Enzygnost* Anti-HBc monoclonal - Medcorp

Enzygnost* Anti-HBc monoclonalEnzyme Immunoassay for qualitative Determination of Antibodies toHepatitis B (core)-Antigen in serum and plasmaEnzymimmunoassay zum qualitativen Nachweis von Antikörpern gegenHepatitis B (core)-Antigen in Serum oder PlasmaTest immunoenzymatique pour la détection qualitative des anticorpsanti-antigène de (core) de l’hépatite B dans le sérum ou le plasmaMetodo immunoenzimatico per la determinazione qualitativa deglianticorpi contro l’antigene dell’epatite B («core») nel siero e nel plasmaPrueba inmunoenzimática para la determinación cualitativo de losanticuerpos contra el antígeno de la hepatitis B (core) en el suero o enel plasmaTeste imunoenzimático para determinação qualitativa de anticorposcontra o antigénio da hepatite B (core) no soro ou no plasmaEnglish: Page 2 to 10Deutsch: Seite 11 bis 18Français: Pages 19 à 26Italiano: Pagina 27 fino 34Español: Pagina 35 hasta 42Português: Página 43 a 50Summary of Test Procedure Page 10Kurzanleitung Testdurchführung Seite 18La technique en bref Page 26Istruzioni in breve, esecuzione del test Pagina 34Resumen de la técnica: Página 42Resumo da técnica Página 50Bibliography/Literatur/Littérature/Bibliografia/Bibliografía/Bibliografia Page/Seite/Pagina/Página 51OUWE G13 C0541 (879) CS/R 1Edition February 2004

Enzygnost* Anti-HBc monoclonalIntended UseEnzyme Immunoassay for qualitative determination of Antibodies to Hepatitis B (core)-AntigenThe enzyme immunoassay is processed using the BEP ® II, BEP ® III and BEP ® 2000 ELISAprocessors. The test was developed for testing individual samples, not for pooled samples. Theproduct is for in vitro diagnostic use only.Summary and ExplanationAntibodies to hepatitis B (core) antigen (anti-HBc) are the first antibodies to appear in an acutehepatitis B infection. They occur shortly after the antigens HBsAg and HBeAg 1 , and often persistfor life 5 . Consequently, the determination of anti-HBc in the serum can be utilized for monitoringthe course of a hepatitis B infection 2 . Furthermore, anti-HBc can serve as a marker for the differentialdiagnosis of hepatitis A, hepatitis B, and non-A/non-B hepatitis. When the anti-HBc assayis used for screening purposes, a positive finding will indicate past contact with the hepatitis Bvirus even in cases of sera negative for HBsAg and anti-HBs. Approximately 10% of all infectionscan be detected only by the serological determination of anti-HBc 3 .Prior to the administration of hepatitis B vaccine, the anti-HBc test yields information on theimmune status of the person to be vaccinated 4 .In epidemiological studies the antibody to HBc antigen is a valuable parameter as it can bedetected over a longer period of time than the antibody to HBs antigen 5 .Principle of the MethodEnzygnost* Anti-HBc monoclonal is competitive one-step enzyme immunoassay for the in vitrodetermination of antibodies to HBcAg in serum or plasma. The anti-HBc contained in the sampleand the Anti-HBc/POD Conjugate compete for binding to the HBcAg coated onto the wells of themicrotitration plate. Unbound reactants are washed out and the enzyme activity of the peroxidaseis then determined. The enzymatic conversion of hydrogen peroxide and chromogen isterminated by the addition of dilute sulphuric acid. Due to the competitive principle of the test, thecolour intensity is inversely proportional to the concentration of anti-HBc in the sample.ReagentsMaterials providedEnzygnost* Anti-HBc monoclonal 2 x 96Enzygnost* Anti-HBc2 test platesAnti-HBc/POD Conjugate monoclonal2 x 1.2 mLConjugate Buffer (anti-HBc monoclonal)4 x 12.5 mLAnti-HBc Control Serum, negative2 x 0.7 mLAnti-HBc Control Serum, positive2 x 0.5 mLWashing Solution POD**1 x 100 mLBuffer/Substrate TMB**1 x 30 mLChromogen TMB**1 x 3 mLStopping Solution POD**1 x 100 mLEmpty bottle for Working Chromogen Solution 1 pcs.Adhesive foils6 pcs.PE bag1 pcs.Barcode table1 pcs.Instructions for use1 pcs.Further packs: 100 x 96** These components are also included in the Supplementary Reagents for Enzygnost* TMB kit(code no. OUVP).OUWE G13 C0541 (879) CS/R 2Edition February 2004

CompositionEnzygnost* Anti-HBc monoclonal (test plate): Microtitration plate coated with geneticallyengineered hepatitis B core antigen.Anti-HBc/POD Conjugate monoclonal: Monoclonal anti-HBc, peroxidase (POD)-conjugated.Preservative: phenol (max. 1 g/L)Conjugate Buffer (anti-HBc monoclonal) Tris Buffer containing Boviserin ® and Tween 20.Preservative: phenol (max. 1 g/L)Anti-HBc Control Serum, negative: Human serum, stabilised, nominal absorbance: ≥ 0.7 APreservatives: amphotericin (approx. 5 mg/L), gentamicin (approx. 100 mg/L)Anti-HBc Control Serum, positive: Human serum, stabilised, nominal absorbance: ≤ 0.1 APreservatives: amphotericin (approx. 5 mg/L), gentamicin (approx. 100 mg/L)Washing Solution POD (concentrate): Phosphate buffer solution containing Tween.Preservative: phenol (max. 1 g/L)Buffer/Substrate TMB: Hydrogen peroxide (approx. 0.1 g/L) in acetate buffer solutionPreservative: n-butanol (approx. 1%)Chromogen TMB: Tetramethylbenzidine dihydrochlorideStopping Solution POD: 0.5 N sulphuric acidWarnings and Precautions1. For In vitro diagnostic use.2. Each individual blood donation for use in manufacture of the control sera is tested for HBsAg,anti-HCV, anti-HIV1 and anti-HIV2. Only donations with negative findings are used formanufacture.Nevertheless, since absence of infectious agents cannot be proven, all materials obtainedfrom human blood should always be handled with due care, observing the precautionsrecommended for biohazardous material 6 .3. It is advisable to wear protective gloves throughout the entire test procedure.4. For disposal, it is recommended that solid infectious materials should be autoclaved for atleast one hour at +121 °C. All aspirated liquids should be collected in two receptaclesconnected in series, which should both contain a disinfectant suitable for inactivatingpathogenic human viruses. The concentrations and times specified by the manufacturer mustbe observed.Preparation of theReagentsBring all the reagents and samples to +18 to +25 °C before beginning the test (without removingthe test plate from its container).For each test plate, dilute 20 mL of Washing Solution POD to 400 mL with distilled or deionized water.Working Chromogen Solution: For each test plate, dilute 1 mL of Chromogen TMB with 10mL of Buffer/Substrate TMB in the empty plastic bottle supplied with the kit (= WorkingChromogen Solution) and store closed and protected from light. Rinse the bottle thoroughly withdistilled water after use.For technical reasons (overfill) it is not permissible to pour together the full contents of theChromogen TMB vial and of the Buffer/Substrate TMB vial.Working Conjugate Solution: For each test plate add 0.5 mL of Anti-HBc/POD Conjugate toan original vial (12.5 mL) of Conjugate Buffer (Anti-HBc monoclonal) (1+25). Shake gently tomix, avoiding the formation of foam.Storage and StabilityStored unopened at +2 to +8 °C, all components of the Enzygnost* Anti-HBc monoclonalcombination pack remain stable up to the dates of expiry given on the labels.For complete stability and storage data see Table 1 in the Appendix.OUWE G13 C0541 (879) CS/R 3

Equipment required:BEP ® II: For automatic dispensing of reagent and washingBEP ® III: For automatic processing of the test after dispensing the samples as well as forevaluationBEP ® 2000: For fully automatic processing and evaluation of the testPipettes: piston-type pipettes: 25, 100 and 1000 µLIncubator: Covered water bath (+37 ± 1 °C) or comparable incubation methodsAll the equipment used in the test must have been validated.SpecimensSuitable specimens are individual samples (human sera or EDTA/ heparinized/citrated plasma)obtained by standard laboratory techniques.The samples should be stored for not more 3 days at +2 - +8 °C. If the samples are to be storedfor a longer period of time, they must be frozen.ProcedureProcedure using the BEP ® II1. Assay scheme: Ascertain the number of wells required (= number of samples to be testedplus 6 wells for controls). Strips not required for the test should be removed from the holderand stored for later use (See Table 1 for stability data).2. Dispense samples: Pipette 25 µL/well of negative Control, into 4 wells, 25 µL of positivecontrol into the next well and then fill the following wells with 25 µL/well of undiluted sample.At the end of the series / plate pipette 25 µL of positive control once more and proceed to ”3.Dispense conjugate“ as soon as possible, max. 15 min after completion of the sampledispensing step.As an alternative to the above pipetting scheme, it is also possible to pipette the positivecontrol twice at the start of the series.Pipetting scheme: Pipette 25 µL/well of the negative control into 4 wells, 25 µL/well of thepositive control into 2 wells, and fill the subsequent wells with 25 µL/well of undiluted sample.3. Dispense conjugate: Pipette 100 µL of the Working Conjugate Solution into each well, sealwith fresh foil and immediately place into the incubator.4. Incubate: Incubate at +37 °C ± 1 °C for 60 ± 5 min., then proceed immediately to the washstep.5. Wash: Remove the foil, aspirate all the wells and wash 4 times with approx. 0.3 mL/well ofWashing Solution POD.6. Add substrate: Pipette 100 µL of Working Chromogen Solution into each well and seal theplate with fresh foil.7. Incubate: Incubate protected from light at +18 to +25 °C for 30 ± 2 min.8. Stop reaction: Remove foil, and add 100 µL of Stopping Solution POD to each well, keepingto the same timing as in „6. Add substrate“.9. Read: Read at 450 nm within one hour.The use of a photometer with two wavelengths (measurement and reference beams) isrecommended.The absorbances of the control and patient samples are to be measured at a wavelength of 450nm. The wavelength recommended for the reference reading is 650 nm (if necessary between615 nm and 690 nm).OUWE G13 C0541 (879) CS/R 4

Test procedure using the BEP ® IIIBefore using the BEP ® III, prepare the test plates and sample dispensing steps (Section 1 and 2at "Test procedure with the BEP ® II"). Immediately afterwards place the uncovered test plates(i.e. not covered with adhesive foil) into the BEP ® III. Note that partially filled test plates need tobe made up to at least half plates (6 test strips) by adding "water-filled strips". The test is thenprocessed fully automatically (see BEP ® III instruction manual).The settings for the incubation times in the BEP ® III software may differ from the times on theBEP ® II for technical reasons (system speed) but have been validated for Enzygnost* on theBEP ® III.Test procedure using the BEP ® 2000The sample dispensing steps and subsequent processing of the test are performed fully automaticallyby the analyzer (see BEP ® 2000 instruction manual).Test validationThe individual values of the absorbances for the control sera are used to calculate the meanvalues if:A neg. ≥ 0.700-0.010 ≤ A pos. ≤ 0.100If one of the absorbance values of the Anti-HBc Control Serum, negative, is outside thespecification, this value can be neglected.Both absorbance values of the positive control must comply with the specification. If theseconditions are not fulfilled, the test is to be repeated.EvaluationThe evaluations are performed automatically if the BEP ® 2000 or BEP ® III is used. Pleaseconsult the relevant instruction manuals. The following sections apply if the measurements arecarried out without using a software.Calculate the mean absorbance value of the negative controls and then calculate the cut-offvalue by multiplying the mean value by a factor of 0.4:–A neg. x 0.4 = cut-off valueThe equivocal range is defined as:cut-off ± 10%Based on the criteria of the test, the samples are classed as follows:Test result:1. A sample > cut-off + 10% ^= negative2. A sample < cut-off – 10% ^= positive3. cut-off - 10% ≤ A sample ≤ cut-off + 10% ^= equivocalIf an equivocal result is obtained the sample is to be retested in dual determination. If, in theretest, both absorbance values are above or below the equivocal range, the initial equivocalresult can be ignored and the sample can be classed as negative or positive, respectively.However, if the sample again reacts equivocally in one or both of the determinations of the retest,to obtain final clarification it is recommended that a new sample should be tested which has beencollected 2 to 4 weeks after the first sample.Limitations of the Procedure1. Samples containing sodium azide must not be used!2. Anticoagulants such as heparin, EDTA and citrate do not affect the test result.3. No interferences were observed with heat-treated samples (60 min, +56 °C).4. Serum from insufficiently coagulated blood, and cellular blood components, may lead tounreliable results.5. Samples that are haemolytic or contain rheumatoid factors do not impair the test results.6. Samples containing antibodies to CMV, and samples which are positive for anti-HBs, do notinterfere with the test result.OUWE G13 C0541 (879) CS/R 5

7. Samples from patients with circulating immune complexes as well as samples containinganti-mouse IgG were not observed to interfere with the test result.8. Samples containing antibodies to hepatitis A virus, EBV, HIV, HCV as well as lipaemic andicteric samples may exhibit elevated reactivity.9. Samples from haemodialysis patients, transplant patients, patients with multiple bloodtransfusions as well as from patients with raised transaminase values may exhibit elevatedreactivity.10. When using thawed samples, ensure good homogenization of the material prior to use.11. The pack contains a matched set of reagents. Reagents must not be interchanged with otherkits unless the reagents are from an identical lot (i.e. they must display the required 6-digit lotnumbers printed on the pack and given in the enclosed barcode table). Washing SolutionPOD, Stopping Solution POD and Working Chromogen Solution are exceptions to thisrequirement. Note that the Working Chromogen Solution must first be prepared frommatched components (do not use Chromogen TMB and Buffer/Substrat TMB from kits with adifferent number).12. Buffer/Substrate TMB, the Working Chromogen Solution and the Stopping Solution PODmust not be allowed to come into contact with heavy metal ions or oxidizing substances (donot use pipettes with metal parts in contact with the liquid!). Do not perform the substratereaction in the proximity of disinfectants containing hypochlorite. If the Working ChromogenSolution has spontaneously developed a blue colour before transferral into the test plate, thisindicates that the solution is contaminated; in such cases prepare a fresh solution in a cleancontainer. Skin contact with the above-mentioned solutions is to be avoided.13. The test plate should be protected from vibration during the incubation phase (e.g. placed ona secured floatation aid, or in a non-circulating water bath); the wells of the plate must be incontact with the thermostated water. If stabilizers are used to prevent microbialcontamination of the water, care must be taken that neither the surface of the test plate northe wells come into contact with these solutions since such contamination can lead tounspecific reactions.14. With highly reactive samples the dye may precipitate during the stopping reaction. This doesnot interfere with the photometric evaluation.15. The control sera have been prepared from native human sera. As a result, turbidity mayoccur but this has no effect on the test result.16. Dade Behring has validated use of these reagents on various analyzers to optimize productperformance and meet product specifications. User defined modifications are not supportedby Dade Behring as they may affect performance of the system and assay results. It is theresponsibility of the user to validate modifications to these instructions or use of the reagentson analyzers other than those included in Dade Behring Application Sheets or theseinstructions for use.17. Results of this test should always be interpreted in conjunction with the patient’s medicalhistory, clinical presentation and other findings.Specific Performance CharacteristicsSensitivity and SpecificityThe results for the sensitivity and specificity study are summarized in Tables 2+3 (in the Appendix).The sensitivity of the test was studied using a total of 1266 anti-HBc positive samples and theresults obtained were 96.9 to 100% (initial testing) and 97.5% (retest result). It cannot be ruledout that when the test is used on a large scale some samples may escape detection.The specificity of the test was studied using a total of 6116 anti-HBc negative blood donationsamples and the specificity results obtained were 99.2% (initial testing) and 99.6% (retestresult). Different values may be obtained depending on the group of samples used, variations inprocedure, etc.Current knowledge indicates that a positive result in the anti-HBc test is not a certain sign of HBVinfection, just as a negative test result does not reliably exclude HBV infection.OUWE G13 C0541 (879) CS/R 6

ReproducibilityThe results for intra-/inter-assay reproducibility are summarized in Table 4 (in the Appendix).For intra-assay reproducibility the coefficients of variation obtained were 3.9 to 13.6%. For interassayreproducibility the coefficients of variation obtained were 5.6 to 15.3%. These are typicaldata. Different values may however be obtained depending on variations in test procedure, etc.* Enzygnost is a registered trademark of Dade Behring Marburg GmbH in Germany and othercountries.BEP is a registered trademark of Dade Behring Marburg GmbH in the USA, in Germany andother countries.Boviserin is a registered Trademark of Aventis Behring.Dade Behring Marburg GmbH0197Emil-von-Behring-Str. 76D-35041 Marburgwww.dadebehring.comUSA Distributor:Dade Behring Inc.Newark, DE 19714 U.S.A.OUWE G13 C0541 (879) CS/R 7

Tab. 1 Enzygnost* Anti-HBc monoclonalStability and StorageMaterial/reagent State Storage Stability •Enzygnost* Anti-HBc once opened +2 to +8 °C 4 weeksmonoclonalin the bag(test plate)with the desiccantAnti-HBc/POD Conjugate once opened +2 to +8 °C 4 weeksmonoclon. ≤ -20 °C 3 monthsConjugate Buffer once opened +2 to +8 °C 4 weeksWorking Conjugate 1 + 25 +2 to +8 °C 4 weeksSolution +18 to +25 °C 1 weekAnti-HBc Control Serum, once opened +2 to +8 °C 4 weekspositiveAnti-HBc Control Serum, once opened ≤ -20 °C 3 monthsnegativeChromogen TMB once opened +2 to +8 °C expiry dateBuffer/Substrate TMB once opened +2 to +8 °C expiry dateWorking Chromogen 1+10 +2 to +8 °C 5 daysSolution +18 to +25 °C 8 hoursclosed container,protected from lightWashing Solution POD undiluted +2 to +8 °C expiry date(concentrate)once opened1:20 +2 to +8 °C 1 week1:20 +18 to +25 °C 1 dayStopping Solution POD once opened +2 to +8 °C expiry date• use each component by the expiry date at the latestTab. 2 SensitivityThe sensitivity studies performed at two independent centres (T, Tr) yielded the following data:Sample panel Number of samples Initially positive Retest positive(T) Acute HBV infection 50 50 50Chronic HBV infection 100 99 99Past HBV infection 196 190 191Follow-up samples 115 115 115(Tr) Acute HBV infection 80 79 79Chronic HBV infection 521 516 516Past HBV infection 73 73 73Follow-up samples 131 131 131OUWE G13 C0541 (879) CS/R 8

