune
Maintenance Regimen Trial. Sirolimus-based therapy following early cyclosporine withdrawal
provides significantly improved renal histology and function at 3 years. Am J
Transplant 2004; 4: 953-61.
55. Vitlaone M, Nankivell BJ, Fung C, Wavamaundo M, Allen RDM, Pleass H, Chapman
JR, O’Connell PJ. Microarrays detect profibrotic gene expression in human renal allografts
early after transplantation associated with chronic allograft nephropathy.
Transplantation 2006, 82, WTC Abstract 1057.
29

DIAGNÓSTICO PRECOZ
DEL RECHAZO SUBCLÍNICO
MEDIANTE BIOPSIAS
DE PROTOCOLO
F. J. Moreso
DEFINICIÓN DE RECHAZO SUBCLÍNICO
El diagnóstico de rechazo subclínico se basa en la demostración histológica de hallazgos
de rechazo agudo en una biopsia obtenida de un injerto renal con una función renal estable.
Las características histológicas, así como los tipos y grados de rechazo, se comentarán
en el siguiente apartado. La definición de injerto renal con función estable no ha sido
uniforme en distintos estudios llevados a cabo. Dado que desconocemos cuál es la mejor
función que puede alcanzar un injerto renal, se ha utilizado como criterio la diferencia
entre la creatinina sérica en el momento de la biopsia y la creatinina sérica durante algún
periodo próximo a la realización de la misma. En nuestra Unidad, se consideran injertos
estables aquellos que muestran una diferencia entre la creatinina sérica el día de la biopsia
y la obtenida durante los 15-30 días antes y después de la biopsia inferior al 15% (1).
De esta manera, se entiende que, en el caso de producirse un deterioro funcional superior
al 15% juntamente con hallazgos de rechazo agudo, se trataría de un caso de rechazo
clínico.
La primera descripción de hallazgos histológicos de rechazo agudo en injertos con función
estable data de principios de la década de los 70 (2). A mediados de la década de los
80, se comunicó la presencia de signos de rechazo agudo en biopsias obtenidas en el
momento del alta en pacientes trasplantados tratados con azatioprina o ciclosporina (3, 4).
A pesar de estas aproximaciones iniciales, no ha sido hasta los últimos 15 años cuando la
práctica de biopsias de protocolo en distintos centros ha permitido caracterizar la historia
31

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
natural de esta entidad, así como describir su epidemiología e implicaciones terapéuticas
y pronósticas. Hay que tener en cuenta que las distintas reuniones del grupo de Banff han
posibilitado desarrollar unos criterios estandarizados para la valoración de las biopsias
(5-7), cuya aplicación por parte de los distintos centros ha hecho posible una descripción
homogénea de las lesiones.
DIAGNÓSTICO DE RECHAZO SUBCLÍNICO
El diagnóstico de rechazo subclínico consiste en el estudio del material obtenido mediante
punción-biopsia renal, el cual es procesado según las técnicas convencionales y valorado
en función de los criterios aceptados internacionalmente.
Seguridad de la biopsia renal de protocolo
La biopsia del injerto renal se realiza habitualmente bajo control ecográfico utilizando agujas
automáticas de los calibres 14 G, 16 G o 18 G, y se suelen obtener dos cilindros. Como
toda técnica invasora, no está exenta de complicaciones y muchas Unidades de Trasplante
prefieren no someter a ningún riesgo un injerto normofuncionante. Existen diversos estudios
sobre la seguridad de la biopsia renal en el paciente trasplantado, pero han sido de
gran utilidad estudios recientes que exploran la seguridad de la biopsia renal de protocolo
(8, 9). De estos estudios se deduce que la pérdida del injerto renal es excepcional (una
pérdida en más de 2.000 procedimientos) y que las complicaciones graves (que requieren
transfusión y/o hospitalización) son inferiores al 1%.
Diagnóstico histológico
La biopsia se procesa en formalina, fija en parafina y se tiñe con las tinciones de hematoxilina-eosina,
ácido periódico de Schiff (PAS), tricrómico de Masson y plata metenamina.
La adecuación de la muestra obtenida, así como la valoración de las lesiones, se basan
en los criterios definidos en la conferencia de consenso de Banff (5-7). Se aconseja
teñir, al menos, siete láminas: tres con hematoxilina-eosina, tres con PAS y una con tricrómico.
Se consideran muestras adecuadas aquellas que contienen diez o más secciones
glomerulares y dos o más secciones arteriales. Son muestras marginales aquellas
que contienen entre siete y nueve secciones glomerulares y, al menos, una sección arterial.
Las muestras con menos de siete secciones glomerulares o sin secciones arteriales
no se consideran suficientes para una adecuada valoración.
Las lesiones histológicas se evalúan mediante una escala ordinal graduada de 0 a 3, en la
cual 0 significa ausencia de lesión, 1 lesión leve, 2 lesión moderada y 3 lesión severa. Esta
escala se utiliza para la valoración de las lesiones a nivel glomerular, intersticial, tubular y
vascular, que se denominan glomerulitis, infiltrado intersticial, tubulitis y vasculitis, respectivamente,
y que se abrevian por convenio como g, i, t y v, respectivamente.
32

DIAGNÓSTICO PRECOZ DEL RECHAZO SUBCLÍNICO MEDIANTE BIOPSIAS
DE PROTOCOLO
Según el esquema de Banff, el diagnóstico de cambios borderline se basa en la presencia
de infiltrado intersticial leve (afecta al 10-25% de la corteza renal) y tubulitis leve (1-4
células inflamatorias por sección tubular). La existencia de infiltrado moderado (afecta entre
el 25% y el 50% de la corteza renal) o severo (afecta a más del 50% del parénquima
cortical) en asociación con tubulitis moderada (5-10 células inflamatorias por sección tubular)
o severa (>10 células inflamatorias por sección tubular) permite definir el rechazo
agudo grados IA y IB, respectivamente. Finalmente, la presencia de arteritis intimal posibilita
definir el rechazo agudo de grado II. En las Figuras 1-4 se muestran ejemplos de los
distintos tipos de lesiones y grados de rechazo.
Diferencias entre rechazo agudo subclínico
y rechazo agudo clínico
Dado que los hallazgos histopatológicos en el rechazo agudo clínico y el rechazo agudo
subclínico son indistinguibles, se han llevado a cabo distintos trabajos para detectar alteraciones
estructurales que justifiquen la presencia de lesiones de rechazo agudo sin
deterioro funcional. Cabe destacar que en los injertos con función estable la presencia
de rechazo vascular (grado II o III) es muy infrecuente, es decir, el rechazo vascular agudo
casi siempre se traduce en deterioro funcional. Para valorar la falta de deterioro fun-
Figura 1. Infiltrado inflamatorio difuso que afecta a más del 25% del área
cortical (i2) con afectación predominantemente perivascular (hematoxilina-eosina;
x 100).
33

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
Figura 2. Infiltrado inflamatorio leve con tubulitis leve (t1), entre una y cuatro
células inflamatorias por sección tubular (hematoxilina-eosina; x 400).
Figura 3. Infiltrado linfomonocitario severo (i3) con presencia de eosinófilos.
Se observa tubulitis (t2) con destrucción de las membranas basales
tubulares (hematoxilina-eosina; x 200).
34

DIAGNÓSTICO PRECOZ DEL RECHAZO SUBCLÍNICO MEDIANTE BIOPSIAS
DE PROTOCOLO
Figura 4. Endotelialitis leve (v1) en las arterias de la zona intercorticomedular
(hematoxilina-eosina; x 100).
cional en los episodios de rechazo subclínico tubulointersticiales (cambios borderline y
grado I), se ha estudiado la expresión fenotípica y el grado de activación de las células
que infiltran el intersticio renal (10-13).
En un estudio que comparaba diez biopsias normales, 13 casos de rechazo subclínico y
nueve de rechazo clínico, se evaluaron distintas subpoblaciones linfocitarias en el infiltrado
intersticial (10). El número de células CD3 (linfocitos T) positivas era similar en los
pacientes con rechazo clínico o subclínico. En cambio, se mostró una tendencia a un mayor
número de células CD20 (linfocitos B), CD8 (linfocitos T citotóxicos) y CD68 (macrófagos)
positivas en aquellos pacientes con rechazo clínico que no alcanzaba significación
estadística debido al pequeño tamaño de la muestra. En este mismo trabajo, se evidenció
una mayor expresión de AIF-1 (factor inflamatorio del aloinjerto producido por los macrófagos
activados), pero no se observó una mayor expresión de TNF-α (factor de necrosis
tumoral), perforina o CD25 (receptor de interleucina 2). Por otra parte, este grupo
de investigación ha demostrado que la expresión de RNA mensajero de perforina y otros
mediadores de lesión es menor en los pacientes con rechazo subclínico que en los pacientes
con rechazo clínico (11). Es decir, en el espectro entre la normalidad y el rechazo
agudo con deterioro funcional se halla el rechazo subclínico, que muestra unas lesiones
muy parecidas al rechazo clínico pero de menor intensidad.
35

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
Por otro lado, se ha referido que una mayor expresión de la proteasa inhibidora de la granzima
B (PI-9) justificaría la falta de deterioro funcional en los injertos con rechazo subclínico
(12). Se ha demostrado que las células T citotóxicas granzima B positivas responsables
de la destrucción de las células tubulares se expresan de forma parecida en el rechazo
agudo clínico y en el subclínico. Así, pues, la expresión de PI-9 en las células tubulares
epiteliales constituiría un mecanismo de resistencia a la apoptosis inducida por
la granzima B.
La aplicación de técnicas de Biología Molecular más complejas, como los microarrays de
ADN, ha permitido caracterizar la heterogeneidad molecular del rechazo agudo y demostrar
que el análisis sistemático de patrones de expresión génica posibilita valorar fenómenos
como la respuesta al tratamiento (14). No se dispone hasta la actualidad de estudios que
valoren si el patrón de expresión génica entre el rechazo agudo clínico y el subclínico es
distinto.
Otros marcadores no histológicos
de rechazo subclínico
Dado que la presencia de episodios de rechazo agudo tanto clínico como subclínico
es muy prevalente durante los primeros meses postrasplante y su monitorización obliga
a la realización de biopsias iterativas, se ha valorado la utilidad de otros métodos
para su detección. Estos métodos se han basado en la aplicación de técnicas de
Genómica y Proteómica a muestras de orina obtenidas de injertos con rechazo agudo
o función estable. Así, se ha demostrado que la cuantificación del ARN mensajero codificante
de proteínas citotóxicas, como la granzima B y la perforina en las células de
la orina, ofrece un método no invasor para diagnosticar el rechazo agudo (15). Además,
se ha evidenciado que los niveles urinarios de ARN mensajero de FOXP3 (marcador
de células T reguladoras) se relacionan con la reversibilidad de los episodios de rechazo
agudo (16).
Por otra parte, la aplicación de la Proteómica ha permitido analizar el espectro de las
proteínas presentes en la orina y se ha descrito que la combinación de la electroforesis
con la espectrometría de masas hace posible definir un espectro característico
para el rechazo agudo tubulointersticial (grado I según Banff), espectro que es similar
en el rechazo clínico y el subclínico (17, 18). Parece ser que la aparición del patrón
proteómico urinario característico del rechazo agudo precede a los hallazgos en la
biopsia.
A pesar de su potencial utilidad, estas novedosas técnicas no han sido aplicadas todavía
a grandes series de pacientes y, por lo tanto, no se ha valorado de forma adecuada
la existencia de un patrón de expresión distinto respecto del rechazo agudo clínico, el
rechazo agudo subclínico en sus diferentes grados y la ausencia de rechazo.
36

DIAGNÓSTICO PRECOZ DEL RECHAZO SUBCLÍNICO MEDIANTE BIOPSIAS
DE PROTOCOLO
EPIDEMIOLOGÍA: PREVALENCIA Y VARIABLES
ASOCIADAS
El rechazo subclínico es una entidad que se diagnostica sobre injertos renales con función
estable. Cuando se revisa la literatura sobre esta entidad se observa cierta heterogeneidad
en los resultados comunicados por distintos grupos. Una de las fuentes más
difíciles de controlar es la variabilidad que depende de la valoración histológica de la biopsia
renal.
Existen diversos trabajos que han mostrado la dificultad de diversos patólogos expertos
en patología del trasplante renal al reproducir el diagnóstico histológico (19, 20). En este
sentido, cabe destacar que el propio grupo de Banff modificó en la conferencia de 1997
la definición de rechazo agudo grado I y II al comprobar que la definición ofrecida por otros
grupos (21) permitía una mayor reproducibilidad del grado histológico de rechazo agudo.
Obviamente, las diferencias en los tratamientos inmunosupresores, así como la mayor o
menor heterogeneidad genética entre las poblaciones estudiadas, también contribuyen
a explicar la variabilidad de los resultados.
En la literatura, sólo existe un trabajo dirigido específicamente a valorar la reproducibilidad
del diagnóstico de rechazo subclínico (22). En este estudio, se muestra una aceptable
reproducibilidad para el diagnóstico de rechazo agudo (índice kappa: entre 0,47 y
0,72), pero una reproducibilidad muy baja para el diagnóstico de cambios borderline (índice
kappa: inferior a 0,4).
Prevalencia
En la Tabla I se muestra la prevalencia de los distintos tipos de rechazo subclínico
en las biopsias de protocolo realizadas en distintos centros (23-29). De los datos comunicados
hasta la actualidad se desprende que la presencia de rechazo agudo durante
los tres primeros meses postrasplante es muy elevada: alcanza a entre un tercio
y la mitad de los pacientes. Se considera que la distribución de las lesiones agudas
a lo largo del tiempo sigue una curva exponencial, de tal manera que su prevalencia
se reduce enormemente a partir de los seis meses. Con respecto al tipo de
rechazo, en aproximadamente dos tercios de los casos se observan cambios borderline
y, en un tercio, se constata rechazo agudo de grado I. Cabe destacar que la
presencia de rechazo vascular (grado II) es excepcional en los injertos con función
estable.
En los trabajos publicados hasta la actualidad no se menciona la presencia de lesiones
específicas de rechazo agudo humoral. Por otra parte, no se dispone de trabajos dirigidos
a valorar la existencia de rechazo agudo humoral según los criterios de Banff definidos
en la reunión de 2001 (7).
37

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
Tabla I. Prevalencia de los distintos grados de rechazo subclínico comunicada
por distintos centros.
Autor Tiempo n Sin Cambios Rechazo Rechazo
rechazo borderline agudo agudo
agudo grado I grado II
Rush (23) 1 mes 25 32% 44% 24% 0%
2 meses 25 12 36% 52% 0%
3 meses 25 44 28% 28% 0%
6 meses 25 6% 8% 28% 0%
12 meses 25 68% 20% 12% 0%
Serón (1) 3 meses 98 61% 24% 5% 0%
Legendre (24) 3 meses 31 25% 57% 18% 0%
12 meses 31 52% 35% 13% 0%
Serón (25) 3 meses 282 66% 30% 3% 1%
Nankivell (26) 3 meses 112 21% 49% 25% 4%
12 meses 112 85% 15% 0% 0%
Serón (27) 3 meses 155 67% 28% 5% 0%
12 meses 155 76% 23% 1% 0%
Roberts (28) 7 días 76 75% 12% 13% 0%
28 días 79 76% 16% 8% 0%
Choi (29) 14 días 304 49% 38% 13% 0%
Variables clínicas asociadas a rechazo subclínico
A continuación, se revisa la relación existente entre distintas variables clínicas y la presencia
de rechazo subclínico. El efecto del tratamiento inmunosupresor se valorará en un
capítulo específico.
Tipo de donante
La mayor parte de los trabajos disponibles en la literatura se han realizado a partir de trasplantes
procedentes de donante cadáver, por lo que la información referente al trasplante
renal procedente de donante vivo es menor. Para comparar las diferencias según el
tipo de donante es útil una de las primeras descripciones que valoró una serie de diez
trasplantes procedentes de donante vivo HLA-idéntico y 31 trasplantes procedentes de
donante cadáver, y que mostró que la incidencia de rechazo subclínico a los tres y 12 meses
era muy inferior en los primeros (24). Una de las experiencias más amplias es la ofrecida
por un grupo coreano (29) que constata, en una serie de 304 biopsias de protocolo
(195 de donante emparentado y 109 de donante no emparentado), una prevalencia rela-
38

DIAGNÓSTICO PRECOZ DEL RECHAZO SUBCLÍNICO MEDIANTE BIOPSIAS
DE PROTOCOLO
tivamente baja de rechazo subclínico, la cual resulta menor en los receptores de un trasplante
procedente de donante vivo emparentado respecto del no emparentado (10% vs.
19%). Por otra parte, otro grupo asiático con una serie de biopsias inferior (127 casos) no
ha podido demostrar ninguna diferencia en la incidencia de rechazo subclínico entre el
donante vivo y el cadavérico (30).
Finalmente, el grupo de Sídney ha comunicado una mayor incidencia de rechazo subclínico
en los pacientes trasplantados con un injerto procedente de donante cadáver fallecido
por accidente cerebrovascular que en los fallecidos por traumatismo craneoencefálico
(31).
Otros factores del donante, como la edad y el sexo, no se han relacionado con el rechazo
subclínico.
Polimorfismos genéticos del donante y el receptor
Se ha sugerido que las características genéticas del donante y/o receptor pueden modular
la respuesta inmune y, por lo tanto, la aparición de rechazo agudo, tanto clínico
como subclínico. Para ello, se ha investigado la existencia de relaciones entre distintos
polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) que pueden modular la producción de diversas
citocinas y la aparición de rechazo agudo postrasplante.
Nuestro grupo ha estudiado la asociación entre SNPs del gen del TGF-β1 (factor de
crecimiento transformante beta) y el rechazo subclínico. Recientemente, hemos constatado
una asociación entre el polimorfismo del codón 10 del exón 1 del TGF-β1 y
una mayor prevalencia de rechazo subclínico (32). Además, hemos demostrado que
esta asociación es independiente de otras variables clínicas. En cambio, no hemos
hallado ninguna relación entre el polimorfismo del codón 25 del exón 1 del mismo
gen y el rechazo subclínico. En este estudio, se ha intentado relacionar el polimorfismo
con la producción de mARN de TGF-β1 y no se ha observado ninguna relación,
con lo cual no se puede concluir que el efecto se deba a una mayor producción de
este mARN.
Por otra parte, el grupo de Winnipeg ha evidenciado una asociación entre los polimorfismos
de distintas citocinas –como TGF-β1, el interferón gamma (INF-γ), la interleucina 10
(IL-10) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α)– y los datos histológicos en biopsias
de protocolo, realizadas a los seis meses, que están parcialmente influenciadas por la
presencia de rechazo subclínico (33). Así, estos autores relacionan el polimorfismo del
codón 25 del TGF-β1 con una menor inflamación y sugieren que los altos productores de
esta citocina presentan menos rechazo subclínico. Por otra parte, los polimorfismos asociados
con una mayor producción de INF-γ, IL-10 y TNF-α se relacionan con un peor pronóstico.
Sin embargo, sería necesario demostrar que estos polimorfismos se asocian a
39

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
la producción de las citocinas que codifican para poder extraer resultados concluyentes.
Es importante recordar que estudios epidemiológicos con un gran número de pacientes
no han sido capaces de detectar ninguna relación entre estos polimorfismos y la supervivencia
del injerto (34).
Compatibilidad HLA, retrasplante y grado de sensibilización
Dado que tanto la compatibilidad HLA, el retrasplante y el grado de sensibilización –porcentaje
de anticuerpos frente al panel (PRA)– se han relacionado con la aparición de rechazo
agudo clínico, distintos grupos han valorado la asociación entre estas variables y
el rechazo subclínico.
La relación entre la compatibilidad HLA y la evolución del injerto debe ser valorada en series
con un número elevado de pacientes, y la mayor parte de los trabajos con biopsias
de protocolo no exceden de los 100 pacientes. Uno de los estudios que cuentan con una
serie amplia de más de 300 casos (29) muestra una asociación entre compatibilidad HLA
y rechazo subclínico. Así, la incidencia de rechazo subclínico pasa del 3% en los pacientes
HLA-DR idénticos al 21% en los pacientes sin ninguna identidad HLA-DR. Estos resultados
no han sido reproducidos por otros grupos.
El diagnóstico de rechazo subclínico es más frecuente en los pacientes hipersensibilizados,
al igual que sucede con el de rechazo clínico. En nuestra experiencia existe una asociación
entre rechazo subclínico y reactividad frente al panel, especialmente en los pacientes
que presentan lesiones de nefropatía crónica del trasplante asociada al rechazo
subclínico (3). A pesar de ser pacientes hipersensibilizados, no se ha podido demostrar
la presencia de un componente humoral en estos pacientes.
No se dispone de información suficiente para testar si los retrasplantes presentan una
prevalencia de rechazo subclínico distinta de la de los primeros trasplantes.
Lesión de isquemia-reperfusión
Aunque la necrosis tubular aguda se ha relacionado con la aparición de rechazo agudo clínico
(36), ninguna de las variables clínicas asociadas a la lesión de isquemia-reperfusión
(edad del donante, tiempo de isquemia fría, requerimientos de diálisis postrasplante) se
ha relacionado con la presencia de rechazo subclínico.
Rechazo agudo clínico
Uno de los hallazgos más consistentes en la literatura es la estrecha relación que existe
entre los episodios de rechazo clínico y el rechazo subclínico. Los pacientes que han presentado
episodios de rechazo clínico antes de la biopsia tienen más riesgo de sufrir re-
40

DIAGNÓSTICO PRECOZ DEL RECHAZO SUBCLÍNICO MEDIANTE BIOPSIAS
DE PROTOCOLO
chazo subclínico. Además, se ha relacionado el hallazgo de rechazo subclínico con la ulterior
aparición de episodios de rechazo agudo clínico (28).
El grupo de Sídney en su amplio número de biopsias realizadas sobre 120 pacientes ha
mostrado que el rechazo subclínico persistente (definido como aquel rechazo subclínico
presente en más del 50% de las biopsias tomadas durante el primer año, o bien en tres
biopsias consecutivas pero de duración inferior a dos años) está estrechamente ligado a
la presencia de rechazo agudo clínico, ya que aparece en el 38% de los pacientes con rechazo
clínico, pero tan sólo en el 8% de los pacientes sin rechazo clínico (31).
Rechazo subclínico y nefropatía crónica del trasplante
El factor más estrechamente relacionado con la aparición de nefropatía crónica del trasplante
(NCT) es la presencia de episodios de rechazo agudo clínico. En este mismo sentido,
diversos trabajos han sugerido una asociación entre la aparición de rechazo agudo
subclínico y el ulterior desarrollo de NCT. De todas formas, ha sido el estudio de biopsias
seriadas el que ha permitido demostrar una estrecha relación entre la aparición de rechazo
agudo subclínico y la NCT. Así, el grupo de Sídney (37), en una serie de 961 biopsias
de protocolo realizadas sobre 120 receptores de un trasplante renopancreático a lo
largo de diez años, ha descrito la historia natural de la NCT y ha mostrado que el rechazo
subclínico es una de las variables determinantes de la aparición de NCT. El grupo de
Sídney ha demostrado que el rechazo subclínico persistente durante los primeros meses
postrasplante es muy frecuente (más del 35% de los casos en su serie) y condiciona la
ulterior aparición de NCT a través de una pérdida progresiva de nefronas. El rechazo agudo
subclínico que persiste durante más de dos años (al que este grupo se refiere como
verdadero rechazo crónico) es poco frecuente y afecta a menos del 5% de los casos.
Nuestro grupo ha observado que incluso con una sola biopsia de protocolo se puede demostrar
dicha asociación. Así, en nuestra serie de 435 biopsias realizadas entre los tres
y los seis meses, constatamos que la prevalencia de NCT era superior en los pacientes
que presentaban rechazo subclínico que en aquellos que no lo presentaban (47% vs.
37%) (35). Además, en un estudio sobre 61 pacientes a los que se les habían realizado
dos biopsias seriadas a los cuatro y a los 12 meses, mostramos que la presencia de rechazo
subclínico en la primera biopsia se asociaba no sólo con una mayor progresión de
la fibrosis intersticial y la atrofia tubular, sino también con una menor adaptación glomerular
y una mayor progresión de la glomerulosclerosis (38).
La definición de rechazo subclínico se basa en la presencia de infiltrado intersticial inflamatorio
asociado a tubulitis. Se ha propuesto que estas lesiones son responsables de las
alteraciones producidas en la membrana basal tubular que pueden llegar a ser irreversibles
y conducir al desarrollo de NCT. Estudios estructurales han evidenciado zonas de rotura
de la membrana basal tubular en los focos de tubulitis con pérdida de las proteínas
41

