TipificaciÃ³n genÃ©tica. AnÃ¡lisis genÃ©ticos de ... - Interreg Bionatura

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CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTEJARDÍN BOTÁNICO CANARIO VIERA Y CLAVIJOUna vez obtenidas las secuencias limpias, y como paso previo al análisis de datos, se realizaronbúsquedas en GENBANK, la base de datos más conocida de secuencias de ADN públicamentedisponibles, utilizando el algoritmo BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi) paracomprobar si las secuencias generadas eran similares o iguales a otras identificadas anteriormentepara la misma especie y/o región analizada.Las secuencias de GENBANK se utilizaron también para delimitar el tamaño de cada una de lastres regiones incluidas en este proyecto.Las secuencias sentido y antisentido ("forward" y "reverse") fueron editadas con el programaBIOEDIT v.5.0.6 (Hall, 1999) y alineadas con la opción CLUSTAL W (Thompson et al, 1994) de dichoprograma. La edición de los cromatogramas es importantísima para paliar posibles errores en lalectura de las bases nitrogenadas de la secuencia de ADN analizada. La edición es manual y consisteen la corroboración visual de la correspondencia de picos de diferentes colores (a cada base se leasigna un pico de color distinto) con la secuencia de bases que aparece en la parte superior delcromatograma, y la correción de la misma en los casos en que esto sea necesario. La edición esespecialmente dificultosa tanto al principio como al final de la lectura cuando los picos no estánperfectamente definidos (por saturación de la señal al principio y por debilitamiento de la señal alfinal).Una vez editadas las secuencias y para poder realizar comparaciones entre las misma, esnecesario alinearlas. Esta alineación puede realizarse también de forma manual o alternativamentecon la ayuda de un programa específico de alineamiento como el paquete informático BIOEDIT(http://www.mcbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html), de utilización gratuita y disponible en la red.Algunas indicaciones básicas para el manejo del programa BIOEDIT se incluyen como Anexo deesta Memoria.Para facilitar la alineación de cada bloque de secuencias, se incluyó como secuencia prototipo, lassecuencias de la base de datos del GENBANK que mayor porcentaje de similitud presentaba con“nuestras secuencias” tras llevar a cabo las búsquedas BLAST para cada uno de los casos.Una vez que las secuencias estaban alineadas, se procedió al cálculo de las distancias genéticas ode disimilitud, como valor orientativo de la fracción de posiciones en que las secuencias comparadasdifieren.Para cada región y género, las secuencias obtenidas se transformaron en matrices de distanciasentre pares de especies (Kress et al, 2007) utilizando el programa DNADIST que calcula distanciasentre secuencias de nucleótidos según el modelo de “Kimura-2” (Kimura, 1980).Los resultados se presentan y discuten en base a estas matrices de distancias, dado que:1. No existe todavía un protocolo de determinación de “código de barras” o un consenso deanálisis de datos para este fin, ni en animales ni en plantas.2. Los “códigos de barras” moleculares no tienen por qué estar basados en árboles, ya que lainformación útil para diferenciar especies (los caracteres exclusivos o autoapomorfías) no puede serutilizada para construir árboles (que se basan en los caracteres compartidos o sinapomorfías)-ResultadosTodas las secuencias obtenidas se suministran alineadas en formato digital en la carpeta“SECUENCIAS”, separadas en ocho sub-carpetas (una para cada género evaluado) que contienen lassecuencias para todas las especies y cada una de las tres regiones secuenciadas. Además lascorrespondientes matrices de distancia se incluyen en la caperta “MATRICES” y se reparten de igualmanera en ocho sub-carpetas para cada género y por región secuenciada. El programa necesario paravisualizar los archivos y matrices se incluye también en la carpeta BIOEDIT.Camino del Palmeral 1535017 Las Palmas de Gran CanariaTel.: 928 219580 Fax: 928 219581
CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTEJARDÍN BOTÁNICO CANARIO VIERA Y CLAVIJOEn los archivos de secuencias alineadas (.bio), se marcan con sombreado las similitudesencontradas entre las secuencias, de forma que las diferencias de cambios de nucleótidos se puedena su vez identificar en las zonas que no quedan sombreadas (Fig.2)Para cada especie se secuenciaron 2 muestras pero debido a que cada par de secuencias eraidéntico entre sí, salvo excepciones puntuales más debidas a "errores" en la lectura por superposiciónde picos, que a diferencias reales entre las mismas, tanto en los alineamientos como en las matricesde distancia se incluye una única secuencia por especie.Todas las secuencias obtenidas en el desarrollo de este estudio, serán depositadas en la web deGENBANK para que tras su homologación, aparezcan etiquetadas como códigos de barras no basadosen CoxI.Fig.2 Archivo del programa BioEdit con secuencias alineadas del género Parolinia, en las que se muestran lassimilitudes (sombreadas) y diferencias (sin sombrear) encontradas al comparar las mismas.Matrices de distancia de Kimura-2Género ConvolvulusRegión matK1 2 3 4 51. C.subauriculatus 0.0000 0.0090 0.0000 0.0030 0.01052. C.glandulosus 0.0090 0.0000 0.0090 0.0121 0.01983. C.perraudieri 0.0000 0.0090 0.0000 0.0030 0.01054. C.canariensis 0.0030 0.0121 0.0030 0.0000 0.01365. C.lopez-socasi 0.0105 0.0198 0.0105 0.0136 0.0000Región rpoB1 2 3 4 51. C.subauriculatus 0.0000 0.0180 0.1538 0.0036 0.00362. C.glandulosus 0.0180 0.0000 0.1410 0.0143 0.01433. C.perraudieri 0.1538 0.1410 0.0000 0.1585 0.15854. C.canariensis 0.0036 0.0143 0.1585 0.0000 0.00005. C.lopez-socasi 0.0036 0.0143 0.1585 0.0000 0.0000Región rpoC1 2 3 4 51. C.subauriculatus 0.0000 0.0074 0.0037 0.0112 0.00742. C.glandulosus 0.0074 0.0000 0.0074 0.0150 0.01113. C.perraudieri 0.0037 0.0074 0.0000 0.0112 0.00744. C.canariensis 0.0112 0.0150 0.0112 0.0000 0.01315. C.lopez-socasi 0.0074 0.0111 0.0074 0.0131 0.0000Camino del Palmeral 1535017 Las Palmas de Gran CanariaTel.: 928 219580 Fax: 928 219581
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