Tab. 3 SpecificityThe specificity studies performed at four independent centres (T, J, R, W) yielded the followingdata:Sample panel Number of sample Initially reactive Retest reactive(T) Normal negative sera 480 2 1(J) Normal negative sera 1943 17 12Normal negativeplasmas 494 4 2(R) Normal negative sera 731 0 0(W) Normal negative 2468 28 9sera/plasmasTab. 4 ReproducibilityThe studies on intra-assay reproducibility performed at two independent centres (T, Tr) yieldedthe following data:Sample Repeats Ratio % CV(T) 1 20 1.531 8.72 20 1.012 13.63 20 0.689 8.0(Tr) 1 15 1.559 5.02 15 1.079 3.93 15 0.951 5.4The studies on inter-assay reproducibility performed at three independent centres (T, J, Tr)yielded the following data:Sample Repeats Ratio % CV(T) 1 10 1.689 8.52 10 1.090 10.73 10 0.844 11.2(J) 1 10 1.878 4.72 10 1.329 11.53 10 1.109 15.3(Tr) 1 7 1.373 5.62 7 0.940 12.03 7 0.705 10.8Ratio = absorbance / cut-offOUWE G13 C0541 (879) CS/R 9

Tab. 5 Test procedure and programmingBEP ® IIPrepare reagents4 x 25 µL Control Serum, negative2 x 25 µL Control Serum, positive25 µL per undiluted sampleBEP ® III100 µL In the case of partially filledConjugate plates: Add water-filledstrips to make up tohalf a plate60 min ± 5 min(37 ± 1 °C)Wash 4x: BEP ® II100 µL Working AutomaticChromogen Solutionprocessing30 min ± 2 min+18 °C to +25 °Cprotected from light100 µL Stopping Solutionafter max. 1 hEvaluate at 450 nm(Referencewavelength: 650 nm)Enzygnost* Anti-HBc monoclonalTest procedure(BEP ® II, BEP ® III, BEP ® 2000)Test resultBEP ® 2000Menu programmingfor theBEP ® IIMENU NOOPERATE 1WASHINGSASPIRATESOAKTIMEDISP VOLCHANNEL NOPHOTNOOPERATE 2YESDISPENSE CONJUGATEWASHINGS 0ASPIRATENOSOAKTIME 0DISP VOL 100CHANNEL NO 1PHOTNOOPERATE 3YESWASH AND DISPENSECHROMOGENWASHINGS 4ASPIRATENOSOAKTIME 0DISP VOL 100CHANNEL NO 4PHOTNOOPERATE 4YESDISPENSE STOPPING SOLUTIONWASHINGS 0ASPIRATENOSOAKTIME 0DISP VOL 100CHANNEL NO 5PHOTYESMEAS WL 450REF WL 650BLK CORNOEVAL MODE 4GEN CUTNONEG CONT 4MAX NEG -MIN NEG 0.700FACT NEG 0.4MAX POS 0.100THRESH -CUT OFF -OUWE G13 C0541 (879) CS/R 10

Enzygnost* Anti-HBc monoclonalAnwendungsbereichEnzymimmunoassay zum qualitativen Nachweis von Antikörpern gegen Hepatitis B (core)-Antigenin Serum oder Plasma.Die Abarbeitung des Enzymimmunoassays erfolgt mit den ELISA Prozessoren BEP ® II, BEP ® IIIund BEP ® 2000. Der Test wurde entwickelt für die Untersuchung von Einzelproben, nicht vongepoolten Proben. Das Produkt darf nur für in vitro diagnostische Zwecke angewendet werden.Diagnostische BedeutungAntikörper gegen das Hepatitis B (core)-Antigen (Anti-HBc) treten bei einer akuten Hepatitis B-Infektion als erste Antikörper kurz nach den Antigenen HBsAg und HBeAg auf 1 und persistierenoft lebenslang 5 . Die Anti-HBc-Bestimmung im Serum kann demzufolge zur Überwachung desVerlaufs einer Hepatitis B-Infektion herangezogen werden 2 . Zusätzlich kann Anti-HBc als einMarker zur Differentialdiagnose von Hepatitis A, Hepatitis B und Non A/Non B-Hepatitis dienen.Wird die Anti-HBc-Bestimmung als Screening-Parameter verwendet, kann bei HBsAg und Anti-HBs-negativen Sera ein positiver Anti-HBc-Befund doch noch auf einen früheren Kontakt mitdem Hepatitis B-Virus hinweisen. Ca. 10% aller Infektionen sind nur durch die Anti-HBc-Bestimmungserologisch nachweisbar 3 .Vor der Verabreichung eines Hepatitis B-Impfstoffes gibt der Nachweis von Anti-HBc Aufschlußüber den Immunstatus des Impflings 4 .Für epidemiologische Untersuchungen ist der Antikörper gegen HBc-Antigen ein wertvoller Parameter,da er über einen längeren Zeitraum als der Antikörper gegen HBs-Antigen nachgewiesenwerden kann 5 .Prinzip der MethodeEnzygnost* Anti-HBc monoclonal ist ein Enzymimmunoassay zur In-Vitro-Bestimmung von Antikörperngegen HBcAg im Serum oder Plasma nach dem kompetitiven Einschritt-Prinzip. DasAnti-HBc der Probe konkurriert mit dem Anti-HBc/POD-Konjugat um die Bindung an das an derOberfläche der Mikrotitrationsplatte fixierte HBcAg. Nach Auswaschen der Vertiefung wird diegebundene Enzymaktivität der Peroxidase bestimmt. Die enzymatische Umsetzung vonWasserstoffperoxid und Chromogen wird durch den Zusatz von verdünnter Schwefelsäure unterbrochen.Aufgrund des kompetitiven Prinzips des Tests ist die Farbintensität der in der Probevorhandenen Anti-HBc-Konzentration umgekehrt proportional.ReagenzienInhalt der HandelspackungEnzygnost* Anti-HBc monoclonal 2 x 96Enzygnost* Anti-HBc2 TestplattenAnti-HBc/POD-Konjugat monoclonal2 x 1,2 mlKonjugat-Puffer (Anti-HBc monoclonal)4 x 12,5 mlAnti-HBc-Kontroll-Serum, negativ2 x 0,7 mlAnti-HBc-Kontroll-Serum, positiv2 x 0,5 mlWaschlösung POD**1 x 100 mlPuffer/Substrat TMB**1 x 30 mlChromogen TMB**1 x 3 mlStopplösung POD**1 x 100 mlLeerflasche für Chromogen-Gebrauchslösung1 StückAbklebefolien6 StückPE-Beutel1 StückBarcodewertetabelle1 StückPackungsbeilage1 StückWeitere Handelspackung: 100 x 96** Diese Komponenten sind auch Bestandteile der Packung Zusatz-Reagenzien für Enzygnost*TMB (Bestell-Nr. OUVP).OUWE G13 C0541 (879) CS/R 11Ausgabe Februar 2004

ZusammensetzungEnzygnost* Anti-HBc monoclonal (Testplatte): Mit gentechnologischem Hepatitis B-core-Antigenbeschichtete Mikrotitrationsplatte.Anti-HBc/POD-Konjugat-monoclonal: Monoclonales Anti-HBc, Peroxidase (POD)-konjugiert.Konservierungsmittel: Phenol (max. 1 g/l)Konjugat-Puffer (Anti-HBc monoclonal): Tris-Puffer mit Boviserin ® und Tween 20.Konservierungsmittel: Phenol (max. 1 g/l)Anti-HBc-Kontroll-Serum, negativ: Humanserum, stabilisiert, Extinktionsrichtwert: ≥ 0,7Konservierungsmittel: Amphotericin (ca. 5 mg/l), Gentamicin (ca. 100 mg/l).Anti-HBc/Kontroll-Serum, positiv: Humanserum, stabilisiert, Extinktionsrichtwert: ≤ 0,1Konservierungsmittel: Amphotericin (ca. 5 mg/l), Gentamicin (ca. 100 mg/l).Waschlösung POD (Konzentrat): Tween-haltige Phosphat-Pufferlösung.Konservierungsmittel: Phenol (max. 1g/l)Puffer/Substrat TMB: Wasserstoffperoxid (ca. 0,1 g/l) in Acetat-Pufferlösung.Konservierungsmittel: n-Butanol (ca. 1%)Chromogen TMB: Tetramethylbenzidin-dihydrochloridStopplösung POD: 0,5 N SchwefelsäureWarnungen und Vorsichtsmaßnahmen1. Nur zur in vitro diagnostischen Anwendung2. Jede individuelle Blutspende, die zur Herstellung von Kontroll-Sera vorgesehen war, wurdeauf HBsAg, auf Anti-HCV auf Anti-HIV1 und auf Anti-HIV2 untersucht. Für die Herstellungwurden nur Spenden mit negativem Befund verwendet.Unabhängig davon sollten alle aus menschlichem Blut gewonnenen Materialien wegen nieauszuschließender Gefährdung durch Krankheitserreger mit angemessener Sorgfalt unterEinhaltung der bei Biogefährdung empfohlenen Sicherheitsmaßnahmen gehandhabt werden6 .3. Das Tragen von Untersuchungshandschuhen während der gesamten Testdurchführung wirdangeraten.4. Für die Entsorgung fester infektiöser Materialien empfiehlt sich eine Autoklavierung von mindestens1 Stunde bei +121 °C. Alle abgesaugten Lösungen sind in zwei hintereinandergeschaltetenVorlagen zu sammeln. Die Vorlagen sollten ein Desinfektionsmittel enthalten, dasgeeignet ist, human-pathogene Viren zu inaktivieren. Die vom Hersteller angegebenen Konzentrationenund Einwirkungszeiten müssen beachtet werden.Vorbereitung der ReagenzienAlle Reagenzien und Proben vor Testbeginn auf +18 bis +25 °C erwärmen.Dabei die Testplatte nicht dem Behältnis entnehmen.Je Testplatte 20 ml Waschlösung POD mit destilliertem oder entionisiertem Wasser auf 400 mlverdünnen.Chromogen-Gebrauchslösung: Je Testplatte 1 ml Chromogen TMB mit 10 ml Puffer/SubstratTMB in der mitgelieferten Kunststoffflasche verdünnen (Chromogen-Gebrauchslösung)und verschlossen unter Lichtschutz aufbewahren. Flasche nach Gebrauch sorgfältig mit destilliertemWasser spülen.Wegen technisch bedingter Überfüllung ist das Zusammengießen der Flascheninhalte vonChromogen TMB und Puffer/Substrat TMB nicht zulässig.Konjugat-Gebrauchslösung: Pro Testplatte 0,5 ml Anti-HBc/POD-Konjugat zu einerOriginalabfüllung (12,5 ml) Konjugat-Puffer (Anti-HBc monoclonal) zugeben (1 + 25) undunter leichtem Schütteln mischen, aber Schaumbildung vermeiden.Haltbarkeit und LagerungsbedingungenUngeöffnet sind alle Bestandteile der Kombinationspackung Enzygnost* Anti-HBc monoclonalbei einer Lagertemperatur von +2 bis +8 °C bis zu den auf den Etiketten angegebenen Datenverwendbar.Die Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen der geöffneten bzw. gebrauchsverdünnten Reagenziensind der Tabelle 1 im Anhang zu entnehmen.OUWE G13 C0541 (879) CS/R 12

Erforderliche GeräteBEP ® II: Zur automatischen Durchführung der Reagenzien-Dosierung und der WaschschritteBEP ® III: Zur automatischen Testabarbeitung nach der Probendosierung sowie AuswertungBEP ® 2000: Zur vollautomatischen Testabarbeitung sowie AuswertungPipetten: Kolbenhubpipetten: 25, 100 und 1000 µlInkubator: Bedecktes Wasserbad (+37 ± 1 °C) oder vergleichbare InkubationsmethodenAlle zur Testdurchführung eingesetzten Geräte müssen validiert sein.UntersuchungsmaterialZur Untersuchung können Einzelproben (Human-Seren oder -EDTA/Heparin/Citrat-Plasmen)verwendet werden, welche nach Standard-Labortechniken entnommen wurden. Die Proben sollenmaximal 3 Tage bei +2 bis +8 °C gelagert werden. Zur längeren Lagerung sind die Probeneinzufrieren.TestdurchführungTestdurchführung mit BEP ® II1. Ansatzschema: Benötigte Anzahl der Auftragsstellen feststellen (Anzahl der zu untersuchendenProben plus 6 Vertiefungen für Kontrollen). Für die Testdurchführung nicht benötigte Riegeldem Halterahmen entnehmen und für die spätere Verwendung lagern (siehe Tabelle 1).2. Proben-Dosierung: In 4 Vertiefungen je 25 µl negative, in eine Vertiefung 25 µl positiveKontrolle, in die folgenden Vertiefungen je 25 µl unverdünnte Probe und am Ende der Seriebzw. Testplatte noch einmal 25 µl positive Kontrolle dosieren und die nachfolgende Konjugat-Dosierung (siehe Punkt 3.) baldmöglichst, max. 15 min nach Beendigung der Proben-Dosierunganschließen.Alternativ zu oben aufgeführtem Pipettierschema ist es auch erlaubt, die positive Kontrollezweimal zu Beginn der Testreihe aufzutragen.Pipettierschema: In 4 Vertiefungen je 25 µl negative und in 2 Vertiefungen je 25 µl positiveKontrolle einfüllen; in die folgenden Vertiefungen je 25 µl unverdünnte Proben dosieren.3. Konjugat-Dosierung: In jede Vertiefung 100 µl der Konjugat-Gebrauchsverdünnung einfüllen,mit Folie abkleben und sofort in den Inkubator stellen.4. Inkubation: 60 min ± 5 min bei +37 °C ± 1 °C inkubieren, Waschvorgang unmittelbar anschließen.5. Waschen: Folie abziehen, alle Vertiefungen absaugen und mit je ca. 0,3 ml Waschlösung 4mal waschen.6. Substrat-Dosierung: In jede Vertiefung 100 µl der Chromogen-Gebrauchslösung einfüllen,Platte mit neuer Folie abkleben.7. Substrat-Inkubation: 30 min ± 2 min bei +18 bis +25 °C lichtgeschützt inkubieren.8. Stoppreaktion: Folie entfernen. Je Vertiefung 100 µl Stopplösung POD zugeben, dabeiden gleichen Zeittakt wie bei Punkt 6. einhalten.9. Messung: Innerhalb einer Stunde bei 450 nm photometrieren.Die Verwendung eines Photometers mit zwei Wellenlängen (Meß- und Referenzstrahl) ist empfehlenswert.Die Extinktionsmessung der Kontroll- und Patientenproben erfolgt bei 450 nm, als Wellenlängeder Referenzmessung wird 650 nm (ggfs. zwischen 615 und 690 nm) empfohlen.Testdurchführung mit BEP ® IIIBei der Abarbeitung mit BEP ® III müssen die Testplatten einschließlich der Probendosierung(Punkt 1 und 2 der „Testduchführung BEP ® II“) vorbereitet werden. Unmittelbar im Anschlußdaran werden die Testplatten offen, d. h. nicht mit Folie abgeklebt, in den BEP ® III eingegeben.Dabei ist zu beachten, dass teilbestückte Testplatten mit „Wasserriegeln“ auf mindestens halbeTestplatten (6 Testriegel) zu ergänzen sind.Die anschließende Testabarbeitung erfolgt vollautomatisch(siehe BEP ® III-Bedienungsanleitung).Die in der BEP ® III Software eingestellten Inkubationszeiten können auf Grund der technischenRahmenbedingungen (Gerätetaktung) von denen der BEP ® II Prozessierung abweichen, sindjedoch in der Kombination BEP ® III/Enzygnost* validiert worden.OUWE G13 C0541 (879) CS/R 13

Testdurchführung mit BEP ® 2000Die Probendosierung und anschließende Testabarbeitung erfolgt vollautomatisch im Gerät (sieheBEP ® 2000-Bedienungsanleitung).TestvalidierungDie Einzelwerte der Extinktionen für die Kontroll-Sera werden zur Berechnung der Mittelwerteeingesetzt, wennE neg. ≥ 0,700-0,010 ≤ E pos. ≤ 0,100Von den Extinktionswerten des Anti-HBc-Kontroll-Serums, negativ, kann ein außerhalb der Spezifikationliegender Wert vernachlässigt werden.Die Extinktionswerte der positiven Kontrolle müssen beide die Spezifikation erfüllen. Werdendiese Bedingungen nicht erfüllt, ist der Test zu wiederholen.TestauswertungDie Auswertungen erfolgen mit BEP ® 2000 und BEP ® III automatisch. Bitte dazu die Bedienungsanleitungenheranziehen. Die nachfolgenden Kapitel sind bei Auswertung ohne Softwareunterstützungzu beachten.Aus den Extinktionswerten der negativen Kontrollen wird der Mittelwert gebildet.Zur Grenzwertberechnung wird der Extinktionsmittelwert der negativen Kontrollen mit dem Faktor0,4 multipliziert.–E neg. . x 0,4 = Grenzwert (cut off)Als grenzwertiger Bereich wird definiert:Grenzwert ± 10%.Nach den Kriterien des Tests werden die Untersuchungsproben wie folgt klassifiziert:Testergebnis:1. E Probe > cut off +10% ^= negativ2. E Probe < cut off – 10% ^= positiv3. cut off - 10% ≤ E Probe ≤ cut off + 10% ^= grenzwertigBei grenzwertigem Ergebnis wird die Probe erneut, dann jedoch als Doppelbestimmung getestet.Liegen in der Wiederholungstestung beide Extinktionswerte ober- bzw. unterhalb desgrenzwertigen Bereichs, so kann das initial grenzwertige Ergebnis vernachlässigt und die Probeals negativ bzw. positiv betrachtet werden. Sollte die Probe in einer oder beiden Bestimmungendes Wiederholungstests grenzwertig reagieren, empfiehlt sich zur endgültigen Abklärung dieTestung einer neuen, im Abstand von 2 bis 4 Wochen gewonnenen Probe.Einschränkungen der Testdurchführung1. Natriumazid-haltige Proben dürfen nicht verwendet werden!2. Antikoagulantien wie Heparin, EDTA und Citrat beeinflussen das Testergebnis nicht.3. Bei hitzebehandelten Proben (60 min, +56 °C) wurden keine Störungen beobachtet.4. Ungenügend geronnenes Serum sowie zelluläre Blutbestandteile können zu unzuverlässigenErgebnissen führen.5. Rheumafaktorhaltige oder hämolytische Proben führen zu keiner Testbeeinträchtigung.6. Proben mit Antikörpern gegen CMV sowie Anti-HBs positive Proben beeinflussen das Testergebnisnicht.7. Mit Proben von Patienten mit zirkulierenden Immunkomplexen sowie Anti-Maus IgG haltigenProben wurde keine Beeinflussung des Testergebnisses beobachtet.8. Proben mit Antikörpern gegen Hepatitis A Virus, EBV, HIV, HCV sowie lipämische oder ikterischeProben können erhöhte Reaktivität zeigen.9. Proben von Hämodialyse-Patienten, Transplantations-Patienten, Patienten mit mehrfacherBluttransfusion sowie Patienten mit erhöhten Transaminasen-Werten können erhöhte Reaktivitätzeigen.10. Bei aufgetauten Proben ist auf eine gute Homogenisierung des Materials zu achten.OUWE G13 C0541 (879) CS/R 14