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
de matriz de la membrana basal tubular. El número de roturas observadas se relaciona
con la función renal en el momento de la biopsia, así como con el ulterior desarrollo de
cambios de nefropatía crónica (39). Obviamente, la capacidad reparativa del órgano trasplantado
condicionará en parte la severidad de las lesiones crónicas que se desarrollen.
Finalmente, a partir de cierto umbral, la pérdida de unidades funcionales conducirá al fracaso
del injerto.
TRATAMIENTO Y PREVENCIÓN
Se abordará en primer lugar la utilidad del tratamiento del rechazo subclínico, puesto que
fue la primera aproximación a este fenómeno. Con la aparición de nuevos inmunosupresores
se ha valorado la utilidad de distintas pautas que combinan diferentes fármacos
para prevenir el rechazo subclínico.
Tratamiento
Se dispone de un solo trabajo prospectivo, aleatorizado, en el que se ha testado la eficacia
del tratamiento con pulsos de esteroides de los episodios de rechazo subclínico (40).
El grupo de Winnipeg diseñó un estudio con dos ramas: en una de ellas, los pacientes eran
sometidos a una biopsia de protocolo al mes, dos meses, tres y seis meses, y los episodios
de rechazo subclínico se trataban con pulsos de esteroides; en la otra rama, se efectuaba
tan sólo una biopsia de protocolo a los seis meses. Los resultados de este trabajo
evidenciaron que el tratamiento consistente en pulsos de esteroides del rechazo agudo
subclínico se acompañaba de un menor grado de lesión crónica en la biopsia de protocolo
a los seis meses y de una mejor función renal a los dos años del trasplante. No se dispone
en la literatura de ningún estudio adicional para confirmar los resultados descritos.
Además, como la presencia de rechazo subclínico puede asociarse a un peor pronóstico
para el injerto, algunos centros tratan a todos los pacientes con rechazo subclínico mediante
pulsos de esteroides. Nuestro grupo piensa que la falta de nuevos estudios prospectivos,
aleatorizados, impide tomar en la actualidad una decisión clínica adecuada.
Dado que se conoce ampliamente la comorbilidad que genera el tratamiento mediante
pulsos de esteroides, otros grupos han centrado sus esfuerzos en valorar la utilidad de
los modernos inmunosupresores para prevenir la aparición del rechazo subclínico.
Rechazo subclínico bajo distintas pautas
de inmunosupresión
La introducción de ciclosporina en microemulsión, de micofenolato mofetil y de tacrolimus
ha permitido comparar los resultados con las experiencias previas. Aunque no se
dispone de estudios prospectivos y aleatorizados que ofrezcan un nivel de evidencia máximo
sobre este aspecto, los estudios a nuestra disposición sugieren que la combinación
42

DIAGNÓSTICO PRECOZ DEL RECHAZO SUBCLÍNICO MEDIANTE BIOPSIAS
DE PROTOCOLO
basada en tacrolimus y micofenolato mofetil brinda la menor tasa de prevalencia de rechazo
subclínico.
En la Tabla II se describen las aportaciones más relevantes sobre la aparición de rechazo
subclínico bajo distintos tratamientos inmunosupresores. Cabe destacar que, para
el grupo de Sídney, las distintas pautas de inmunosupresión forman parte de épocas
distintas y, por lo tanto, puede haber otros factores no controlados que contribuyan a la
disminución del rechazo subclínico (31). Para obviar este fenómeno, nuestro grupo analizó
un grupo de 49 casos tratados con ciclosporina en microemulsión, micofenolato mofetil
y esteroides, y lo comparó con 49 controles tratados con tacrolimus, micofenolato
mofetil y esteroides. La prevalencia de rechazo subclínico en este último grupo fue aproximadamente
la mitad que en el primero (42). En un estudio no controlado, el grupo de
la Clínica Mayo comunicó unos resultados prácticamente idénticos a los de nuestro centro
(43).
El grupo de Winnipeg se aparta de las conclusiones de los otros grupos al evidenciar que
la asociación de ciclosporina A en microemulsión con micofenolato mofetil permite reducir
la incidencia de rechazo agudo clínico pero no la de rechazo subclínico cuando se
compara con ciclosporina y azatioprina (41). Estos resultados son contradictorios respecto
de los del grupo de Sídney, que constata las ventajas de los esquemas de inmunosupresión
más potentes. Cabe destacar que, para este grupo, la introducción de tacrolimus
Tabla II. Prevalencia de rechazo agudo subclínico bajo distintas pautas
de inmunosupresión.
Autor Inmunosupresión n Rechazo subclínico a los tres meses
(borderline, rechazo agudo)
Nankivell (31) CsA + AZA + P 61 63% (45%, 18%)
CsA-ME + AZA + P 13 38% (23%, 15%)
CsA-ME + MMF + P 25 24% (16%, 8%)
TAC + CsA + P 21 5% (5%, 0%)
Nickerson (41)* CsA + AZA + P 36 27%
CsA-ME + MMF + P 17 31%
Moreso (42) CsA-ME + MMF + P 49 35% (26%, 9%)
TAC + MMF + P 49 14% (11%, 3%)
Gloor (43) TAC + MMF + P 114 15% (12%, 3%)
CsA = ciclosporina A; AZA = azatioprina; P = prednisona; CsA-ME = ciclosporina A
microemulsión; MMF = micofenolato mofetil; TAC = tacrolimus.
* Comunica rechazos agudos pero no valora la presencia de cambios borderline
como el rechazo subclínico.
43

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
disminuye especialmente el infiltrado inflamatorio, mientras que la introducción de micofenolato
mofetil reduce la tubulitis (31).
Existen pocas experiencias en los pacientes tratados sin anticalcineurínicos. En un reducido
número de pacientes tratados con suero antilinfocitario poli- o monoclonal, micofenolato
mofetil y prednisona, se ha observado una mayor prevalencia de rechazo subclínico
que en los pacientes tratados a base de anticalcineurínicos (35).
Aparte de los nuevos inmunosupresores, el manejo de los mismos con herramientas de
monitorización más adecuadas puede también contribuir a disminuir la tasa de rechazo
agudo subclínico. Así, se ha sugerido que la monitorización de los niveles de ciclosporina
transcurridas dos horas puede reducir la tasa de rechazo subclínico en comparación
con la monitorización habitual del nivel valle (44).
Se dispone de escasa información respecto de la utilidad de los inhibidores de mTOR
(mammalian target of rapamycin), sirolimus y everolimus, sobre la aparición de rechazo
subclínico. Un estudio prospectivo, aleatorizado, sobre la eficacia de tacrolimus y micofenolato
mofetil versus tacrolimus y sirolimus en pacientes libres de esteroides ha comparado
la aparición de rechazo subclínico a lo largo del seguimiento. En ambos grupos,
la incidencia es baja al mes, a los seis, 12 y 24 meses postrasplante. Cabe destacar que,
en el grupo de sirolimus, la incidencia de rechazo subclínico es significativamente menor
a los 12 meses (15% vs. 4%) (45).
Finalmente, es importante tener en cuenta que, si bien las pautas más potentes se asocian
a menores tasas de rechazo subclínico, pueden acompañarse de un aumento de las
complicaciones derivadas de la sobreinmunosupresión, como las nefritis inducidas por
virus (46).
Rechazo subclínico y supervivencia del injerto
Ha sido ampliamente descrita en la literatura la asociación entre la frecuencia y la severidad
de los episodios de rechazo agudo clínico y el ulterior fracaso del injerto. Este
tipo de asociación es más estrecha en los casos de rechazo vascular y rechazo tardío.
Además, estos dos eventos se relacionan también con el desarrollo de NCT. En cambio,
algunos trabajos han puesto en duda que el rechazo intersticial agudo (borderline y
grado I según los criterios de Banff) que aparece durante el primer trimestre postrasplante
se asocie con la supervivencia del injerto. Dado que el rechazo subclínico es principalmente
leve y aparece de forma predominante durante los primeros meses postrasplante,
han sido necesarios estudios prospectivos con largos periodos de seguimiento
para poder evaluar de forma adecuada la asociación entre rechazo subclínico y
supervivencia del injerto. Se revisarán, a continuación, los estudios más relevantes que
han analizado la relación entre rechazo subclínico y supervivencia del injerto.
44

DIAGNÓSTICO PRECOZ DEL RECHAZO SUBCLÍNICO MEDIANTE BIOPSIAS
DE PROTOCOLO
El grupo de Sídney ha demostrado que existe una estrecha relación entre la aparición
de rechazo subclínico, NCT y disfunción crónica del injerto (31). La presencia de rechazo
subclínico no sólo se asocia con una menor tasa de filtración glomerular a los tres
meses (62 mL/min en los pacientes sin rechazo, 58 mL/min en los pacientes que presentan
cambios borderline y 52 mL/min en aquellos con rechazo agudo), sino que la
presencia de rechazo subclínico persistente se acompaña de un deterioro funcional progresivo.
Así, los pacientes con rechazo subclínico persistente muestran una disminución
de la tasa de filtración glomerular desde 54 mL/min a los tres meses hasta 35 mL/min
a los dos años.
El estudio llevado a cabo en Seúl sobre más de 300 receptores de un trasplante renal
procedente de donante vivo y con un seguimiento superior a los diez años (29)
ha evidenciado que los pacientes con rechazo agudo subclínico en una biopsia realizada
a los 14 días presentaban una peor supervivencia que los pacientes con una
biopsia normal (60% vs. 96% a los diez años). En cambio, la supervivencia de los pacientes
que mostraban cambios borderline en la biopsia de protocolo era similar a la
de los que presentaban una biopsia normal (96% y 94% a los diez años, respectivamente)
(20).
En un estudio realizado sobre un grupo de pacientes pediátricos se constata que los
cambios de nefropatía crónica aislada al año del trasplante tienen mínimas consecuencias
funcionales a los cinco años. Por el contrario, el mismo grado de nefropatía
crónica asociado con rechazo subclínico persistente se acompaña de un deterioro funcional
progresivo, así como de una peor supervivencia del injerto (47). Estos resultados
han sido confirmados por el grupo de la Clínica Mayo que, en un estudio que contaba
con casi 300 pacientes, ha evidenciado que la presencia de rechazo subclínico en
asociación con cambios de nefropatía crónica en la biopsia de protocolo al año se relaciona
con una peor supervivencia que la presencia de nefropatía crónica aislada (48).
Nuestro grupo, en un estudio que sumaba más de 400 biopsias realizadas entre los
cuatro y los seis meses, ha mostrado también que el rechazo subclínico en asociación
con cambios de nefropatía crónica comporta un peor pronóstico a largo plazo que los
cambios de nefropatía crónica aislada (35). En cambio, el reducido número de casos
de nuestra serie (74 pacientes) que presentaba cambios de rechazo subclínico aislado
evidencia una supervivencia a largo plazo similar a la de los pacientes con una biopsia
normal (Figura 5).
Tan sólo un grupo no ha mostrado efectos deletéreos del rechazo subclínico sobre la disfunción
crónica del injerto y la supervivencia. El grupo de Oxford en un estudio sobre 115
pacientes concluye que la presencia de rechazo subclínico en la biopsia de protocolo, realizada
a los 28 días, no tiene efectos a largo plazo (28). A los seis años de seguimiento,
la supervivencia es similar en los pacientes con o sin rechazo subclínico (75% vs. 80%).
Entre sus resultados, destaca que la creatinina sérica a los seis meses es incluso inferior
45

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
Figura 5. Supervivencia del injerto a los 200 meses en nuestra serie de biopsias
de protocolo clasificadas según la presencia de rechazo subclínico y nefropatía
crónica del trasplante.
en los pacientes que sufren rechazo subclínico que en aquellos sin rechazo (129 µmol/L
vs. 163 µmol/L).
Tomados todos estos datos en conjunto, parece demostrarse que la presencia de rechazo
subclínico de grado I afecta la supervivencia del injerto a largo plazo, especialmente cuando
se asocia con cambios de nefropatía crónica del injerto. Todavía está por demostrar si
la presencia de cambios borderline sin nefropatía crónica asociada puede afectar la supervivencia
del injerto renal. No se puede olvidar que todos los estudios se han realizado
en pacientes tratados a base de anticalcineurínicos, los cuales pueden también ser
responsables de la progresión del daño crónico. Los estudios que se realicen en los próximos
años y que utilicen fármacos no nefrotóxicos nos ayudarán a contestar las preguntas
pendientes de respuesta en la actualidad.
BIBLIOGRAFÍA
1. Serón D, Moreso F, Bover J y cols. Early protocol renal allograft biopsies and graft
outcome. Kidney Int 1997; 51: 310-6.
2. Ratner MI, Tomilina NA, Alekseev LP, Fedorova ND. Subclinical crises of kidney allotransplantation
rejection. Vestn Akad Med Nauk SSSR 1973; 28: 59-64.
46

DIAGNÓSTICO PRECOZ DEL RECHAZO SUBCLÍNICO MEDIANTE BIOPSIAS
DE PROTOCOLO
3. Matas AJ, Sibley R, Mauer SM y cols. Pre-discharge, post-transplant kidney biopsies
does not predict rejection. J Surg Res 1982; 32: 269-74.
4. Burdick JF, Beschorner WE, Smith WJ y cols. Characteristics of early routine renal
allograft biopsies. Transplantation 1984; 38: 679-83.
5. Solez K, Axelsen RA, Benediktsson H y cols. International standardization of criteria
for the histologic diagnosis of renal allograft rejection: The Banff working classification
of kidney transplant pathology. Kidney Int 1993; 44: 411-22.
6. Racusen LC, Solez K, Colvin RB y cols. The Banff 97 working classification of renal
allograft pathology. Kidney Int 1999; 55: 713-23.
7. Racusen LC, Colvin RB, Solez K y cols. Antibody-mediated rejection criteria-an addition
to the Banff’s 97 classification of renal allograft pathology. Am J Transplant 2003;
3: 708-14.
8. Furness PN, Philpott CM, Chorbadjian MT y cols. Protocol biopsy of the stable renal
transplant: a multicenter study of methods and complication rates. Transplantation
2003; 76: 969-73.
9. Schwarz A, Gwinner W, Hiss M, Radermacher J, Mengel M, Haller H. Safety and adequacy
of renal transplant protocol biopsies. Am J Transplant 2005; 5: 1992-6.
10. Grimm PC, Mckenna R, Nickerson P y cols. Clinical rejection is distinguished from
subclinical rejection by increased infiltration by a population of activated macrophages.
J Am Soc Nephrol 1999; 10: 1582-9.
11. Lipman M, Shen Y, Jeffery J y cols. Immune activation gene expression in stable renal
allograft biopsies: molecular evidence for subclinical rejection. Transplantation
1998; 66: 1673-81.
12. Rowshani AT, Florquin S, Bemelman F, Kummer JA, Hack CE, Ten Berge IJM.
Hyperexpression of the granzyme B inhibitor PI-9 in human renal allografts: A potential
mechanism for stable renal function in patients with subclinical rejection. Kidney
Int 2004; 66: 1417-22.
13. Veronese FV, Noronha IL, Manfro RC, Edelweiss MI, Goldberg J, Gonçalves LF.
Prevalence and immunohistochemichal findings of subclinical kidney allograft rejection
and its association with graft outcome. Clin Transplant 2004; 18: 357-64.
14. Sarwal M, Chua MS, Kambham N y cols. Molecular heterogeneity in acute renal allograft
rejection identified by DNA microarray profiling. N Eng J Med 2003; 349: 125-38.
15. Li B, Hartono C, Ding R y cols. Non invasive diagnosis of renal allograft rejection by
measurement of messenger RNA for perforine and granzyme B in urine. N Eng J Med
2001; 344: 947-54.
16. Muthukumar T, Dadhania D, Ding R y cols. Messenger RNA for FOXP3 in the urine
of renal-allograft recipients. N Eng J Med 2005; 353: 2342-51.
17. Schaub S, Rush D, Wilkins J y cols. Proteomic-based detection of urine proteins associated
with renal allograft rejection. J Am Soc Nephrol 2004; 15: 219-27.
18. Wittke S, Haubitz M, Walden M y cols. Detection of acute tubulointerstitial rejection
by proteomic analysis of urinary samples in renal transplant rejection. Am J Transplant
5; 2479-88.
47

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
19. Marcusen N, Olsen TS, Benediktsson H y cols. Reproducibility of the Banff classification
of renal allograft pathology. Transplantation 1995; 60: 1083-9.
20. Furness PN, Taub N. International variation in the interpretation of renal transplant
biopsies: report of the CERTPAP project. Kidney Int 2001; 60: 1198-2010.
21. Colvin RB, Cohen AH, Saiontz C y cols. Evaluation of pathologic criteria for acute renal
allograft rejection: reproducibility, sensitivity, and clinical correlation. J Am Soc
Nephrol 1997; 8: 1930-41.
22. Veronese FV, Manfro RC, Roman FR y cols. Reproducibility of the Banff classification
in subclinical kidney transplant rejection. Clin transplant 2005; 19: 518-21.
23. Rush DN, Jeffery JR, Gough J. Sequential protocol biopsies in renal transplant patients.
Transplantation 1995; 59: 511-4.
24. Legendre C, Thervet E, Skiri H y cols. Histologic features of chronic allograft nephropathy
revealed by protocol biopsies in kidney transplant recipients. Transplantation
1998; 65: 1506-09.
25. Serón D, Moreso F, Ramón JM y cols. Protocol renal allografts biopsies and the design
of clinical trials aimed to prevent or treat chronic allograft nephropathy.
Transplantation 2000; 69: 1849-55.
26. Nankivell BJ, Fenton-Lee CA, Kuypers DR y cols. Effect of histological damage on
long-term kidney outcome. Transplantation 2001; 71: 515-21.
27. Serón D, Moreso F, Fulladosa X, Hueso M, Carrera M, Grinyó JM. Reliability of chronic
allograft nephropathy diagnosis in sequential protocol biopsies. Kidney Int 2002; 61: 727-
33.
28. Roberts ISD, Reddy S, Russell C y cols. Subclinical rejection and borderline changes in early
protocol biopsies specimens after renal transplantation. Transplantation 2004; 77: 1194-8.
29. Choi BS, Shin MJ, Sjin SJ y cols. Clinical significance of an early protocol biopsy in living-donor
renal transplantation: ten-year experience at a single center. Am J Transplant
2005; 5: 1354-60.
30. Ishikawa MM, Mizuiri S, Aikawa A, Ohara T, Hasegawa A. Significance of subclinical
rejection in early renal allograft biopsies for chronic allograft dysfunction. Clin transplant
2005; 19: 456-65.
31. Nankivell BJ, Borrows RJ, Fung CLS, O’Connell PJ, Allen RDM, Chapman JR. Natural
history, risk factors, and impact of subclinical rejection in kidney transplantation.
Transplantation 2004; 78: 242-9.
32. Hueso M, Navarro E, Moreso F y cols. Relationship between subclinical rejection and
genotype, renal messenger RNA, and plasma protein transforming growth factor-β1
levels. Transplantation 2006 (en prensa).
33. Tinckam K, Rush D, Hutchinson I y cols. The relative importance of cytokine gene
polymorphisms in the development of early and late acute rejection and six-month
renal allograft pathology. Transplantation 2005; 79: 836-41.
34. Mytilineos J, Laux G, Opelz G. Relevance of IL10, TGFβ1, TNFα and IL4Rα gene polymorphisms
in kidney transplantation: a collaborative study report. Am J Transplant
2004; 4: 1684-71.
48

DIAGNÓSTICO PRECOZ DEL RECHAZO SUBCLÍNICO MEDIANTE BIOPSIAS
DE PROTOCOLO
35. Moreso F, Ibernon M, Goma M y cols. Subclinical rejection associated with chronic
allograft nephropathy in protocol biopsies as a risk factor for late graft loss. Am J
Transplant 2006; 6: 747-52.
36. Moreso F, Serón D, Gil-Vernet S y cols. Donor age and delayed graft function as predictors
of renal allograft survival in rejection-free patients. Nephrol Dial Transplant
1999; 14: 930-5.
37. Nankivell BJ, Borrows RJ, Fung CLS, O’Connell PO, Allen RDM, Chapman JR. The
natural history of chronic allograft nephropathy. N Eng J Med 2003; 349: 2326-33.
38. Ibernon M, Goma M, Moreso F y cols. Subclinical rejection impairs glomerular adaptation
after renal transplantation. Kidney Int 2006 (en prensa).
39. Bonsib SM, Abul-Ezz SR, Ahmad I y cols. Acute rejection-associated tubular basement
membrane defects and chronic allograft nephropathy. Kidney Int 2000; 58: 2206-14.
40. Rush DN, Nickerson P, Gough J y cols. Beneficial effects of treatment of early subclinical
rejection: a randomized study. J Am Soc Nephrol 1998; 9: 2129-34.
41. Nickerson P, Jeffery J, Gough J y cols. Effect of increasing baseline immunosuppression
on the prevalence of subclinical rejection: a pilot study. J Am Soc Nephrol
1999; 10: 1801-5.
42. Moreso F, Serón D, Carrera M y cols. Baseline immunosuppresion is associated with
histological findings in early protocol biopsies. Transplantation 2004; 78: 1064-8.
43. Gloor JM, Cohen AJ, Lager DJ y cols. Subclinical rejection in tacrolimus-treated renal
transplant patients. Transplantation 2002; 1965-8.
44. Barama A, Sepandj F, Gough J, McKenna R. Correlation between Neoral 2 hours postdose
and histologic findings on surveillance biopsies. Transplant Proc 2004; 36 (Suppl.
2): 465S-467S.
45. Anil Kumar MS, Heifets M, Fyfe B y cols. Comparison of steroid avoidance in tacrolimus/mycophenolate
mofetil and tacrolimus/sirolimus combination in kidney transplantation
monitored by surveillance biopsies. Transplantation 2005; 80: 807-14.
46. Buehrig CK, Lager DJ, Stegall MD y cols. Influence of surveillance renal allograft biopsy
on diagnosis and prognosis of polyomavirus-associated nephropathy. Kidney Int 2003;
64: 665-73.
47. Shishido S, Asanuma H, Nakai H y cols. The impact of repeated subclinical acute rejection
on the progression of chronic allograft nephropathy. J Am Soc Nephrol 2003;
14: 1046-52.
48. Cosio FG, Grande JP, Wadei H, Larson TS, Griffin MD, Stegall MD. Predicting subsequent
decline in kidney allograft function from early surveillance biopsies. Am J
Transplant 2005; 5: 2464-72.
49

PROTOCOL BIOPSIES
AND THE DIAGNOSIS
OF HUMORAL REJECTION
M. Mengel
INTRODUCTION
The humoral theory of allograft rejection proposes that an organ transplant is rejected
by the action of antibodies, not cells. However, for the last three decades, T cells have
been in the main focus of transplant research. T cells are regarded to be the pivotal effector
and regulatory cells in allograft rejection. This conception was based on early findings
in animal models and humans that T cell depletion prevents allograft rejection.
Considerable therapeutic success was achieved by modern drugs suppressing T cells
and improving short-term allograft survival to >90% in the first year after transplantation.
Already in 1990, Halloran et al. drew attention to anti-donor antibodies as a further cause
of severe allograft dysfunction. Still today a considerable percentage of renal allografts
undergo episodes of acute rejection, frequently leading to chronic rejection and subsequent
graft lost. However, against the background of modern, very effective anti-T cell
immunosuppression an continuously increasing number of recent publications reflect a
crucial role of antibodies (humorale rejection) besides T cells (cellular rejection) in renal
allograft rejection.
This overview focuses on the morphological findings in acute and chronic humoral (antibody-mediated)
rejection in renal allograft biopsies. The mechanisms of antibody-mediated
allograft injury and graft resistance to immunological injury (i.e., accommodation)
will be described to stimulate the discussion of new therapeutical strategies in case of
humoral rejection.
51

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
IMMUNOLOGICAL MECHANISMS OF HUMORAL
REJECTION AFTER ORGAN TRANSPLANTATION
The pathogenesis of hyperacute and acute humoral rejection is based on complement
fixation by antibodies. Antibody-mediated complement activation in humoral rejection
follows the classical pathway. Complement component C1 is activated by the interaction
of IgG or IgM with C1q bound to antigen epitopes on the graft endothelium.
Conformational changes in C1q then allows cleavage of C1r, and activated C1r cleaves
and activates C1s, which is the enzyme that activates C2 and C4. C4 is cleaved by C1s
into the small fragment C4a and the large fragment C4b. After inactivation of C4b to C4d
by factor I, C4d remains covalently bound to the tissue by a thioester group at the site
where it was degraded. So far, no reports indicate that C4d has here any functional activity;
nevertheless, this makes C4d to a durable in situ marker of complement activation.
(Complement activation in transplants is reviewed in detail in) After complement
activation at the endothelium in the microcirculation of allografts (i.e., peritubular and
glomerular capillaries in renal allografts) C4d can be detected by immunohistochemistry
or immunofluorescence using anti C4d antibodies. C4d co-distributes with type IV collagen
along the capillary basement membrane and the endothelial cell surfaces. From
this localization, C4d can be cleared, after the antibody response has ended. Disappearance
of C4d has been described as early as 8 days after treatment.
C4b combines with C2a and forms C4b-C2a, which is known as the classical-pathway C3
convertase activating C3 by cleavage to C3a and C3b. When a C3b molecule is covalently
deposited in the immediate vicinity of the C3 convertase, the C5 convertase –C4b-C2a-
C3b– forms. Cleavage of C5 then releases C5a, and C5b. C5b initiates formation of the
Membrane-Attack-Complex (MAC C5b-C9) which finally causes cell lysis and death.
Furthermore, complement activation mediates acute graft injury by attracting inflammatory
cells like neutrophils and macrophages via the chemoattractants C3a and C5a and simultaneously
leads to endothelial cell activation with an increased production of pro-inflammatory
molecules (e.g., cytokines, chemokines, adhesion molecules, growth factors).
For allograft injury the activation and regulation of the steps of the complement cascade
after C4 are crucial. If activation would stop at C4 (i.e. C4d already detectable in the allograft)
without activation of C3 (i.e., no C3d in the allograft), then allograft injury might
be prevented or at least reduced.
DIAGNOSIS OF ACUTE HUMORAL REJECTION
AFTER RENAL TRANSPLANTATION
A recent up-date of the international Banff classification system for renal allograft pathology
defines the entity of acute humoral rejection (AHR) and provides the following four
diagnostic criteria:
52

