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CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTEJARDÍN BOTÁNICO CANARIO VIERA Y CLAVIJOVial code Taxon Population [μg/ml]470 Limonium spectabile Morro de La Galera. T665 Convolvulus perraudieri 316/04 cultivado JBCVC, C 62,22337 Convolvulus perraudieri Arguineguín, C 459,4490 Convolvulus baruriculatus Aluce, Gomera 222,0474 Convolvulus subaruriculatus Cañada Cabrera-Agulo, La 24,9664 Convolvulus glandulosus 2163/B/02 cultivado JBCVC, C 238,01144 Convolvulus glandulosus Amurga, C 28,42506 Convolvulus canariensis Centro Visitantes Garajonay,G 380,082614 Convolvulus canariensis Ancón Negro, G 368,0717 Convolvulus lopez-socasi 56/04 cultivado JBCVC, C 92,23868 Convolvulus lopez-socasi .Famara, L 1024,21333 Dendriopoterium Guayedra, C 5.294,01626 Dendriopoterium menendezi Aldea San Nicolás, C 49,71586 Dendriopoterium pulidoi Bco. de Tejeda, C 87,71584 Dendriopoterium pulidoi Bco. de Tejeda. C 540,22632 Bencomia exstipulata Tiro del Guanche, T 374,52634 Bencomia exstipulata Tiro del Guanche, T 1337,02023 Bencomia sphaerocarpa Fuente de Tincos, H 1223,32025 Bencomia sphaerocarpa Tabanos, H 1181,93867 Bencomia brachystachya Barranco de Tirajana, C 1377,63867.2 Bencomia brachystachya Barranco de Tirajana, C 976,9BCA16 Bencomia caudata Barranco Añavingo, T 58,7BSUP12 Bencomia caudata Barranco Seco, P 47,5Pb154 Poligonum maritimum Lobos, F 73,9Pb158 Poligonum maritimum Lobos, F 123,8Pb58 Poligonum balansae El Médano, T 60Pb59 Poligonum balansae El Médano, T 56,5- Optimización de los protocolos de amplificación y secuenciación.Según convenio, las amplificaciones se han desarrollado para tres regiones codificantes del ADNcloroplástico (rpoB, rpoC1 y matK) utilizando los cebadores universales para estas regiones aceptadospor el “Consortium for the Barcoding of Life” (CBOL de aquí en adelante). El CBOL todavía no hallegado a un consenso en cuanto a las regiones definitivas que van a utilizarse para plantas, aunqueen la reciente reunión de Nueva York, en la que el Departamento de Biodiversidad Molecular delJBCVC estuvo representado, se estableció un plazo máximo de cuatro semanas (finales de mayoprincipiosde junio de 2008) para consensuar las regiones definitivas, entre las que probablemente seencuentren al menos dos de las que se han incluido en este estudio. La relación de nuestroDepartamento con la iniciativa del código de barras de la vida y el hecho de que los ADN de estasmuestras se hallan depositados en el Banco de ADN de la Flora Canaria van a hacer posible secuenciarestas mismas muestras para cualquier otra región que se incluya en la propuesta final para plantas.Para aquellas muestras con una concentración y pureza adecuadas se montaron reacciones deamplificación (PCR) para un volumen final de 25µl y con las condiciones (nº de ciclos y tiempos)recomendadas por el CBOL, en el termociclador “Mastercycler Gradient” de la casa comercialEppendorf. En todos los casos, se utilizó el kit REDDY MIX TM PCR MASTER MIX (Abgene) y se añadióBSA al 0.4% como componente adicional del cóctel de reacción. El ADN de aquellos especimenes paralos que se obtuvo una amplificación exitosa, fue purificado con las columnas “GENELUTE PCR CLEAN-UP” (Sigma-Aldrich, C.O). Las muestras purificadas se secuenciaron con "BIG DYE V·3.1" (AppliedBiosystems, California, USA) en el secuenciador automático ABI 3100 del laboratorio de GenéticaForense de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria.Tanto para las reacciones de PCR como para las de secuenciación fue necesario realizar algunasmodificaciones (Newmaster, et al. 2007) respecto a los protocolos propuestos y recomendados porCBOL (Kress, et al, 2005; Chase et al, 2007). Algunas de estas modificaciones supusieron variacionesde la temperatura de anillamiento (Ta), de la concentración final de magnesio, del número de ciclosen el termociclador o la adición de DMSO en un 0.8%.Una vez optimizada la s condiciones de amplificación se cuantificó la concentración del productode PCR y según el tamaño de la región a secuenciar se estimó la concentración del ADN necesario aañadir al cóctel de reacción.Camino del Palmeral 1535017 Las Palmas de Gran CanariaTel.: 928 219580 Fax: 928 219581
CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTEJARDÍN BOTÁNICO CANARIO VIERA Y CLAVIJOAunque las primeras amplificaciones parecían exitosas, especialmente para las regiones rpoB yrpoC (ya que daban lugar a bandas brillantes y únicas en el gel después de electroforesis), seencontraron numerosos problemas (ruido de fondo, presencia de subproductos, secuencias queacaban repentinamente, etc) para la obtención de secuencias válidas (ver Fig 1). En consecuencia, semodificaron las concentraciones de ADN inicial en la reacción de secuenciación y se realizaron reamplificacionesde los amplicones a distintas diluciones (1/50 y 1/100), así como, se establecieronunas condiciones de amplificación más restrictivas, manteniéndose la Ta por encima de 55ºc y elnúmero de ciclos igual o por debajo de 30 ciclos para evitar la amplificación de subproductos por launión de los cebadores a distintas dianas dentro de las regiones estudiadas.Por último, se solicitaron nuevos cebadores para asegurarnos de que los problemas no se debíana un mal diseño de los que se venían utilizando o a un exceso de inespecificidad de los mismos. Estaúltima acción solucionó la mayoría de problemas que interferían con la obtención de secuenciaslimpias.Fig. 1 Diferentes cromatogramas de secuencias analizadas en esta asistencia técnica. En el cromatogramasuperior se muestra una secuencia que disminuye su señal repentinamente. En el cromatograma del centro semuestra una secuencia que presenta problemas de lectura por la presencia de subproductos. En elcromatograma de la parte inferior se muestra una secuencia limpia obtenida tras paliar los problemascomentados anteriormente.Los cromatogramas resultantes de la edición de cada una de las secuencias analizadas no losincluimos en esta Memoria final porque ocuparían muchísimo espacio pero quedan a disposición paracualquier consulta que se quiera realizar.Camino del Palmeral 1535017 Las Palmas de Gran CanariaTel.: 928 219580 Fax: 928 219581
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