11. Die Reagenzien (ausgenommen Waschlösung POD, Stopplösung POD und die aus denchargengebundenen Reagenzien Chromogen TMB und Puffer/Substrat TMB hergestellteChromogen-Gebrauchslösung) sind nur chargengebunden zu verwenden, d.h. nur in derKombination der einzelnen 6-ziffrigen Chargen-Bezeichnungen, die auf der Packung aufgedrucktbzw. der separat beigepackten Barcode-Tabelle zu entnehmen sind.12. Puffer/Substrat TMB, Chromogen-Gebrauchslösung und Stopplösung POD dürfen nicht inKontakt mit Schwermetallionen oder oxidierenden Substanzen kommen (keine Pipetten mitflüssigkeitsführenden Metallteilen verwenden). Die Substratreaktionen nicht in der Nähe vonHypochlorit-haltigen Desinfektionsmitteln durchführen. Eine spontane Blaufärbung derChromogen-Gebrauchslösung vor der Übertragung in die Testplatte deutet auf Kontaminationhin; eine frische Lösung ist in einem sauberen Gefäß anzusetzen. Hautkontakt mit denvorgenannten Lösungen ist zu vermeiden.13. Die Testplatte soll während der Inkubation ruhig liegen (z.B. auf fixierter Schwimmhilfe oderim nicht zirkulierenden Wasserbad); die Kavitäten sind dabei in Kontakt mit dem temperiertenWasser. Werden Stabilisatoren zur Verhinderung der Verkeimung des Wassers verwendet,so ist sorgfältig darauf zu achten, daß weder die Testplattenoberfläche noch die Näpfchenmit diesen Lösungen in Kontakt kommen, da dadurch unspezifische Reaktionen hervorgerufenwerden könnten.14. Bei stark reaktiven Proben kann bei der Stoppreaktion der Farbstoff ausfallen. Die photometrischeAuswertung wird dadurch nicht beeinflußt.15. Die Kontrollsera sind unter Verwendung nativer Humansera hergestellt. Daher können Trübungenauftreten, die das Testergebnis jedoch nicht beeinflussen.16. Dade Behring hat den Einsatz dieser Reagenzien auf verschiedenen Analysengeräten aufoptimale Produktleistung und Einhaltung der Produktspezifikationen überprüft. Vom Benutzervorgenommene Änderungen werden von Dade Behring nicht unterstützt, da sie die Leistungdes Systems und die Testergebnisse beeinflussen können. Es liegt in der Verantwortungdes Benutzers, Änderungen an diesen Anleitungen oder die Verwendung dieser Reagenzienauf anderen als in den Applikationsvorschriften von Dade Behring oder diesen Gebrauchsanweisungengenannten Analysengeräten zu validieren.17. Resultate dieses Tests sollten stets in Verbindung mit der Vorgeschichte des Patienten, demklinischen Bild und anderen Untersuchungsergebnissen interpretiert werden.Leistungsmerkmale des TestsSensitivität und SpezifitätDie Ergebnisse zur Prüfung der Sensitivität und Spezifität sind in den Tabellen 2+3 (im Anhang)zusammengefaßt.Bei der Ermittlung der Sensitivität wurden insgesamt 1266 Anti-HBc-positive Proben untersuchtund eine Sensitivität von 96,9 bis 100% (initiale Testung) bzw. 97,5% (Retestung) ermittelt. Es kannnicht ausgeschlossen werden, daß sich bei breiter Anwendung des Tests einzelne Proben demNachweis entziehen können.Bei der Ermittlung der Spezifität wurden insgesamt 6116 Anti-HBc-negative Blutspendeproben untersuchtund eine Spezifität von 99,2% (initiale Testung) bzw. 99,6% (Retestung) ermittelt. Bedingtdurch das Untersuchungskollektiv, die Testdurchführung u. a. sind abweichende Werte möglich.Nach derzeitigem Kenntnisstand kann aus einem positiven Ergebnis der Anti-HBc-Testung nichtmit Sicherheit eine HBV-Infektion abgeleitet werden, wie auch ein negatives Testergebnis keineswegseine HBV-Infektion sicher ausschließt.ReproduzierbarkeitDie Ergebnisse zur Intra/Inter-assay-Reproduzierbarkeit sind in der Tabelle 4 (im Anhang) zusammengefaßt.Für die Intra-assay-Reproduzierbarkeit wurden Variationskoeffizienten von 3,9 bis 13,6% erhalten.Für die Inter-assay-Reproduzierbarkeit wurden Variationskoeffizienten von 5,6 bis 15,3%erhalten. Es handelt sich hierbei um beispielhaft ermittelte Daten. Abhängig von der Testdurchführungu. a. sind durchaus abweichende Werte möglich.* Enzygnost ist eine eingetragene Marke der Dade Behring Marburg GmbH in Deutschland undanderen Ländern.BEP ist eine eingetragene Marke der Dade Behring Marburg GmbH in den USA, Deutschlandund anderen Ländern.Boviserin ist eine eingetragene Marke von Aventis Behring.Dade Behring Marburg GmbH0197Emil-von-Behring-Str. 76D-35041 Marburgwww.dadebehring.comOUWE G13 C0541 (879) CS/R 15

Tab. 1 Enzygnost* Anti-HBc monoclonalHaltbarkeit und LagerungsbedingungenMaterial/Reagenz Zustand Lagerung Stabilität •Enzygnost* Anti-HBc nach Öffnen +2 bis +8 °C 4 Wochenmonoclonalim Beutel mit(Testplatte)TrockenkapselnAnti-HBc/POD-Konjugat nach Öffnen +2 bis +8 °C 4 Wochenmonoclonal ≤ -20 °C 3 MonateKonjugat-Puffer nach Öffnen +2 bis +8 °C 4 Wochengebrauchsfertig verdünntes 1+25 +2 bis +8 °C 4 WochenKonjugat +18 bis +25 °C 1 WocheAnti-HBc-Kontroll-Serum, nach Öffnen +2 bis +8°C 4 WochenpositivAnti-HBc-Kontroll-Serum, nach Öffnen ≤ -20 °C 3 MonatenegativChromogen TMB nach Öffnen +2 bis +8 °C bis VerfallsdatumPuffer/Substrat TMB nach Öffnen +2 bis +8 °C bis VerfallsdatumChromogen-Gebrauchs- 1+10 +2 bis +8 °C 5 Tagelösung +18 bis +25 °C 8 Stundengeschlossenes,Gefäß, lichtgeschütztWaschlösung POD unverdünnt +2 bis +8 °C bis Verfallsdatum(Konzentrat)nach Öffnen1:20 +2 bis +8 °C 1 Woche1:20 +18 bis +25 °C 1 TagStopplösung POD nach Öffnen +2 bis +8 °C bis Verfallsdatum• in keinem Fall länger als bis zum VerfallsdatumTab. 2 SensitivitätBei den Untersuchungen zur Sensitivität wurden an zwei unabhängigen Zentren (T, Tr) folgendeDaten ermittelt:Probenkollektiv Probenanzahl initial positiv retest positiv(T) akute HBV-Infektion 50 50 50chronische HBV-Infektion 100 99 99zurückliegende HBV-Infektion 196 190 191Verlaufskontrollproben 115 115 115(Tr) akute HBV-Infektion 80 79 79chronische HBV-Infektion 521 516 516zurückliegende HBV-Infektion 73 73 73Verlaufskontrollproben 131 131 131OUWE G13 C0541 (879) CS/R 16

Tab. 3 SpezifitätBei den Untersuchungen zur Spezifität wurden an vier unabhängigen Zentren (T, J, R, W) folgendeDaten ermittelt:Probenkollektiv Probenanzahl initial reaktiv retest reaktiv(T) normal negative Seren 480 2 1(J) normal negative Seren 1943 17 12normal negative Plasmen 494 4 2(R) normal negative Seren 731 0 0(W) normal negative 2468 28 9Seren/PlasmenTab. 4 ReproduzierbarkeitBei den Untersuchungen zur Intra-assay-Reproduzierbarkeit wurden an zwei unabhängigenZentren (T, Tr,) folgende Daten ermittelt:Probe Wiederholung Ratio % CV(T) 1 20 1.531 8.72 20 1.012 13.63 20 0.689 8.0(Tr) 1 15 1.559 5.02 15 1.079 3.93 15 0.951 5.4Bei den Untersuchungen zur Inter-assay-Reproduzierbarkeit wurden an drei unabhängigenZentren (T, J, Tr) folgende Daten ermittelt:Probe Wiederholung Ratio % CV(T) 1 10 1.689 8.52 10 1.090 10.73 10 0.844 11.2(J) 1 10 1.878 4.72 10 1.329 11.53 10 1.109 15.3(Tr) 1 7 1.373 5.62 7 0.940 12.03 7 0.705 10.8Ratio = Absorption/GrenzwertOUWE G13 C0541 (879) CS/R 17

Tab. 5 Testdurchführung und -programmierungEnzygnost*Anti-HBc monoclonalTestdurchführung(BEP ® II, BEP ® III, BEP ® 2000)Vorbereitung der ReagenzienBEP ® 2000Menüprogrammierungfür denBEP ® IIBEP ® II100 µl Konjugat60 min ± 5 min(37 ± 1 °C)4 x Waschen: BEP ® II4 x 25 µl Kontroll-Serum, negativ2 x 25 µl Kontroll-Serum, positiv25 µl unverdünnte ProbeBEP ® IIIteilbestückte Platten mit„Wasserriegeln“ auf halbePlatten ergänzen100 µl Chromogen- automatischeGebrauchslösungTestabarbeitung30 min ± 2 min+18 °C bis +25 °Clichtgeschützt100 µl Stopplösungnach maximal 1 hAuswertung 450 nm(Referenzwellenlänge: 650 nm)TestergebnisMENU NOOPERATE 1WASHINGSASPIRATESOAKTIMEDISP VOLCHANNEL NOPHOTNOOPERATE 2YESDOSIERUNG KONJUGATWASHINGS 0ASPIRATENOSOAKTIME 0DISP VOL 100CHANNEL NO 1PHOTNOOPERATE 3YESWASCHEN UND DOSIERUNGCHROMOGENWASHINGS 4ASPIRATENOSOAKTIME 0DISP VOL 100CHANNEL NO 4PHOTNOOPERATE 4YESDOSIERUNG STOPPLÖSUNGWASHINGS 0ASPIRATENOSOAKTIME 0DISP VOL 100CHANNEL NO 5PHOTYESMEAS WL 450REF WL 650BLK CORNOEVAL MODE 4GEN CUTNONEG CONT 4MAX NEG -MIN NEG 0.700FACT NEG 0.4MAX POS 0.100THRESH -CUT OFF -OUWE G13 C0541 (879) CS/R 18

Enzygnost * Anti-HBc monoclonalDomaine d’utilisationTest immunoenzymatique pour la détection qualitative des anticorps anti-antigène de (core) del’hépatite B dans le sérum ou le plasma.Le test immunoenzymatique s’effectue à l’aide des ELISA Processors BEP ® II, BEP ® III et BEP ®2000. Il a été mis au point pour l’analyse d’échantillons individuels et non pas d’échantillonspoolés. Les réactifs ne peuvent être utilisés qu’à des fins de diagnostic in vitro.Intérêt diagnostiqueDans une hépatite B aiguë, ce sont les anticorps dirigés contre l‘antigène de core de l‘hépatite B(anti-HBc) qui apparalissent comme premiers anticorps peu de temps apres les antigènesAgHBs et AgHBe 1 ; ils persistent souvent toute la vie 5 . C‘est pourquoi le dosage des anti-HBcdans le sérum peut-il être utilisé pour la surveillance de l‘évolution d‘une hépatite B 2 . L‘anti-HBcpeut également servir de marqueur pour le diagnostic différentiel des hépatites A, B et non A/nonB. Lorsque l‘anti-HBc est utilisé comme paramètre de dépistage, un résultat positif en anti-HBcdans des sérums AgHBs et anti-HBs-négatifs peut indiquer un contact ancien avec le virus del‘hépatite B. Environ 10% de l‘ensemble des infections ne sont sérologiquement détectables quepar le dosage des anti-HBc 3 .Avant une vaccination contre l‘hépatite B, une recherche des anti-HBc permet de connaître l‘étatimmunitaire du sujet 4 .Pour les études épidémiologiques, l‘anti-HBc est un paramètre précieux, dans la mesure où ilest plus longtemps détectable que l‘anti-HBs 5 .Principe de la méthodeL‘Enzygnost* Anti-HBc monoclonal est un test immunoenzymatique permettant le dosage invitro des anticorps dirigés contre l‘AgHBc dans le sérum ou le plasma selon le principe decompétition en une étape. L‘anti-HBc de l‘échantillon est en compétition avec le conjugué anti-HBc/POD pour se lier à l‘AgHBc fixé à la surface de la plaque de microtitration. Après rinçagedes cupules, on mesure l‘activité enzymatique liée de la peroxydase. La transformationenzymatique du peroxyde d‘hydrogène et du chromogène est interropue par l‘addition d‘acidesulfurique dilué. Du fait du principe de compétition du test, l‘intensité de la coloration estinversément proportionnelle à la concentration d‘anti-HBc de l‘échantillon.RéactifsContenu du coffretEnzygnost* Anti-HBc monoclonal 2 x 96Enzygnost* Anti-HBcConjugué anti-HBc/POD monoclonalTampon conjugué (anti-HBc monoclonal)Sérum de contrôle anti-HBc négatifSérum de contrôle anti-HBc positifSolution de lavage POD (concentrée)**Tampon/substrat TMB**Chromogène TMB**Solution d’arrêt POD**Flacon vide pour solution d’emploi du chromogèneFeuilles adhésivesSachet PETableau de codes à barresFiche techniqueAutre conditionnement : 100 x 962 plaques-tests2 x 1,2 ml4 x 12,5 ml2 x 0,7 ml2 x 0,5 ml1 x 100 ml1 x 30 ml1 x 3 ml1 x 100 ml1 pièce6 pièce1 pièce1 pièce1 pièce** Ces éléments font également partie du Coffrert de réactifs complémentaries pour Enzygnost*TMB (code OUVP).OUWE G13 C0541 (879) CS/R 19Edition Février 2004

CompositionEnzygnost* Anti-HBc monoclonal (plaque-test): plaque de microtitration recouverte del’antigène de core de l‘hépatite B obtenu par génie génétique.Conjugué anti-HBc/POD monoclonal: anti-HBc monoclonal conjugué à la peroxydase (POD).Agent de conservation: phénol (max. 1 g/l)Tampon conjugué (anti-HBc monoclonal) Tampon Tris additionné de Boviserin ® et de Tween 20.Agent de conservation: phénol (max. 1 g/l)Sérum de contrôle anti-HBc négatif: sérum humain, stabilisé, valeur de D. O. indicative:≥ 0,7 D.O.Agent de conservation: amphotéricine (env. 5 mg/l), gentamycine (env. 100 mg/l)Sérum de contrôle anti-HBc positif: sérum humain, stabilisé, valeur de D. O. indicative:≤ 0,1 D.O.Agent de conservation: amphotéricine (env. 5 mg/l), gentamycine (env. 100 mg/l)Solution de lavage POD (concentrée): solution tampon phosphate additionnéede TweenAgent de conservation: phénol (max. 1g/l)Tampon/substrat TMB: peroxyde d’hydrogène (0,1 g/l) en solution tampon acétate.Agent de conservation: n-butanol (env. 1%)Chromogène TMB: tétraméthylbenzidine-dihydrochlorureSolution d’arrêt POD: acide sulfurique 0,5 NMises en garde et précautions d’emploi1. Ne doit être employé que pour un usage in vitro2. Tout don de sang individuel prévu pour la préparation des sérums de contrôle a été testé visà-visde l’anticorps AgHBs, de l’anticorps anti-VHC, de l’anticorps anti-VIH 1 et de l’anticorpsanti-VIH 2. Seuls les dons trouvés négatifs ont été utilisés.Néanmoins, toutes les préparations obtenues à partir de sang humain doivent êtremanipulées avec les précautions nécessaires en cas de risque biologique, dans la mesure oùl’on ne peut exclure totalement un risque d’infection 6 .3. Il est recommandé de porter des gants de protection pendant toute la réalisation du test.4. Pour décontaminer le matériel de laboratoire infecté, l’autoclaver pendant au moins 1 heure à+121 °C. Toutes les solutions aspirées doivent être récoltées dans deux récipients reliés l’unà l’autre et contenant chacun un désinfectant spécialement conçu pour inactiver les viruspathogènes pour l’homme. Respecter les concentrations et temps d’incubation indiqués parle fabricant.Préparation des réactifsPorter tous les réactifs et échantillons à +18/+25 °C avant le début du test, sans sortir la plaquetestde son emballage.Pour une plaque, diluer 20 ml de solution de lavage POD avec de l’eau distillée ou désioniséeen complétant à 400 ml.Solution d’emploi du chromogène: pour une plaque, diluer 1 ml de Chromogène TMB avec10 ml de Tampon/substrat TMB dans le flacon plastique vide inclus dans le coffret (solutiond’emploi du chromogène), et la conserver dans le flacon fermé à l’abri de la lumière. Aprèsemploi, bien rincer le flacon avec de l’eau distillée.Pour des raisons de capacité de flacon, il est impossible de verser la totalité du contenu d’unflacon de Chromogène TMB dans un flacon de Tampon/substrat TMB.Solution d’emploi du conjugué: pour une plaque, ajouter 0,5 ml de Conjugué AgHBc/PODau contenu d‘un flacon (12,5 ml) de Tampon conjugué (anti-HBc monoclonal) (dilution au 1/26),et mélanger en agitant légèrement et en évitant la formation de mousse.Stabilités et conditions de conservationTous les éléments du coffret Enzygnost* Anti-HBc monoclonal conservés à +2/+8 °C dans leurflacon ou sachet d’origine non ouvert peuvent être utilisés jusqu’à la date indiquée surl’étiquette.Pour les stabilités et conditions de conservation des réactifs ouverts ou dilués à la dilutiond’emploi, se reporter au Tableau 1 en annexe.OUWE G13 C0541 (879) CS/R 20