PROTOCOL BIOPSIES AND THE DIAGNOSIS OF HUMORAL REJECTION
• Clinical evidence of acute allograft dysfunction.
• Histological evidence of acute allograft injury, i.e. neutrophils, macrophages, or thrombi
in capillaries (peritubular and/or glomerular capillaries), fibrinoid necrosis of arterioles,
acute tubular injury.
• Immunological evidence for the action of antibodies, i.e., C4d deposition in peritubular
capillaries, or antibodies or C3 in arteries.
• Serological evidence of donor-specific-antibodies at the time of biopsy.
At least three of the four criteria should be given to make the diagnosis of acute humoral
rejection. In this setting the biopsy has a central role since it can provide two (specific
pathology and C4d) of the four diagnostic criteria. In this setting diagnostic pioneer work
was done by Feucht and colleagues already in the early nineties. This group was the
first to describe C4d as an in situ marker of acute antibody-mediated rejection in renal
allografts showing a highly significant correlation to the presence of donor-specific
antibodies in the patient’s serum. However, it took more than a decade to finally implement
the entity of AHR, although the characteristic morphological changes of antibodymediated
allograft injury were well described by several groups, mostly from cases of
hyperacute rejection in pre-sensitized patients with high titers of preformed antibodies.
These pathological features comprise capillary congestion with neutrophils and/or
macrophages (=capillaritis), glomerulitis, microthrombi, fibrinoid arterial necrosis, and
acute tubular necrosis. Rarely all features are present simultaneously. From our experiences
the most frequent morphological findings in C4d positive biopsies are acute tubular
injury and capillaritis (Figure 1), followed by glomerulitis (Figure 2), whereas microthrombi
and fibrinoid arterial necrosis are very rare nowadays.
The up-date of the Banff classification recommends a C4d stain to be obligatory for all
renal allograft biopsies. However, the consecutively published incidence of C4d detection
in renal allograft biopsies by immunohistochemistry and immunofluorescence
varies between 21-51% in various transplant centers. Herewith the incidence is higher
in biopsies with simultaneous signs of acute cellular rejection than in those without.
A retrospective multicenter study conducted in three European transplants centers
revealed that differences in the percentage of pre-sensitized, mostly re-transplanted
patients is one explanation for a variable incidence of C4d detection. Furthermore,
up to date no internationally accepted cut-off levels to call a case C4d positive by immunohistochemistry
or immunofluorescence are established, and therefore, methodological
issues might explain for different incidences in C4d-positive cases as well. In
contrast, criteria defining the specificity of a C4d stain as a marker of AHR are exactly
defined by the Banff community for frozen as well as paraffin-embedded tissue sections:
53

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
Figure 1. Capillaritis in a case with acute humoral rejection. Peritubular capillaries
(arrow) are crowded by neutrophils and mononuclear cells, mostly
macrophages.
• Only a linear circumferential staining pattern at the endothelial site of peritubular capillaries
should be considered as a specific stain (Figure 3).
• Only peritubular capillaries of cortex and medulla in non-scared and non-necrotic areas
should be evaluated.
• Staining intensity is not relevant in paraffin sections, but intensive, diffuse staining pattern
should be present in frozen sections to be regarded as specific.
• In frozen section glomeruli are always positive and can therefore serve as internal controls,
but have to be regarded as non-specific concerning the diagnosis of acute humoral
rejection.
• Membranous glomerulonephritis is suitable as positive control for immunohistochemistry in
paraffin sections, while in allograft biopsies without acute humoral rejection glomeruli are negative
in formalin fixed specimens.
54

PROTOCOL BIOPSIES AND THE DIAGNOSIS OF HUMORAL REJECTION
Figure 2. Acute glomerulitis in humoral rejection. Numerous inflammatory
cells, mainly macrophages can be found in glomerular capillaries.
Based on results from the above mentioned multicenter study we apply the following
cut-offs for C4d in our center: 50% of ptc
with specific C4d stain = diffuse C4d positive. Focal as well a diffuse C4d detection in
ptc correlated significantly with the pathological features of AHR. However, the proof that
a focal Cd4 detection is also significantly related to the presence of donor-specific antibodies
in the patient’s serum is currently lacking but was shown for diffusely positive
biopsies in several studies.
In summary, every pathological report should comprise the result of a C4d stain and describe
any morphological features potentially being part of the spectrum of humoral allograft
injury. In the bottom line or at least in the commentary of the report it should be
stated whether both, C4d detection and AHR pathology are present and with this biopsy
an episode of acute humoral rejection is diagnosed. If just one of the two features is
present (C4d or pathology) the biopsy has to be considered as being “suspicious for”
acute humoral rejection. In any case, C4d detection should always lead to the analysis of
55

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
Figure 3. Specific, diffuse linear stain for C4d in peritubular capillaries (immunohistochemistry
with a polyclonal rabbit-anti-human C4d antiserum in
formalin-fixed and paraffin embedded tissue specimen).
the patient’s serum for the presence of donor-specific antibody titers to further confirm
or exclude the diagnosis of acute humoral rejection.
DIAGNOSIS OF CHRONIC HUMORAL REJECTION
AFTER RENAL TRANSPLANTATION
Circulating HLA-specific anti-donor antibodies are frequently described in patients with
long-term functioning renal allografts supporting the hypothesis that a considerable subset
of cases of chronic rejection might be mediated by alloantibodies. In one study following
prospectively more than 2000 renal allograft recipients, graft failure at 1 year occurred
more frequently in patients who developed allo-antibodies than in those who did
not. Furthermore, de novo antibodies that are specific for allograft HLA class I and/or class
II molecules are found to be a risk factor for the onset chronic transplant vasculopathy
with subsequent accelerated allograft deterioration. During a 5-year follow-up, donor-specific
antibodies were detected in 51% of renal allograft recipients with graft failure compared
with 2% of stable control individuals. However, antibody detection preceded chronic
allograft deterioration by months to years indicating that antibody-mediated allograft
injury can develop slowly.
56

PROTOCOL BIOPSIES AND THE DIAGNOSIS OF HUMORAL REJECTION
Figure 4. Chronic transplant glomerulopathy with thickening and duplication
of peripheral basement membranes. In capillary loops still inflammatory
cells can be appreciated as a sign of ongoing immunological damage
to the endothelial cells.
Yet (2006), specific pathological features of chronic humoral rejection are not officially
part of the current up-dated Banff classification system. However, at the two recent
Banff meetings in 2003 and 2005 an open-forum consensus-discussion was proceeded
to confirm the entity of chronic humoral rejection and to define diagnostic criteria.
In was agreed that this entity exists and that it should be part of the classification in
the future. Based on several publications, beside non-specific features of chronic allograft
damage like tubular atrophy and interstitial fibrosis, the following pathological features
appear to be specific diagnostic hallmarks of chronic antibody-mediated allograft
damage:
• Duplication of glomerular basement membrane, i.e., chronic allograft glomerulopathy
(Figure 4, Figure 5).
• Intimal myofibroblastic and foam cell proliferation in allograft arteries (Figure 6) with infiltration
of mononuclear cells and few T-lymphocytes (Figure 7), i.e., chronic allograft
vasculopathy.
57

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
Figure 5. Electron microscopy of a glomerulum showing duplication
of the basement membrane as the morphological
hallmark of chronic transplant glomerulopathy. Typically no
diffuse foot process effacement is seen, electron dense deposits
might be present in the expanded subendothelial space.
• Lamination of peritubular capillary basement membrane, i.e., chronic allograft capillaropathy
(Figure 8).
At 1 year after transplantation around 30% of renal allografts show signs of chronic
humoral rejection, i.e., one or more of the above mentioned morphological features
plus C4d deposition in peritubular capillaries. In parallel to acute humoral rejection
again both, C4d and pathology have to be present to make the diagnosis of chronic
humoral rejection from an allograft biopsy. Frequently additionally to signs of chronic
antibody mediated allograft damage morphological features of acute humoral activity
(capillaritis, glomerulitis) can be observed indicating an acute flare or ongoing antibody
58

PROTOCOL BIOPSIES AND THE DIAGNOSIS OF HUMORAL REJECTION
Figure 6. Intimal accumulation of foam cells is the hallmark of chronic
transplant vasculopathy and leads to lumen narrowing and decreased
perfusion with chronic ischemia of the allograft. Additionally, myofibroblasts
invade and proliferate in the subendothelial and intimal space.
Figure 7. As a hint to a concomitant T-cell-mediated immunological
pathogenesis of transplant vasculopathy sometimes scattered
T-lymphocytes (positive for CD3 in the immunohistochemical reaction)
can be found in the extended subendothelial space (arrows) adjacent
to the foam cells.
59

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
Figure 8. Only by electron microscopy chronic transplant capillaropathy
can be detected. At least five, better seven lamellas should
be found in the basement membrane of peritubular capillaries to
make the diagnosis.
mediated allograft injury, respectively. More than 80% of patients with chronic signs
of humoral allograft damage and specific C4d detection in peritubular capillaries have
simultaneously circulating donor-specific antibodies in their sera. In this context, a
study from the Vienna group was able to show in sequential biopsies that C4d detection
precedes the later onset of chronic transplant glomerulopathy and has herewith
a predictive value. Comparable data are available for the chronic-humoral pathogenesis
of transplant capillaropathy. These findings suggest that C4d deposition indicates
episodes of active humoral responses to the allograft and represent an early stage
of chronic irreversible allograft damage. Against this background timely detection of
C4d might allow for specific therapeutic intervention at least attenuating chronic humoral
rejection.
However, a contribution of T-cell-mediated injury to chronic rejection and the onset of
glomerulopathy, vasculopathy, or capillaropathy, beside chronic predominantly tubulointerstitial
allograft damage, might also be likely. Further studies are urgently needed
to define more precisely different entities of chronic allograft damage, which are currently
all lumped together in the non-specific term of chronic allograft nephropathy.
60

PROTOCOL BIOPSIES AND THE DIAGNOSIS OF HUMORAL REJECTION
ROLE OF PROTOCOL BIOPSIES
FOR THE DETECTION OF SUBCLINICAL
HUMORAL REJECTION
From protocol biopsies studies it is well known that subclinical cellular rejection is present
in 15-30% of all protocol biopsies. Subclinical rejection is defined as the presence of
morphological signs of cellular rejection fulfilling at least Banff grade IA (i.e., >25% interstitial
infiltrate + tubulitis with more than 4 T-cells per tubular cross section) without simultaneous
clinically overt allograft dysfunction (=significant rise in serum creatinine).
This implies that subclinical rejection can only be detected by biopsies taken from clinically
stable or non-functioning allografts, i.e., protocol biopsies.
During the recent renaissance of humoral rejection in renal transplantation, mostly due
to the widespread availability of C4d, data were lacking concerning the incidence or rather
the existence of subclinical humoral rejection. From the early days of renal transplantation
it was dreadfully known that the presence of preformed antibodies in the recipient’s
serum will rapidly lead to hyperacute rejection with overt allograft dysfunction and rapid
allograft loss. Therefore, it was questionable whether episodes of subclinical circulation
of donor-specific antibodies can be that harmless not leading to clinically overt allograft
dysfunction. Furthermore, if such episodes can be detected it can be assumed that they
rather be a signs of accommodation (see below) to the allograft and herewith represent
a positive event. Against this background our group conducted together with two other
European transplant centers, all doing protocol biopsies on a regular basis, a retrospective
multicenter study staining nearly a thousand protocol and indication biopsies for C4d.
Staning results were correlated to morphology of cellular and humoral rejection as well
as to various clinical parameters (sex, age, presence of panel reactive antibodies, immunosuppression,
induction therapy, number of prior transplants) and short term allograft
outcome. We found C4d focally in 8.5% of the indication biopsies and 2.4% of the
protocol biopsies. A diffuse C4d pattern was seen in 12.2% of indication biopsies (i.e., in
allografts with dysfunction) and subclinical in 2.0% of the protocol biopsies (p< 0.05, Table
I). These findings indicate a quite low incidence of C4d in clinically stable allografts.
Compared to other centers even the incidence in indication biopsies was lower in our series.
Furthermore, one center (Table I, center 2) showed a significantly higher incidence
of C4d positive biopsies.
Analyzing potential reasons for such center-specific variances in the incidence of C4d detection
revealed that in the center with higher numbers of C4d positive cases significant
more patients had re-transplants and in average higher levels of panel reactive antibodies
were detected prior to transplantation. This indicated that also subclinical C4d detection
is related to pre-sensitization. This was further confirmed by correlating C4d to various
clinical parameters in the whole collective revealing again prior transplants and high lev-
61

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
Table I
Tx-center n Bx C4d (%) C4d (%) C4d (%)
Type of biopsy Bx >50% PTC 25-50% PTC negative
Center 1
indication Bx 48 5 (10.4) 7 (14.6) 36 (75.0)
Center 2
indication Bx 99 15 (15.2) 8 (8.1) 76 (76.7)
Center 3
indication Bx 230 26 (11.3) 17 (7.4) 187 (81.3)
Total indication Bx 377 46 (12.2) 32 (8.5) 299 (79.3)
Center 1
protocol Bx 128 1 (0.8) 2 (1.6) 125 (97.6)
Center 2
protocol Bx 94 6 (6.4) 4 (4.3) 84 (89.3)
Center 3
protocol Bx 329 4 (1.2) 7 (2.1) 318 (96.7)
Total protocol Bx 551 11 (2.0) 13 (2.4) 527 (95.6)
Total 928 57 (6.1) 45 (4.8) 826 (89.1)
els of panel reactive antibodies as significant risk factors for the detection of C4d in protocol
as well indication biopsies.
Looking at the morphological features of humoral rejection and C4d showed for indication
and protocol biopsies a highly significant correlation with the signs of acute tubular
damage, capillaritis, and glomerulitis. Hyaline thrombi or arterial necrosis were very rarely
seen at all, in both indication and protocol biopsies. Finding no significant differences in
the morphology of C4d positive cases in indication biopsies (with allografts dysfunction)
and protocol biopsies (without concomitant dysfunction) suggests that subclinical episodes
of acute humoral rejection can be detected, although in a quite low incidence. Analyzing
a short-term follow-up of such subclinical episodes of humoral rejection revealed no significant
negative prognostic effect, but long term follow-up is still under observation.
However, no data concerning circulating donor-specific antibodies at the time point of
biopsy was available for our patients, but several groups were able to demonstrate a highly
significant correlation (70-95%) between the detection of C4d and circulating allo-specific
antibodies.
Detecting C4d in clinically stable functioning allografts supports a recently by R. B. Colvin
(Boston Massachusetts) introduced scheme of four theoretical stages of antibody-medi-
62

PROTOCOL BIOPSIES AND THE DIAGNOSIS OF HUMORAL REJECTION
ated rejection (Figure 9): according to this model, the first evidence of a humoral response
is the de novo generation of donor-specific antibodies (stage I). However, in many circumstances
and for unknown reasons, donor-reactive antibodies do not elicit acute humoral
rejection. The next stage (stage II) fit the criteria (see below) of accommodation
(=grafts resistance to antibody = C4d detectable in allograft without pathology and dysfunction)
and are therefore not necessarily predestined to lead to allograft injury. In stage
III, in addition to positive staining for C4d, there are identifiable pathological features of
humoral rejection, but allograft function is still normal (i.e., subclinical humoral rejection).
Finally, in stage IV, in addition to positive staining for C4d and morphological signs of humoral
rejection, clinically overt allograft dysfunction occurs. At this point in most cases
already chronic allograft damage with often non specific changes like tubular atrophy or
interstitial fibrosis, or even with for a humoral pathogenesis specific features like glomerulopathy
or capillaropathy can be seen.
Hypothesized stages of humoral rejection
I II III IV
Graft dysfunction
(clinical chronic rejection)
Graft injury (pathology in graft biopsy)
Transplant
C4d detectable in graft microvasculature
De novo antibodies detectable in circulation
Antibodies first
produced
Time (not to scale)
Graft loss
Figure 9. Proposed sequence of stages of antibody-mediated rejection as first suggested
by R. B. Colvin, Department of Pathology, Massachusetts General Hospital, Boston, MA.
However, detecting C4d at a very early time point after transplantation in clinically stable
allografts by protocol biopsies (taken at day seven after transplantation) was of highly predictive
marker for the onset of increasing titers of newly produced donor-specific antibodies.
No C4d deposition was seen in preimplantation biopsies in these patients. Early
detection of C4d and donor-specific antibodies was not associated with an inferior posttransplant
allograft outcome at one-year follow-up, even without specific treatment in this
study. This observation further supports the above mentioned hypothesis that early and
mild humoral responses might be part of an accommodation process.
63

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
However, as shown from animal models or in sequential allograft indication biopsies C4d
often can precede the onset of chronic humoral rejection, but the interval between the
stages can be very variable and quite long, and it is not known whether progression is
inexorable. Therefore, prospective long term follow-up is needed for cases of subclinical,
C4d positive humoral rejection to clarify whether this is an unavoidable precursor of
chronic humoral rejection or a sign of accommodation. Since current therapy for cases
of acute humoral rejection can be related to various sever side effects more data are
needed to further support already at an early time point (subclinical C4d detection without
pathology = stage II) a specific therapeutic intervention for the prevention of chronic
humoral rejection.
ACCOMMODATION AND HUMORAL REJECTION
Accommodation is defined as the resistance of an allograft to the acute pathological effects
of allograft-specific antibodies and complement activation. This phenomenon was
already observed in the late eighties in recipients of an ABO-incompatible renal allograft.
Transient depletion of the circulating antibodies that are specific for the blood group antigens
at the time of transplantation allows immediate allograft survival without hyperacute
rejection. However, in 90% of the cases a rebound of the antibodies with high titers in
patient’s serum leads to humoral rejection within the first 10 days. But the remaining
showed no correlation between the occurrence of humoral rejection and antibody titers
within the next 21 days. Even if the antibody titers return to pre-transplant levels or higher,
the allografts continue to function. Findings from mice models showed that, in the absence
of T-cell help (e.g., due to an initial conditioning regime), B-cells that are exposed
to incompatible antigens on allografts differentiate into cells that can produce non-complement-fixing
antibodies, and these B cells gradually become tolerant after a prolonged
exposure.
In HLA-mismatched allografts, alloantibodies can be found in the absence of clinical graft
dysfunction, herewith fulfilling the criteria of accommodation. However, patients with circulating
HLA-specific anti-donor antibodies have a greater likelihood of later allograft loss,
indicating that, if accommodation occurs under transplant conditions, then it is either transient
or insufficient to prevent chronic humoral rejection. Long term, complete accommodation
has not been documented for MHC molecules in humans so far, and the phenomenon
might therefore be partly determined by the nature of antigen.
Several molecular pathways should be involved in accommodation. A central role is most
probably located within the allografts’ endothelium which is thought to express cytoprotective
proteins like anti-apoptotic BCL-2, BCL-X, and haem oxygenase 1 (HO-1).
Increased expression of BCL-X was found in the endothelium of renal allografts from patients
with circulating donor-specific antibodies. Furthermore, HLA-class-I-specific antibodies
increase endothelial-cell expression of BCL-2, BCL-X, and HO-1, and increase the
64

PROTOCOL BIOPSIES AND THE DIAGNOSIS OF HUMORAL REJECTION
activity PI3K and AKT, two further cytoprotective cell signaling molecules. Complement
regulation might theoretically be involved in accommodation, too. Under physiological
conditions the endothelial surface in the renal microcirculation (in peritubular capillaries
and glomeruli) is unopposed concerning complement activation via the classical pathway.
In general, four cell-surface inhibitors of complement activation has been identified:
complement receptor 1 (CR1), decay-accelerating factor (DAF, CD55), membrane cofactor
protein (MCP, CD46), and CD59 which are usually expressed in the endothelium at
low or undetectable levels. However, DAF expression can be increased in cultured endothelial
cells in the presence of various mediators like thrombin, bFGF, TNF, IFN-gamma,
or VEGF. In vitro upregulation of DAF inhibits complement-mediated cytotoxicity of
endothelial cells and reduces complement deposition. In animal models it has been shown
that DAF is required to prevent acute antibody-mediated rejection. Alternatively, exposure
to C-reactive protein increases the expression of DAF, CSD59, and MCP by cultured
endothelial cells. Anecdotally it has been reported that increased CD59 expression by
endothelial cells is a common event in acute and chronic humoral rejection and that increased
endothelial-cell expression of DAF can be seen in chronic humoral rejection.
Although this response might function to attenuate acute antibody-mediated allograft
damage, but accommodation is obviously inadequate to prevent the onset of chronic humoral
rejection. Nevertheless, a short term studies of pig-to-baboon solid organ (heart,
lung, and kidney) xenografts showing accommodation supported the concept that accommodation
is a consequence of full inhibition of complement activation. However, further
studies are needed to understand how complement activation can therapeutically
be controlled to achieve accommodation renal transplantation.
THERAPEUTIC IMPLICATIONS
At present, no definite guidelines for treatment of acute and chronic humoral rejection
are available. Various therapy regimes are still evolving but few prospective controlled
studies are currently underway. The most common treatment strategies are based on
the quick as possible removal of the circulating antibodies using plasmapheresis in combination
with immunosuppression targeting B cells as well as T cells. The intravenous application
of immunoglobulin (IVIG) or thymoglobulin represents a frequent therapeutic
approach that effect especially B cells and antibodies or to a lesser extent also plasma
cells (thymoglobulin) as the source of antibodies. IVIG induces apoptosis in B cells and
monocytes as well as inhibiting binding of donor-reactive antibodies to target cells in 80%
of patients, although the molecular mechanism is not known in detail. IVIG and thymoglobulin
might also function, in part, by inhibition of complement activation.
New therapeutic strategies are available in form of highly specific monocloncal antibodies
selectively inhibiting B cells (rituximab). This antibody binds to CD20, a surface molecule
expressed by precursor and mature B cells, and leads to transient B-cell depletion,
with typical B-cell recovery after 6-9 months. Preliminary studies indicate that rituximab
65

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
decreases the concentration of pre-existing and post-transplantation antibodies. Recently,
results from a single center study were published indicating that multiple plasmapheresis
treatments leads to more reproducible desensitization and lower humoral rejection
rates than a single high-dose of IVIG. In this study, comprising 61 patients, three different
treatment regimens were compared: plasmapheresis + low-dose IVIG + anti-CD20-
antibody versus high-dose IVIG versus plasmapheresis + low-dose IVIG + anti-CD20-antibody
+ pre-transplant thymoglobulin. However, none of these three therapeutical regimens
was completely effective in preventing humoral rejection in renal allograft recipients
with high levels of donor specific alloantibodies.
Prospective treatment guidelines can not be drawn from these small studies yet, since
rituximab is usually combined with other drugs and therapies in these uncontrolled trials.
However, plasma cells, the physiological source of antibodies do express little or
no CD20 and are therefore resistant to rituximab mediated depletion. Plasma cells express
various cell surface molecules (CD138, CD38, alpha4-beta1-integrin, CXCR4) which
are however all not entirely plasma-cell specific. In mouse models treatment with anti
TACI immunoglobulin (=transmembrane activator and calcium-modulating cyclophilinligand
interactor), which is expressed by B cells and plasma cells as a member of TNFreceptor
family, depleted long-living plasma cells. TACI-immunoglobulin is already in
Phase I clinical trials for treatment of systemic lupus erythemathodes and B-cell lymphomas
with signs of plasma cellular maturation. This approach might lead to more specific
and more effective plasma cell depletion than currently achieved by thymoglobulins
alone.
Future strategies might be directed towards a highly specific complement blockade by
complement receptor antagonists like C5a receptor inhibitors. Antagonizing activation of
complement component C5 leads to blockade of C5a and MAC formation and herewith
should prevent complement mediated cell damage. First candidate compounds are in
preliminary stages of evaluation for clinical use.
CONCLUSIONS
Humoral rejection is beside cellular rejection a relevant pathogenetic factor for acute and
chronic immunologic allograft damage. Under modern, mainly T cell targeted immunosuppression
and as a consequent of an increasing number of patients with repetitive
transplantations alloantibodies will become a major obstacle to short- and long-term allograft
survival.
For the detailed understanding of the ambivalent potential of alloantibodies (rejection versus
accommodation) more insights into the regulation of B cells and the development
and differentiation pathways of memory B cells and plasma cells are desperately needed.
This can be the basis for developing methods to promote accommodation and to pre-
66