Matériel nécessaireBEP ® II : pour la distribution automatique des réactifs et l’automatisation des étapes delavageBEP ® III : pour l’automatisation du test après la distribution des échantillons et del’exploitation des résultatsBEP ® 2000 : pour l’entière automatisation du test et de l’exploitation des résultatsPipettes : pipettes à embout de 25, 100 et 1000 µl.Incubateur : bain-marie couvert (+37 ± 1 °C) ou méthode d’incubation équivalenteTout le matériel utilisé pour la réalisation du test doit être validé.Echantillons à testerUtiliser des échantillons (sérums humains ou plasmas citratés, héparinés ou prélevés sur EDTA)obtenus selon les techniques standard des laboratoires. Les échantillons peuvent êtreconservés 3 jours maximum à +2/+8 °C. Pour une conservation plus longue, les congeler.Réalisation du testRéalisation du test sur le BEP ® II1. Schéma de distribution: déterminer le nombre de cupules nécessaires (nombred‘échantillons à tester + 6 cupules pour les contrôles). Sortir du cadre les barrettes inutiles etles conserver pour un test futur (cf. Tableau 1).2. Distribution des contrôles et échantillons: distribuer 25 µl de contrôle négatif dans les 4premières cupules, 25 µl de contrôle positif dans la cupule 5, 25 µl de chacun deséchantillons non dilués dans les cupules suivantes, puis de nouveau 25 µl de contrôle positifà la fin de la série ou de la plaque. Enchaîner ensuite le plus rapidement possible, mais auplus tard dans les 15 min, la distribution du conjugué (cf. point 3).Comme alternative au schéma de pipetage indiqué ci-dessus, on peut également déposer lecontrôle positif deux fois en début de série.Schéma de pipetage : distribuer 25 µl de contrôle négatif dans 4 cupules, 25 µl de contrôlepositif dans 2 cupules, puis 25 µl de chacun des échantillons non dilués dans les cupulessuivantes.3. Distribution du conjugué: ajouter dans chaque cupule 100 µl du conjugué à la dilutiond‘emploi, recouvrir la plaque d‘une feuille adhésive et la placer immédiatement dansl‘incubateur.4. Incubation: laisser incuber 60 ± 2 min à +37 °C ± 1 °C, et enchaîner immédiatement leprocessus de lavage.5. Lavage: retirer la feuille adhésive, aspirer le contenu de toutes les cupules, et distribuer danschacune d’elles env. 0,3 ml de Solution de lavage; faire 4 lavages.6. Distribution du substrat: ajouter dans chaque cupule 100 µl de la solution d’emploi duchromogène, et couvrir la plaque d’une nouvelle feuille adhésive.7. Incubation du substrat: laisser incuber 30 ± 2 minutes à +18/+25 °C a l’abri de la lumière.8. Arrêt de la réaction: retirer la feuille adhésive et ajouter dans chaque cupule 100 µl deSolution d’arrêt POD en respectant le même rythme qu’en 6.9. Mesure: faire une mesure photométrique dans l’heure qui suit a 450 nm.Il est recommandé d’utiliser un photomètre avec deux longueurs d’onde (une de mesure et unede référence).La mesure de la densité optique des contrôles et des échantillons de patients se fait à 450 nm.La longueur d’onde de référence doit être de 650 nm (éventuellement comprise entre 615 à 690nm).Réalisation du test sur le BEP ® IIIPour une utilisation sur le BEP ® III, les plaques-tests doivent être préparées jusqu’y compris ladistribution des échantillons (points 1 et 2 du paragraphe « Réalisation du test sur le BEP ® II »).Immédiatement après cette étape, placer la plaque ouverte, c’est-à-dire non recouverte d’unefeuille adhésive, dans le BEP ® III. Si la plaque n’est pas totalement utilisée, la compléter aumoins pour moitié (6 barrettes) avec des barrettes remplies d’eau. La suite du test est ensuiteeffectuée entièrement automatiquement (cf. Manuel d’utilisation du BEP ® III).OUWE G13 C0541 (879) CS/R 21

Les temps d’incubation prévus dans le logiciel du BEP ® III peuvent, du fait de conditionstechniques (cadence de l’appareil), diverger par rapport à ceux du BEP ® II. Ils ont toutefois étévalidés dans la combinaison BEP ® III/Enzygnost*.Réalisation du test sur le BEP ® 2000La distribution des échantillons ainsi que toutes les étapes suivantes sont effectuées entièrementautomatiquement par l’appareil (cf. Manuel d’utilisation du BEP ® 2000).Validation du testLes différentes valeurs de densités optiques des sérums de contrôle sont utilisées pour le calculdes valeurs moyennes si:D.O. nég. ≥ 0,700-0,010 ≤ D.O. pos. ≤ 0,100Pour les valeurs du sérum de contrôle anti-HBc négatif, une seule valeur sortant du domaineindiqué peut être négligée.Les deux valeurs du contrôle positif doivent être trouvées dans le domaine indiqué. Si cesconditions ne sont pas remplies, le test doit être recommencé.Exploitation du testSur le BEP ® 2000 ou le BEP ® III, le calcul des résultats se fait automatiquement. Suivre ledéroulement du manuel d’utilisation. Le protocole indiqué ci-après permet l’exploitation desrésultats sans aide de logiciel.Calculer la valeur moyenne des densités optiques du contrôle négatif.Pour obtenir la valeur-seuil, multiplier la valeur moyenne des contrôles négatifs par le facteur 0,4.–D.O. nég. x 0,4 = valeur-seuil (cut off)La zone grise est définie comme suit:valeur-seuil ± 10%Selon les critères du test, les échantillons sont classés comme suit:Résultat du test1. D.O. échantillon > cut off + 10% ^= négatif:2. D.O. échantillon < cut off – 10% ^= positif:3. cut off - 10% ≤ D.O. échantillon ≤ cut off + 10% ^= douteuxEn cas de résultat douteux, retester l‘échantillon, cette fois en double. Si dans le deuxième testles deux densités optiques obtenues sont trouvées soit supérieures soit inférieures à la valeurseuil,la premier resultat peut être négligé, et l‘échantillon considéré comme négatif ou positif. Sil‘échantillon redonne une valeur douteuse dans l‘un ou les deux dosages il recommandé derefaire un test sur un échantillon prélevé 2 à 4 semaines plus tard.Limites du test1. Ne pas utiliser d’échantillon de patient contenant de l’azide de sodium!2. Les anticoagulants comme l‘héparine, l‘EDTA ou le citrate, n‘influencent pas les résultats du test.3. On n’a pas observé de perturbations suite à l’utilisation d’échantillons traités à la chaleur (60min à +56 °C).4. Un sérum insuffisamment coagulé ou contenant des éléments sanguins cellulaires peutdonner des résultats non fiables.5. Les échantillons hémolytiques ou contenant des facteurs rhumatoïdes ne perturbent pas le test.6. Les échantillons contenant des anticorps anti-CMV ansi que les échantillons anti-HBspositifs n’influencent pas le résultat du test.7. Aucune influence sur le résultat du test n’a été observée avec des échantillons provenant depatients avec des immuncomplexes circulants ainsi que des échantillons contenant desanticorps anti-IgG de souris.8. Les échantillons contenant des anticorps anti-virus de l’hépatite A, anti-EBV, anti-VHC ainsique les échantillons lipémiques ou ictériques peuvent présenter une réactivité augmentée.9. Les échantillons de patients hémodyalisés, transplantés, ayant eu plusieurs transfusionssanguines ou ayant des valeurs de transaminases augmentées peuvent présenter uneréactivité augmentée.OUWE G13 C0541 (879) CS/R 22

10. Si on utilise des échantillons décongelés, bien veiller à leur homogénéisation.11. Les réactifs (à l’exception de la Solution de lavage POD, de la Solution d’arrêt POD et de lasolution d’emploi du chromogène obtenue à partir des lots de réactifs indiqués pour leChromogène TMB et le Tampon/substat TMB) ne peuvent être utilisés que selon lacombinaison des numéros de lots à 6 chiffres indiqués sur le coffret et dans le tableau descodes à barres joint.12. Le Tampon/substrat TMB, la solution d’emploi du chromogène et la Solution d’arrêt POD nedoivent pas entrer en contact avec des ions de métaux lourds ni des substances oxydantes(ne pas utiliser de pipettes à parties métalliques). La réaction du substrat ne doit pas êtreeffectuée à proximité de désinfectants contenant de l’eau de Javel. Une coloration bleuespontanée de la solution d’emploi du chromogène avant son transfert dans la plaque indiqueune contamination ; préparer une nouvelle solution dans un récipient propre. Éviter toutcontact de la peau avec les solutions sus-mentionnées.13. La plaque doit rester immobile pendant toute l’incubation (la placer par ex. sur un supportfixe ou dans un bain-marie sans circulation d’eau) ; le fond des cupules doit être en contactavec l’eau thermostatée. Si l’eau contient des stabilisateurs pour éviter une contamination,bien veiller à ce que ni la surface supérieure de la plaque ni l’intérieur des cupules n’entrenten contact avec cette eau, au risque d’obtenir des réactions non-spécifiques.14. En cas d’échantillon fortement réactif, il peut y avoir précipitation lors de l’addition de la Solutiond’arrêt et du virage de la coloration, sans que cela ait d’influence sur l’exploitation photométrique.15. Les sérums de contrôle sont obtenus à partir de sérums humains natifs. Ils peuvent doncdevenir trouble, sans que cela ait d’influence sur le résultat du test.16. Dade Behring a validé l’utilisation de ces réactifs sur plusieurs analyseurs afin d’optimiser lesperformances du produit et répondre à ses spécifications. Les modifications apportées parl’utilisateur ne sont pas sous la responsabilité de Dade Behring dans la mesure où ellespeuvent affecter les performances du système et les résultats des dosages. Il est de laresponsabilité de l’utilisateur de valider toutes modifications apportées à ces instructions ouà l’utilisation des réactifs sur les analyseurs autres que ceux mentionnés dans les protocolesd’application Dade Behring ou dans la présente notice d’utilisation.17. Les résultats de ce test doivent toujours être interprétés en rapport avec les antécédentsmédicaux du patient, les signes cliniques et autres constatations.Caractéristiques du testSensibilité et spécificitéLes résultats des études de sensibilité et de specificité sont résumés dans les tableaux 2 et 3 (enannexe).Pour l‘étude de sensibilité, 1266 échantillons anti-HBc-positifs on été testés, donnant unesensibilité de 96,9 à 100% au test initial, et de 97,5% au retest. La possibilité que, dans le cadred‘une large utilisation du test, des échantillons ne soient pas révélés, ne peut être exclue.Pour l‘étude de spécificité, 6116 échantillons anti-HBc-négatifs provenant de donneurs de sangont été testés, donnant une spécificité de 99,2% au test initial, et de 99,6% au retest. Selon lecollectif étudié, la réalisation du test et d‘autres paramètres, des valeurs divergentes peuventêtre obtenues.Selon l‘état des connaissances actuelles, un résultat trouvé positif au test anti-HBc ne permetpas avec certitude de déduire une infection à HBV, de même qu‘un résultat négatif ne permet enaucun cas d‘exclure avec certitude une infection à HBV.ReproductibilitéLes résultats d‘étude de répétabilité et de reproductibilité sont résumés dans le tableau 4 (en annexe).Pour la répétabilité, les coefficients de variation ont été trouvés entre 3,9 et 13,6%, et pour lareproductibilité, entre 5,6 et 15,3%. Ce sont des données qui ne peuvent être prises qu‘à titred‘exemple. Selon la réalisation du test ou d‘autres paramètres, des valeurs divergentes peuventtout-à-fait être obtenues.* Enzygnost est une marque déposée de Dade Behring Marburg GmbH en Allemagne et dansd’autres pays.BEP est une marque déposée de Dade Behring Marburg GmbH aux USA, en Allemagne et dansd’autres pays.Boviserin est une marque déposée de Aventis BehringDade Behring Marburg GmbH0197Emil-von-Behring-Str. 76D-35041 Marburgwww.dadebehring.comOUWE G13 C0541 (879) CS/R 23

Tab. 1 Enzygnost* Anti-HBc monoclonalStabilités et conditions de conservationEchantillons/réactifs état conservation stabilité •Enzygnost* Anti-HBc après +2/+8 °C 4 semainesmonoclonal ouverture dans sachet avec(plaque-test)capsule dessicativeConjugué anti-HBc/POD après +2/+8 °C 4 semainesmonoclonal ouverture ≤ -20 °C 3 moisTampon conjugué après +2/+8 °C 4 semainesouvertureConjugué à la dilution 1/26 +2/+8 °C 4 semainesd‘emploi +18/+25 °C 1 semaineSérum de contrôle après +2/+8 °C 4 semainesanti-HBc positifouvertureSérum de contrôle après ≤ -20 °C 3 moisanti-HBc négatifouvertureChromogène TMB après +2/+8 °C date deouverturepéremptionTampon/substrat TMB après +2/+8 °C date deouverturepéremptionSolution d‘emploi du 1/11 +2/+8 °C 5 jourschromogènedans récipientfermé à l‘abride la lumièreà TA (+18/+25 °C) 8 heuresSolution de lavage POD après +2/+8 °C date de(concentrée) ouverture péremption1/20 +2/+8 °C 1 semaine+18/+25 °C 1 jourSolution d‘arrêt POD après +2/+8 °C date deouverturepéremption• jamais au-delà de la date de péremptionTab. 2 SensibilitéLes études de sensibilité effectuées dans deux centres indépendants (T, Tr) ont donné lesrésultats suivants:collectif d‘échantillons nombre d‘échantillon positif au test positif au retest(T) infection aiguë à HBV 50 50 50infection chronique à HBV 100 99 99infection ancienne à HBV 196 190 191échantillons de contrôled‘evolution 115 115 115(Tr) infection aiguë à HBV 80 79 79infection chronique à HBV 521 516 516infection ancienne à HBV 73 73 73échantillons de contrôled‘evolution 131 131 131OUWE G13 C0541 (879) CS/R 24

Tab. 3 SpécificitéLes études de spécificité effectuées dans quatre centres indépendants (T, J, R, W) ont donné lesrésultats suivants:collectif d‘échantillons nombre d‘échantillon positif au test positif au retest(T) sérums négatifs normaux 480 2 1(J) sérums négatifs normaux 1943 17 12plasmas négatifs normaux 494 4 2(R) sérums négatifs normaux 731 0 0(W) sérums/plasmas 2468 28 9négatifs normauxTab. 4 ReproductibilitéLes études de sensibilité effectuées dans deux centres indépendants (T, Tr) ont donné lesrésultats suivants:échantillon nombre de passages ratio CV %(T) 1 20 1.531 8.72 20 1.012 13.63 20 0.689 8.0(Tr) 1 15 1.559 5.02 15 1.079 3.93 15 0.951 5.4Les études de reproducibilité effectuées dans trois centres indépendants (T, J, Tr) ont donné lesrésultats suivants:échantillon nombre de passages ratio CV %(T) 1 10 1.689 8.52 10 1.090 10.73 10 0.844 11.2(J) 1 10 1.878 4.72 10 1.329 11.53 10 1.109 15.3(Tr) 1 7 1.373 5.62 7 0.940 12.03 7 0.705 10.8ratio = densité optique/valeur-seuilOUWE G13 C0541 (879) CS/R 25

Tabl. 5 : Réalisation du test et programmationEnzygnost* Anti-HBc monoclonalRéalisation du testProgrammation du menu(BEP ® II, BEP ® III, BEP ® 2000)pour lepréparation des réactifsBEP ® IIBEP ® 2000MENU NO4 x 25 µl de Sérum de contrôle négatif2 x 25 µl de Sérum de contrôle positifOPERATE 125 µl de chaque échantillon non diluéWASHINGSASPIRATESOAKTIMEDISP VOLBEP ® IIBEP ® III CHANNEL NOPHOT100 µl de conjugué compléter éventuellementla plaque à mi-plaque avecdes barrettes remplies d’eau60 min à ± 5 min(37 ± 1 °C)4 lavages: BEP ® II100 µl de solution réalisationd’emploi du chromogèneautomatique du test30 min ± 2 min+18 °C/+25 °Cà l’abri de la lumière100 µl de Solution d’arrêtaprès 1 h maximumexploitation à 450 nm(longueur d’onde deréférence : 650 nm)résultat du testNOOPERATE 2YESDISTRIBUTION DU CONJUGUÉWASHINGS 0ASPIRATENOSOAKTIME 0DISP VOL 100CHANNEL NO 1PHOTNOOPERATE 3YESLAVAGE ET DISTRIBUTION DUCHROMOGÈNEWASHINGS 4ASPIRATENOSOAKTIME 0DISP VOL 100CHANNEL NO 4PHOTNOOPERATE 4YESDISTRIBUTION DE LA SOLUTIOND'ARRÊTWASHINGS 0ASPIRATENOSOAKTIME 0DISP VOL 100CHANNEL NO 5PHOTYESMEAS WL 450REF WL 650BLK CORNOEVAL MODE 4GEN CUTNONEG CONT 4MAX NEG -MIN NEG 0.700FACT NEG 0.4MAX POS 0.100THRESH -CUT OFF -OUWE G13 C0541 (879) CS/R 26

Enzygnost* Anti-HBc monoclonalSettori d’impiegoMetodo immunoenzimatico per la determinazione qualitativa degli anticorpi contro l’antigenedell’epatite B («core») nel siero e nel plasma.L’esecuzione del test immunoenzimatico avviene su processore ELISA BEP ® II, BEP ® III eBEP ® 2000. Il test è stato sviluppato per l’analisi di campioni singoli e non per pool di campioni.Il prodotto deve essere impiegato solo per scopi diagnostici in vitro.Significato diagnosticoGli anticorpi contro l‘antigene «core» dell‘epatite B (anti-HBc) si manifestano nella fase acuta diuna infezione da virus dell‘epatite B come primi anticorpi subito dopo la comparsa degli antigeniHBsAg e HBeAG 1 e persistono spesso per tutta la vita 5 . La determinazione anti-HBc nel sieropuò essere utile per il controllo del decorso dell‘infezione da virus dell‘Epatite B 2 . L’anti-HBc puòservire inoltre come marker per la diagnosi differenziale delle epatiti A, B e non A e non B. Se ladeterminazione dell‘anti-HBc viene utilizzata come parametro di screening su sieri negativi perl‘HBsAg e per l‘anti HBs, un risultato positivo anti-HBc può essere indice di un precedentecontatto con il virus dell‘epatite B. Circa il 10% di tutti i casi di infezione possono essere rilevatisierologicamente soltanto con la determinazione degli anticorpi anti-HBc 3 .L’identificazione degli anticorpi anti-HBc è utile per la definizione dello stato immunitario deipazienti prima di essere vaccinati contro il virus dell‘epatite B 4 .Gli anticorpi contro l’antigene HBc sono un parametro importante per la ricerca epidemiologica,poichè possono essere rilevati per un periodo più prolungato degli anticorpi contro l‘antigeneHBs 5 .Principio del metodoL‘Enzygnost* anti-HBc monoclonale è un test immunoenzimatico per la determinazione in vitrodegli anticorpi contro l‘HBcAg nel siero o nel plasma secondo la tecnica competitiva ad unafase. L‘anti-HBc presente nel campione in esame compete con il coniugato anti-HBc/POD per illegame con l‘antigene HBcAg fissato sulla superficie dei pozzetti della piastra dimicrotilolazione. Dopo il lavaggio dei pozzetti viene determinata l‘attività enzimatica dellaperossidasi. La reazione enzimatica del perossido di idrogeno e del cromogeno viene bloccatacon l‘aggiunta di acido solforico diluito. In relazione alla tecnica competitiva del test l‘intensitàdel colore sviluppato è inversamente proporzionale alla concentrazione di anti-HBc presentenel campione in esame.ReagentiContenuto della confezioneEnzygnost* anti-HBc monoclonalEnzygnost* anti-HBcConiugato anti-HBc/POD, monoclonaleTampone per il coniugato (anti-HBc monoclonale)Siero di controllo anti-HBc, negativoSiero di controllo anti-HBc, positivoSoluzione di lavaggio POD (concentrata)**Tampone/substrato TMB**Cromogeno TMB**Soluzione bloccante POD**Flacone vuoto per la soluzione d’uso del cromogenoFogli adesiviSacchetti in PETabella con codice a barreIstruzioni per l’usoUlteriori confezioni: 100 x 962x962 piastre test2 x 1,2 mL4 x 12,5 mL2 x 0,7 mL2 x 0,5 mL1 x 100 mL1 x 30 mL1 x 3 mL1 x 100 mL1 pz6 pz1 pz1 pz1 pz** Questi componenti sono inclusi anche nel Kit Reagenti Supplementari per Enzygnost* TMB(codice OUVP).OUWE G13 C0541 (879) CS/R 27 Edizione Febbraio 2004

ComposizioneEnzygnost* anti-HBc monoclonale (piastra test): piastra per microtitolazione sensibilizzatacon l‘antigene «core» d‘epatite B prodotto con tecniche di ingegneria genetica.Coniugato anti-HBc/POD, monoclonale: anti-HBc monoclonale, coniugato con perossidasi(POD).Conservante: fenolo (max. 1 g/L)Tampone per coniugato (anti-HBc monoclonale) Tampone Tris contente Boviserina ® eTween 20.Conservante: fenolo (max. 1 g/L)Siero di controllo anti-HBc, negativo: siero umano, stabilizzato, valore nominale di estinzione: ≥ 0,7Conservanti: amfotericina (ca. 5 mg/L), gentamicina (ca. 100 mg/L).Siero di controllo anti-HBc, positivo: siero umano, stabilizzato, valore nominale di estinzione: ≤ 0,1Conservanti: amfotericina (ca. 5 mg/L), gentamicina (ca. 100 mg/L).Soluzione di lavaggio POD (concentrata): soluzione di tampone fosfato contenente Tween.Mezzo di conservazione: fenolo (ca. 1g/L)Tampone substrato TMB: perossido di idrogeno (0,1 g/L) in soluzione tampone acetato.Mezzo di conservazione: n-butanolo (max. 1%).Cromogeno TMB: tetrametilbenzidina-cloridratoSoluzione bloccante POD: acido solforico 0,5 NAvvertenze e precauzioni1. Solo per uso diagnostico in-vitro2. Ogni donazione di sangue utilizzata per la produzione dei sieri di controllo è stata esaminataper la ricerca della HBsAg e degli anticorpi anti-HCV, anti-HIV1 e anti-HIV2. Solo i campionirisultati negativi sono stati impiegati per la produzione.Tuttavia, tutti i derivati da sangue umano devono essere trattati con le necessairieprecauzioni rispettando le norme di sicurezza sul rischio biologico, in quanto non è possibileescludere con assoluta certezza il pericolo di agenti patogeni 6 .4. Si consiglia l’uso di guanti di protezione durante l’intera esecuzione del test.5. Per lo smaltimento del materiale solido infettivo si consiglia il trattamento in autoclave peralmeno 1 ora a +121 °C. Tutti i liquidi aspirati devono essere raccolti in due contenitori collegatiin serie, i quali dovrebbero contenere un disinfettante adatto all’inattivazione dei virus patogeniumani. Osservare le concentrazioni ed i tempi di azione indicati dal produttore.Preparazione dei reagentiPortare tutti i reagenti ed i campioni in esame a +18/+25 °C prima dell‘inizio del test. Non toglierela piastra test dal sacchetto di alluminio.Per ogni piastra test diluire 20 mL di liquido di lavaggio POD con 400 mL di acqua distillata odeionizzata.Soluzione d’uso di cromogeno: per ogni piastra test diluire 1 mL di cromogeno TMB con 10mL di tampone/substrato TMB nel flacone vuoto appositamente fornito (soluzione d’uso dicromogeno), e custodire ben chiuso al riparo dalla luce. Dopo l’uso, lavare accuratamente ilflacone con acqua distillata.A causa della dimensione del flacone non è possibile versare il cromogeno TMB direttamentenel tampone/substrato.Soluzione d’uso di coniugato: per ogni piastra test aggiungere 0,5 mL di coniugato anti-HBc/POD al contenuto di una confezione originale (12,5 mL) di tampone coniugato (anti-HBcmonoclonale), (diluizione 1:25) e mescolare agitando delicatamente, evitando la formazione dischiuma (= soluzione di coniugato pronta per l‘uso).Conservazione e validitàPrima dell’apertura, tutte le componenti della confezione Enzygnost* anti-HBc monoclonalepossono essere utilizzate fino alla data di scadenza indicata in etichetta, purchè conservate a+2/+8 °C.La conservazione e la validità dei reagenti pronti per l’uso, dopo l’apertura, sono riportate inappendice nella Tabella 1.OUWE G13 C0541 (879) CS/R 28

Strumentazione necessariaBEP ® II:Per la dispensazione automatica dei reagenti e della soluzione dilavaggioBEP ® III:Per l’esecuzione automatica e valutazione del test, dopo ladistribuzione dei campioniBEP ® 2000:per l’esecuzione automatica del test e la valutazione dei risultatiPipette:Pipette automatiche da 25, 100 e 1000 µl.Sistema di incubazione: bagnomaria coperto (+ 37 ± 1 °C) o analoghi metodi di incubazione.Tutta la strumentazione usata nel test deve essere validata.CampioniSi impiegano come campioni in esame quelli singoli (siero umano o plasma citratato/eparinizzato/EDTA) ottenuti da tecniche standard di laboratorio. I campioni devono essereconservati a + 2/+ 8 °C per non più di 3 giorni. Se i campioni devono essere conservati per unlungo periodo di tempo, devono essere congelati.Esecuzione del testEsecuzione del test con il BEP ® II1. Schema di distribuzione: definire il numero di pozzetti necesari. (Numero di campioni inesame + 6 pozzetti per i controlli). Per l‘esecuzione del test togliere le file di pozzetti nonutilizzate e conservarle per un successivo uso (vadi tabella 1).2. Distribuzione dei campioni: distribuire 25 µL/pozzetto di controllo negativo in 4 pozzetti, 25µL di controllo positivo nel pozzetto successivo, quindi distribuire 25 µL/pozzetto delcampione non diluito nei pozzetti successivi. Alla fine della serie o della piastra distribuireancora una volta 25 µL di controllo positivo ed effettuare nel più breve tempo possibile, almassimo entro 15 min. dalle distribuzione dei campioni, ladistribuzione del coniugato (ved.punto 3).In alternativa al suriportato schema di distribuzione, è possibile distribuire il controllo positivodue volte all’inizio della serie.Schema di distribuzione: distribuire 25 µL di siero di controllo negativo in ognuno dei primi4 pozzetti e 25 µL di siero di controllo positivo nei 2 pozzetti successivi; distribuire in ognunodei successivi pozzetti 25 µL di campione non diluito.3. Distribuzione del coniugato: distribuire in ogni pozzetto 100 µL di coniugato diluito perl‘uso, coprire con un foglio adesivo e inserire immediatamente nel sistema di incubazione.4. Incubazione: incubare la piastra coperta con un foglio adesivo a +37/± 1 °C per 60 ± 5 mon.Al termine inserirla immediatamente nel dispositivo di lavaggio.5. Lavaggio: rimuovere il foglio adesivo, aspirare tutti i pozzetti e lavare 4 volte con ca. 0,3 mLdi soluzione di lavaggio.6. Distribuzione del substrato: distribuire in ogni pozzetto 100 µL di soluzione d’uso dicromogeno. Copire la piastra con un nuovo foglio adesivo.7. Incubazione del substrato: incubare per 30 ± 2 min, a +18/+25 °C al riparo dalla luce.8. Arresto della reazione: rimuovere il foglio adesivo e aggiungere in ogni pozzetto 100 µL disoluzione bloccante POD, osservando la stessa cadenza del punto 6.9. Valutazione: leggere fotometricamente i risultati a 450 nm entro 1 ora.Si consiglia l’uso di un fotometro con due lunghezze d’onda (raggio di misura e raggio diriferimento).Effettuare la misurazione dei valori di estinzione dei campioni di controllo e dei pazienti a450 nm. Si consiglia una lunghezza d’onda della misura di riferimento di 650 nm (fra 615 nm e690 nm).OUWE G13 C0541 (879) CS/R 29

Esecuzione del test usando il BEP ® IIIPrima di utilizzare il BEP ® III, preparare le piastre test ed eseguire le operazioni didispensamento dei campioni (Paragrafo 1 e 2 in ”Esecuzione del test con il BEP ® II”). Subitodopo porre le piastre non coperte da foglio adesivo nel BEP ® III. Attenzione: le piastreparzialmente riempite devono essere completate almeno a metà piastra (6 strip) aggiungendo”strip riempite con acqua”. Il test viene quindi eseguito in modo completamente automatico (v.Manuale d’uso BEP ® III).Le impostazioni per i periodi di incubazione nel software del BEP ® III possono differire dai periodidel BEP ® II per motivi tecnici (velocità del sistema), ma sono state validate per i metodiEnzygnost* sul BEP ® III.Esecuzione del test usando il BEP ® 2000Le fasi di dispensazione del campione e la successiva esecuzione del test sono eseguite inmaniera completamente automatica dall’analizzatore (v. manuale d’uso del BEP ® 2000).Validità del testI singolil valori di estinzione per i sieri di controllo vengono utilizzati per calcolare il valore medio quando:Eneg. ≥ 0,700-0,010 ≤ Epos. ≤ 0,100Se uno dei valori di estinzione del siero di controllo negativo anti-HBc non rientra nell valoreatteso, non viene preso in considerazione.I valori di estinzione dei controlli positivi devono essere compresi nell‘ambito indicato. Se nonsussistono queste condizioni, il test deve essere ripetuto.Valutazione del testSul BEP ® 2000 o BEP ® III, il calcolo dei risultati viene eseguito automaticamente. Consultare il rispettivomanuale d’uso. I seguenti capitoli permettono la valutazione dei risultati senza l’ausilio del software.Dai valori di estinzione dei controlli negativi si calcola il valore medio.Per valutare il valore soglia si moltiplica il valore medio di estinzione del controllo negativo per ilfattore 0,4.–E neg. x 0,4 = valore soglia (cut off)L‘ambito limite viene così definito:valore soglia ± 10%Secondo i criteri del test i campioni in esame vengono classificati come segue:Risultato del test:1. E campione > cut off + 10% = campione ^= «negativo»2. E campione > cut off - 10% = campione ^= «temporaneamente positivo»3. cut off -10% ≤ E campione ≤ cut off + 10% ^= campione «dubbio»Con un risultato dubbio la prova deve essere ripetuta in doppio. Se, dopo aver ripetuto il test,entrambi i valori di estinzione risultano rispettivamente al di sopra o al di sotto dell‘ambito del valoredubbio, il valore ottenuto inizialmente non deve essere considerato e il campione deve essereconsiderato rispettivamente negativo o positivo. Se i campioni, in una o in entrambe ledeterminazione del test di ripetizione, reagiscono al limite dei valori, si consiglia, per una definitivachiarificazione del risultato, di ripetere il test su un campione prelevato a distanza di 2–4 settimane.Limitazioni della esecuzione del test1. Non devono essere utilizzati campioni contenenti sodio azide!2. Gli anticoagulanti come l’eparina, l’EDTA e il citrato non influenzano il risultato del test.3. Non sono state riscontrate interferenze nei campioni trattati al calore (60 minuti a +56 °C).4. I sieri provenienti da sangue non completamente coagulato, come anche componenticellulari del sangue, possono portare a risultati in inesatti.5. Campioni emolizzati o contenenti fattori reumatoidi non influenzano i risultati del test.6. I campioni contenenti anticorpi anti-CMV ed i campioni positivi per l’anti-HBs noninterferiscono con il risultato del test.7. I campioni di pazienti con immunocomplessi circolanti ed i campioni contenenti IgG direttecontro anticorpi murini non presentano interferenze con il risultato del test.8. I campioni contenenti anticorpi contro il virus dell’epatite B, EBV, HIV, HCV ed i campionilipemici ed itterici possono presentare una elevata reattività.9. I campioni di pazienti emodializzati, trapiantati o sottoposti a trasfusioni di sangue multipleed i campioni di pazienti con valori di transaminasi aumentati possono presentare unaelevata reattività.OUWE G13 C0541 (879) CS/R 30

10. Quando si utilizzano campioni scongelati, assicurarsi di una buona omogeneizzazione delmateriale prima dell’uso.11. E' necessario utilizzare solo reagenti appartenenti tutti ad uno stesso lotto (ad esclusione dellasoluzione di lavaggio POD, la Soluzione bloccante POD e la Soluzione d'uso del cromogenopreparata con i reagenti Cromogeno TMB e Tampone/Substrato TMB appartenenti tutti allostesso lotto). La combinazione ammessa dei numeri di lotto a 6 cifre (Lot. nr.) e quellastampata sulla confezione ed anche riportata nell'allegata tabella dei codici a barre.12. Il tampone/substrato TMB, la soluzione d’uso del cromogeno e la soluzione bloccante PODnon devono entrare in contatto con ioni di metalli pesanti o sostanze ossidanti (non utilizzarepipette con parti metalliche a contatto con il liquido!). Non eseguire la reazione con il substratoin presenza di disinfettanti contenenti ipoclorito. Se la soluzione d’uso del cromogeno si coloraspontaneamente di blu prima del dispensamento nella piastra test significa che la soluzione èstata contaminata; in tal caso preparare nuovamente la soluzione fresca in un contenitorepulito. Evitare il contatto di queste soluzioni con la cute.13. Durante la fase di incubazione la piastra test deve rimanere immobile (ad esempio utilizzare unsupporto fisso ed evitare bagnomaria a circolazione d’acqua); i pozzetti della piastra devonoessere a contatto con l’acqua termostatata. Se vengono utilizzati stabilizzanti per evitare lacontaminazione batterica dell’acqua, occorre fare attenzione che la superficie della piastra tested i pozzetti non vengano a contatto con queste soluzioni, in quanto simili contaminazionipossono produrre reazioni aspecifiche.14. In presenza di campioni fortemente reattivi si può verificare la formazione di un precipitatoentro la soluzione colorata. Tuttavia la valutazione fotometrica non viene compromessa.15. Il siero di controllo è stato ottenuto da siero umano nativo. Possono manifestarsi intorbidamenti,che però non interferiscono sui risultati del test.16. Dade Behring ha validato l’uso di questi reagenti su vari analizzatori per ottimizzare leprestazioni e rispettare le specifiche dei prodotti. Le modifiche definite dall’utente non sonosupportate da Dade Behring poiché possono influire sulle prestazioni del sistema e suirisultati del test. Pertanto è responsabilità dell’utente validare tutte le modifiche apportate aqueste istruzioni, l’uso dei reagenti su analizzatori diversi da quelli inclusi nei fogli diistruzioni o nelle istruzioni d’uso fornite da Dade Behring.17. I risultati di questo test devono essere sempre interpretati alla luce della anamnesi delpaziente, della presentazione clinica e valutando contestualmente l’esito di altri accertamenti.Caratteristiche del testSensibilità e specificitàI risultat per la valutazione della sensibilità e della specificità sono riportati nelle tabelle 2 e 3 (in appendice).Per la valutazione della sensibilià sono stati esaminati complessivamente 1266 campioni anti-HBc positivi ed è stata rilevata una sensibilità da 96,9 a 100% (test iniziale) e di 97,5% (doporipezzione del test). Nonsi può tuttavia escludere la possibilità che, con l‘impiego del test suvasta scala, qualche particolare campione possa risultare non identificato.Per la valutazione della specificità sono stati esaminati 6116 campioni di sangue anti-HBcnegativi ed e stata rilevata una specificità da 99,2% (test iniziale) e da 99,6% (dopo ripetizionedel test). Possibili scostamenti da tali valori possono dipendere dal tipo di collettività esaminata,dalle modalità di esecuzione del test o da altre variabili.Scondo to stato attuale delle conoscenze un risultato positivo al test anti-HBc non permette didiagnosticare con certezza un‘infezione da HBV, cosi come un risultato negativo del test nonpuò escudere con assoluta certezza la presenza di un‘infezione da HBV.RiproducibilitàI risultati della riproducibilità intra-ed inter-assay sono riportati nella tabella 4 (in appendice).Per quanto riguarda la riproducibilità intra-assay i coefficienti di variazione ottenuti variano da3,9 a 13,6%. Per la riproducibilità inter-assay i coefficienti di variazione ottenuti variano da 5,6 a15,3%. I dati ottenuti sono da considerare come esempio. Possibili scostamenti da tali valoripossono dipendere dalle modalità di esecuzione del test.* Enzygnost è un marchio registrato della Dade Behring Marburg GmbH negli Germania e altri paesi.BEP è un marchio registrato della Dade Behring Marburg GmbH negli Stati Uniti, Germania e altri paesi.Boviserina è un marchio registrato della Aventis BehringDade Behring Marburg GmbH0197Emil-von-Behring-Str. 76D-35041 Marburgwww.dadebehring.comOUWE G13 C0541 (879) CS/R 31