PROTOCOL BIOPSIES AND THE DIAGNOSIS OF HUMORAL REJECTION
vent acute humoral allograft rejection. Protocol biopsies appear to be an adequate tool
for monitoring the natural course of humoral immune responses and all prospective clinical
trials testing new drugs for the treatment of manifest humoral rejection episodes
should include protocol biopsies. Furthermore, protocol biopsies should also allow for a
timely therapeutic intervention ones intragraft signs of accommodation and humoral rejection
are adequately understood.
REFERENCES
1. Bohmig GA, Exner M, Habicht A, Schillinger M, Lang U, Kletzmayr J, et al. Capillary
C4d deposition in kidney allografts: a specific marker of alloantibody-dependent graft
injury. J Am Soc Nephrol 2002; 13 (4): 1091-9.
2. Bohmig GA, Exner M, Watschinger B, Wenter C, Wahrmann M, Osterreicher C, et
al. C4d deposits in renal allografts are associated with inferior graft outcome. Transplant
Proc 2001; 33 (1-2): 1151-2.
3. Colvin RB, Smith RN. Antibody-mediated organ-allograft rejection. Nat Rev Immunol
2005; 5 (10): 807-17.
4. Feucht HE, Felber E, Gokel MJ, Hillebrand G, Nattermann U, Brockmeyer C, et al.
Vascular deposition of complement-split products in kidney allografts with cell-mediated
rejection. Clin Exp Immunol 1991; 86 (3): 464-70.
5. Feucht HE, Schneeberger H, Hillebrand G, Burkhardt K, Weiss M, Riethmuller G, et
al. Capillary deposition of C4d complement fragment and early renal graft loss. Kidney
Int 1993; 43 (6): 1333-8.
6. Feucht HE, Lederer SR, Kluth B. Humoral alloreactivity in recipients of renal allografts
as a risk factor for the development of delayed graft function. Transplantation 1998;
65 (5): 757-8.
7. Fidler ME, Gloor JM, Lager DJ, Larson TS, Griffin MD, Textor SC, et al. Histologic findings
of antibody-mediated rejection in ABO blood-group-incompatible living-donor kidney
transplantation. Am J Transplant 2004; 4 (1): 101-7.
8. Fiebeler A, Mengel M, Merkel S, Haller H, Schwarz A. Diffuse C4d deposition and
morphology of acute humoral rejection in a stable renal allograft. Transplantation 2003;
76 (7): 1132-3.
9. Halloran PF, Wadgymar A, Ritchie S, Falk J, Solez K, Srinivasa NS. The significance of
the anti-class I antibody response. I. Clinical and pathologic features of anti-class I-
mediated rejection. Transplantation 1990; 49 (1): 85-91.
10. Halloran PF, Schlaut J, Solez K, Srinivasa NS. The significance of the anti-class I response.
II. Clinical and pathologic features of renal transplants with anti-class I-like
antibody. Transplantation 1992; 53 (3): 550-5.
11. Herzenberg AM, Gill JS, Djurdjev O, Magil AB. C4d deposition in acute rejection: an
independent long-term prognostic factor. J Am Soc Nephrol 2002; 13 (1): 234-41.
12. Ivanyi B. Transplant capillaropathy and transplant glomerulopathy: ultrastructural markers
of chronic renal allograft rejection. Nephrol Dial Transplant 2003; 18 (4): 655-60.
67

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
13. Koch CA, Khalpey ZI, Platt JL. Accommodation: preventing injury in transplantation
and disease. J Immunol 2004; 172 (9): 5143-8.
14. Lederer SR, Kluth-Pepper B, Schneeberger H, Albert E, Land W, Feucht HE. Impact
of humoral alloreactivity early after transplantation on the long-term survival of renal
allografts. Kidney Int 2001; 59 (1): 334-41.
15. Liptak P, Kemeny E, Morvay Z, Szederkenyi E, Szenohradszky P, Marofka F, et al.
Peritubular capillary damage in acute humoral rejection: an ultrastructural study on
human renal allografts. Am J Transplant 2005; 5 (12): 2870-6.
16. Magil AB, Tinckam K. Monocytes and peritubular capillary C4d deposition in acute renal
allograft rejection. Kidney Int 2003; 63 (5): 1888-93.
17. Mauiyyedi S, Pelle PD, Saidman S, Collins AB, Pascual M, Tolkoff-Rubin NE, et al.
Chronic humoral rejection: identification of antibody-mediated chronic renal allograft
rejection by C4d deposits in peritubular capillaries. J Am Soc Nephrol 2001; 12 (3):
574-82.
18. Mauiyyedi S, Crespo M, Collins AB, Schneeberger EE, Pascual MA, Saidman SL, et
al. Acute humoral rejection in kidney transplantation: II. Morphology, immunopathology,
and pathologic classification. J Am Soc Nephrol 2002; 13 (3): 779-87.
19. Mengel M, Bogers J, Bosmans J-L, Serón D, Moreso F, Carrera M, et al Incidence of
C4d Stain in Protocol Biopsies from Renal Allografts: Results from a Multicenter Trial.
Am J Transplant 2005; 5 (5): 1050-6.
20. Nickeleit V, Zeiler M, Gudat F, Thiel G, Mihatsch MJ. Detection of the complement
degradation product C4d in renal allografts: diagnostic and therapeutic implications.
J Am Soc Nephrol 2002; 13 (1): 242-51.
21. Pascual MA, Crespo M, Tolkoff-Rubin N. Progress in understanding humoral rejection
in kidney transplantation: implications for patient management. Nefrologia 2001; 21
(4): 327-31.
22. Platt JL. C4d and the fate of organ allografts. J Am Soc Nephrol 2002; 13 (9): 2417-9.
23. Racusen LC, Colvin RB, Solez K, Mihatsch MJ, Halloran PF, Campbell PM, et al.
Antibody-mediated rejection criteria - an addition to the Banff 97 classification of renal
allograft rejection. Am J Transplant 2003; 3 (6): 708-14.
24. Regele H, Bohmig GA, Habicht A, Gollowitzer D, Schillinger M, Rockenschaub S,
et al. Capillary deposition of complement split product C4d in renal allografts is associated
with basement membrane injury in peritubular and glomerular capillaries:
a contribution of humoral immunity to chronic allograft rejection. J Am Soc Nephrol
2002; 13 (9): 2371-80.
25. Regele H, Exner M, Watschinger B, Wenter C, Wahrmann M, Osterreicher C, et
al. Endothelial C4d deposition is associated with inferior kidney allograft outcome
independently of cellular rejection. Nephrol Dial Transplant 2001; 16 (10): 2058-
66.
26. Stegall MD, Gloor J, Winters JL, Moore SB, Degoey S. A Comparison of Plasmapheresis
versus High-Dose IVIG Desensitization in Renal Allograft Recipients with High Levels
of Donor Specific Alloantibody. Am J Transplant 2006; 6 (2): 346-51.
68

PROTOCOL BIOPSIES AND THE DIAGNOSIS OF HUMORAL REJECTION
27. Terasaki PI, Cai J. Humoral theory of transplantation: further evidence. Curr Opin
Immunol 2005; 17 (5): 541-5.
28. Trpkov K, Campbell P, Pazderka F, Cockfield S, Solez K, Halloran PF. Pathologic features
of acute renal allograft rejection associated with donor-specific antibody, Analysis
using the Banff grading schema. Transplantation 1996; 61 (11): 1586-92.
29. Watschinger B, Pascual M. Capillary C4d Deposition as a Marker of Humoral Immunity
in Renal Allograft Rejection. J Am Soc Nephrol 2002; 13 (9): 2420-3.
30. Zand MS, Vo T, Huggins J, Felgar R, Liesveld J, Pellegrin T, et al. Polyclonal rabbit antithymocyte
globulin triggers B-cell and plasma cell apoptosis by multiple pathways.
Transplantation 2005; 79 (11): 1507-15.
69

ADAPTACIÓN GLOMERULAR
EVALUADA MEDIANTE BIOPSIAS
DE PROTOCOLO
X. Fulladosa
INTRODUCCIÓN
El número de nefronas en los humanos es muy variable, con una media de 700.000 y un
rango comprendido entre 200.000 y 1.800.000 (1, 2). La dotación nefronal está predeterminada
genéticamente y condicionada por factores medioambientales durante el periodo prenatal.
El número de nefronas no aumenta a lo largo de la vida del individuo (3), al contrario,
diversas noxas y el mismo desarrollo y envejecimiento del riñón pueden provocar, con mayor
o menor intensidad, una disminución progresiva de unidades funcionales renales. Varios
estudios autópsicos que utilizan el método del fraccionator-disector (4), gold standard reproducible
y sin sesgo para el cálculo del número de glomérulos (nefronas), confirman esta
relación inversa entre la edad y el número de nefronas (1, 2). Estos trabajos observan, además,
que el número de glomérulos se correlaciona inversamente con el volumen de los mismos
(2, 5), probablemente como traducción del crecimiento compensador del corpúsculo
ante situaciones de escasez o reducción nefronal, con la finalidad de conseguir una superficie
de filtración suficiente. Esta relación sugiere que el volumen glomerular (Vg) puede ser
un indicador subordinado inverso del número de nefronas de un riñón (6).
El metabolismo basal condiciona el filtrado glomerular (7) y la masa renal disponible debe
asumir esta demanda. Así como la evolución ha dotado a cada especie de un número determinado
de nefronas proporcional a su metabolismo, dentro de cada especie la adaptación
a la carga metabólica de cada individuo se lleva a cabo, básicamente, mediante incrementos
del tamaño nefronal (8). En los estudios llevados a cabo en humanos, la superficie
corporal total –marcador subordinado del metabolismo basal– no se correlaciona
con el número de glomérulos y sí en cambio con el Vg medio (1, 2). El propio crecimiento
71

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
del niño durante los primeros años de vida e infancia conlleva un inherente incremento
de su superficie corporal y de su metabolismo basal, que se traduce a nivel renal en un
aumento del tamaño de sus estructuras con el predominio de hiperplasia más que de hipertrofia
celular. En el adulto pueden aparecer requerimientos mayores absolutos o relativos
de la demanda metabólica que condicionen una sobrecarga funcional por unidad nefronal.
Es decir, puede aumentar el metabolismo con el mismo número de nefronas –como
ocurre en la obesidad, el sobreaporte proteico crónico, etc.– o un mismo requerimiento
metabólico puede incidir sobre una población disminuida de nefronas –como en el caso
de la nefrectomía, de la nefropatía, etc.–. Esta sobrecarga funcional individual de cada nefrona
implica un incremento de su filtrado glomerular y un incremento de sus funciones
tubulares para mantener una adecuada homeostasis. El resultado estructural de esta hiperfiltración
en esta etapa de la vida es la hipertrofia, más que la hiperplasia, de las estructuras
glomerulares y tubulares, al menos en situaciones de pérdida moderada absoluta
o relativa de masa renal. Ante reducciones mayores, como el modelo experimental
5/6, los fenómenos de hiperplasia también adquieren un papel relevante (9). En estudios
experimentales se ha estimado que, en los individuos adultos, un 80% del incremento del
tamaño renal se debe a un aumento del tamaño de las células (hipertrofia), sobre todo a
nivel del túbulo proximal, mientras que un 15-30% se debe a la proliferación celular (hiperplasia),
a diferencia de lo que ocurre en los individuos jóvenes, en los que predomina
la hiperplasia por encima de la hipertrofia.
No se conocen con certeza los mecanismos concretos que condicionan esta situación
de hipertrofia, pero se barajan mecanismos físicos y humorales, los cuales aparecen precozmente
en la primeras horas tras la pérdida de masa renal (10). El incremento del filtrado
glomerular por nefrona precede al aumento de la reabsorción tubular proximal, que
se produce con el fin de restablecer el feedback tubuloglomerular. Esta sobrecarga de
trabajo de la nefrona se considera un estímulo determinante para el crecimiento glomerular
a través de la elevación de la tensión intracapilar glomerular e intratubular, por el aumento
del flujo renal y del fluido tubular, respectivamente (11). Además, se postula la
existencia de factores humorales circulantes (“renotropinas”) no caracterizados con un
efecto inductor o regulador sobre el crecimiento renal tras la reducción de la masa renal
funcionante. Diversos estudios a nivel experimental respaldan la existencia de dichos factores
al demostrar que animales sanos desarrollan un crecimiento renal compensador
cuando son sometidos, mediante parabiosis in vivo o in vitro, al efecto de la sangre de
animales nefrectomizados (12).
Se han implicado diversos factores de crecimiento en el control de la masa renal relacionados
con el crecimiento glomerular, tubular y de la matriz extracelular: hormona del
crecimiento, platelet derived growth factor (PDGF), insulin-like growth factor (IGF-1), transforming
growth factor (TGF), epidermal growth factor (EGF), vascular endothelial growth
factor (VEGF), interleucina 1 y 6, tumor necrosis factor (TNF-α), angiotensina II, hepatocyte
growth factor (HGF), endotelina, etc. Como ejemplos de la participación de los
72

ADAPTACIÓN GLOMERULAR EVALUADA MEDIANTE BIOPSIAS DE PROTOCOLO
mismos en los fenómenos adaptativos renales, cabe mencionar varios estudios experimentales,
los cuales han objetivado que la presencia de VEGF es necesaria para la hipertrofia
glomerular y tubular, y que su bloqueo con anticuerpos específicos suprime el
crecimiento del glomérulo y del túbulo tanto después de una nefrectomía (13) como ante
una sobrecarga proteica crónica (14). Asimismo, la utilización de drogas como la rapamicina
–con un conocido efecto sobre la reducción de la expresión de genes proinflamatorios
y profibróticos (monocyte chemotactic protein-1, VEGF, PDGF, TGF-β1, colágeno I,
etc.)–, a dosis menores de las utilizadas en modelos de trasplante renal, inhibe la hipertrofia
renal y la hipertrofia glomerular compensatorias en una situación de reducción de
la masa renal tras una nefrectomía (15).
Todas las estructuras de la nefrona aumentan de tamaño, aunque en proporción crece
más el glomérulo, el cual aumenta de volumen y, sobre todo, el túbulo proximal, que
incrementa su diámetro, volumen y longitud (11). La hipertrofia glomerular comporta
un crecimiento de sus diferentes compartimentos y de los diferentes componentes celulares.
Los capilares glomerulares aumentan más por subdivisión y ramificación que
por el aumento de su longitud (16-18), y no presentan un incremento significativo de
su diámetro, al menos en situaciones de reducción de un 50% de la masa renal (19).
En reducciones mayores, como en el modelo 5/6, sí que se ha demostrado un mayor
diámetro capilar y, con ello, una mayor tensión de su pared, por efecto de la ley de
Laplace, circunstancia que se considera potencialmente más lesiva (20).
Los capilares, por lo tanto, se ramifican y aumentan su superficie, la cual debe mantener
su estructura y función intactas. Esto implica una proliferación de las células endoteliales,
una generación de matriz de la membrana basal y una adaptación de las células
epiteliales viscerales. Las células mesangiales también crecen tanto en tamaño
como en número. Los podocitos, en cambio, tienen una escasa capacidad de proliferación
y mitosis tras el periodo de nefrogénesis. Su proceso de mitosis puede comportar
una división nuclear, pero no una división celular, por lo que su adaptación para
dar cobertura mediante sus ramificaciones a la mayor superficie de membrana basal
disponible se consigue mediante hipertrofia. Esta hipertrofia podocitaria, sin embargo,
tiene un límite no definido a partir del cual, si el crecimiento glomerular persiste, deja
parte de la membrana basal epitelial denudada, lo que favorece la aparición de sinequias
con la cápsula de Bowman e hialinosis glomerular (21). Diversas noxas pueden,
además, reducir el número de podocitos disponibles o inhibir su capacidad de adaptación
(22), menguando con ello, aún más, la posibilidad de un crecimiento glomerular
eficaz.
Está ampliamente descrito que el crecimiento glomerular es un factor determinante para
la aparición de glomerulosclerosis (23) (Tabla I) y se postula que ésta se desarrolla cuando
los glomérulos llegan a su máxima hipertrofia. No obstante, el umbral de crecimiento
del corpúsculo a partir del cual se genera hialinosis no está definido, si bien parece que
73

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
depende de la edad: es mayor en la infancia que en la edad adulta. Así, pues, en los adultos,
con una capacidad de adaptación glomerular más limitada, aparece glomerulosclerosis
ante incrementos menores del tamaño glomerular. Las observaciones aportadas
por diversos ensayos sugieren que también hay situaciones particulares, como el trasplante
renal, en las que el umbral crítico de hipertrofia glomerular es aún menor. Los injertos
renales están expuestos fácilmente a fenómenos de esclerosis glomerular cuando
la demanda metabólica exige una adaptación del corpúsculo por encima de este reducido
umbral (24).
Tabla I. Situaciones de crecimiento glomerular anómalo y esclerosis
en el humano.
Hipoxia (enfermedad cardiaca cianosante, anemia falciforme, síndrome de apnea
del sueño en obesos, etc.)
Masa renal reducida (oligomeganefronia, agenesia renal unilateral, nefrectomía
mayor del 50%, trasplante renal, etc.)
Desproporción entre masa renal y metabolismo basal (obesidad, etc.)
Diabetes mellitus
Nefropatía por reflujo
Esclerosis segmentaria y focal primaria incipiente
Los fenómenos adaptativos encargados de mantener una adecuada homeostasis tras la
pérdida de masa renal funcionante pueden volverse en contra y provocar per se daño glomerular,
desencadenando un círculo vicioso con una recurrente pérdida nefronal que se
traducirá, finalmente, en una insuficiencia renal progresiva (Figura 1). La respuesta a una
pérdida o déficit de masa renal en el humano depende de la situación basal previa, del
grado de pérdida de masa renal y de la edad en la que aparece. El grado de crecimiento
glomerular es más intenso en el individuo joven que en el adulto (16, 25). En situaciones
de agenesia renal unilateral u oligomeganefronia, el volumen glomerular puede llegar a
ser hasta 5-6 veces el volumen normal, a diferencia de otras situaciones como la nefrectomía
unilateral en la edad adulta, en las que el crecimiento glomerular llega a ser
aproximadamente dos veces el normal (26).
La cantidad de masa renal perdida condiciona el pronóstico y la lesión de la masa renal
remanente. Estudios de seguimiento a largo plazo de pacientes nefrectomizados como
donantes de riñón o por una patología en el riñón contralateral, con una reducción del
50% de la masa renal, objetivan una evolución benigna y presentan sólo una leve proteinuria
no evolutiva. Diferente situación se aprecia en los casos de una pérdida de masa
renal mayor del 50%, de una nefrectomía en los pacientes con una nefropatía de base o
de una obesidad importante en los pacientes monorrenos, en los que aumenta el riesgo
74

ADAPTACIÓN GLOMERULAR EVALUADA MEDIANTE BIOPSIAS DE PROTOCOLO
Aumento
del metabolismo
Pérdida de masa
renal funcionante
Sobrecarga
nefronal individual
Adaptación morfofuncional
Hiperfiltración
Hipertrofia
Adaptación compensada y estable:
- Escasa glomerulosclerosis
- Función renal adecuada y estable
- Proteinuria leve o ausente
- Aparición ocasional de HTA
Desequilibrio adaptativo:
- Marcada hipertrofia nefronal y glomerulosclerosis
- Progresivo daño renal crónico
- Insuficiencia renal progresiva
- Proteinuria significativa
- Frecuente HTA
- Mayor incremento del metabolismo basal
- Nuevas noxas con mayor pérdida de masa renal
Figura 1. Esquema del proceso adaptativo nefronal en situaciones de desproporción entre
el metabolismo basal y la masa renal funcionante.
de proteinuria, de daño crónico glomerular e intersticial y de insuficiencia renal progresiva
(27).
EL TRASPLANTE RENAL COMO MODELO
DE MASA RENAL REDUCIDA
Cuando se lleva a cabo un trasplante renal, se implanta habitualmente un solo riñón, lo
que representa aproximadamente la mitad de la masa renal del donante. Este hecho, por
sí solo, provoca desde el momento del trasplante una sobrecarga funcional en el injerto
que exigirá una adaptación morfofuncional del mismo para dar respuesta a la demanda
metabólica del receptor. Diversas variables y circunstancias pueden añadirse a este estado
monorreno del trasplante renal, las cuales condicionan una mayor desproporción entre
la oferta nefronal y el metabolismo del receptor, y exigen una mayor adaptación potencialmente
nociva (Tabla II).
75

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
Tabla II. Circunstancias del trasplante renal que favorecen la sobrecarga funcional
del injerto debido a una menor dotación nefronal trasplantada o a un mayor
metabolismo basal del receptor.
Donante
Receptor
Periodo peritrasplante
Mayor edad
Sexo femenino
¿Raza negra?
Hipertensión arterial
Enfermedad cardiovascular
Obesidad
Disparidad de tamaño entre donante y receptor
Tiempo de isquemia fría prolongado
Lesión de isquemia-reperfusión
Necrosis tubular aguda
Rechazo agudo
Fármacos inmunosupresores nefrotóxicos
Variables y circunstancias que se añaden
al estado monorreno
Dependientes del donante
Tal como se ha reflejado previamente, el número de nefronas en la población general es
muy variable, por lo que al provenir los donantes de esta población la masa renal trasplantable
puede ser también muy variable. Hasta el momento, no tenemos la posibilidad de estimar
de forma viable el número de nefronas en el donante. Aunque nuestro grupo ha realizado
aproximaciones a los cuatro meses del trasplante renal para determinar el número
de nefronas in vivo con una aceptable precisión (28) mediante una biopsia renal y una resonancia
magnética nuclear, esta metodología es de difícil aplicación en la dinámica habitual
del manejo del donante previa a la extracción del injerto. Sin embargo, la medida del
Vg en una biopsia renal del injerto preimplante como marcador subordinado inverso del número
de nefronas podría ser de utilidad.
Diferentes ensayos han constatado en biopsias del donante que un mayor Vg, sugestivo
de una menor masa nefronal, se asocia de forma independiente a un peor pronóstico del
injerto (29, 30). Otros factores como el sexo femenino también condicionan un menor número
de nefronas trasplantadas. En los estudios autópsicos, si bien no cuentan con una sólida
significación estadística, el número de glomérulos observados en el sexo femenino es
sistemáticamente un 10-15% menor respecto del sexo masculino (1, 2). El efecto de la raza
es controvertido y, aunque algunos autores han evidenciado un Vg medio mayor en los ri-
76

ADAPTACIÓN GLOMERULAR EVALUADA MEDIANTE BIOPSIAS DE PROTOCOLO
ñones de los individuos afroamericanos que en los de los blancos –lo que sugiere una menor
dotación nefronal (31)–, esta asunción no ha sido confirmada en los estudios autópsicos,
que utilizan el fraccionator-disector como método de medida sin sesgo (2).
Otro factor crucial es la edad de los donantes. Hay una marcada correlación inversa entre la
edad y el número de nefronas, de tal forma que se estima una pérdida de unas 6.700 unidades
por año a partir de los 18 años (2), a pesar de que este declinar probablemente no sea
lineal y se magnifique en las edades más avanzadas. Actualmente, los donantes tienden a
ser cada vez más mayores, con un mayor grado de hipertensión y una patología cardiovascular
asociada (32) (Figura 2). Esta situación, globalmente relacionada con una mayor lesión
renal subrepticia tanto glomerular como intersticial, puede influir directa y negativamente en
la dotación global de nefronas en el momento del trasplante y en la evolución del injerto.
Dependientes del periodo peritrasplante
Diversos factores pueden menguar el número de nefronas durante este periodo, como la
lesión de isquemia-reperfusión, la necrosis tubular aguda prolongada, los episodios de rechazo
agudo, las infecciones sobre el injerto y la utilización de fármacos inmunosupresores
nefrotóxicos.
Dependientes de las características del receptor
Aunque el receptor no influirá directamente en el número de nefronas implantadas, sí es
cierto que algunas características del mismo influirán en una mayor demanda metabólica,
como pueden ser la obesidad y, en particular, la desproporción entre el tamaño del donante
y el receptor (33).
La adaptación del injerto a la nueva situación, con el objetivo de ofrecer la mejor función renal
posible, se fundamenta en la hipertrofia de sus estructuras, tal como sucede en los órganos
nativos ante diferentes situaciones de pérdida nefronal. Nuestro grupo ha confirmado el
crecimiento del glomérulo tras el trasplante renal mediante el estudio de biopsias pareadas
del injerto en el momento del implante y al cuarto mes postrasplante, tiempo suficiente para
asegurar la instauración de los fenómenos de adaptación (34). A partir de este instante, el crecimiento
glomerular puede continuar, como observamos en un estudio posterior con datos
pareados de biopsias de protocolo practicadas a los cuatro meses y al año del trasplante (35).
EVALUACIÓN DEL TAMAÑO GLOMERULAR
MEDIANTE LA BIOPSIA DE PROTOCOLO
Los métodos morfométricos y estereológicos permiten la evaluación del número, el tamaño
y la distribución de las estructuras tridimensionales a partir de su proyección bidimensional
como, por ejemplo, la obtenida en diversas exploraciones de imagen (ecografías, tomografía
77

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
computarizada, resonancia magnética nuclear, etc.) o en preparaciones histológicas (4). La estereología
se define como el “conjunto de métodos matemáticos y estadísticos que relacionan
parámetros tridimensionales que definen una estructura, con medidas bidimensionales
obtenidas en secciones de la estructura estudiada” (36).
Figura 2. Datos obtenidos del Registro de Enfermos Renales de Cataluña, en el que se
muestra la evolución en el tiempo de la edad y de la causa de muerte de los donantes.
Informe estadístic del Registre de Malalts Renals de Catalunya 2003. Organització Catalana
de Trasplantaments (OCATT). Generalitat de Catalunya - Servei Català de la Salut. 2005.
78

ADAPTACIÓN GLOMERULAR EVALUADA MEDIANTE BIOPSIAS DE PROTOCOLO
Se han aplicado diversas técnicas para estimar el tamaño del glomérulo –una estructura
espacial tridimensional dentro del parénquima renal– a partir del análisis de sus secciones
obtenidas en el material histológico. De la sección del glomérulo se pueden obtener medidas
uni- o bidimensionales, como distancias, radios, diámetros y áreas. El área se mide sobre
la proyección histológica mediante una técnica de recuento de puntos (point-counting),
tal como se esquematiza en la Figura 3, o bien mediante una tableta digitalizada y un software
específico de análisis de imagen. A partir de las áreas de las diversas secciones se
puede calcular el Vg (37, 38): el método gold standard de medida del Vg es el método de
Cavalieri, el cual afirma que el volumen de un objeto es igual a la suma de las áreas de sus
secciones (Ai) multiplicado por la media del grosor de las secciones (T) (Figura 4).
Figura 3. Esquema del método de recuento de puntos (point-counting) para medir el
área glomerular. Partimos de una cuadrícula en la que se definen unos puntos por intersección
de las líneas, con una distancia entre puntos conocida (d). La cuadrícula se
superpone a la imagen histológica proyectada, de la que se debe conocer el aumento
real de la proyección. Se cuentan los puntos (P) que quedan englobados dentro del área
que se ha de contar, en este caso el glomérulo delimitado por la cápsula de Bowman.
Como cada punto lleva implícita un área conocida (d 2 ), el área real de cada glomérulo
será el número de puntos contados multiplicado por el área implícita en cada punto, corregido
por el aumento de la proyección de la imagen.
79

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
Figura 4. Esquema del método de Cavalieri.
El método de Cavalieri aplicado al glomérulo
implica obtener y medir el área en todas
las secciones del mismo y tener finamente
controlado el grosor del corte, lo
que condiciona un importante consumo de
tiempo y la necesidad de conseguir material
histológico suficiente, que no siempre
es posible en las biopsias renales con aguja.
Por contrapartida, es un método preciso
que permite calcular sin sesgos el volumen
individual de cada glomérulo y, así,
obtener también información del coeficiente
de variación del Vg.
Otro sistema que también da información del Vg individual es el método del área máxima
(MPA: maximal profile area o maximal planar area), el cual es algo más sencillo y
consume menos tiempo. Se basa en el estudio de cortes secuenciales del glomérulo para
identificar el corte con el mayor perfil, definido como aquel que posee al menos dos perfiles
menores antes y después. A partir del área de este perfil se obtiene su radio –se
asume que es un círculo– y, a partir del radio, se calcula el volumen –se asume que el
glomérulo es una esfera– (Figura 5). Estas asunciones pueden comportar un cierto sesgo
en el cálculo del Vg, ya que habitualmente el glomérulo adopta una forma elíptica e
irregular con las técnicas de fijación habituales. Aun así, la correlación entre los dos métodos
anteriores en los glomérulos humanos es buena según diversos estudios comparativos
(38).
La búsqueda de sistemas que requiriesen un menor consumo de tiempo para la utilización
en la práctica clínica motivó la aplicación de diversas metodologías más simples. Uno
de estos métodos, el método de dos perfiles, consiste en la utilización de sólo dos perfiles
paralelos aleatorios del glomérulo, siempre que se conozca la distancia entre los mismos
(39). Se calcula el volumen a partir de la utilización de principios geométricos y transformaciones
matemáticas, con una aceptable correlación con el método de Cavalieri, y
es sobre todo aplicable cuando se dispone de muestras de tejido limitadas.
Otro tipo de métodos estima el Vg a partir del área glomerular media calculada a partir de los
perfiles glomerulares de una sola sección, sin que se requieran secciones consecutivas de
la muestra. De éstos, el método de Weibel y Gómez es el más utilizado (36), el cual obtiene
el Vg medio aplicando una ecuación a partir del área glomerular media; se asume que el
glomérulo es una esfera y que el coeficiente de distribución de los tamaños glomerulares es
menor de un 10% (Figura 6), asunciones que pueden comportar sesgos en la medida. Además,
no permite alcanzar resultados individuales de los glomérulos y precisa un número mínimo
de perfiles para ser representativo, que se estima en alrededor de 10-15 perfiles. Por con-
80

ADAPTACIÓN GLOMERULAR EVALUADA MEDIANTE BIOPSIAS DE PROTOCOLO
Figura 5. Esquema del método del área máxima (MPA).
trapartida, es más sencillo, consume mucho menos tiempo y se puede utilizar sobre una
sola sección de la biopsia, lo que resulta útil cuando trabajamos con un escaso material histológico.
A pesar de sus limitaciones y cuando no es factible el empleo de métodos de Vg individual,
el método de Weibel y Gómez ofrece una estimación adecuada del Vg, tal como se
observa en un reciente estudio sobre 20 pacientes trasplantados renales estables, en los
que se comprueba en biopsias de protocolo a los cuatro meses del trasplante una buena
correlación y concordancia entre el Vg calculado por el método de Weibel y Gómez y el
calculado por el método MPA (datos no publicados y que se reproducen en la Figura 7).
A partir del volumen glomerular en la biopsia de protocolo se puede estimar el número
de glomérulos (Ng) in vivo en el trasplante renal. El método del fraccionator-disector,
como método gold standard reproducible y sin sesgos para el cálculo del Ng en un riñón,
precisa la obtención de toda la pieza histológica, por lo que no es aplicable en estudios
clínicos. Nuestro grupo aplicó una metodología validada previamente en perros (40) para
determinar el Ng, la cual combinaba la biopsia renal de protocolo a los cuatro meses del
trasplante con una resonancia magnética nuclear del injerto. Este método se basa en la
premisa de que el Ng total de un riñón se puede obtener de la división del volumen absoluto
que ocupan los glomérulos en el riñón –que se obtiene de la multiplicación de la
81

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
Figura 6. Esquema del método de Weibel y Gómez.
fracción del volumen que ocupan los glomérulos en el cortex renal (Vvglom/cortex) por el volumen
del cortex (Vcortex)– partido por el volumen glomerular medio (Vg).
Vvglom/cortex • Vcortex
Ng = –––––––––––––––––––
Vg
Vvglom/cortex y Vg se pueden estimar a partir de una biopsia renal y Vcortex de la resonancia magnética
nuclear del injerto. Para calcular Vvglom/cortex se puede utilizar el método de recuento
de puntos sobre las imágenes histológicas, para obtener Vg se aplica el método de Weibel
y Gómez antes referenciado, y para calcular Vcortex se aplica el método de Cavalieri a las
imágenes secuenciales de las secciones del injerto obtenidas con la resonancia magné-
82

ADAPTACIÓN GLOMERULAR EVALUADA MEDIANTE BIOPSIAS DE PROTOCOLO
Figura 7. Correlación (izquierda) y test de concordancia de Bland-Altman (derecha) entre
el volumen glomerular estimado por el método de Weibel y Gómez (Vg-W&G) y el
método del área máxima (Vg-MPA).
tica nuclear. Pueden aparecer diversos sesgos que condicionan las limitaciones de la técnica,
los sesgos propios de la estimación del Vg por el método de Weibel y Gómez, y el
sesgo ocasionado por la retracción del tejido tras el procesado histológico de la biopsia.
Observamos que el número de glomérulos se correlacionaba con el filtrado glomerular,
lo que sugería que para obtener una adecuada función renal tras el trasplante era necesaria
una adecuada dotación nefronal. Además, así como otros estudios han referido, la
edad del donante se correlacionaba inversamente con el número de glomérulos y directamente
con el volumen glomerular. A pesar de la imposibilidad del cálculo de la precisión
del método in vivo, constatamos que el número de glomérulos en los pacientes trasplantados
renales estables era un determinante crucial de la función renal del injerto y,
consecuentemente, un determinante de su evolución (28).
Las biopsias renales de protocolo realizadas en el trasplante renal preimplante a los cuatro
meses y al año de seguimiento permiten estudiar la variación e influencia del tamaño glomerular,
estimado mediante el método de Weibel y Gómez, tal como nuestro grupo ha comunicado
recientemente. En un primer estudio (34) que comparaba biopsias pareadas preimplante
y a los cuatro meses del trasplante, comprobamos que tras el trasplante renal los
glomérulos crecían un 24%, fruto de su adaptación al receptor. El Vg medio a los cuatro
meses se correlacionaba con la función del injerto en el momento de la biopsia, lo que sugería
que esta adaptación glomerular era necesaria tras el trasplante para conseguir una
adecuada función renal. Observamos, además, que el crecimiento glomerular era menor
en aquellos pacientes que habían recibido riñones con mayores volúmenes glomerulares
83

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
basales y en aquellos que habían desarrollado lesiones de nefropatía crónica del injerto a
los cuatro meses. Cuanto mayor es el tamaño de los glomérulos del donante, es decir, cuanto
más han tenido que crecer para adaptarse a las características y circunstancias del donante
–ya sea por una menor dotación congénita de glomérulos, ya sea por la pérdida de
los mismos a lo largo de su vida–, poseen una menor capacidad de adaptación tras el trasplante
y, quizás, tienen una mayor probabilidad de glomerulosclerosis cuando están sometidos
a una constante demanda de adaptación. Por otra parte, la relación inversa con las lesiones
de nefropatía crónica evidencia que los factores incidentes sobre el injerto postrasplante
también pueden influir en la adaptación glomerular.
El crecimiento glomerular se mantiene a lo largo del año postrasplante, como hemos observado
en un reciente estudio que analizaba biopsias de protocolo pareadas realizadas a
los cuatro meses y al año del trasplante (35) (Figura 8). Nuevamente detectamos que crecían
más aquellos glomérulos que mostraban en la primera biopsia un volumen menor, lo
que refuerza la teoría de que el crecimiento glomerular adaptativo se manifiesta en aque-
A (4 meses)
A (1 año)
B (4 meses)
B (1 año)
Figura 8. Ejemplos de biopsias de protocolo seriadas a los cuatro meses y al año, que
muestran el crecimiento del glomérulo en el caso A y no en el caso B. Cabe destacar
que el tamaño del glomérulo a los cuatro meses en la biopsia B es mayor que en la biopsia
A (tinción hematoxilina-eosina; x 200).
84

ADAPTACIÓN GLOMERULAR EVALUADA MEDIANTE BIOPSIAS DE PROTOCOLO
llos que aún no han agotado su capacidad para hacerlo. Además, esta capacidad de crecimiento-adaptación
se mantiene sólo en los injertos sin lesiones crónicas y está abolida en
los pacientes cuya lesión crónica progresa en las biopsias seriadas y en aquellos en los que
persisten lesiones inflamatorias sugestivas de rechazo subclínico. La estructura renal, pues,
debe estar preservada para una adecuada adaptación glomerular, y las lesiones inflamatorias
persistentes, además de relacionarse con una mayor lesión crónica, también pueden
condicionar una menor adaptación glomerular.
Cuando analizamos la evolución de los injertos tras el estudio morfométrico de los mismos,
observamos que, si bien la adaptación glomerular era necesaria para conseguir una
buena función renal, este crecimiento podía pasar factura a largo plazo y condicionar un
peor pronóstico. Un mayor Vg a los cuatro meses del trasplante, evaluado en biopsias de
protocolo, es un factor predictivo independiente, junto con una peor función renal y mayores
lesiones histológicas crónicas, de una menor supervivencia del injerto (41). Cuando
lo analizamos en conjunto, apreciamos que los injertos con mayor supervivencia a largo
plazo eran aquellos con un menor Vg y una mejor función renal en el momento de la biopsia,
reflejo de una mayor dotación nefronal en el momento del trasplante y de un requerimiento
menor de adaptación para asumir la demanda metabólica del receptor. Este grupo
se caracterizaba por tener los donantes más jóvenes y por haber sufrido un menor retraso
de la función del injerto. De forma diametralmente opuesta, encontramos al grupo
de pacientes con un mayor Vg y una peor función renal, los cuales tenían una supervivencia
a los 15 años de sólo el 45%. Los donantes eran significativamente mayores y los
receptores presentaban un mayor índice de masa corporal; sugestivo todo ello de una
gran desproporción entre demanda y oferta, y de una ineficaz adaptación, que comportaba
en consecuencia el desarrollo de daño renal crónico. Hubiera sido interesante poder
analizar el Vg en los donantes para saber si éstos ya partían de Vg mayores.
Los grupos con glomérulos grandes y una buena función renal, o bien con glomérulos
pequeños y una mala función renal, tenían supervivencias intermedias entre el 73% y el
78% (Figura 9). Los pacientes con mayores niveles de ciclosporina A expresaban un menor
Vg, lo que sugería un bloqueo del crecimiento glomerular ante una mayor exposición
a una droga vasoconstrictora como ésta, resultados que están de acuerdo con observaciones
previas en relación con las glomerulopatías primarias en niños (42).
Con el estudio reglado de las biopsias de protocolo se ha determinado que:
• Los glomérulos crecen al menos hasta el año del trasplante renal, como efecto de la
adaptación de la limitada masa renal trasplantada al metabolismo del huésped.
• Este crecimiento es necesario para obtener una adecuada función renal y una adecuada
homeostasis tras el trasplante.
85

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
Figura 9. Esquema de los resultados de supervivencia obtenidos en el estudio de Azevedo
et al., que agrupan a los pacientes según el tamaño glomerular y la función renal en el
momento de la biopsia a los cuatro meses del trasplante.
• Puede verse limitado por la presencia de lesiones inflamatorias persistentes o de lesiones
de nefropatía crónica, así como de niveles elevados de fármacos anticalcineurínicos.
• El grado de adaptación que hayan tenido que sufrir los glomérulos en el seno del donante
condicionará una menor capacidad de adaptación de los mismos tras el trasplante.
• El requerimiento de una excesiva adaptación del glomérulo para satisfacer la demanda
del receptor –por una dotación nefronal insuficiente o por un excesivo metabolismo basal
del huésped– será, sin embargo, contraproducente y condicionará una menor supervivencia
del injerto a largo plazo.
BIBLIOGRAFÍA
1. Nyengaard JR, Bendtsen TF. Glomerular number and size in relation to age, kidney
weight, and body surface in normal man. Anatomical Record 1992; 232 (2): 194-201.
2. Hoy WE, Douglas-Denton RN, Hughson MD, Cass A, Johnson K, Bertram JF. A stereological
study of glomerular number and volume: preliminary findings in a multiracial
study of kidneys at autopsy. Kidney Int 2003; (S83): S31-S37.
86

ADAPTACIÓN GLOMERULAR EVALUADA MEDIANTE BIOPSIAS DE PROTOCOLO
3. Moritz KM, Wintour EM. Functional development of the meso- and metanephros.
Pediatric Nephrology 1999; 13 (2): 171-8.
4. Nyengaard JR. Stereologic methods and their application in kidney research [comment].
[Review] [208 refs]. J Am Soc Nephrol 1999; 10 (5): 1100-23.
5. Hughson M, Farris III AB, Douglas-Denton R, Hoy WE, Bertram JF. Glomerular number
and size in autopsy kidneys: The relationship to birth weight. Kidney Int 2003; 63 (6):
2113-22.
6. Hoy WE, Hughson MD, Bertram JF, Douglas-Denton R, Amann K. Nephron Number,
Hypertension, Renal Disease, and Renal Failure. J Am Soc Nephrol 2005; 16 (9): 2557-64.
7. Singer MA. Of mice and men and elephants: metabolic rate sets glomerular filtration
rate. Am J Kidney Dis 2001; 37 (1): 164-78.
8. Nyengaard JR, Bendtsen TF. A practical method to count the number of glomeruli in
the kidney as exemplified in various animal species. Acta Stereol 1990; 9 (2): 243-58.
9. Terzi F, Ticozzi C, Burtin M, Motel V, Beaufils H, Laouari D, et al. Subtotal but not unilateral
nephrectomy induces hyperplasia and protooncogene expression. Am J Physiol
Renal Physiol 1995; 268 (5): F793-F801.
10. Ikeda M, Suzuki M, Miyazaki K, Takeuchi Y, Yamaguchi Y, Sakai S, et al. Glomerular
growth in the remnant kidney after a contralateral nephrectomy. Nephron 1993; 65
(1): 95-9.
11. Fine L. The biology of renal hypertrophy. [Review] [242 refs]. Kidney Int 1986; 29 (3):
619-34.
12. Austin H, Goldin H, Preuss HG. Humoral regulation of renal growth. Evidence for and
against the presence of a circulating renotropic factor. Nephron 1981; 27 (4-5): 163-70.
13. Flyvbjerg A, Schrijvers BF, de Vriese AS, Tilton RG, Rasch R. Compensatory glomerular
growth after unilateral nephrectomy is VEGF dependent. American Journal of
Physiology - Endocrinology & Metabolism 2002; 283 (2): E362-E366.
14. Schrijvers BF, Rasch R, Tilton RG, Flyvbjerg A. High protein-induced glomerular hypertrophy
is vascular endothelial growth factor-dependent. Kidney Int 2002; 61 (5): 1600-04.
15. Bonegio RG, Fuhro R, Wang Z, Valeri CR, Andry C, Salant DJ, et al. Rapamycin ameliorates
proteinuria-associated tubulointerstitial inflammation and fibrosis in experimental
membranous nephropathy. J Am Soc Nephrol 2005; 16 (7): 2063-72.
16. Nyengaard JR. Number and dimensions of rat glomerular capillaries in normal development
and after nephrectomy. Kidney Int 1993; 43 (5): 1049-57.
17. Marcussen N, Nyengaard JR, Christensen S. Compensatory growth of glomeruli is
accomplished by an increased number of glomerular capillaries. [Comment]. Lab Invest
1994; 70 (6): 868-74.
18. Akaoka K, White RH, Raafat F. Human glomerular growth during childhood: a morphometric
study. Journal of Pathology 1994; 173 (3): 261-8.
19. Schwartz MM, Churchill M, Bidani A, Churchill PC. Reversible compensatory hypertrophy
in rat kidneys: morphometric characterization. Kidney Int 1993; 43 (3): 610-4.
20. Daniels BS, Hostetter TH. Adverse effects of growth in the glomerular microcirculation.
Am J Physiol Renal Physiol 1990; 258 (5): F1409-F1416.
87

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
21. Kriz W. Progressive renal failure-inability of podocytes to replicate and the consequences
for development of glomerulosclerosis. Nephrol Dial Transplant 1996; 11:
1738-42.
22. Petermann AT, Pippin J, Durvasula R, Pichler R, Hiromura K, Monkawa T, et al.
Mechanical stretch induces podocyte hypertrophy in vitro. Kidney Int 2005; 67 (1):
157-66.
23. Fogo A. Glomerular hypertension, abnormal glomerular growth, and progression of
renal diseases. [Review] [46 refs]. Kidney International - Supplement 2000; 75: S15-
S21.
24. Bhathena DB. Glomerular size and the association of focal glomerulosclerosis in longsurviving
human renal allografts. J Am Soc Nephrol 1993; 4 (6): 1316-26.
25. Hayslett JP. Effect of age on compensatory renal growth. Kidney Int 1983; 23 (4): 599-602.
26. Bhathena DB, Julian BA, McMorrow RG, Baehler RW. Focal sclerosis of hypertrophied
glomeruli in solitary functioning kidneys of humans. Am J Kidney Dis 1985; 5
(5): 226-32.
27. Praga M, Hernández E, Herrero JC, Morales E, Revilla Y, Díaz-González R, et al. Influence
of obesity on the appearance of proteinuria and renal insufficiency after unilateral
nephrectomy. Kidney Int 2000; 58 (5): 2111-18.
28. Fulladosa X, Moreso F, Narváez JA, Grinyó JM, Serón D. Estimation of total glomerular
number in stable renal transplants. J Am Soc Nephrol 2003; 14 (10): 2662-8.
29. Abdi R, Slakey D, Kittur D, Burdick J, Racusen L. Baseline glomerular size as a predictor
of function in human renal transplantation. Transplantation 1998; 66 (3): 329-33.
30. Lopes JA, Moreso F, Riera L, Carrera M, Ibernon M, Fulladosa X, et al. Evaluation of
pre-implantation kidney biopsies: comparison of Banff criteria to a morphometric approach.
Kidney Int 2005; 67 (4): 1595-600.
31. Abdi R, Slakey D, Kittur D, Racusen LC. Heterogeneity of glomerular size in normal
donor kidneys: impact of race. Am J Kidney Dis 1998; 32 (1): 43-6.
32. Informe estadístic del Registre de Malalts Renals de Catalunya 2003. 2005. Organització
Catalana de Trasplantaments (OCATT). Generalitat de Catalunya - Servei Català de la
Salut. 26-9-2005. Ref Type: Report.
33. Moreso F, Serón D, Anunciada AI, Hueso M, Ramón JM, Fulladosa X, et al. Recipient
body surface area as a predictor of posttransplant renal allograft evolution.
Transplantation 1998; 65 (5): 671-6.
34. Alperovich G, Maldonado R, Moreso F, Fulladosa X, Grinyó JM, Serón D. Glomerular
enlargement assessed by paired donor and early protocol renal allograft biopsies. Am
J Transplant 2004; 4 (4): 650-4.
35. Ibernon M, Goma M, Moreso F, Fulladosa X, Hueso M, Cruzado JM, et al. Subclinical
rejection impairs glomerular adaptation after renal transplantation. Kidney Int 2006.
36. Weibel ER. Stereological Methods: Practical Methods for Biological Morphometry.
London: Academic Press 1979.
37. Lane PH, Steffes MW, Mauer SM. Estimation of glomerular volume: a comparison of
four methods. Kidney Int 1992; 41 (4): 1085-9.
88

ADAPTACIÓN GLOMERULAR EVALUADA MEDIANTE BIOPSIAS DE PROTOCOLO
38. Pagtalunan ME, Drachman JA, Meyer TW. Methods for estimating the volume of individual
glomeruli. Kidney Int 2000; 57 (6): 2644-9.
39. Najafian B, Basgen JM, Mauer M. Estimating mean glomerular volume using two arbitrary
parallel sections. J Am Soc Nephrol 2002; 13 (11): 2697-05.
40. Basgen JM, Steffes MW, Stillman AE, Mauer SM. Estimating glomerular number in
situ using magnetic resonance imaging and biopsy. Kidney Int 1994; 45 (6): 1668-72.
41. Azevedo F, Alperovich G, Moreso F, Ibernon M, Goma M, Fulladosa X, et al. Glomerular
size in early protocol biopsies is associated with graft outcome. Am J Transplant 2005;
5 (12): 2877-2.
42. Jeong HJ, Kim JH, Kim PK, Choi IJ. Glomerular growth under cyclosporine treatment
in childhood nephrotic syndrome. Clin Nephrol 2001; 55 (4): 289-96.
89

BIOPSIA DE PROTOCOLO:
ASPECTOS TÉCNICOS
Y SEGURIDAD
R. Palomar
INTRODUCCIÓN
Las biopsias renales (de riñones propios o trasplantados) se han realizado clásicamente
por indicación clínica. La biopsia de protocolo en el trasplante renal es motivo de controversia
desde hace años. El riesgo de la realización de biopsias ha disminuido en los
últimos años con el uso de agujas más pequeñas y con la utilización del ecógrafo de forma
rutinaria. Además, el injerto renal se encuentra más superficial y asequible que los
riñones propios y esto hace que el procedimiento sea más sencillo. La biopsia de protocolo
ya forma parte de la práctica habitual de algunos centros trasplantadores, aunque
en otros muchos todavía no se ha incorporado a la rutina, a causa de una serie de condicionantes,
de tipo ético y debidos a las complicaciones teóricas derivadas del procedimiento.
En este capítulo se resumirán cuáles son los aspectos técnicos y de seguridad en relación
con la realización de biopsias de protocolo en el injerto renal.
TÉCNICA
Es importante que la muestra sea de la corteza renal y se recomienda, para optimizar el
rendimiento de la biopsia, obtener al menos dos cilindros si se pueden extraer de dos
puntos distintos, puesto que hay lesiones que tienen una distribución focal en el riñón,
como son las infecciones y el rechazo. En principio, no hay consideraciones específicas
distintas en cuanto a la técnica per se para los trasplantes o los riñones propios, por lo
que cada centro debería realizarlas según su práctica habitual.
91

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
INDICACIONES
¿Por qué se deben realizar biopsias de protocolo?
Clásicamente, las biopsias de trasplante se efectúan cuando hay un deterioro de la función
renal, a veces asociado a hipertensión y proteinuria. Es en esta situación cuando se
hace el diagnóstico clínico, que se confirma histológicamente y, por lo general, en ese
momento el injerto está tan dañado que las lesiones son con frecuencia irreversibles.
Algunos estudios sugieren que la presencia de rechazo agudo (RA) y de nefropatía crónica
del injerto (NCI) podría cursar de forma subclínica sin producir disfunción del injerto.
Si bien la creatinina sérica es el marcador de la función renal usado con mayor frecuencia,
parece ser que las variaciones en sangre no se correlacionan de forma total con la
disminución de la función renal, motivo por el cual no se considera un marcador adecuado
de disminución del filtrado glomerular ni en los riñones propios ni en los trasplantados.
Se han encontrado en biopsias de protocolo de injertos renales lesiones histológicas
compatibles con rechazo subclínico, vascular o humoral con mínimos cambios en la
creatinina sérica.
Por esto, las biopsias de protocolo permiten detectar de forma precoz las alteraciones
del injerto antes de que tengan repercusión clínica y de que se encuentren en un estadio
más avanzado, de manera que el tratamiento, o bien no esté indicado, o bien las lesiones
no sean reversibles.
¿Cuándo se debería realizar una biopsia de protocolo?
Existen determinadas situaciones, bien
definidas, en las que estaría justificado
realizar biopsias de protocolo tal como
se describe en la Tabla I, siempre que se
cumplan unos requisitos (Tabla II). Además,
se han publicado unas recomendaciones
en cuanto a la necesidad de la biopsia
según el tiempo de evolución del trasplante
y las características del receptor
(Tabla III).
Tabla I. Indicaciones de las biopsias
de protocolo.
Rechazo agudo subclínico
Rechazo crónico
Donantes marginales
Necrosis tubular aguda
Toxicidad por anticalcineurínicos
Infección por el virus BK
VENTAJAS E INCONVENIENTES
Hay varios estudios que avalan la seguridad de las biopsias de protocolo. El grupo de
Furness analizó las complicaciones derivadas de 3.613 biopsias de protocolo llevadas
a cabo en injertos estables sin signos inflamatorios ni deterioro agudo de la función
92