Tab. 1 Enzygnost* Anti-HBc monoclonaleConservazione e validitàCampioni/Reagenti Condizioni Conservazione Stabilità •Enzygnost* anti-HBc dopo apertura +2/+8 °C 4 settimanemonoclonale(nel sacchetto con(piastra test)l‘essiccante)Coniugato anti-HBc/POD dopo apertura +2/+8 °C 4 settimane≤ -20 °C3 mesTampone per ol coniugato dopo apertura +2/+8 °C 4 settimaneConiugato diluito per 1 + 25 +2/+8 °C 4 settimanel‘uso +18/+25 °C 1 settimaneSiero di controllo anti-HBc, dopo apertura +2/+8 °C 4 settimanepositivoSiero di controllo anti-HBc, dopo apertura ≤ -20 °C 3 mesnegativoCromogeno TMB dopo apertura +2/+8 °C data di scadenzaTampone/Substrato TMB dopo apertura +2/+8 °C data di scadenzaSoluzione Cromogeno 1+10 +2/+8 °C 5 giorni+18/+25 °C 8 ore(ben chiuso, protettodalla luce)Soluzione di lavaggio POD non diluita +2/+8 °C data di scadenza(concentrata)dopo apertura1:20 +2/+8 °C 1 settimane1:20 +18/+25 °C 1 giornoSoluzione bloccante POD dopo apertura +2/+8 °C data di scadenza• In nessun caso oltre la data di scadenzaTabella 2: sensibilitàPer la valutazione della sensibilità sono stati forniti da due centri indipendenti (T, Tr) i seguentidai:Insieme del campioni Numero di Inizialmente Reattivi dopocampioni reattivi ripetizione(T) Infezione acuta da HBV 50 50 50Infezione cronica da HBV 100 99 99Infezione da HBV risolta 196 190 191Controlli del decorso 115 115 115(Tr) Infezione acuta da HBV 80 79 79Infezione cronica da HBV 521 516 516Infezione da HBV risolta 73 73 73Controlli del decorso 131 131 131OUWE G13 C0541 (879) CS/R 32

Tabella 3: specificitàPer la valutazione della specificità sono stati forniti da quatro centri indipendenti (T, J, R, W)i seguenti dai:Insieme del campioni Numero di Inizialmente Reattivi dopocampioni reattivi ripetizione(T) Sieri normali negativi 480 2 1(J) Sieri normali negativi 1943 17 12Plasmi normali negativi 494 4 2(R) Sieri normali negativi 731 0 0(W) Sieri/Plasmi normali negativi 2468 28 9Tabella 4: riproducibilitàPer la valutazione della riproducibilità intra-assay sono stati forniti da due centri indipendenti (T,Tr) i seguenti dati:Campione Ripetizioni Ratio CV %(T) 1 20 1.531 8.72 20 1.012 13.63 20 0.689 8.0(Tr) 1 15 1.559 5.02 15 1.079 3.93 15 0.951 5.4Per la valutazione della riproducibilità inter-assay sono stati forniti da tre centri indipendenti (T, J,Tr) i seguenti dati:Campione Ripetizioni Ratio CV %(T) 1 10 1.689 8.52 10 1.090 10.73 10 0.844 11.2(J) 1 10 1.878 4.72 10 1.329 11.53 10 1.109 15.3(Tr) 1 7 1.373 5.62 7 0.940 12.03 7 0.705 10.8Ratio = Estinzione/cut-offOUWE G13 C0541 (879) CS/R 33

Tabella 5: Esecuzione e programmazione del testBEP ® IIPreparazione dei reagenti4 x 25 µL Siero di controllo, negativo2 x 25 µL Siero di controllo, positivo25 µL per campioni non diluitiBEP ® III100 µL Nel caso di piastredel coniugatoriempite parzialmente,aggiungere file di pozzetticon acqua fino a riempiremezza piastra test.60 ± 5 min(a 37 ± 1 °C)4 lavaggi BEP ® II100 µL Soluzione d’uso Esecuzionedel cromogenoautomatica del test30 ± 2 mina +18 /25 °Cal riparo della luce100 µL Soluzione bloccanteal massimo entro 1 oraLettura a 450 nm (lunghezzad’onda di riferimento: 650 nm)Enzygnost* Anti-HBc monoclonaleEsecuzione del test(BEP ® II, BEP ® III, BEP ® 2000)RisultatiProgrammazionedel menù per ilBEP ® IIBEP ® 2000MENU NOOPERATE 1WASHINGSASPIRATESOAKTIMEDISP VOLCHANNEL NOPHOTNOOPERATE 2YESDISPENSAZIONE CONIUGATOWASHINGS 0ASPIRATENOSOAKTIME 0DISP VOL 100CHANNEL NO 1PHOTNOOPERATE 3YESLAVAGGIO E DISPENSAZIONECHROMOGENOWASHINGS 4ASPIRATENOSOAKTIME 0DISP VOL 100CHANNEL NO 4PHOTNOOPERATE 4YESDISPENSAZIONE SOLUZIONEBLOCCANTEWASHINGS 0ASPIRATENOSOAKTIME 0DISP VOL 100CHANNEL NO 5PHOTYESMEAS WL 450REF WL 650BLK CORNOEVAL MODE 4GEN CUTNONEG CONT 4MAX NEG -MIN NEG 0.700FACT NEG 0.4MAX POS 0.100THRESH -CUT OFF -OUWE G13 C0541 (879) CS/R 34

Enzygnost* Anti-HBc monoclonalCampos de aplicaciónPrueba inmunoenzimática para la determinación cualitativo de los anticuerpos contra elantígeno de la hepatitis B (core) en el suero o en el plasma.La realización del ensayo inmunológico se lleva a cabo en los ELISA Procesadores BEP ® II, BEP ®III y BEP ® 2000. El test se desarrolló para la investigación de muestras individuales, no de muestrasen pool. El producto debe ser usado únicamente en diagnósticos in vitro.Importancia diagnósticaLos anticuerpos contra el antígeno de la hepatitis B (core) (Anti-HBc) son los primerosanticuerpos que se hacen presentes en el curso de una hepatitis B aguda después de laaparición de los antígenos HBsAg y HBeAg 1 y persisten a menudo durante toda la vida 5 . Por esemotivo, la determinación de Anti-HBc en el suero puede utilizarse para controlar la evolución deuna hepatitis B 2 . Además, Anti-HBc puede servir de marcador en el diagnóstico diferencial entrehepatitis A, hepatitis B y hepatitis non A/non B. Si se utiliza la determinación de Anti-HBc comoparámetro del screening, un diagnóstico de Anti-HBc positivo puede indicar un contacto previocon el virus de la hepatitis B, aun en sueros negativos frente al HBsAg y al Anti-HBs. Alrededordel 10% de todas las hepatitis son detectables serológicamente sólo mediante la determinacióndel Anti-HBc 3 .Antes de aplicar una vacuna contra la hepatitis B, el hallazgo de Anti-HBc permite sacarconclusiones sobre el estado inmunitario de la persona a vacunar 4 .En las investigaciones epidemiológicas, el anticuerpo contra el antígeno HBc es un parámetrovalioso ya que puede ser demostrado durante un tiempo más prolongado que el anti-cuerpocontra el antígeno HBs 5 .Principio del métodoEnzygnost* Anti-HBc monoclonal es una prueba immunoenzimática para la determinación invitro de anticuerpos contra el HBcAg en el suero o en el plasma según el principio competitivo.El anti-HBc de la muestra compite con el conjugado Anti-HBc/POD para fijarse al HBcAgdepositado en la superficie de la placa de microtitulación. Después del lavado del pocillo sedetermina la actividad enzimática de la peroxidasa fijada. La transformación enzimática delperóxido de hidrógeno y del cromógeno se interrumpe por la adición de ácido sulfúrico diluido.En razón del principio competitivo de la prueba, la intensidad cromática es inversamenteproporcional a la concentración de Anti-HBc presente en la muestra.ReactivosContenido del envase comercialEnzygnost* Anti-HBc monoclonal 2 x 96Enzygnost* Anti-HBc2 placas de pruebaConjugado Anti-HBc/POD, monoclonal2 x 1,2 mlTampón para conjugado (Anti-HBc monoclonal)4 x 12,5 mlSuero de control Anti-HBc, negativo2 x 0,7 mlSuero de control Anti-HBc, positivo2 x 0,5 mlSolución de lavado POD (concentrado)**1 x 100 mlTampón/sustrato TMB**1 x 30 mlCromógeno TMB**1 x 3 mlSolución de parada POD**1 x 100 mlFrasco vacío para preparar la solución de cromógeno 1 unidadLáminas adhesivas6 unidadesBolsa de PE1 unidadTabla de valores Barcode1 unidadBoletín informativo1 unidadOtros envases comerciales: 100 x 96** Estos componentes también vienen includíos en el kit de Reactivos adicionales paraEnzygnost* TMB (N° de pedido OUVP).OUWE G13 C0541 (879) CS/R 35Edición Febrero 2004

ComposiciónEnzygnost* Anti-HBc monoclonal (placa de prueba): Placa de microtitulación recubierta conantígenos de la hepatitis B-core obtenidos por tecnología genética.Conjugado Anti-HBc/POD, monoclonal: Antí HBc monoclonal, conjugado con peroxidasa(POD). Agente de conservación: Fenol (máx. 1 g/l).Tampón para conjugado (anti-HBc monoclonal) Tampón Tris con Boviserin ® y Tween 20.Agente de conservación: Fenol (máx. 1 g/l)Suero de control Anti-HBc, negativo: Suero humano, estabilizado; valor teórico de extinción ≥0,7. Agentes de conservación: Anfotericina (aprox. 5 mg/l), Gentamicina (aprox. 100 mg/l).Suero de control Anti-HBc, positivo: Suero humano, estabilizado; valor teórico de extinción≥ 0,1. Agentes de conservación: Anfotericina (aprox. 5 mg/l), Gentamicina (aprox. 100 mg/l).Solución de lavado POD (concentrado): Solución de tampón de fosfato con adición de Tween.Agente de conservación: Fenol (máx. 1 g/l)Tampón/sustrato TMB: Peróxido de hidrógeno (aprox. 0,1 g/l) en solución tampón de acetato.Agente de conservación: n-butanol (aprox. 1%)Cromógeno TMB: diclorhidrato de tetrametilbenzidinaSolución de parada POD: Acido sulfúrico 0,5 NAdvertencias y medidas de precaución1. Sólo para ser utilizado en diagnósticos in-vitro2. Cada donación individual de sangre destinada a la preparación de sueros de control ha sidoinvestigada para detectar la presencia del HBsAg, anti-HCV, anti-HIV1 y anti-HIV2. En laelaboración sólo se utilizan donaciones con resultados negativos.Independientemente de esto, todos los materiales obtenidos a partir de sangre humanadeben ser manipulados con las precauciones necesarias, siguiendo las medidas deseguridad recomendadas en caso de riesgo biológico, puesto que nunca se puede excluircompletamente la existencia de agentes patógenos 6 .3. Se aconseja utilizar guantes de seguridad durante el desarrollo del test.4. Para la eliminación del material infeccioso sólido se recomienda colocarlo en el autoclave porlo menos 1 hora a + 121 °C. Todas las soluciones aspiradas se deben recoger en dosrecipientes conectados uno con el otro. Estos recipientes deben contener un medio dedesinfección apropiado para inactivar virus patógenos humanos. Deben observarse laconcentración y el tiempo de acción dados por el fabricante.Preparación de reactivosLlevar todos los reactivos y las muestras a una temperatura entre +18 y +25 °C antes de iniciarla prueba, sin sacar del recipiente la placa de prueba.Para cada placa de prueba diluir 20 ml de solución de lavado POD con agua destilada odesionizada hasta obtener 400 ml.Solución de uso del cromógeno: Para cada placa de prueba diluir 1 ml de cromógeno TMBcon 10 ml de tampón/sustrato TMB en el frasco plástico adjunto (solución de uso delcromógeno) y conservar el frasco cerrado al abrigo de la luz. Después de su uso, lavarcuidadosamente el frasco con agua destilada.Para evitar la repleción no está permitido verter juntos el contenido de los frasco decromógeno TMB y de tampón/sustrato TMB.Solución de uso del conjugado: Para cada placa de prueba agregar 0,5 ml de conjugadoAnti-HBc/POD a un frasco original (12,5 ml) de tampón de conjugado (Anti-HBcmonoclonal) (dilución 1+25) y agitar suavemente para mezclar evitando la formación deespuma.Estabilidad y almacenajeTodos los componentes del envase combinado Enzygnost* anti-HBc monoclonal aún cerrados,conservados entre +2 y +8 °C, son utilizables hasta las fechas indicadas en las etiquetas.La estabilidad y las condiciones de almacenaje de los envases ya abiertos o de los reactivos yadiluidos, se pueden consultar en la Tabla 1 del apéndice.OUWE G13 C0541 (879) CS/R 36

Equipo necesario:BEP ® II: Para el desarrollo automático de la dosificación de reactivos y de las etapas de lavadoBEP ® III: Para la realización completamente automática del test después de la distribuciónde las muestras, así como para la evaluación.BEP ® 2000: Para la realización y valoración completamente automática del test.Pipetas: Pipetas a émbolo 25, 100 y 1000 µlIncubadora: Baño de agua cubierto (+37 ± 1 °C) u otros métodos de incubación similaresTodos los instrumentos utilizados para el desarrollo del test deben estar validados.Material a investigarPara la investigación se pueden utilizar muestras aisladas (sueros humanos o plasma conEDTA/heparina/citrato), las cuales hayan sido tomadas según las técnicas estándar delaboratorio. Las muestras se pueden almacenar máximo 3 días entre +2 y +8 °C. Para tiemposmás largos de almacenamiento las muestras se deben congelar.ProcedimientoRealización del test usando el BEP ® II1. Plan de distribución: Comprobar la cantidad necesaria de pocillos (cantidad de muestras ainvestigar más 6 pocillos para los controles). Quitar del soporte los elementos que no han deser utilizados y conservarlos para su empleo ulterior (ver Tabla 1).2. Distribución de las muestras: Dosificar en cuatro pocillos 25 µl del control negativo por c/u,en un pocillo 25 µl del control positivo y en cada uno de los siguientes pocillos 25 µl de lamuestra non diluir. Al final de la serie o de la placa de ensayo dosificar una vez más 25 µl delcontrol positivo. Acto seguido distribuir el conjugado lo antes posible, como máximo 15 mindespués de la distribución de las muestras.Coma una alternativa para el esquema de pipeteo descrito anteriormente se permite tambiéncolocar un control positivo dos veces al comienzo de cada serie del test.Esquema de pipeteo: Colocar en 4 pocillos 25 µl de suero de control negativo encada uno y en 2 pocillos 25 µl de control positivo en cada uno así como en cada uno de lossiguientes pocillos 25 µl de la muestras sin diluir.3. Distribución del conjugado: Colocar en cada pocillo 100 µl de la solución de uso delconjugado, cubrir con la lámina adhesiva y llevar de immediato al incubador.4. Incubación: Incubar durante 60 min ± 5 min a +37 ± 1 °C. Lavar de inmediato.5. Lavado: Retirar la lámina adhesiva, aspirar el contenido de todos los pocillos y lavar cadauno de ellos con aprox. 0,3 ml de solución de lavado 4 veces.6. Distribución del sustrato: Colocar en cada pocillo 100 µl de la solución de cromógeno listapara el uso. Cubrir la placa con una nueva lámina adhesiva.7. Incubación del sustrato: Incubar durante 30 ± 2 min entre +18 y +25 °C al abrigo de la luz.8. Reacción de parada: Retirar la lámina adhesiva. Agregar 100 µl de solución de parada PODen cada pocillo, manteniendo el mismo ritmo que en el punto 6.9. Medición: Valorar fotométricamente a 450 nm en el término de una hora.Es recomendable utilizar un fotómetro con dos longitudes de onda (rayo de medida y rayo dereferencia).La medida de la extinción de las muestras de control y de las muestras de pacientes deberealizarse con una longitud de onda de 450 nm; la longitud de onda de la medida de referenciadebe ser de 650 nm (o entre 615 y 690).Procedimiento en el BEP ® IIIPara el desarrollo del test en el BEP ® III, las placas de prueba se deben preparar hasta ladistribución de las muestras (punto 1 hasta punto 3 del «Procedimiento en el BEP ® II»).Directamente después de esto, colocar las placas de prueba abiertas, esto es, sin láminaadhesiva en el BEP ® III. Aquí es importante observar que las placas de prueba que no esténllenas se deben completar con «elementos con agua» hasta por lo menos la mitad de la placade prueba (6 elementos). Todas las etapas subsiguientes van a ser realizadas de formacompletamente automática por el aparato (ver manual de funcionamiento del BEP ® III).Los tiempos de incubación ajustados en el software del BEP ® III pueden desviarse de los delprocedimiento en el BEP ® II debido a condiciones técnicas básicas (ritmo del aparato), están sinembargo validados en la combinación BEP ® III/Enzygnost*.OUWE G13 C0541 (879) CS/R 37

Procedimiento en el BEP ® 2000La distribución de las muestras y la realización subsiguiente del test se efectúa de forma completamenteautomática por el aparato (ver manual de funcionamiento del BEP ® 2000).Validez de la pruebaLos valores de extinciones de los sueros de control se pueden utilizar para calcular el valor mediocuando:E neg. ≥ 0,700-0,010 ≤ E pos. ≤ 0,100Si uno de los valores de extinción del suero de control negativo Anti-HBc se halla fuera del límiteespecificado, se puede no tenerlo en cuenta para el cálculo.Los valores de extinción de los controles positivos, en cambio, deben estar ambos dentro dellímite especificado. Si no se cumplen estos requisitos, hay que repetir la prueba.Valoración de la pruebaLa evaluación con el BEP ® 2000 o con el BEP ® III, se realiza automáticamente. Para estoconsultar los manuales de operaciones. Los siguientes capítulos son para tener en cuenta en elcaso de evaluaciones sin la ayuda del software.Obtener el valor medio de las extinciones de los controles negativos.Para calcular el valor límite, multiplicar el valor medio de extinción de los controles negativos porel factor 0,4.–E neg. x 0,4 = valor límite (cut off)Como zona límite se establece:valor límite ± 10%Según los criterios de la prueba, las muestras se clasifican de la siguiente manera:Resultado del test:1. E muestra > cut-off + 10% ^= negativo2. E muestra < cut-off + 10% ^= positivo3. cut-off - 10% ≤ E muestra ≤ cut-off + 10% ^= valor límiteEn casos de resultados con valor límite la prueba se repetirá esta vez en una dobledeterminación. Si en la repetición de la prueba ambas extinciones se hallan por encima o pordebajo de la zona límite, no se tomará en cuente el valor límite inicial y la muestra se prodráconsiderar como negativa o positiva respectivamente. Si, en cambio, en una o en ambasdeterminaciones de la repetición las muestras dan valores límites de extinción, se recomienda,para aclarar el resultado, una nueva determinación con una muestra extraída 2 a 4 semanasdespués de la primera.Limitaciones del Procedimiento1. No deben usarse muestras que contengan azida sódica!2. Los anticoagulantes como heparina, EDTA y citrato no influyen sobre el resultado de laprueba.3. No se ha observado ninguna alteración en muestras tratadas por calor (60 min. a +56 °C).4. El suero de sangre insuficientemente coagulada, así como los componentes celularessanguíneos, pueden conducir a resultados dudosos.5. Las muestras hemolíticas y las muestras que contienen factor reumatoideo no alteran eldesarrollo del test.6. Las muestras con anticuerpos contra CMV, así como, las muestras anti-HBs positivas noinfluyen sobre los resultados del test.7. En muestras de pacientes con inmunocomplejos circulantes, así como, en muestras quecontienen IgG anti ratón no se observo ninguna influencia sobre los resultados del test.8. Las muestras con anticuerpos contra el virus de la hepatitis A, EBV, HIV, HCV, así como, lasmuestras lipémicas o ictéricas pueden mostrar aumento en la reactividad.9. Las muestras de pacientes en hemodiálisis, pacientes con trasplantes, pacientes con variastransfusiones sanguíneas, así como, pacientes con valores de transaminasas elevadospueden presentar una reactividad aumentada.10. En muestras descongeladas se debe tener en cuenta que el material se encuentre bien homogenizado.OUWE G13 C0541 (879) CS/R 38