BIOPSIA DE PROTOCOLO: ASPECTOS TÉCNICOS Y SEGURIDAD
Tabla II. Prerrequisitos necesarios para la realización de las biopsias de protocolo.
1. Que la biopsia realizada con aguja suponga un riesgo bajo de pérdida del injerto
o de morbilidad.
2. Que los resultados histológicos obtenidos en la biopsia nos permitan establecer
un diagnóstico.
3. Que la incidencia de la patología objeto de estudio sea suficiente
como para justificar el procedimiento.
4. Que exista un tratamiento eficaz para esa patología.
5. Que el tratamiento suponga un beneficio para el paciente.
6. Que el riesgo-beneficio de la técnica esté justificado.
Tabla III. Recomendaciones para las biopsias de protocolo.
Recomendación
Tipo de receptor
Obligatorio
Postimplantación
Todos
Semanal
Todos los que tengan NTA
En los primeros tres meses Hiperinmunizados/pacientes de riesgo (excepto RA)
En el diagnóstico
Cualquier receptor con marcadores urinarios
o plasmáticos de infección por PV
Muy recomendable
6-12 meses Tratamiento con ICN o antecedentes de toxicidad
6-12 meses Antecedentes de NTA o RA
Recomendado para estudio (ensayos)
1-3 meses Todos
6-12 meses Todos
NTA = necrosis tubular aguda; RA = rechazo agudo; PV = Polyoma virus;
ICN = inhibidores de la calcineurina.
renal. De todos ellos, sólo un injerto se perdió como consecuencia de complicaciones
derivadas de la biopsia, tres pacientes sufrieron hemorragia y dos presentaron una peritonitis.
Puesto que el riesgo de presentar complicaciones es bajo, se considera éticamente
justificada la realización de las biopsias de protocolo no sólo en los pacientes
incluidos en ensayos clínicos, sino también como práctica habitual. De manera similar,
otro trabajo en el que se analizaban las complicaciones derivadas de 277 biopsias
renales encontró solamente un 0,4% de hemorragias importantes. Asimismo, un
estudio que contaba con 1.171 biopsias demostró una disminución de la incidencia de
93

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
las complicaciones mayores del 1% al 0,7% gracias al cambio de agujas de 18-gauges
a 16-gauges que se utilizaron para su realización.
Ventajas
Diagnóstico del rechazo agudo subclínico
El primer grupo que definió el RA subclínico descrito según la clasificación de Banff fue
el de Rush y cols., quienes encontraron una frecuencia del 33% en los injertos normofuncionantes
en las biopsias de protocolo efectuadas en los tres primeros meses del trasplante.
Otros grupos han confirmado posteriormente estos hallazgos tanto en los adultos
como en los niños. La prevalencia del RA subclínico es variable según las series y depende
también del momento en que se realice la biopsia en el periodo postrasplante
(Tabla IV). El estudio que abarca un mayor número de biopsias (>300) encuentra una prevalencia
de un 15%; el 75% de ellos son RA tipo IA, y un 24% tipo IB, siendo la afectación
vascular (tipos II o III) muy poco frecuente. Algunos trabajos publican una prevalencia
de RA subclínico del 25-30% en los pacientes tratados con CsA, mientras que en otros
en los que el tratamiento incluyó tacrolimus ésta fue del 18%. Existen pocos datos en
cuanto a los pacientes tratados con sirolimus (SRL); en un ensayo en el que se comparaba
el uso de SRL + FK a dosis bajas frente a SRL + MMF (sin ICN), se encontró RA subclínico
en el 53% de las biopsias del primer grupo frente a un 15% en el grupo que no
recibió anticalcineurínicos.
Parece ser que la prevalencia del rechazo subclínico disminuye en las biopsias que se
realizan de forma más tardía –tal como se muestra en la Tabla IV–, de tal forma que
después del primer año del trasplante se ha descrito una prevalencia de un 18% y, a
los dos años, de un 8,9% en los tratados con FK-506, frente a un 9,2% en el grupo
de CsA.
El principal factor de riesgo asociado al desarrollo de esta patología es la incompatibilidad
HLA entre donante y receptor, cuya prevalencia llega a duplicarse en los pacientes con
dos incompatibilidades respecto de los que no tienen ninguna (63% frente al 30%).
Además, los pacientes con anticuerpos pretrasplante contra los antígenos del sistema
HLA tanto de clase I como de clase II presentan RA subclínico con mayor frecuencia que
los no sensibilizados.
Diagnóstico de la nefropatía crónica del injerto
Cada vez hay más evidencias de que las biopsias de protocolo son un buen método
para descubrir las lesiones de nefropatía crónica subclínica. En un gran porcentaje de
pacientes, las lesiones histológicas de NCI aparecen pronto tras el trasplante, lo que
sugiere que los primeros meses son esenciales en su desarrollo. Existen muchos tra-
94

BIOPSIA DE PROTOCOLO: ASPECTOS TÉCNICOS Y SEGURIDAD
bajos que valoran la prevalencia de daño renal cónico en las biopsias de protocolo
(Tabla V).
La clasificación de Banff es poco sensible en la detección de las lesiones precoces de
cronicidad, de manera que en algunos casos se infravaloran. Por esta razón, se han utilizado
también otros métodos, como la morfometría, o bien técnicas que cuantifican las
lesiones específicas, como el depósito de colágeno tipo III o el engrosamiento intimal.
Tabla IV. Estudios en los que se halla RA subclínico.
Autor n Tiempo desde el trasplante %
Choi et al. (11) 304 2 semanas 13
Roberts et al. (52) 115 1 semana 13
1 mes 8
Shapiro et al. (4) 100 1 semana 25
Nankivell et al. (8) 112 3 meses 29
Jain et al. (39) 50 1 semana 4
Jain et al. (53) 78 3 meses 1
Rush et al. (49) 35 1 mes 43
3 meses 27
6 meses 15
Serón et al. (25) 98 3 meses 4
Rush et al. (54) 25 1 mes 20
3 meses 16
6 meses 12
Tabla V. Estudios en los que se encuentran lesiones de NCI.
Autor n Tiempo desde el trasplante %
Isoniemi et al. (55) 89 2 años 50
Kuypers et al. (45) 112 3 meses 79
Legendre et al. (56) 31 3 meses 25
Serón et al. (25) 98 3 meses 42
Dimeny et al. (23) 99 6 meses 35
Rush et al. (54) 25 1 mes 0
3 meses 4
6 meses 20
Nankivell et al. (8) 112 3 meses 24
95

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
Además, otros autores han utilizado otros índices como el CADI (Chronic Allograft Damage
Index), que valora varios parámetros de cronicidad.
En uno de los estudios que contaba con un mayor número de biopsias de protocolo (reunía
959 realizadas en 120 trasplantes de riñón-páncreas), se tomaron muestras en distintos
momentos evolutivos (al implante, al mes, tres y seis meses, al año, tres, cinco,
siete y diez años) y se encontró una prevalencia de NCI del 40% en los primeros seis meses.
Al año del trasplante, el 94% mostraban lesiones de NCI de grado I, con predominio
de la afectación tubulointersticial. A partir del año, las lesiones eran básicamente glomerulares
y vasculares, y a los diez años el 58% de los pacientes tenían lesiones severas
de NCI.
Muchos estudios sugieren que la detección precoz de la NCI en las biopsias de protocolo
en injertos normofuncionantes podría ser un predictor de la pérdida del injerto a largo
plazo. Se ha evidenciado que la supervivencia del injerto es menor en aquellos casos en
los que hay lesiones de NCI respecto de las biopsias sin alteraciones. Este mismo grupo
observó que la presencia de vasculopatía del trasplante en las biopsia de protocolo,
realizadas a los tres meses del trasplante, se asociaba con una menor supervivencia del
injerto a los diez años respecto de los que no la presentaban (41% versus 82%); de manera
que la presencia de vasculopatía a los tres meses del trasplante sería un predictor
de la supervivencia del injerto a largo plazo.
Laine y cols. constataron un aumento de apoptosis de las células tubulares en las biopsias
de protocolo en las que había lesiones de NCI. Hace poco, se han descrito asociaciones
entre la expresión de genes profibróticos y el desarrollo de NCI.
Un trabajo reciente evalúa 435 biopsias realizadas durante los seis primeros meses y encuentra
que los injertos con RA subclínico + NCI ofrecen una peor supervivencia que los
que tienen una de las dos lesiones de forma aislada. Sugiere que, probablemente, este
grupo de pacientes es el que más se beneficiaría del tratamiento del RA subclínico para
prevenir la evolución de la NCI.
Rechazo humoral en las biopsias de protocolo
Existen pocos datos al respecto, en parte debido a que los criterios descritos para su identificación
se han establecido recientemente. El depósito de C4d en el endotelio de los
capilares peritubulares representa un marcador específico de rechazo mediado por anticuerpos.
En las biopsias efectuadas por disfunción aguda del injerto, el depósito de C4d se ha encontrado
con una incidencia del 25-50%. Varios estudios valoran este marcador en las
biopsias de protocolo. El grupo de Sund y cols. halló C4d en 11 de 37 biopsias de do-
96

BIOPSIA DE PROTOCOLO: ASPECTOS TÉCNICOS Y SEGURIDAD
nante vivo, realizadas a los siete días del trasplante, nueve de las cuales estaban asociadas
a disfunción del injerto. Otro trabajo anterior describió este marcador en seis de
53 biopsias llevadas a cabo también en la primera semana del trasplante. Se valoró la
incidencia de depósito de C4d en las biopsias realizadas entre el mes y los seis meses
postrasplante, y se evidenció que la positividad para este marcador se asociaba a RA
subclínico en un 25% de los casos. El grupo de Fiebeler sugiere que la sospecha de rechazo
humoral C4d positivo en la biopsia puede aparecer aun en ausencia de disfunción
del injerto.
También se ha relacionado el hallazgo de C4d con la NCI. Así, se ha demostrado una asociación
estrecha entre este marcador y los datos de NCI, esto es, la glomerulopatía del
trasplante y la duplicación de la membrana basal de los capilares peritubulares. Además,
el depósito de C4d en una primera biopsia (sin evidencia de glomerulopatía del trasplante)
se ha asociado al hallazgo de glomerulopatía en las biopsias posteriores, aun en ausencia
de C4d en esa segunda biopsia. En un estudio multicéntrico donde se valoró el
depósito de C4d en 551 biopsias de protocolo, se observó una prevalencia del 2% en distribución
difusa y del 2,4% cuando ésta era focal. La detección subclínica de C4d en estas
biopsias no influyó en la supervivencia del injerto.
Estos datos sugieren que el depósito precoz de C4d podría predecir la aparición de lesiones
histológicas de rechazo humoral crónico.
Valoración de los pacientes con un alto riesgo inmunológico
Las biopsias de protocolo son muy útiles en los pacientes con un alto riesgo inmunológico,
puesto que permiten establecer un diagnóstico y tratamiento precoz del rechazo
agudo. En caso de NTA, es difícil hacer el diagnóstico de RA únicamente con medios clínicos,
por lo que en esta situación la biopsia sería de gran utilidad.
Varios estudios valoran el RA subclínico en los pacientes con NTA y observan una mayor
frecuencia de rechazo en los casos con NTA asociada frente a los que no presentan NTA
(18% frente al 4%). Otro ensayo con biopsias de protocolo establece que los pacientes
con NTA tienen un riesgo 2,9 veces mayor de sufrir disfunción del injerto por RA respecto
de los que presentan función inicial.
Otro trabajo realizado sobre 230 biopsias de protocolo encontró un 17% de RA vascular
o humoral en las biopsias realizadas entre los diez y 30 días del trasplante. El 50%
de éstos aparecieron en pacientes con anticuerpos de clase I, el 25% en aquellos con
anticuerpos de clase II, y el 25% cuando poseían anticuerpos frente a antígenos de clase
I y II. Por lo tanto, las biopsias de protocolo pueden ser útiles en el diagnóstico del
rechazo mediado por anticuerpos subclínico en los pacientes con un alto riesgo inmunológico.
97

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
Diagnóstico de disfunción del injerto de causa no inmunológica
Existen otros tipos de lesiones halladas en las biopsias de protocolo que se comentarán
brevemente (Tabla VI).
Toxicidad por INC (inhibidores de la calcineurina)
Uno de los motivos más frecuentes de disfunción del injerto de causa no inmunológica
es la nefrotoxicidad por ciclosporina (CsA). Estas lesiones pueden ser reversibles si se
modifica la inmunosupresión de forma precoz: se ha de reducir la dosis de CsA mientras
se aumenta la de otros inmunosupresores. Las biopsias de protocolo podrían ser útiles
para identificar lesiones de nefrotoxicidad en injertos estables.
En un estudio en el que se realizaron las biopsias a los 12 meses del trasplante, se encontraron
lesiones compatibles con toxicidad por CsA en el 42% de los casos. En otro
trabajo realizado sobre un total de 961 biopsias renales, de las cuales 808 eran de protocolo,
y con un seguimiento de diez años, se observó que la toxicidad histológica por ICN
estaba presente a los tres meses del trasplante en un 10% de los casos y que aumentaba
progresivamente, de manera que a los diez años el 100% de los injertos la presentaban.
Tabla VI. Otro tipo de lesiones histológicas en las biopsias de protocolo.
Autor n Tiempo desde el trasplante %
Toxicidad por anticalcineurínicos
Takeda et al. (42) - 12 meses 42
Nankivell et al. (24) 949 3 meses 10
10 años 100
Polyoma virus
Rea et al. (43) 547 4 meses 2,6
12 meses 5
24 meses 2
Virus BK
Los casos de nefritis subclínica por virus BK también se pueden diagnosticar mediante
las biopsias de protocolo. La activación del virus BK es frecuente en los pacientes trasplantados
y, generalmente, se asocia con un deterioro de la función renal. Ya que esta
patología sólo se puede controlar disminuyendo la inmunosupresión, es muy importante
hacer el diagnóstico y el tratamiento de forma precoz.
98

BIOPSIA DE PROTOCOLO: ASPECTOS TÉCNICOS Y SEGURIDAD
En un trabajo en el que se valoraron más de 500 biopsias, se evidenció una frecuencia
de nefritis por BK del 2-5%, dependiendo del momento de realización de la biopsia (4-24
meses). En otro grupo no se detectaron casos nuevos de nefritis por BK tras poner en
marcha un programa de monitorización del virus BK en orina, sangre y tejido renal en las
biopsias de protocolo.
Uso en ensayos clínicos diseñados para prevenir la NCI
La evolución de la NCI parece que puede modificarse con determinadas intervenciones
terapéuticas encaminadas a enlentecer el curso irreversible hacia la pérdida del injerto.
En los ensayos clínicos diseñados para valorar esta patología, se estima que la muestra
debería ser diez veces superior a la necesaria para valorar el RA; asimismo, el seguimiento
debería ser todavía más largo, puesto que se evalúa la supervivencia del injerto a largo
plazo.
Dado que las alteraciones histológicas aparecen antes de que haya una repercusión
clínica, las lesiones de NCI encontradas en las biopsias de protocolo son predictores
independientes de la supervivencia del injerto a largo plazo. Los hallazgos de las biopsias
de protocolo en pacientes con injertos estables podrían ser útiles en la monitorización
de la progresión de la NCI y su posible intervención terapéutica, de manera que
en los ensayos clínicos destinados a valorar la NCI la muestra necesaria se reduciría
considerablemente, lo que favorecería su realización y la interpretación de los resultados.
Inconvenientes
Variación en la incidencia de RA subclínico y de NCI
La decisión de cada centro en cuanto a la realización o no de biopsias de protocolo depende
de la frecuencia con la que se diagnostique el RA subclínico o la NCI y del posible
beneficio del tratamiento en la supervivencia y función del injerto.
Tal como se ha comentado anteriormente en los distintos apartados de este capítulo,
la prevalencia diagnóstica del RA subclínico varía, dependiendo en gran parte del momento
en que se realice la biopsia. Esto hace que sea difícil valorar los resultados en
conjunto y sacar conclusiones definitivas, dadas las grandes diferencias en la metodología
aplicada. Hay que tener en cuenta que algunos estudios excluyen a los pacientes
con necrosis tubular aguda, por lo que el diagnóstico de RA subclínico es menos probable.
Los cambios histológicos en las biopsias de trasplante son la primera evidencia de daño
en el injerto, incluso antes de que tengan repercusión clínica. El valor predictivo de estas
99

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
lesiones sobre la supervivencia del injerto es superior al del RA y la creatinina sérica.
Además, hay lesiones en el injerto relacionadas con la edad del donante que se asemejan
a las de la NCI, dato que en algunos estudios no se tiene en consideración al valorar
las lesiones de cronicidad. Esto explica la variabilidad de los resultados en cuanto al diagnóstico
de NCI.
Validez diagnóstica del RA subclínico y de la NCI. Cómo valorar su utilidad
La interpretación de las alteraciones histológicas es difícil, puesto que cualquier trasplante
induce una respuesta inmune en mayor o menor grado, de manera que la interpretación
de los resultados resulta compleja en este tipo de biopsias. Parece claro que se necesitan
métodos que sean fáciles de interpretar y reproducibles en lo que respecta a la cuantificación
de los cambios histológicos en las biopsias de protocolo.
La ausencia de marcadores específicos ha hecho que las biopsias de protocolo se valoren
según la clasificación de Banff del 97. Sin embargo, hay que tener presente que esta
clasificación se creó para valorar las biopsias diagnósticas utilizando los parámetros más
fácilmente identificables y no para las biopsias con lesiones de fibrosis leve, como pueden
ser las biopsias de protocolo. Por lo tanto, esto conlleva una gran probabilidad de malinterpretar
los resultados, principalmente las lesiones borderline y la NCI de grado I.
Se han desarrollado varias técnicas de Biología Molecular para intentar solucionar este
problema, incluyendo la identificación de marcadores proinflamatorios en los tejidos o en
la orina, y la medición de distintos marcadores de activación celular. No cabe duda de que
estas nuevas tecnologías serán fundamentales en un futuro para la interpretación histológica
de las biopsias de protocolo.
Tratamiento del RA subclínico y de la NCI
Hay algunos estudios que valoran la importancia del tratamiento del RA subclínico. Hay
un único ensayo aleatorizado que muestra que el tratamiento de este tipo de rechazo en
los primeros meses del trasplante (1-3 meses) se traduce en una disminución de la fibrosis
intersticial y la atrofia tubular a los seis meses, junto con una mejor función renal
a los dos años, al compararlo con el grupo control. No obstante, otros autores describen
una menor supervivencia del injerto a los diez años del trasplante en los pacientes con
RA subclínico (diagnosticado a los 14 días) y tratado respecto del grupo que no presentaba
este tipo de patología.
Los estudios del perfil fenotípico de las células que infiltran los injertos sugieren que los
rechazos agudos subclínico y clínico representan dos estadios distintos del mismo proceso
inmunológico y, por lo tanto, tienen la misma capacidad para lesionar el órgano trasplantado.
100

BIOPSIA DE PROTOCOLO: ASPECTOS TÉCNICOS Y SEGURIDAD
El tratamiento de la NCI todavía no está claramente definido. Cuando la NCI se diagnostica
a partir de los cinco años del trasplante raramente responde al tratamiento, pero
es probable que, si éste se instaura entre los seis meses y los cinco años del trasplante,
la evolución sea diferente. También es posible que durante el primer año los mecanismos
implicados en su desarrollo sean distintos de los que pueden influir posteriormente.
Por consiguiente, antes de establecer el momento idóneo para el inicio del tratamiento,
se debería definir el mejor momento y la secuencia de las biopsias de protocolo.
CONCLUSIONES
Tal como se ha comentado anteriormente, las biopsias de protocolo tienen su indicación,
dado que permiten no sólo obtener un diagnóstico, sino iniciar el tratamiento adecuado
de forma precoz antes de que las lesiones histológicas tengan una repercusión clínica.
De esta manera, es posible que en un futuro podamos frenar la evolución de los injertos
hacia la pérdida de función.
La necesidad de realizar estas biopsias de forma protocolizada y rutinaria no está todavía
establecida, aunque hay que valorar siempre los riesgos potenciales derivados del procedimiento
de la biopsia frente a los posibles beneficios de la misma. Actualmente, existen
evidencias suficientes para considerar adecuada la realización de este tipo de biopsias,
puesto que la posibilidad de presentar complicaciones es baja si se efectúa el procedimiento
de forma reglada y bajo control ecográfico, y todavía más si se dispone del
tratamiento adecuado para las lesiones encontradas en las muestras.
BIBLIOGRAFÍA
1. Racusen LC. Protocol biopsies in kidney allografts. J Am Soc Nephrol (en prensa).
2. Nankivell BJ, Chapman JR. The significance of subclinical rejection and the value of
protocol biopsies. Am J Transplant 2006; 6: 2006-12.
3. Furness PN, Philpott CM, Chorbadjian MT, et al. Protocol biopsy of the stable renal
transplant: A multicentre study of methods and complication rates. Transplantation
2003; 76: 969-73.
4. Shapiro R, Ranhawa P, Jordan ML, et al. An analysis of early renal transplant protocol
biopsies: the high incidence of subclinical tubulitis. Am J Transplant 2001; 1: 47-50.
5. Schwarz A, Gwinner W, Hiss M, Radermacher J, Mengel M, Haller H. The risk of ambulant
renal protocol biopsies according to needle size [Abstract 157]. Paper presented
at the American transplant Congress; May 20 to 25, 2005; Seattle, WA.
6. Racusen LC, Solez K, Colvin RB, et al. The Banff 97 working classification of renal
allograft pathology. Kidney Int 1999; 55: 713-23.
7. Rush DN, Henry SF, Jeffery JR, et al. Histological findings in early routine biopsies of
stable renal allograft recipients. Transplantation 1994; 57: 208-11.
101

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
8. Nankivell BJ, Fenton-Lee CA, Kuypers DR, et al. Effect of histological damage on longterm
kidney transplant outcome. Transplantation 2001; 71: 515-23.
9. Gloor JM, Cohen AJ, Lager DJ, et al. Subclinical rejection in tacrolimus-treated renal
transplant recipients. Transplantation 2002; 73: 1965-8.
10. Moreso F, Serón D, Carrera M, et al. Baseline immunosuppression is associated with
histological findings in early protocol biopsies. Transplantation 2004; 78: 1064-8.
11. Choi BS, Shin MJ, Shin SJ, et al. Clinical significance of an early protocol biopsy in living-donor
renal transplantation; ten year experience at a single centre. Am J Transplant
2005; 5: 1354-60.
12. Shishido S, Asanuma H, Nakai H, et al. The impact of repeated subclinical acute rejection
on the progression of chronic allograft nephropathy. J Am Soc Nephrol 2003;
114: 1046-52.
13. Birk PE, Standard KM, Honrad HB, et al. Surveillance biopsies are superior to functional
studies for the diagnosis of acute and chronic renal allograft pathology in children.
Pediatr Transplant 2004; 8: 29-38.
14. Rush D. Controversies in nephrology: Protocol biopsies should be part of the routine
management of kidney transplant recipients. Am J Kidney Dis 2002; 40: 671-3.
15. Lo A, Egidi MF, Gaber LW, et al. Comparison of sirolimus-based calcineurin inhibitorsparing
and calcineurin inhibitor-free regimens in cadaveric renal transplantation.
Transplantation 2004; 77: 1228-35.
16. Nankivell BJ, Borrows RJ, Fung CLS, et al. Natural history, risk factors, and impact of
subclinical rejection in renal transplantation. Transplantation 2004; 78: 242-9.
17. Solez K, Vincenti F, Filo RS. Histopathologic findings from 2-year protocol biopsies
from a US multicenter kidney transplant trial comparing tacrolimus versus cyclosporine:
a report of the FK506 kidney transplant study group. Transplantation 1998; 66:
1736-40.
18. Rush D. Protocol transplant biopsies: an underutilized tool in kidney transplantation.
J Am Soc Nephrol (en prensa).
19. Böhmig GA, Regele H, Hörl WH. Protocol biopsies after kidney transplantation.
Transplant Int 2005; 18: 131-9.
20. Moreso F, López M, Vallejos A, et al. Serial protocol biopsies to quantify the progression
of chronic transplant nephropathy in stable renal allografts. Am J Transplant 2001; 1: 82-88.
21. Nicholson ML, Bailey E, Williams S, Harris KP, Furness PN. Renal allograft survival
can be predicted by histomorphometric assessment of extracellular matrix in 6-month
protocol biopsies. Transplant Proc 1998; 30: 1305.
22. Lehtonen SR, Taskinen EI, Isoniemi HM. Histological alterations in implant and one-year
protocol biopsy specimens of renal allografts. Transplantation 2001; 72: 1138-1144.
23. Dimeny E, Whalberg J, Larsson E, Fellstrom B. Can histopatological findings in early
renal allograft biopsies identify patients at risk for chronic vascular rejection? Clin
Transplant 1995; 9: 79-84.
24. Nankivell BJ, Borrows RJ, Chir B, et al. The natural history of chronic allograft nephropathy.
NEJM 2003; 349: 2326-33.
102