11. Los reactivos (con exepción de la solución de lavado POD, la solución de parada y lasolución de uso del cromógeno, la cual ha sido preparada a partir de los reactivosdependientes del lote, cromógeno TMB y Tampón/sustrato TMB ) sólo se pueden utilizarjuntos si provienen del mismo lote, esto es, con el mismo número de 6 cifras (Nr. de Lote)que está impreso en el envase o que se puede tomar de la Tabla de código de barrasincluida en él.12. El tampón/sustrato TMB, la solución de uso del cromógeno y la solución de parada POD nodeben entrar en contacto con iones de metales pesados o con sustancias oxidantes (no utilizarpipetas que tengan partes metálicas que entren en contacto con el líquido). Las reacciones delsustrato no se deben efectuar en la cercanía de medios de desinfección que contenganhiploclorito. Una coloración azul espontánea de la solución de uso del cromógeno antes deagregarse a la placa de prueba está indicando una contaminación; prepare una nueva solución enun recipiente limpio. Evite el contacto de la piel con las soluciones arriba mencionadas.13. Durante la incubación la placa de prueba debe de permanecer en reposo (por ej. con ayuda de unflotador fijo o con un bañomaría no circulante). Si se utilizan agentes de conservación para evitar lacontaminación del agua, hay que tener la precaución de que ni la superficie de la placa de prueba ni lospocillos entren en contacto con estas soluciones pues podrían provocar reacciones no especificas.14. En muestras altamente reactivas se puede presentar una precipitación del colorante al agregar lasolución de parada. La valoración fotométrica de la muestra no va a ser perturbada por esto.15. Los sueros de control son fabricados a partir de sueros humanos nativos. Por esta razónpuede aparecer turbidez, la cual no influye sobre los resultados del test.16. Dade Behring ha validado el uso de los reactivos en varios analizadores para optimizar elrendimiento del producto y cumplir con las especificaciones del mismo. Las modificacionesdefinidas por el usuario no están garantizadas por Dade Behring dado que pueden afectar alrendimiento del sistema y a los resultados del ensayo. Es responsabilidad del usuariovalidar las modificaciones realizadas a estas instrucciones o el uso de los reactivos enanalizadores distintos a los incluidos en las hojas de aplicaciones de Dade Behring o enestas instrucciones de uso.17. Los resultados de esta prueba deberán interpretarse siempre de acuerdo con la historiaclínica del paciente, la sintomatologia clínica y otras observaciones.Caracteristicas del testSensibilidad y especificidadLos resultados de las pruebas de sensibilidad y especificidad están resumidos en las Tablas 2 y3 (en el apéndice).Para la determinación de la sensibilidad se estudiaron en total 1266 muestras anti-HBc positivasencontrándose una sensibilidad entre el 96,9 y el 100% (ensayo inicial) o del 97,5% (repeticióndel ensayo). Para una aplicación más amplia del test no se puede excluir que algunas muestrasaisladas no puedan ser reconocidas.Para determinar la especificidad se investigaron en total 6116 muestras de sangre donada anti-HBc negativas encontrándose una especificidad entre el 99,2% (ensayo inicial) o del 99,6%(repetición del ensayo). Es posible encontrar valores diferentes dependiendo, entre otros, de lacolectividad investigada y del desarrollo del test.De acuerdo al estado actual de los conocimientos no se puede deducir de un resultado positivodel ensayo Anti-HBc que exista con seguirdad una infección por HBV, como tampoco un resultadonegativo de ninguna manera descarta con seguridad la presencia de una infección por HBV.ReproducibilidadLos resultados para la reproducibilidad en intra/inter-assay están resumidos en la Tabla 4 (en elapéndice).En la reproducibilidad mediente intra-assay se obtuvieron coeficientes de variación desde 3,9hasta 13,6%. Para la reproducibilidad por inter-assay se obtuvieron coeficientes de variacióndesde 5,6 hasta 15,3%. En este caso se trata de datos encontrados como ejemplo. Es posibleencontrar valores diferentes dependiendo, entre otros, del procedimiento.* Enzygnost es una marca registrada de Dade Behring Marburg GmbH en Alemania y en otros países.BEP es una marca registrada de Dade Behring Marburg GmbH en USA, Alemania y en otros países.Boviserin es una marca registrada de Aventis BehringDade Behring Marburg GmbH0197Emil-von-Behring-Str. 76D-35041 Marburgwww.dadebehring.comOUWE G13 C0541 (879) CS/R 39

Tabla 1 Enzygnost* Anti-HBc monoclonaleEstabilidad y almacenajeMaterial/reactivo Estado Almacenaje Estabilidad •Enzygnost* Anti-HBc abierto entre +2 y +8 °C en 4 semanasmonoclonalenvase con cápsulas(placa de prueba)deshidratantesConjugato Anti-HBc/POD abierto entre +2 y +8 °C 4 semanasmonoclonal a ≤ -20°C 3 mesesTampon para conjugado abierto entre +2 y +8 °C 4 semanasConjugado diluido 1 + 25 entre +2 y +8 °C 4 semanaslisto para el uso entre +18 y +25 °C 1 semanaSuero de control Anti-HBc, abierto entre +2 y +8 °C 4 semanaspositivoSuero de control Anti-HBc, abierto ≤ -20 °C 3 mesesnegativoCromógeno TMB abierto entre +2 y +8 °C Fecha de caducidadTampón/sustrato TMB abierto entre +2 y +8 °C Fecha de caducidadSolución de uso del 1+10 entre +2 y +8 °C 5 díascromógeno entre +18 y +25 °C 8 horasen recipiente cerrado,al abrigo de la luzSolución de lavado POD sin diluir entre +2 y +8 °C Fecha de caducidad(concentrado)abierto1:20 entre +2 y +8 °C 1 semana1:20 entre +18 y +25 °C 1 díaSolución de parada POD abierto entre +2 y +8 °C Fecha de caducidad• EN ningún caso más allá de la fecha de caducidadTab. 2 SensibilidadEn la investigación de la sensibilidad se encontraron, en dos centros de investigación diferentes(T, Tr), los siguientes datos:Colectivo Número Reactividad Reactividadde muestras de muestras inicial repetida(T) Infección aguda por HBV 50 50 50Infeccion crónica por HBV 100 99 99Infección anterior por HBV 196 190 191Muestras de control del 115 115 115procedimiento(Tr) Infección aguda por HBV 80 79 79Infeccion crónica por HBV 521 516 516Infección anterior por HBV 73 73 73Muestras de control delprocedimiento 131 131 131OUWE G13 C0541 (879) CS/R 40

Tab. 3 EspecificidadEn la investigación de la especificidad se encontraron, en cuatro centros de investigacióndiferentes (T, J, R, W), los siguientes datos:Colectivo Número Reactividad Reactividadde muestras de muestras inicial repetida(T) Sueros negativos normales 480 2 1(J) Sueros negativos normales 1943 17 12Plasmas negativos normales 494 4 2(R) Sueros negativos normales 731 0 0(W) Sueros/Plasmas 2468 28 9negativos normalesTab. 4 ReproducibilidadEn la investigación de la reproducibilidad por intra-assay se encontraron, en dos centros deinvestigación diferentes (T, Tr), los siguientes datos:Muestra Repeticiones Radio CV %(T) 1 20 1.531 8.72 20 1.012 13.63 20 0.689 8.0(Tr) 1 15 1.559 5.02 15 1.079 3.93 15 0.951 5.4En la investigación de la reproducibilidad por inter-assay se encontraron, en tres centros deinvestigación diferentes (T, J, Tr), los siguientes datos:Muestra Repeticiones Radio CV %(T) 1 10 1.689 8.52 10 1.090 10.73 10 0.844 11.2(J) 1 10 1.878 4.72 10 1.329 11.53 10 1.109 15.3(Tr) 1 7 1.373 5.62 7 0.940 12.03 7 0.705 10.8Radio = Absorción/Valor límiteOUWE G13 C0541 (879) CS/R 41

Tabla 5 Realización de la prueba y programaciónBEP ® IIPreparación de los reactivos4 x 25 µl de suero control, negativo2 x 25 µl de suero control, positivo25 µl de cada muestraBEP ® III100 µl de fraccionadas a mediasconjugadoplacas con "elementoscon agua"60 min ± 5 min.(37 ± 1 °C)4 x lavar: BEP ® II100 µl de sol. de uso Procesamientodel cromógenoautomático30 min ± 2 min.entre +18 °C y +25 °Cprotegido de la luz100 µl de sol. deparadamáximo 1 h despuésValoración a 450 nm(longitud de ondade referencia: 650 nm)Enzygnost * Anti-HBc monoclonalProcedimiento(BEP ® II, BEP ® III, BEP ® 2000)Resultado de la pruebaProgramaciónpara elBEP ® IIBEP ® 2000MENU NOOPERATE 1WASHINGSASPIRATESOAKTIMEDISP VOLCHANNEL NOPHOTNOOPERATE 2YESDOSIFICACIÓN DEL CONJUGADOWASHINGS 0ASPIRATENOSOAKTIME 0DISP VOL 100CHANNEL NO 1PHOTNOOPERATE 3YESLAVADO E Y DOSIFICACIÓNDEL CHROMÓGENOWASHINGS 4ASPIRATENOSOAKTIME 0DISP VOL 100CHANNEL NO 4PHOTNOOPERATE 4YESDOSIFICACIÓN SOLUCIÓN DEPARADAWASHINGS 0ASPIRATENOSOAKTIME 0DISP VOL 100CHANNEL NO 5PHOTYESMEAS WL 450REF WL 650BLK CORNOEVAL MODE 4GEN CUTNONEG CONT 4MAX NEG -MIN NEG 0.700FACT NEG 0.4MAX POS 0.100THRESH -CUT OFF -OUWE G13 C0541 (879) CS/R 42

Enzygnost* Anti-HBc monoclonalCampo de aplicaçãoTeste imunoenzimático para determinação qualitativa de anticorpos contra o antigénio dahepatite B (core) no soro ou no plasma.O processamento do teste imunoenzimático faz-se com os processadores ELISA BEP ® II,BEP ® III e BEP ® 2000. O teste foi desenvolvido para a análise de amostras individuais, não deamostras de pool. O produto só pode ser utilizado para efeitos de diagnóstico in vitro.Significado diagnósticoOs anticorpos contra o antigénio da hepatite B (core) (Anti-HBc) são os primeiros a manifestarse,logo depois dos antigénios HBsAg e HBeAg, numa hepatite B aguda 1 e persistemfrequentemente durante toda a vida 5 . Por esse motivo, a determinação de anti-HBc no soropode servir para controlar a evolução de uma infecção pela hepatite B 2 . Além disso, o anti-HBcpode servir de marcador no diagnóstico diferencial das hepatites A, B e não A/não B. Se seutiliza a determinação de anti-HBc como parâmetro de screening, um resultado anti-HBcpositivo em soros HBsAg e anti-HBs negativos pode ser indício de um contacto anterior com ovírus da hepatite B. Aproximadamente 10% de todas as hepatites só são serologicamentedetectáveis mediante a determinação do anti-HBc 3 .Antes de aplicar uma vacina contra a hepatite B, a determinação de HBc permite conhecer oestado imunitário do vacinado 4 .Nas investigações epidemiológicas, o anticorpo contra o antigénio HBc é um parâmetro valioso,uma vez que pode ser reconhecido durante um período mais prolongado do que o anticorpocontra o antigénio Hbs 5 .Princípio metodológicoEnzygnost* Anti-HBc monoclonal é um ensaio imunoenzimático para determinação in vitro deanticorpos contra HBcAg no soro ou plasma estruturado segundo o princípio da monorreacçãocompetitiva: O anti-HBc da amostra em teste e o conjugado Anti-HBc/POD (peroxidase)competem entre si para se fixarem ao HBcAg fixado à superfície dos poços da microplaca.Lavados os poços, é determinada a actividade enzimática da peroxidase ligada.A reacção enzimática do peróxido de hidrogénio e do cromogénio é bloqueada por junção deácido sulfúrico diluído. Em virtude do princípio competitivo do teste, a intensidade cromática éinversamente proporcional à concentração de Anti-HBc presente na amostra.ReagentesConteúdo da embalagem comercialEnzygnost* Anti-HBc monoclonal 2 x 96Enzygnost* Anti-HBc2 placas de ensaioConjugado Anti-HBc/POD, monoclonal:2 x 1,2 mlTampão para conjugado (Anti-HBc monoclonal)4 x 12,5 mlSoro de controlo Anti-HBc, negativo2 x 0,7 mlSoro de controlo Anti-HBc, positivo2 x 0,5 mlSolução de lavagem POD (concentrado)1 x 100 mlTampão-substrato TMB1 x 30 mlCromógeno TMB1 x 3 mlSolução de paragem POD1 x 100 mlFrasco vazio para a solução de trabalho do cromógeno 1 unidadeFolhas adesivas6 unidadesBolsa de PE1 unidadeTabela de código de barras1 unidadeFolheto da embalagem1 unidadeOutras embalagens comerciais: 100 x 96** Estes componentes também são uma parte integrante da embalagem dos reagentesacidionais para Enzygnost* TMB (ref. OUVP).OUWE G13 C0541 (879) CS/R 43Edição Fevereiro 2004

ComposiçãoEnzygnost* Anti-HBc monoclonal (Microplaca): Microplaca revestida com antigénio dahepatite B-core obtido por tecnologia genética.Conjugado Anti-HBc/POD, monoclonal: Anti-HBc monoclonal, conjugado com peroxidase(POD).Conservante: fenol (máx. 1 g/l)Tampão para conjugado (Anti-HBc monoclonal): tampão de Tris com boviserina ® e Tween20.Conservante: fenol (máx. 1 g/l)Soro de controlo Anti-HBc, negativo: Soro humano, estabilizado; valor indicativo deabsorvância: ≥ 0,7Conservantes: anfotericina (aprox. 5 mg/l), gentamicina (aprox. 100 mg/l)Soro de controlo Anti-HBc, positivo: Soro humano, estabilizado; valor indicativo deabsorvância: ≤ 0,1Solução de lavagem (concentrado): Solução tampão de fosfato com adição de TweenConservante: fenol (máx. 1 g/l)Tampão/substrato TMB: Peróxido de hidrogénio (aprox. 0,1 g/l) em solução tampão de acetatoConservante: n-butanol (aprox. 1%)Cromógeno TMB: Diidrocloreto de tetrametilbenzidinaSolução de paragem: Ácido sulfúrico 0,5 NAdvertências e medidas de precaução1. Só para uso diagnóstico in vitro.2. Cada dádiva individual de sangue destinada à preparação de soros de controlo foipreviamente examinada com vista à detecção de HBsAg, Anti-HCV, Anti-HIV1 e Anti-HIV2.Na elaboração só são utilizados soros com resultado negativo.No entanto, todos os materiais obtidos de sangue humano devem ser manuseados com asprecauções devidas, seguindo as medidas de segurança recomendadas em caso de riscobiológico, uma vez que nunca se pode excluir inteiramente o risco de contaminação poragentes patogénicos 6 .3. Recomenda-se utilizar luvas para análise durante toda a realização do teste.4. Para descontaminação de materiais sólidos, aconselha-se uma autoclavagem durante pelomenos 1 hora a uma temperatura de, pelo menos, + 121 ° C. Todas as soluções aspiradasdevem ser recolhidas em dois recipientes ligados em série, os quais devem conter umdesinfectante apropriado para inactivação de vírus humano-patogénicos. Observem-se asconcentrações e os tempos de incubação indicados pelo fabricante.Preparação dos reagentesAntes de iniciar o teste, levar todos os reagentes e amostras à temperatura de + 18 a + 25 ° C,mas sem tirar a microplaca do seu recipiente.Para cada microplaca, diluir 20 ml da solução de lavagem POD (concentrado) com águadestilada ou desionizada até obter 400 ml.Solução de cromogénio: Diluir, por placa, 1 ml de cromogénio TMB com 10 ml de tampão/substrato TMB no frasco de plástico anexo à embalagem e conservá-lo fechado e ao abrigo daluz. Depois do uso, lavá-lo cuidadosamente com água destilada.Dada a capacidade dos frascos, não passar todo o conteúdo do frasco de cromogénio TMBpara o de tampão/substrato TMB!Solução de uso do conjugado: Adicionar, por placa, 0,5 ml de conjugado Anti-HBc/POD aum frasco original (12,5 ml) de tampão para conjugado (Anti-HBc monoclonal) (1 + 25) eagitar suavemente para misturar, mas evitar formação de espuma.Estabilidade e condições de conservaçãoNão abertos, e enquanto conservados entre +2 e +8 ° C, todos os componentes da embalagemcombinada Enzygnost* Anti-HBc se mantêm utilizáveis até ao termo do prazo de validadeindicado nos rótulos.Sobre estabilidade e condições de conservação dos reagentes abertos ou diluídos para uso, v.tabela 1 em apêndice.OUWE G13 C0541 (879) CS/R 44