BIOPSIA DE PROTOCOLO: ASPECTOS TÉCNICOS Y SEGURIDAD
25. Serón D, Moreso F, Bover J, et al. Early protocol renal allograft biopsies and graft outcome.
Kidney Int 1997; 51: 310-6.
26. Serón D, Moreso F, Ramón JM, et al. Protocol renal allograft biopsies and the design
of clinical trials aimed to prevent or treat chronic allograft nephropathy. Transplantation
2000; 69: 1849-1855.
27. Laine J, Etelamaki P, Holmberg C, Dunkel L. Apoptotic cell death in human chronic
allograft rejection. Transplantation 1997; 63: 101-105.
28. Baboolal K, Jones GA, Janezic A, Griffiths DR, Jurewicz WA. Molecular and structural
consequences of early renal allograft injury. Kidney Int 2002; 61: 686-696.
29. Moreso F, Ibernon M, Gomà M, et al. Subclinical rejection associated with chronic
allograft nephropathy in protocol biopsies as a risk factor for late graft loss. Am J
Transplant 2006; 6: 747-52.
30. Racusen LC, Colvin RB, Solez K, et al. Antibody-mediated rejection criteria-an addition
to the Banff´97 classification of renal allograft rejection. Am J Transplant 2003; 3
(6): 708-14.
31. Böhmig GA, Regele H. Diagnosis and treatment of antibody-mediated kidney allograft
rejection. Transplant Int 2003; 16: 773-734.
32. Mauiyyedi S, Colvin RB. Humoral rejection in kidney transplantation: new concepts
in diagnosis and treatment. Curr Opin Nephrol Hypertens 2002; 11: 609-619.
33. Sund S, Hovig T, Reisaeter AV, Scott H, Bentdal O, Mollnes TE. Complement activation
in early protocol kidney graft biopsies after living-donor transplantation.
Transplantation 2003; 75: 1204-1213.
34. Roberts ISD, Koo DDH, Quiroga I, et al. C4d deposition in early renal allograft protocol
biopsies. J Pathol 2002; 198 (Suppl.): 1A.
35. Nickerson P, Gibson IW, Karpinski ME, et al. C4d deposition in protocol biopsies from
flow-cytometry crossmatch (FCXM) positive (+ve) or (-ve) renal transplant recipients
(RTR). J Am Soc Transpl 2002; 13: 567A.
36. Fiebeler A, Mengel M, Merkel S, et al. C4d deposition is increased in subclinical humoral
rejection of renal allograft. J Am Soc Nephrol 2002; 13 (Suppl.): 568A.
37. Regele H, Böhmig GA, Habitch A, et al. Capillary deposition of complement split product
C4d in renal allografts is associated with basement membrane injury in peritubular
and glomerular capillaries: a contribution of humoral immunity to chronic allograft
rejection. J Am Soc Nephrol 2002; 13: 2371-2380.
38. Mengel M, Bogers J, Bosmans JL, et al. Incidence of C4d stain in protocol biopsies
from renal allografts: results from a multicenter trial. Am J Transplant 2005; 5: 1050-6.
39. Jain S, Curwood V, White SA, et al. Sub-clinical acute rejection detected using protocol
biopsies in patients with delayed graft function. Transplant Int 2000; 13 (suppl. 1): 52-5.
40. Qureshi F, Rabb H, Kasiske BL. Silent acute rejection during prolonged delayed graft
function reduces allograft survival. Transplantation 2002; 74: 1400-4.
41. Shimizu T, Taabe K, Ishida H, et al. Detection of subclinical humoral and/or vascular
rejection of protocol biopsies in highly sensitized renal transplant recipients [Abstract].
Am J Transplant 2004; 4 (Suppl. 8): 206.
103

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
42. Takeda A, Morozumi K, Yoshida A, et al. Studies of cyclosporine-associated arteriolopathy
in renal transplantation: Does the long-term outcome of renal allografts depend
on chronic cyclosporine toxicity? Transplant Proc 1994; 26: 925-8.
43. Rea DJ, Stegall MD, Cosio FG, Grande JP, Gloor JM, Larson TS. Histological findings
on surveillance protocol biopsies after renal transplantation (Abstract). Am J Transplant
2004; 4 (suppl. 8): 566.
44. Bruno DA, Cheng O, Hale DA, et al. Limiting overimmunosuppression post-transplant:
the role of BK polyoma viral monitoring (Abstract 386). Paper presented at the American
Transplant Congress; may 20 to 25, 2005; Seattle, WA.
45. Kuypers DRJ, Chapman JR, O’Conell PJ, Allen RDM, Nankivell BJ. Predictors of renal
transplant histology at three months. Transplantation 1999; 67: 1222-30.
46. Serón D, Moreso F, Fulladosa X, Hueso M, Carrrera M, Grinyó JM. Reliability of chronic
allograft nephropathy diagnosis in sequential protocol biopsies. Kidney Int 2002; 61:
727-73.
47. Rush D, Somoraji R, Deslauriers R, Shaw A, Jeffery J, Nickerson P. Subclinical rejection
-a potential surrogate marker for chronic rejection- may be diagnosed by protocol
biopsy or urine spectroscopy. Ann Transplant 2000; 5: 44-9.
48. Li B, Hartono C, Ding R, et al. Noninvasive diagnosis of renal-allograft rejection by
measurement of Messenger RNA for perforin and ganzyme B in urine. N Engl J Med
2001; 344: 947-54.
49. Rush D, Nickerson P, Gough J, et al. Beneficial effects of early subclinical rejection:
A randomized study. J Am Soc Nephrol 1998; 9: 2129-34.
50. Hoffmann FC, Hale DA, Kleiner DE, et al. Functionally significant renal allograft rejection
is defined by transcriptional criteria. Am J Transplant 2005; 5: 573-81.
51. Salomon DR. Protocol biopsies should be part of the routine management of kidney
transplant patients. Am J Kidney Dis 2002; 40: 674-7.
52. Roberts ISD, Reddy S, Russell C, et al. Subclinical rejection and borderline changes
in early protocol biopsy specimens after renal transplantation. Transplantation 2004;
77: 1194-8.
53. Jain S, Curwood V, Kazi J, et al. Acute rejection in protocol renal transplant biopsies:
institutional variations. Transplant Proc 2000; 32: 616.
54. Rush DN, Jeffery IR, Gough J. Sequential biopsies in renal transplant patients.
Transplantation 1995; 59: 511-4.
55. Isoniemi H, Taskinen E, Hayry P. Histological chronic allograft damage index accurately
predicts chronic renal allograft rejection. Transplantation 1994; 58: 1195-8.
56. Legendre C, Thervet E, Skhiri H, et al. Histologic features of chronic allograft nephropathy
by protocol biopsies in kidney transplant recipients. Transplantation 1998; 65:
1506-9.
104

BIOPSIAS DE PROTOCOLO
EN EL DISEÑO
DE ENSAYOS CLÍNICOS
D. Serón
INTRODUCCIÓN
La mejora en las últimas décadas de los resultados del trasplante, tanto de la supervivencia
del injerto como del paciente, o la importante reducción de la tasa de rechazo
han supuesto un verdadero desafío para diseñar ensayos clínicos, ya que las variables
que permitieron demostrar la eficacia y la seguridad de los fármacos inmunosupresores
en las décadas de los 80 y los 90 han dejado de ser útiles para evaluar los
fármacos actuales.
A principios de los 80, la supervivencia del injerto al año permitió demostrar la superioridad
de la ciclosporina sobre la azatioprina. Una vez que la supervivencia del injerto
al año alcanzó el 80%, esta variable dejó de ser de utilidad. Hoy en día, la supervivencia
del injerto es igual o superior al 90% en la mayoría de los centros.
A comienzos de los 90, la tasa de rechazo agudo durante los primeros meses sirvió
para constatar la superioridad del micofenolato mofetil asociado a ciclosporina
y prednisona sobre el tratamiento con ciclosporina, azatioprina y prednisona. Sin
embargo, una vez que la tasa de rechazo bajó al 20%, esta variable dejó de tener
utilidad para evaluar la eficacia de los distintos tratamientos en régimen de ensayo
clínico.
Esta situación ha estimulado la definición de nuevos parámetros con el fin de discriminar
los efectos de distintos tratamientos con un número razonable de casos.
105

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
SUPERVIVENCIA DEL PACIENTE
Y SUPERVIVENCIA DEL INJERTO
Las variables que no admiten discusión para valorar el resultado de un tratamiento inmunosupresor
son la supervivencia del paciente y la del injerto. Una diferencia en la
supervivencia entre dos tratamientos es un argumento irrefutable sobre la superioridad
de uno respecto del otro. La supervivencia es la resultante final que resume las
características principales de la población estudiada y los efectos del tratamiento, tanto
su eficacia como sus efectos adversos. Para demostrar una diferencia en la supervivencia
entre tratamientos inmunosupresores, el tiempo de seguimiento y el número
de pacientes que deben incluirse son muy elevados. En un estudio basado en los
datos del registro norteamericano, Hariharan y cols. estimaron el tamaño muestral
mínimo para detectar una diferencia en la supervivencia del injerto en cinco años.
En este estudió se demostró que, a pesar de considerar un seguimiento extraordinariamente
prolongado para un ensayo clínico, el tamaño muestral mínimo era muy superior
al tamaño considerado factible hoy en día, tal como se muestra en la Tabla I.
Tabla I. Tamaño muestral mínimo en cada grupo para detectar una mejora
de la supervivencia del injerto a los cinco años. En este caso, se ha asumido
que en el grupo control la supervivencia es del 75%. Los cálculos se basan
en los obtenidos en el registro norteamericano.
Poder estadístico 80% 90% 95%
Supervivencia del injerto
Número de pacientes por grupo
en el grupo de estudio
78% 3.133 4.195 7.334
80% 1.092 1.462 2.556
82% 538 720 1.258
Al no poder utilizar la supervivencia como variable de eficacia en los ensayos clínicos, se
utilizan variables de eficacia intermedias que permiten evaluar el resultado de un estudio
con un tiempo de seguimiento razonablemente corto y un tamaño muestral relativamente
pequeño. Una variable de eficacia debe cumplir una serie de requisitos y debe haber sido
validada adecuadamente. Existen muchas variables que se consideran posibles variables
de eficacia, pero solamente unas pocas cumplen los requisitos necesarios para poder incluirlas
en el diseño de ensayos clínicos como la variable de eficacia principal o primaria,
que es la que permite evaluar de forma global la eficacia del tratamiento.
VARIABLE DE EFICACIA
Es la variable utilizada para evaluar el efecto de distintos tratamientos en un ensayo clínico.
Puede tratarse de una variable cualitativa, ordinal o cuantitativa. En general, son pre-
106

BIOPSIAS DE PROTOCOLO EN EL DISEÑO DE ENSAYOS CLÍNICOS
feribles las variables cuantitativas. Puede ser una variable que no admite discusión, como
la supervivencia, o una variable intermedia que se utiliza en vez de la supervivencia. Se
distinguen dos tipos de variables de eficacia: la variable de eficacia primaria y las variables
de eficacia secundarias.
La variable de eficacia primaria es aquella que permite decidir la superioridad o la igualdad
entre tratamientos en un ensayo clínico. Las variables de eficacia secundaria son
aquellas que posibilitan evaluar algunos aspectos del efecto de los tratamientos; sin embargo,
no son útiles para decidir globalmente si un tratamiento es superior a otro.
La decisión de qué variable de eficacia se debe utilizar en un ensayo clínico no es arbitraria.
La primera condición es que la variable de eficacia primaria ha de relacionarse con
la variable referencia que, en el caso del trasplante, es la supervivencia. Desde el punto
de vista epidemiológico, existen dos tipos de variables que se relacionan con la supervivencia:
las variables predictivas y las variables subordinadas. A continuación, se explica
la diferencia entre ambos tipos de variables y su utilidad como variables de eficacia en
los ensayos clínicos.
VARIABLE PREDICTIVA
Es una variable intermedia que explica una parte de la variabilidad de la variable referencia
o, en inglés, outcome variable. En el caso de las variables intermedias utilizadas en
ensayos clínicos en el trasplante renal, la variable referencia siempre debe ser la supervivencia
del paciente o del injerto. El interés de una variable predictiva dependerá del grado
de relación con la variable referencia.
Para evaluar la correlación entre variables cuantitativas se utiliza el coeficiente de determinación
r 2 , que no es más que el coeficiente de correlación elevado al cuadrado. El estudio
entre variables se basa en un modelo de regresión simple o múltiple. El coeficiente
de determinación indica el porcentaje de variabilidad de la variable referencia explicado
por la variable predictiva. Si existe una correlación entre el aclaramiento de la creatinina
y la presión arterial media, siendo el coeficiente de determinación del 30%, podemos
interpretar que el aclaramiento de la creatinina explica el 30% de la variación de la
tensión arterial media. Existe un 70% de variabilidad de la tensión arterial que no se explica
por el aclaramiento de la creatinina. Cuanto mayor sea el coeficiente de determinación,
más útil será la variable predictiva para explicar la variable referencia y mayor será
su interés para ser considerada como una potencial variable de eficacia en los ensayos
clínicos.
En el trasplante renal, la variable intermedia o variable de eficacia primaria sirve para
predecir la supervivencia del injerto y esta situación hace que no se pueda utilizar el
coeficiente de determinación. Para estudiar el valor predictivo de una variable sobre la
107

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
supervivencia, se utiliza la regresión de Cox. El modelo de regresión de Cox sirve para
calcular riesgos relativos. El riesgo relativo es la probabilidad de que se produzca la
pérdida del injerto en un paciente que cumple una condición con respecto al que no
la cumple. Por ejemplo, decimos que el rechazo se asocia a dos veces más riesgo de
pérdida del injerto que aquellos casos sin rechazo. En el caso de una variable cuantitativa,
el riesgo relativo se expresa por unidad. Si a medida que aumenta la edad del
donante disminuye la supervivencia del injerto, un riesgo relativo del 4% implica que por
cada año que aumente la edad del donante la posibilidad de pérdida del injerto aumenta
un 4%.
¿Cuándo se puede considerar que un riesgo relativo es suficientemente elevado para
asumir que una variable predice adecuadamente la supervivencia? Cuando se utiliza
el modelo de regresión de Cox, puede darse la paradoja de que una variable asociada
a un riesgo muy elevado tenga un valor predictivo muy bajo sobre la supervivencia.
En el caso de los modelos predictivos basados en la regresión múltiple, el coeficiente
de determinación r 2 nos indica qué porcentaje de la variabilidad de la variable
explicada depende de la variable predictiva. En cambio, el riesgo relativo no
describe qué porcentaje de la variabilidad de la supervivencia se explica por la variable
predictiva.
Con el fin de poder definir en términos de modelos estadísticos basados en la supervivencia
un estadístico parecido al coeficiente de determinación, se ha propuesto la utilización
de un análisis que permite acercarnos al concepto de coeficiente de determinación.
Esta aproximación consiste en el empleo de curvas ROC o receiver operator curves
entre la variable predictiva y la supervivencia determinada en un periodo preestablecido.
A pesar de que la creatinina sérica constituye un importante factor de riesgo asociado a
la pérdida del injerto, Kaplan B y cols. demostraron elegantemente mediante curvas ROC
que la creatinina no ofrece una predicción suficientemente precisa de la supervivencia y
que, por lo tanto, no tiene sentido considerar la creatinina como una variable de eficacia
primaria en un ensayo clínico.
VARIABLE SUBORDINADA
Una variable subordinada es aquella que puede utilizarse en vez de la variable de
referencia. En el caso que nos ocupa es una variable que se emplea en lugar de la
supervivencia del injerto. Sin embargo, así como todas las variables subordinadas son
variables predictivas, no todas las variables predictivas constituyen una medida subordinada.
Una variable predictiva implica, simplemente, la existencia de una asociación con la variable
referencia. En el caso de una variable subordinada, se debe cumplir la condición adicional
de que las modificaciones del valor de la variable intermedia conlleven cambios
108

BIOPSIAS DE PROTOCOLO EN EL DISEÑO DE ENSAYOS CLÍNICOS
en la variable referencia. En términos más técnicos, una medida subordinada es una variable
respuesta para la cual la aceptación de la hipótesis nula (igualdad de eficacia
entre tratamientos) comporta que se cumpla la hipótesis nula para la variable referencia.
La definición de la concordancia basada en la hipótesis nula es una condición mucho
más estricta que la concordancia en la hipótesis alternativa entre la variable predictiva y
la variable referencia. Lógicamente, si se cumple la hipótesis alternativa (diferencia de
eficacia entre tratamientos) para la medida subordinada, debe cumplirse la hipótesis
alternativa para la variable referencia.
Validación de una variable subordinada
La aceptación de una variable subordinada en un ensayo clínico no tiene sentido si esta
variable no ha sido validada. La validación requiere la observación de qué cambios en la
variable referencia conllevan cambios en la variable subordinada como resultado de las
distintas intervenciones terapéuticas. Si existe una correlación entre el rechazo y la supervivencia,
el rechazo puede considerarse una medida subordinada de la supervivencia
únicamente si se ha demostrado que una intervención terapéutica que disminuye la incidencia
de rechazo también es capaz de mejorar la supervivencia a largo plazo.
Estas condiciones subrayan la importancia de seguir a los pacientes incluidos en ensayos
clínicos más allá del tiempo de seguimiento propuesto con el fin de poder evaluar
la bondad de la predicción de la variable subordinada a largo plazo. Muchas veces el
desarrollo clínico de un fármaco y la validación de medidas subordinadas se realizan simultáneamente
pero, en un ensayo clínico de fase III, la medida subordinada debe estar
validada.
Características que definen el interés
de una variable subordinada
Una vez validada, el interés de una variable subordinada dependerá del valor predictivo
sobre la supervivencia y de que este valor predictivo sea independiente de otras variables
clínicas, analíticas, histológicas, etc. Cuanto más estrechamente se relacione la variable
subordinada con la supervivencia, mayor será su utilidad.
Si la variable subordinada no tiene un poder predictivo independiente de otras variables,
su utilidad será muy discutible. En cambio, si es independiente de otras variables, se podrá
incluso mejorar su poder predictivo mediante la elaboración de una variable compuesta
que contenga diferentes variables predictivas independientes, ajustadas por su
contribución relativa a la predicción de la variable referencia.
Otra característica que define la utilidad de una medida subordinada es el tiempo de seguimiento
que es necesario que transcurra para su obtención. De forma ideal, una me-
109

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
dida subordinada debe poder obtenerse en una fase precoz del tratamiento. Esto permite
el diseño de ensayos clínicos con seguimiento corto. Además, debe tenerse en
cuenta que la obtención de la medida subordinada ha de ser segura y, por consiguiente,
implicar los menores riesgos posibles para el paciente. En la Tabla II, se resumen las
características que debe cumplir una variable subordinada. Por otro lado, en la Tabla III
se enumeran variables que, potencialmente, pueden contribuir a la mejora del diseño
de los ensayos clínicos. No obstante, de toda esta lista, la única variable que ha sido
adecuadamente validada es la prevalencia de nefropatía crónica del trasplante (NCT) evaluada
mediante biopsias de protocolo.
Tabla II. Condiciones que debe cumplir una variable subordinada.
1. Debe correlacionarse con la supervivencia del injerto y/o del paciente.
2. Su poder predictivo sobre la supervivencia debe ser independiente
de otras variables.
3. Su obtención ha de ser precoz en la evolución del injerto.
4. Es segura, es decir, poco invasora y con las menores consecuencias
para el paciente.
BIOPSIAS DE PROTOCOLO
Las biopsias de protocolo son aquellas que se realizan de forma prospectiva en un momento
predeterminado del seguimiento con objeto de diagnosticar la aparición de lesiones del
aloinjerto en sus estadios precoces. Las primeras biopsias de protocolo se realizaron en los
años 70 y 80 para estudiar si la histología del aloinjerto de los pacientes con una función renal
estable era normal. En estos primeros estudios, se observó la presencia de lesiones inflamatorias
y de fibrosis intersticial en los pacientes con una función renal estable, lo que
sugería que estas lesiones podrían asociarse a la evolución posterior del injerto. A finales
de los 80 y principios de los 90, distintos centros incluyeron la biopsia de protocolo con el
fin de evaluar la aparición precoz de lesiones renales. Estos estudios han permitido describir
la historia natural de la NCT y del rechazo subclínico.
Diagnóstico y evolución de la nefropatía crónica
evaluada mediante biopsias de protocolo
La NCT se caracteriza por la presencia de fibrosis intersticial y atrofia tubular que puede
acompañarse o no de vasculopatía del trasplante de acuerdo con los criterios de Banff.
En la Figura 1 se muestra la aparición de fibrosis intersticial y atrofia tubular en una biopsia
de protocolo realizada a los cuatro meses y, en la Figura 2, se observa la presencia de
vasculopatía del trasplante en una biopsia diagnóstica realizada en un paciente con una
creatinina de 170 µmol/L a los ocho años de seguimiento. El porcentaje de pacientes con
NCT aumenta de forma exponencial después del trasplante. Se estima que, a los tres
110

BIOPSIAS DE PROTOCOLO EN EL DISEÑO DE ENSAYOS CLÍNICOS
Tabla III. Variables de eficacia primaria y secundaria en ensayos clínicos.
Función renal
1. Creatinina
2. Filtrado glomerular
Variables clínicas de comorbilidad
1. Diabetes
2. Hipertensión
3. Hiperlipemia
4. Infecciones
5. Neoplasias
Calidad de vida
1. Test de calidad de vida
Variables inmunológicas
1. Respuesta humoral
• Anticuerpos contra el panel
postrasplante
• Anticuerpos donante-específicos
- Anti-HLA
- Otros
2. Respuesta celular
• Elispot
Variables histológicas
1. Incidencia/prevalencia
de rechazo subclínico
2. Incidencia/prevalencia
de nefropatía crónica
3. Escalas ordinales de daño agudo
y crónico
• Banff
• CADI
4. Morfometría
• Volumen glomerular
• Fracción de volumen intersticial
cortical
• Fracción de volumen intimal
arterial
5. Análisis de imagen
• Fracción rojo sirio positiva
intersticial
6. Otros abordajes
• Subpoblaciones celulares
• C4d
Otras variables
1. PCR a tiempo real
2. Gene chips
3. Proteoma
4. Metaboloma
meses, entre el 30% y el 40% de las biopsias de protocolo presentan NCT, el 50% al
año, el 66% a los dos años y el 100% a los diez años. Por lo tanto, la incidencia es máxima
durante los primeros 3-6 meses (Figura 3).
Desde el punto de vista del diseño de ensayos clínicos, esta observación sugiere que, si se
utiliza como variable de eficacia primaria la presencia/ausencia de NCT en una biopsia de
protocolo, esta biopsia puede realizarse durante los primeros meses cuando la incidencia
es máxima. Teóricamente, si durante los 3-6 primeros meses la incidencia de NCT es máxima,
la probabilidad de prevenir su progresión también es más elevada durante este periodo.
Estos datos apuntan que la biopsia de protocolo, como variable de eficacia, tendría
el interés de permitir la reducción del tiempo de seguimiento en los ensayos clínicos.
111

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
Prevalencia e incidencia de nefropatía
crónica estimada mediante biopsias de protocolo
Las lesiones que caracterizan a la
nefropatía crónica del trasplante
son indistinguibles de las lesiones
crónicas relacionadas con la edad.
Cuando se evalúan de forma ciega
biopsias de protocolo y biopsias
del donante, un porcentaje de
las biopsias del donante se diagnostican
como NCT. Se ha estimado
que entre un 15% y un 25%
de las biopsias del donante presentan
lesiones indistinguibles de
la NCT. Esta observación es importante,
ya que implica que para
conocer la incidencia de NCT es
necesaria la obtención de una
biopsia del donante, con el fin de
poder calcular los casos que desarrollan
NCT de novo. La distinción
entre incidencia y prevalencia de
NCT en las biopsias de protocolo
es relevante en el diseño de ensayos
clínicos.
Figura 1. Muestra la aparición de fibrosis intersticial
y atrofia tubular en una biopsia de protocolo realizada
a los cuatro meses.
Figura 2. Se evidencia la presencia de vasculopatía
del trasplante en una biopsia diagnóstica
realizada en un paciente con una
creatinina de 170 µmol/L a los ocho años
de seguimiento.
Figura 3. Incidencia de NCT máxima durante
los primeros 3-6 meses.
112

BIOPSIAS DE PROTOCOLO EN EL DISEÑO DE ENSAYOS CLÍNICOS
VALOR PREDICTIVO
DE LA NEFROPATÍA CRÓNICA DEL INJERTO
SOBRE LA SUPERVIVENCIA DEL INJERTO
En 1992, se describió una asociación entre la severidad de las lesiones crónicas evaluadas
mediante biopsias de protocolo a los dos años y una mayor probabilidad de deterioro
de la función renal. En 1995, se describió por primera vez una relación entre la severidad
de las lesiones crónicas y la supervivencia del injerto. Dos años después, no sólo se confirmó
que la presencia de NCT se correlacionaba con la supervivencia del injerto, sino que
la existencia de NCT era un predictor independiente de la supervivencia cuando se utilizaba
un modelo multivariante. Esta observación demostró que la biopsia de protocolo contenía
una información para predecir la supervivencia del injerto que no estaba presente en
otras variables clínicas. La demostración de que la biopsia era una variable predictiva independiente
de la supervivencia del injerto de otras variables clínicas sugirió que la biopsia
de protocolo podría constituir una nueva variable de eficacia en los ensayos clínicos.
TAMAÑO MUESTRAL MÍNIMO EN UN ENSAYO
CLÍNICO EN EL QUE LA PRESENCIA DE NCT
EN LA BIOPSIA DE PROTOCOLO ES LA VARIABLE
DE EFICACIA PRIMARIA
En un estudio en el que se incluyeron aproximadamente 300 pacientes a los que se les
practicó una biopsia de protocolo a los tres meses, se observó que la presencia de NCT
con vasculopatía se asociaba a una baja supervivencia del injerto, mientras que la presencia
de NCT sin vasculopatía conllevaba una supervivencia intermedia en comparación
con los pacientes que no presentaban NCT (Figura 4). En este trabajo se confirmó
el valor predictivo independiente de la NCT y de la vasculopatía del trasplante sobre la
supervivencia del injerto respecto de otras variables, como la creatinina o la proteinuria.
A partir de los datos de este estudio se realizaron cálculos de poder estadístico para estimar
el tamaño muestral mínimo necesario en un hipotético ensayo clínico en el que la
incidencia de NCT y la incidencia de vasculopatía del trasplante se consideraron como
la variable de eficacia primaria. En este trabajo, el 16% de las biopsias del donante presentaban
lesiones indistinguibles de la NCT. A los tres meses, el 38% de los pacientes
sufrían NCT en la biopsia de protocolo, tal como se muestra en la Figura 5. Por consiguiente,
en un 22% de los casos apareció una NCT de novo. Se calculó el tamaño muestral
mínimo para detectar una disminución de la incidencia del 50%, es decir, se asumió
que el número de casos nuevos en el grupo control sería del 22% y, en el grupo de tratamiento,
del 11%; consecuentemente, la prevalencia a los tres meses en el grupo control
sería del 38% y del 27% en el grupo de tratamiento, como se aprecia en la Figura 5.
113