Aparelhos necessáriosBEP ® II: para a execução automática da dosagem dos reagentes e das fases de lavagemBEP ® III: Processamento automático do ensaio e interpretação após dosagem dasamostrasBEP ® 2000: para o processamento e interpretação do teste, de forma inteiramente automáticaPipetas: pipetas com êmbolo 25, 100 e 1000 µlIncubador: Banho-maria tapado (+37 ± 1 °C) ou outros métodos de incubação comparáveisTodos os aparelhos utilizados no ensaio têm de estar validados.Material a investigarPara a análise podem ser utilizadas amostras individuais (soros humanos e plasmas EDTA/Heparina/Citrato), colhidos de acordo com as técnicas do laboratório. As amostras poderão serconservadas durante de 3 dias, no máximo, entre +2 - +8 °C. Se se pretender conservá-lasdurante um período de tempo superior, deverão ser congeladas.ProcedimentoRealização do teste com o BEP ® II1. Esquema de distribuição: Determinar o número necessário de poços (número dasamostras a investigar mais 6 poços para controlos). Retirar do suporte as fileiras de poçosdesnecessárias e reservá-las para ulterior utilização (v. tabela 1).2. Distribuição das amostras: distribuir em 4 poços, 25 µl em cada um, de soro de controlo,negativo, em 1 poço 25 µl de soro de controlo, positivo, nos poços seguintes 25 µl, em cadaum, de amostra não diluída e no fim da série de teste ou da microplaca novamente 25 µl desoro de controlo, positivo e proceder quanto antes, no máximo 15 min após o doseamentodas amostras, à distribuição do conjugado (v. 3.).Alternativamente ao esquema de pipetagem acima indicado é permitido também distribuir ocontrolo positivo dois vezes no início da série de teste.Esquema de pipetagem: Pipetar em 4 poços, 25 µl em cada um, de soro de controlonegativo, em 2 poços 25 µl, em cada um, de soro de controlo positivo, nos poços seguintes25 µl, em cada um, de amostra não diluída.3. Distribuição do conjugado: Distribuir 100 µl de solução de uso do conjugado, cobrir amicroplaca com folha adesiva e colocar imediatamente na incubadora.4. Incubação: Deixar incubar durante 60 min ± 5 min a + 37 ± 1 ° C, imediatamente a seguir darinício à lavagem.5. Lavagem: Retirar a folha adesiva, aspirar o conteúdo de todas as cavidades e lavar cadauma 4 vezes com aprox. 0,3 ml, de cada vez, de solução de lavagem.6. Distribuição do substrato: Distribuir 100 µl de solução de cromogénio em cada poço, cobrira placa com nova folha adesiva.7. Incubação do substrato: Deixar incubar durante 30 ± 2 min ao abrigo da luz entre + 18 e + 25 °C.8. Reacção de paragem: Retirar a folha adesiva. Acrescentar a cada poço 100 µl de soluçãode paragem, mantendo o mesmo ritmo que em 6.9. Leitura: Fazer uma medição fotométrica a 450 nm dentro de 1 hora.É aconselhável empregar um fotómetro com dois comprimentos de onda (um de medição eoutro de referência).Efectuar a medição das densidades ópticas das amostras de controlo e das dos pacientes a 450nm; como comprimento de onda de referência aconselha-se 650 nm (eventualmente entre 615e 690 nm).Realização do teste com o BEP ® IIINo caso do processamento ser feito com BEP ® III é necessário preparar as placas de ensaioincluindo a dosagem das amostras (ponto 1 e 2 da “execução do teste com BEP ® II).Imediatamente a seguir, as placas de ensaio são colocadas no BEP ® III abertas, ou seja, sempelícula colada. Ao mesmo tempo, é necessário prestar atenção a que as placas de ensaioparcialmente providas de ”barras de água” sejam acrescentadas até ficarem, no mínimo, pelomeio ( 6 barras de água). O processamento subsequente do teste realiza-se automaticamente(vide instruções de serviço do BEP ® III).OUWE G13 C0541 (879) CS/R 45

Devido às condições técnicas básicas (ciclo dos aparelhos), os tempos de incubação ajustadosno software do BEP ® III podem divergir dos tempos do processamento com o BEP ® II, masforam validados na combinação BEP ® III/Enzygnost* .Realização do teste com o BEP ® 2000A dosagem das amostras e subsequente processamento do teste são efectuados de formatotalmente automática no aparelho (vide instruções de serviço do BEP ® 2000).Validação do testeOs valores de absorvância dos soros de controlo serão utilizados para cálculo dos valoresmédios, se:E neg ≥ 0,700-0,010 ≤ E pos ≤ 0,100Dos valores de absorvância do soro de controlo anti-HBc, negativo, apenas um pode mostrarsefora dos limites especificados e ser ignorado.Os valores de absorvância dos controlos positivos têm de estar ambos dentro dos limitesespecificados. Não estando preenchidas estas condições, há que repetir o teste.ValoraçãoAs interpretações são realizadas automaticamente com o BEP ® 2000 ou o BEP ® III. Para oefeito, consultar as instruções de serviço. Para uma interpretação sem a ajuda do software, énecessário prestar atenção aos seguintes capítulos.Calcular a média dos valores de absorvância dos controlos negativos.Para calcular o valor-limite multiplicar o valor médio de absorvância dos controlos negativospelo factor 0,4.–E neg. x 0,4 = valor-limite (cut off)Como zona-limite define-se:Valor-limite ± 10%De acordo com os critérios do teste, as amostras serão classificadas do seguinte modo:Resultado do teste:1. E amostra > cut off + 10% ^= negativo2. E amostra < cut off - 10% ^= positivo3. cut off - 10% ≤ E amostra ≤ cut off + 10% ^= zona-limite (duvidoso)Se o resultado se encontra na zona-limite, a amostra terá de ser sujeita a novo teste, desta vezporém numa dupla determinação. Se, na repetição do teste, ambos os valores se acharemacima ou abaixo da zona-limite, não se tomará em conta o resultado inicialmente tido porduvidoso e a amostra será considerada negativa ou positiva.Se, porém, numa ou em ambas as determinações do teste repetido, a amostra acusar valoressituados zona-limite, recomenda-se, para esclarecimento definitivo, uma nova determinaçãocom uma amostra colhida 2 a 4 semanas depois da primeira.Limitações do procedimento1. É interdito utilizar amostras que contenham azida sódica!2. Anticoagulantes como heparina, EDTA e citrato não influenciam o resultado do teste.3. Não foram observadas alterações em amostras sujeitas a tratamento térmico (60 min, +56 °C).4. Soro de sangue insuficientemente coagulado, bem como componentes celularessanguíneos podem levar a resultados duvidosos.5. Amostras hemolíticas ou que contenham factor reumatóide não prejudicam o teste.6. As amostras com anticorpos contra o CMV e amostras positivas Anti-HBs não influenciam oresultado do teste.7. Não foi observada qualquer influência sobre o resultado do teste com amostras depacientes com imunocomplexos circulantes e amostras contendo anti IgG de rato8. As amostras com anticorpos contra o vírus da hepatite A, EBV, HIV, HCV, bem como asamostras lipémicas ou ictéricas podem apresentar reactividade elevada.9. As amostras de pacientes hemodialisados, pacientes transplantados, pacientes comtransfusões de sangue múltiplas ou pacientes com valores elevados de transaminasespodem apresentar reactividade elevada.OUWE G13 C0541 (879) CS/R 46

10. Amostras descongeladas devem estar bem homogeneizadas.11. Os reagentes (com excepção da solução de lavagem POD, da solução de paragem POD eda solução de trabalho do cromogénio, preparada esta última a partir dos reagentesespecíficos de cada lote Cromogénio TMB e Tampão/substrato TMB) só podem ser utilizadoscomo constituintes de um mesmo lote, isto é, somente na combinação de 6 cifras (N.° de lote)que vem impressa na embalagem e indicada na Tabela de código de barras adjunta.12. O tampão/substrato TMB, a solução de trabalho do cromogénio e a solução de paragem PODnão devem entrar em contacto com iões de metais pesados nem com substâncias oxidantes(não usar pipetas com partes metálicas portadoras de líquido). Não efectuar a reacção dosubstrato na proximidade de desinfectantes que contenham hipoclorito. Uma coloração azulespontânea da solução de trabalho do cromógeno antes de esta ser colocada na placa deensaio é indício de contaminação; deverá então preparar-se uma solução fresca numrecipiente limpo. Evite-se o contacto cutâneo com as soluções acima mencionadas.13. Durante a incubação deve manter-se a placa de ensaio imóvel (p. ex. sobre um suporte fixoou num banho-maria sem circulação de água); deste modo as cavidades mantêm-se emcontacto com a água temperada. Caso se utilizem estabilizadores para evitar umacontaminação da água, tomar todo o cuidado para que nem a superfície da placa de ensaionem os receptáculos entrem em contacto com estas soluções, pois tais contaminaçõespodem produzir reacções inespecíficas.14. Em amostras altamente reactivas o corante pode precipitar ao adicionar-se a solução deparagem. O facto é irrelevante para os resultados fotométricos.15. Os soros de controlo são preparados utilizando soros humanos congénitos. Por essa razão,podem ocorrer turvações que, todavia, não influenciam o resultado do teste.16. A Dade Behring validou a utilização destes reagentes em vários analisadores, com o intuitode optimizar o desempenho do produto e satisfazer as especificações do produto. Asmodificações definidas pelo utilizador não são suportadas pela Dade Behring, na medidaem que podem afectar o desempenho do sistema e os resultados do ensaio. Constituiresponsabilidade do utilizador validar as modificações efectuadas nestas instruções ou emrelação ao uso dos reagentes noutros analisadores que não os incluídos nas folhas deinstruções de aplicação da Dade Behring ou nestas instruções de utilização.17. Os resultados deste teste devem sempre ser interpretados em conjunto com o históricomédico do doente, estado clínico e outros dados de interesse.Características do testeSensibilidade e especificidadeOs resultados das provas de sensibilidade e especificidade encontram-se resumidos nastabelas 2 e 3 (em apêndice).Para averiguar a sensibilidade foi investigado um total de 1266 amostras anti-HBc positivas,tendo sido verificada uma sensibilidade de 96.9% a 100% (ensaio inicial) e 97.5% apósrepetição das amostras inicialmente borderline. Não é de excluir que, numa aplicação do teste amais alta escala, algumas amostras escapem a um reconhecimento.Para determinação da especificidade foi testado um total de 6116 amostras de sangue dedádiva anti-HBc negativas e achada uma especificidade de 99,2% (ensaio inicial) ou de 99,6%(repetição do ensaio). Valores divergentes destes são também possíveis, dependendo isso,entre outros factores, do colectivo testado ou da modalidade de execução do teste.No estado actual de conhecimentos, não se pode inferir com certeza de um resultado positivodo teste anti-HBc a presença de uma infecção pelo HBV, nem tão-pouco um resultado negativopermite excluir com certeza a sua presença.ReprodutibilidadeOs resultados para a reprodutibilidade em intra/inter-ensaio estão resumidos na Tabela 4 (em apêndice).Para a reprodutibilidade intra-ensaio foram obtidos coeficientes de variação de 3,9 a 13,6%.Para a reprodutibilidade inter-ensaio foram obtidos coeficientes de variação de 5,6 a 15,3%.Estes dados devem ser compreendidos somente a título de exemplo. Segundo a modalidade deexecução do teste, etc., eles podem variar.* Enzygnost e uma marca registada da Dade Behring Marburg GmbH na Alemanha e noutros países.BEP e uma marca registada da Dade Behring Marburg GmbH nos EUA, na Alemanha e noutros países.Boviserina é uma marca registada da Aventis BehringDade Behring Marburg GmbH0197Emil-von-Behring-Str. 76D-35041 Marburgwww.dadebehring.comOUWE G13 C0541 (879) CS/R 47

Tab. 1 Enzygnost* Anti-HBc monoclonalEstabilidade e condições de conservaçãoMaterial/Reagente Estado Conservação Estabilidade •Enzygnost* Anti-HBc aberto +2 a +8 °C em 4 semanasmonoclonalno saco com cáp-(placa de ensaio)sulas desidratantesConjugado Anti-HBc/POD aberto +2 a +8 °C 4 semanasmonoclonal ≤ -20 °C 3 mesesTampão para conjugado aberto +2 a +8 °C 4 semanasConjugado diluído 1 + 25 +2 a +8 °C 4 semanaspronto para uso +18 a +25 °C 1 semanaSoro de controlo Anti-HBc, aberto +2 a +8 °C 4 semanaspositivoSoro de controlo Anti-HBc, aberto ≤ -20 °C 3 mesesnegativoCromógeno TMB aberto +2 a +8 °C até termo da validadeTampão/Substrato TMB aberto +2 a +8 °C até termo da validadeSolução de uso do 1+10 +2 a +8 °C 5 diascromógeno +18 a +25 °C 8 horasrecipiente fechado,ao abrigo da luzSolução de lavagem POD não diluída +2 a +8 °C até termo da validade(concentrado)aberto1:20 +2 a +8 °C 1 semana1:20 +18 a +25 °C 1 diaSolução de bloqueio POD aberto +2 a +8 °C até termo da validade• Nunca depois de expirado o prazo de validade!Tab. 2 SensibilidadeResultados do exame da sensibilidade fornecidos por 2 centros independentes (T, Tr):Colectivos Número Inicialmente Positivo nade amostras de amostras positivo repetição(T) Infecção aguda por HBV 50 50 50Infecção crónica por HBV 100 99 99Infecção anterior por HBV 196 190 191Amostras de controlo da 115 115 115evolução(Tr) Infecção aguda por HBV 80 79 79Infecção crónica por HBV 521 516 516Infecção anterior por HBV 73 73 73Amostras de controlo daevolução 131 131 131OUWE G13 C0541 (879) CS/R 48

Tab. 3 EspecificidadeResultados do exame da especificidade fornecidos por 4 centros independentes (T, J, R, W):Colectivos Número Inicialmente Reactivo nade amostras de amostras reactivo repetição(T) Soros negativos normais 480 2 1(J) Soros negativos normais 1943 17 12Plasmas negativos normais 494 4 2(R) Soros negativos normais 731 0 0(W) Soros/Plasmas 2468 28 9negativos normaisTab. 4 ReprodutibilidadeResultados do exame da reprodutibilidade intra-assay fornecidos por 2 centros independentes(T, Tr):Amostra Repetição Ratio CV %(T) 1 20 1.531 8.72 20 1.012 13.63 20 0.689 8.0(Tr) 1 15 1.559 5.02 15 1.079 3.93 15 0.951 5.4Resultados do exame da reprodutibilidade inter-assay fornecidos por 3 centros independentes(T, J, Tr):Amostra Repetição Ratio CV %(T) 1 10 1.689 8.52 10 1.090 10.73 10 0.844 11.2(J) 1 10 1.878 4.72 10 1.329 11.53 10 1.109 15.3(Tr) 1 7 1.373 5.62 7 0.940 12.03 7 0.705 10.8Ratio = Extinção/valor-limite (cut-offOUWE G13 C0541 (879) CS/R 49

Tab. 5 Realização e programação do ensaioEnzygnost* Anti-HBc monoclonalRealização(BEP ® II, BEP ® III, BEP ® 2000)Programação doMenu para oPreparação dos reagentesBEP ® 20004 x 25 µl de soro de controlo negativoMENU NO2 x 25 µl de soro de controlo positivoOPERATE 125 µl de cada amostra não diluídaWASHINGSASPIRATESOAKTIMEDISP VOLBEP ® IIBEP ® III CHANNEL NOPHOT100 µl de placas incompletas:conjugadocompletar até meia placa comfileiras de poços com água60 min ± 5 min.(37 ± 1 °C)BEP ® II: lavar 4 x100 µl solução de trabalho Processamentodo cromógenoautomático30 min ± 2 min.+18 °C a +25 °Cao abrigo da luz100 µl de soluçãode paragemapós máx. 1 hLeitura a 450 nm(comprimento de ondade referência: 650 nm)Resultado do testeBEP ® IINOOPERATE 2YESDOSAGEM DO CONJUGADOWASHINGS 0ASPIRATENOSOAKTIME 0DISP VOL 100CHANNEL NO 1PHOTNOOPERATE 3YESLAVAGEM E DOSAGEM DOCROMÓGENOWASHINGS 4ASPIRATENOSOAKTIME 0DISP VOL 100CHANNEL NO 4PHOTNOOPERATE 4YESDOSAGEM DA SOLUÇÃO DEBLOQUEIOWASHINGS 0ASPIRATENOSOAKTIME 0DISP VOL 100CHANNEL NO 5PHOTYESMEAS WL 450REF WL 650BLK CORNOEVAL MODE 4GEN CUTNONEG CONT 4MAX NEG -MIN NEG 0.700FACT NEG 0.4MAX POS 0.100THRESH -CUT OFF -OUWE G13 C0541 (879) CS/R 50

Bibliography/Literatur/Littérature/Bibliografia/Bibliografía/Bibliografia:1. Frösner GG. Die Aussagekraft serologischer Untersuchungsmethoden bei Virushepatitiden. Med Klin1982; 77: 18-27.2. McCollum RW, Zuckerman AJ. Viral hepatitis: Report on a WHO informal consultation. J Med Virol 1981; 8:1-29.3. Grady GF. Hepatitis B immunity in hospital staff targeted for vaccination. Role of screening tests in immunisationprograms. JAMA 1982; 248: 2266-9.4. Deinhardt F, Weise HJ. Aktive Immunoprophylaxe der Hepatitis B: Kolloquium über den heutigen Standund die zukünftige Entwicklung der Hepatitis B-Impfung in der Bundesrepublik Deutschland. Bundesgesundheitsbl1982; 25: 272-3.5. Niermeijer P, Gips CH, Huizenga JR, et al. IgM Anti-HBc as a marker of persistent and IgG anti-HBc as amarker of past hepatitis B infection. A longitudinal study over 5 years. Acta Hepatogastroenterol 1978; 25:360-4.6. U.S. Department of Health and Human Services CDC, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories,HHS Publication (CDC) 93-8395; 1999; Section II; 8-16.Symbols Key / Symbolschlüssel / Explication des Symboles /Interpretazione simboli / Clave de los Símbolos / Chave dos SímbolosManufactured by / Hergestellt von / Fabriqué par / Prodotto da / Fabricado porIVDLOTEXPCCYY-MM-DDIn Vitro Diagnostic Medical Device / In Vitro Diagnosticum / Dispositif MédicalDiagnostic In Vitro / Dispositivo Medico per Diagnostica In Vitro / Producto sanitariopara Diagnóstico In VitroLot Number / Chargenbezeichnung / Numéro de Lot / Numero di Lotto / Número deLoteExpiration Date / Verfalldatum / Date de Péremtion / data di scadenza / Fecha devencimiento / termo da validadeStorage Temperature / Lagertemperatur / Température de Conservation / Temperaturadi conservazione / Temperatura de almacenamiento / Temperatura de armazenagemREFCE Mark / CE-Zeichen / Marquage CE / Marchio CE / CE Marca / Marca CECatalogue Number / Katalog Nummer / Référence / Codice Catalogo / Número deCatálogoConsult Instructions for Use / Gebrauchsanweisung beachten / Consulter la Noticed'Utilisation / Istruzioni per l'uso / Consultar Instucciones para el Uso / Consulte asInstruções de UtilizaçãoOUWE G13 C0541 (879) CS/R 51