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
Figura 4. La presencia de NCT sin vasculopatía conlleva una supervivencia intermedia
en comparación con los pacientes que no presentan NCT.
Tabla IV. Tamaño muestral mínimo en cada grupo para detectar una mejora
de la creatinina sérica al año de seguimiento. En este caso, se ha asumido
que en el grupo control la creatinina al año es de 1,6 mg/100 mL. Los cálculos
se basan en los obtenidos en el registro norteamericano.
Poder estadístico 80% 90% 95%
Mejora de la creatinina
Número de pacientes por grupo
de 1,6 mg/100 mL a
1,52 (diferencia del 5%) 1.577 1.977 2.444
1,44 (diferencia del 10%) 370 494 611
1,36 (diferencia del 15%) 164 219 272
114

BIOPSIAS DE PROTOCOLO EN EL DISEÑO DE ENSAYOS CLÍNICOS
Figura 5. A los tres meses, el 38% de los pacientes presentan NCT en la biopsia de protocolo.
Para este ensayo hipotético de prevención primaria, el número de casos para detectar
esta diferencia fue de 285 por grupo con un error α del 5% y un error β del 20%.
Si se comparan estas cifras con los estudios en los que se estimó el tamaño muestral
mínimo para detectar una diferencia entre tratamientos basada en la creatinina, la incidencia
de NCT en la biopsia de protocolo es una variable con una buena capacidad para
discriminar entre tratamientos, a pesar de que la creatinina es una variable cuantitativa
y la incidencia de NCT una variable cualitativa. En la Tabla IV se resume el tamaño muestral
mínimo estimado a partir de los datos del registro norteamericano realizado por
Hariharan y cols. en un hipotético estudio en el que la variable de eficacia primaria fuese
la creatinina sérica. La observación de que la incidencia de NCT en la biopsia de protocolo
permite disminuir, de forma importante, el tamaño muestral mínimo en los ensayos
clínicos ha favorecido la inclusión de biopsias de protocolo como una variable de
eficacia secundaria en los ensayos clínicos recientes.
En el trabajo antes mencionado se utilizó el mismo planteamiento para evaluar el tamaño
muestral mínimo que permitiese detectar una reducción del 50% en la incidencia
de vasculopatía del trasplante. El 2% de las biopsias del donante presentaban lesio-
115

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
nes indistinguibles de la vasculopatía del trasplante y, a los cuatro meses, el 7,5%
ofrecían vasculopatía del trasplante. Para detectar una reducción del 50% en la incidencia
de la vasculopatía se requerirían 1.142 pacientes por grupo. Este resultado sugiere
que no tiene demasiado sentido utilizar la incidencia de vasculopatía del trasplante
a los tres meses como una variable de eficacia primaria.
UTILIZACIÓN DE LA BIOPSIA DE PROTOCOLO
COMO VARIABLE DE EFICACIA EN LOS ENSAYOS
CLÍNICOS CON SIROLIMUS: CONSTATACIÓN
DE QUE LA BIOPSIA DE PROTOCOLO
ES UNA VARIABLE SUBORDINADA
DE LA SUPERVIVENCIA DEL INJERTO
La aprobación del tratamiento con sirolimus en el trasplante renal se basó en gran parte
en los resultados del estudio 310. En este ensayo, se incluyeron 525 pacientes. Todos
los pacientes fueron tratados con ciclosporina, sirolimus y prednisona durante los tres
primeros meses. Los pacientes que a los tres meses tenían un riñón funcionante con
una creatinina inferior a 400 µmol/L y que no habían presentado antes un rechazo de
grado III de acuerdo con los criterios de Banff o un rechazo de grado II durante el mes
anterior fueron aleatorizados para seguir una pauta con ciclosporina, sirolimus y prednisona,
o bien una pauta en la que se retiró la ciclosporina a partir del tercer mes.
En este estudio, se realizaron biopsias de protocolo al año y a los tres años que se evaluaron
con el índice CADI. Se observó que a los tres años la severidad de la NCT era menor
en el grupo de pacientes a los que se les retiró la ciclosporina y, asimismo, se cons-
Figura 6. A los tres años, la severidad de la NCT es menor en el grupo de pacientes en
los que se había retirado la ciclosporina; asimismo, se aprecia que la supervivencia del
injerto es superior a los cinco años.
116

BIOPSIAS DE PROTOCOLO EN EL DISEÑO DE ENSAYOS CLÍNICOS
tató que la supervivencia del injerto era superior a los cinco años (Figura 6), lo que demostraba
por primera vez que una disminución en la variable predictiva –en este caso,
la severidad de la lesión crónica en la biopsia de protocolo– se asocia con una disminución
de la supervivencia del injerto.
A partir de estos datos, el daño crónico evaluado mediante biopsias de protocolo se puede
considerar desde el punto de vista epidemiológico no sólo una variable predictiva, sino
también una variable subordinada. Por lo tanto, esta observación permite estimar la prevalencia
de NCT evaluada mediante biopsias de protocolo como una variable de eficacia
primaria en ensayos clínicos cuya finalidad es la modificación de la historia natural de la
NCT. En la actualidad, ya existen ensayos en fase de realización en los que la incidencia
de NCT es la variable de eficacia primaria.
INCIDENCIA DE NCT EVALUADA MEDIANTE
BIOPSIAS DE PROTOCOLO EN ENSAYOS
CLÍNICOS SIN ANTICALCINEURÍNICOS
En un estudio prospectivo y aleatorizado realizado en un solo centro, se comparó mediante
biopsias de protocolo la prevalencia de NCT a los dos años en los pacientes que
recibieron basiliximab, micofenolato mofetil y prednisona asociados a ciclosporina o sirolimus.
Se incluyeron 61 pacientes y, a los dos años, se obtuvo una biopsia de protocolo
en 48 pacientes, de los cuales la mitad recibieron ciclosporina y la otra mitad sirolimus.
La incidencia de NCT a los dos años fue del 79% en los pacientes tratados con ciclosporina
y del 32% en aquellos que recibieron sirolimus.
En un estudio de fase II en el que se evaluó la eficacia del tratamiento con belatacept –un
inhibidor de la señal coestimuladora–, los pacientes fueron aleatorizados en tres grupos.
Dos grupos recibieron belatacept, uno de forma intensiva (n = 74) y otro de manera menos
intensiva (n = 71), y el grupo control ciclosporina (n = 73). Además, los tres grupos
recibieron basiliximab, micofenolato mofetil y prednisona. A los seis meses, la incidencia
de NCT evaluada mediante biopsias de protocolo fue del 29% en los pacientes a los
que se les administró el régimen intensivo con belatacept (n = 52), del 20% en aquellos
que recibieron el régimen menos intensivo con belatacept (n = 52), y del 44% en los tratados
con ciclosporina (n = 45).
Estos datos muestran que el tratamiento sin anticalcineurínicos se asocia con una importante
reducción de la prevalencia de NCT, aproximadamente del 50% a los seis meses y
de casi dos tercios a los dos años. Aparte del indudable interés de estos resultados desde
el punto de vista clínico, la reducción de la prevalencia de NCT implica que en el futuro,
cuando los ensayos clínicos comparen tratamientos sin anticalcineurínicos, el tamaño muestral
mínimo para demostrar una diferencia entre grupos será necesariamente superior al
117

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
que ha sido preciso para demostrar la eficacia de los tratamientos sin anticalcineurínicos en
la prevención de la NCT, en comparación con los tratamientos con anticalcineurínicos.
Si se calcula el tamaño muestral mínimo para detectar una diferencia del 50% en la prevalencia
de NCT, por ejemplo a los seis meses, a medida que se disminuye la prevalencia
en el grupo control, el tamaño muestral se incrementa. Si se asume que en un
ensayo clínico la prevalencia de NCT es del 50% en el grupo control y del 25% en el grupo
de tratamiento, solamente necesitaremos 65 pacientes por grupo para detectar esta
diferencia, con un error α del 5% y un error β del 20%. En cambio, si asumimos que en
un ensayo clínico la prevalencia de NCT es del 20% en el grupo control y del 10% en el
grupo de estudio, necesitaremos 218 pacientes por grupo para detectar esta diferencia
(Tabla V).
Tabla V. Tamaño muestral mínimo por grupo en un ensayo clínico
en el que se intenta demostrar una diferencia del 50% en la prevalencia de NCT
a los seis meses. A medida que mejoran los resultados en el grupo control,
el tamaño muestral mínimo para detectar esta diferencia del 50% aumenta
de forma progresiva.
Prevalencia de NCT a los seis meses
Grupo control Grupo de estudio Casos por grupo
50 25 65
40 20 90
30 15 133
20 10 218
17 7,5 303
10 5 473
EVALUACIÓN DE LAS LESIONES CRÓNICAS
MEDIANTE PARÁMETROS CUANTITATIVOS
Hasta ahora hemos visto la utilidad de la prevalencia de NCT evaluada en biopsias de protocolo
en el diseño de ensayos clínicos. La prevalencia de NCT es un parámetro cualitativo
y, por tanto, su utilización como una variable de eficacia primaria en ensayos clínicos
comporta, al menos desde el punto de vista teórico, la inclusión de un mayor número de
pacientes respecto de una variable cuantitativa. De ahí el interés que surge en evaluar la
utilidad de distintos abordajes para cuantificar el daño crónico en los distintos compartimentos
renales. Se han desarrollado diferentes estrategias para valorar el daño intersticial
crónico y la vasculopatía del trasplante mediante parámetros cuantitativos a través
de técnicas morfométricas o basadas en el análisis de imagen, y se ha evaluado su posible
utilidad en el diseño de ensayos clínicos.
118

BIOPSIAS DE PROTOCOLO EN EL DISEÑO DE ENSAYOS CLÍNICOS
Fracción de volumen intersticial
El parámetro que más se ha utilizado en la cuantificación del daño renal crónico es la fracción
de volumen intersticial cortical, puesto que a medida que aumenta la fibrosis intersticial
aumenta el volumen intersticial. Este parámetro se obtiene mediante la utilización
de una cuadrícula con puntos equidistantes que se superpone a la biopsia, tal como
se muestra en la Figura 7. Se cuenta el número de puntos que intersectan la estructura
de interés –en este caso, el espacio intersticial– y el número de puntos que intersectan
el espacio de referencia –en este caso, la porción de la biopsia con tejido cortical–. El cociente
entre el número de puntos que intersectan el espacio de interés y el espacio de
referencia constituye la fracción de volumen.
Figura 7. Cálculo de la fracción de volumen intersticial cortical. Cuadrícula superpuesta
sobre la biopsia.
La fracción de volumen intersticial es un buen predictor de la evolución de la función renal
y de la supervivencia en las biopsias de riñón de los pacientes con distintas glomerulonefritis
crónicas. Además, la fracción de volumen intersticial evaluada en las biopsias
del donante permite predecir la evolución posterior del injerto.
Se ha estudiado la posible utilidad de la fracción de volumen intersticial en la evaluación
del daño crónico en las biopsias de protocolo. Sin embargo, en las biopsias del injerto el
119

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
tamaño intersticial aumenta no sólo debido a la presencia de fibrosis intersticial, sino también
en los casos que presentan rechazo subclínico debido al infiltrado intersticial. Como
la prevalencia de rechazo subclínico es máxima durante los primeros meses y la prevalencia
de NCT aumenta en función del tiempo, se ha demostrado que en las biopsias de
protocolo realizadas a los cuatro meses la fracción de volumen intersticial constituye una
medida que traduce la severidad del infiltrado intersticial y no de la NCT. En cambio, al
año del trasplante, la fracción de volumen intersticial refleja el grado de fibrosis intersticial.
Ésta es una observación importante, ya que si queremos evaluar el efecto de un tratamiento
sobre el daño intersticial crónico mediante la fracción de volumen intersticial las
biopsias deberán realizarse pasado el primer año.
Se ha demostrado que la fracción de volumen intersticial se asocia con la supervivencia
del injerto y se ha empleado este parámetro para evaluar el tamaño muestral mínimo en
un hipotético ensayo en el que la fracción de volumen intersticial fuese la variable de eficacia
primaria. Si en la biopsia del donante la fracción de volumen intersticial es del 11%
y del 18% al año del trasplante, se estima que el tamaño muestral mínimo para detectar
una reducción del 50% en la progresión del daño intersticial durante el primer año es de
42 pacientes por grupo para un error α del 5% y un error β del 20%.
Fracción rojo sirio positiva
La tinción con rojo sirio tiñe selectivamente las fibras de colágeno y permite evaluar fácilmente
el daño crónico. La diferencia de color entre el área teñida de rojo y el fondo de
la biopsia es lo suficientemente contrastada para la utilización de técnicas de análisis de
imagen, en particular cuando la biopsia se observa bajo luz polarizada. A partir de esta tinción,
se obtiene el área rojo sirio positiva como una medida de daño crónico (Figura 8).
Figura 8. Con esta tinción se obtiene el área rojo sirio positiva como una medida de daño
crónico.
120

BIOPSIAS DE PROTOCOLO EN EL DISEÑO DE ENSAYOS CLÍNICOS
Se ha constatado que este parámetro se relaciona con la supervivencia del injerto, lo que
sugiere su potencial utilidad en el diseño de ensayos clínicos.
Fracción de volumen de la íntima arterial
La vasculopatía del trasplante se caracteriza por el engrosamiento progresivo de la íntima
arterial y es una lesión común a todos los trasplantes de órgano sólido. En una biopsia renal,
se obtienen habitualmente dos o tres secciones de arterias de pequeño tamaño.
Mediante la utilización de técnicas morfométricas, es posible conseguir la fracción de volumen
intimal en cada una de las secciones arteriales (Figura 9). Dado que la vasculopatía
del trasplante progresa en función del tiempo y es un predictor independiente de la supervivencia
del injerto renal, se ha sugerido su utilización como una variable de eficacia en
los ensayos clínicos. Si en la biopsia del donante la fracción de volumen intimal arterial es
del 13% y del 18% al año del trasplante, se ha estimado que el tamaño muestral mínimo
para detectar una reducción del 50% en la progresión del daño intersticial durante el primer
año es de 50 pacientes por grupo para un error α del 5% y un error β del 20%.
El interés por utilizar el engrosamiento intimal como una variable de eficacia en el trasplante
renal se ha visto reforzado gracias a la demostración de que la cuantificación del
Figura 9. Mediante técnicas morfométricas es posible obtener la fracción de volumen
intimal en cada una de las secciones arteriales.
121

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
engrosamiento intimal en el trasplante cardiaco mediante la ecografía intravascular permite
monitorizar el efecto de distintos tratamientos sobre la vasculopatía del trasplante.
La fracción de volumen intimal de las arterias coronarias ha evidenciado la eficacia
del everolimus y de la pravastatina en la prevención de la vasculopatía del trasplante.
RECHAZO SUBCLÍNICO Y ENSAYOS CLÍNICOS
El rechazo subclínico se define como la presencia de lesiones histológicas de cambios
de rechazo en los pacientes con una función renal estable. En estudios realizados mediante
biopsias seriadas se ha constatado que el rechazo subclínico se asocia con una
progresión más rápida de las lesiones crónicas y con una peor función renal. En distintos
estudios observacionales se ha descrito una asociación entre el tipo de tratamiento
inmunosupresor y la incidencia de rechazo subclínico. Además, se ha evidenciado que
en los pacientes tratados con tacrolimus y micofenolato la prevalencia de rechazo subclínico
a los tres meses no sólo era inferior que en los pacientes tratados con ciclosporina
y azatioprina o en aquellos tratados con ciclosporina y micofenolato, sino que la prevalencia
de NCT a los 12 meses también era más baja, lo que sugiere una relación entre
tratamiento inmunosupresor, rechazo subclínico y NCT.
Sin embargo, solamente en un estudio en el que se realizaron biopsias de protocolo a los
15 días en receptores de un riñón de donante vivo se pudo demostrar una asociación entre
el rechazo subclínico y una peor supervivencia del injerto. Aunque estos datos epidemiológicos
sugieren que el rechazo subclínico podría considerarse como una variable
de eficacia en algunos ensayos clínicos, el rechazo subclínico no ha sido utilizado como
una variable de eficacia, puesto que su relación con la supervivencia es menos consistente
que la observada entre la NCT y la supervivencia del injerto.
A pesar de que el rechazo subclínico no se considera una variable de eficacia primaria, la
asociación temporal entre la aparición precoz de rechazo subclínico y la posterior aparición
de NCT ha apuntado que el tratamiento del rechazo subclínico podría mejorar los resultados
del trasplante. Se ha realizado un ensayo clínico prospectivo y aleatorizado para tratar
el rechazo subclínico. En el grupo de estudio se obtuvo una biopsia de protocolo al mes,
dos, tres y seis meses, mientras que en el grupo control solamente se efectuó una biopsia
a los seis meses. En el grupo de estudio se administró tratamiento con bolus de esteroides
si los pacientes presentaban rechazo subclínico en la biopsia de protocolo. La fibrosis
intersticial fue menor en el grupo de estudio que en el grupo control, lo que sugería que
el tratamiento del rechazo subclínico mejoraba la evolución de los pacientes trasplantados.
CONCLUSIONES
La mejora de los resultados del trasplante ha puesto en evidencia la necesidad de replantear
el diseño de los ensayos clínicos con el fin de definir nuevas variables que permitan
122

BIOPSIAS DE PROTOCOLO EN EL DISEÑO DE ENSAYOS CLÍNICOS
discriminar la eficacia de los tratamientos actuales, con un tamaño muestral razonable y
un tiempo de seguimiento corto. La prevalencia de NCT evaluada mediante biopsias de
protocolo se ha utilizado como una variable de eficacia secundaria y, en la actualidad, como
una variable de eficacia primaria, ya que permite discriminar diferencias entre tratamientos
con pocos casos relativamente y un tiempo de seguimiento corto. La introducción de
pautas sin anticalcineurínicos ha permitido disminuir la prevalencia de NCT. A medida que
disminuye la NCT, aumenta el tamaño muestral para demostrar la superioridad de un tratamiento.
De ahí el interés que surge por las medidas cuantitativas del daño crónico del
injerto, especialmente para comparar pautas de tratamiento sin anticalcineurínicos, que
se asocian a una prevalencia baja de NCT.
BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA
1. Hariharan S, Kasiske B, Matas A, Cohen A, Harmon W, Rabb H. Surrogate markers
for long term renal allogrft survival. Am J Transplant 2004; 4: 1179-83.
2. Hunsicker LG, Bennett LE. Design of trials of methods to reduce late renal allograft
loss: the price of success. Kidney Int 1995; 48 (Suppl. 52): S120-S123.
3. Lachenbruch PA, Rosenberg AS, Bonvini E, Cavaillé-Coll MW, Colvin RB. Biomarkers
and surrogate end-points in renal transplantation: present status and considerations
for clinical trials. Am J Transplant 2004; 4: 451-7.
4. Hariharan S, McBride MA, Cohen EP. Evolution of endpoints for renal transplant outcome.
Am J Transplant 2003; 3: 933-41.
5. Kaplan B, Schold J, Meier-Kriesche. Poor predictive value of serum creatinine for renal
llograft loss. Am J Transplant 2003; 3: 1560-5.
6. Nankivell BJ, Borrows RJ, Fung CLS, O’Connell PJ, Allen RDM Chapman JR. The natural
history of chronic allograft nephropathy. N Engl J Med 2003; 349: 2326-33.
7. Isoniemi HM, Krogerus L, von Willebrand E, Taskinen E, Ahonen J, Häyry P. Histopathological
findings in well-functioning, long-term renal allografts. Kidney Int 1992; 41: 155-60.
8. Dimény E, Wahlberg J, Larsson E, Fellstrom B. Can histological findings in early renal
allograft biopsies identify patients at risk for chronic vascular rejection. Clin Transplant
1995; 9: 79-84.
9. Serón D, Moreso F, Bover J, et al. Early protocol renal allograft biopsies and graft outcome.
Kidney Int 1997; 51: 310-6.
10. Legendre C, Thervet E, Skhiri H, et al. Histologic features of chronic allograft nephropathy
revealed by protocol biopsies in kidney transplant recipients. Transplantation
1998; 65: 1506-9.
11. Serón D, Moreso F, Ramón JM, et al. Protocol renal allograft biopsies and the design
of clinical trials aimed to prevent of treat chronic allograft nephropathy. Transplantation
2000; 69: 1849-55.
12. Bosmans JL, Woestenburg A, Ysebaert DK. Fibrous intimal thickening at implantation
as a risk factor for the outcome of cadaveric renal allografts. Transplantation 2000;
69: 2238-394.
123

BIOPSIA DE PROTOCOLO EN EL TRASPLANTE RENAL
13. Lopes JA, Moreso F, Riera L, et al. Evaluation of pre-implantation kidney biopsies: comparison
of Banff criteria to a morphometric approach. Kidney Int 2005; 67: 1595-600.
14. Racusen LC, Solez K, Colvin RB, et al. The Banff 97 working classification of renal
allograft pathology. Kidney Int 1999; 55: 713-23.
15. Mota A, Arias M, Taskinen EI, et al. Sirolimus-based therapy following early cyclosporine
withdrawal provides significantly improved renal histology and function at 3
years. Am J Transplant 2004; 4: 953-961.
16. Oberbauer R, Segoloni G, Campistol JM, et al. Early cyclosporine withdrawal from a
sirolimus based-regimen results in better renal allograft survival and renal function at
48 months after transplantation. Transplant Int 2005; 18: 22-8.
17. Vincenti F, Larsen C, Durrbach A, et al. Costimulation blockade with belatacept in renal
transplntation. N Engl J Med 2005; 353: 770-81.
18. Flechner SM, Kurian SM, Solez K, et al. De novo kidney transplantation without use
of calcineurin inhibitors preserves real structure and function at 2 years. Am J Transplant
2004; 4: 1776-85.
19. Moreso F, López M, Vallejos A, et al. Serial protocol biopsies to quantify the progression
of chronic transplant nephropathy in stable renal allografts. Am J Transplantation
2000; 1: 82-8.
20. Nicholson ML, Mc Culloch TA, Harper SJ, et al. Early measurement of interstitial fibrosis
predicts long term renal function and graft survival in renal transplantation. Br
J Surg 1996; 83: 1082-5.
21. Grimm PC, Nickerson P, Gough J, et al. Computarized image analysis of sirius redstained
renal allograft biopsies as a surrogate marker to predict long-term allograft
function. J Am Soc Nephrol 2003; 14: 1662-8.
22. Nankivell BJ, Borrows RS, Fung CL, O’Conell PJ, Chapman JR, Allen RD. Natural history,
risk factors, and impact of subclinical rejection in kidney transplantation.
Transplantion 2004; 78: 242-9.
23. Rush D, Nickerson P, Gough J, et al. Beneficial effects of treatment of early subclinical
rejection: a randomized study. J Am Soc Nephrol 1998; 9: 2129-34.
24. Shishido S, Asanuma H, Nakai H, et al. The impact of repeated subclinical acute rejection
on the progression of chronic allograft nephropathy. J Am Soc Nephrol 2003; 14: 1046-52.
25. Cosio FG, Grande JP, Wadei H, Larson TS, Griffin MD, Stegall MD. Predicting subsequent
decline in kidney allograft function from early surveillance biopsies. Am J
transplant 2005; 5: 1130-6.
26. Mengel M, Bogers J, Bosmans JL, et al. Incidence of C4d stin in protocol biopsies from
renal allografts: results from a multicenter trial. Am J Transplant 2005; 5: 1050-6.
27. Moreso F, Ibernon M, Gomà M, et al. Subclinical rejection associated with chronic
allograft nephropathy in protocol biopsies as a risk factor for late graft loss. Am J
Transplantation 2006 (in press).
28. Furness PN, Philpott CM, Chorbadjian MT, et al. Protocol biopsy of the stable renal
transplant: a multicenter study of methods and complication rates. Transplantation
2003; 969.
124

BIOPSIAS DE PROTOCOLO EN EL DISEÑO DE ENSAYOS CLÍNICOS
29. Kobashigawa JA, Katznelson S, Laks H, et al. Effect of pravastatin on outcomes after
cardiac transplantation. N Engl J Med 1995; 333: 621-7.
30. Eisen HJ, Tuczu EM, Dorent R, et al. Everolimus in the prevenion of allograft rejection
and vasculopathy in cardiac transplant recipients. N Engl J Med 2003; 349: 847-58.
125