Contenido - Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal

ContenidoDiagnóstico fitosanitarioDetección de β-exotoxina por HPLC en cepas nativas de Bacillus thuringiensis por HPLC 255Yamilé Baró Robaina, Cecilia Linares Jiménez y Gonzalo Dieksmeier CorcueraDiagnóstico de fitonematodos en suelos de cultivos frutales 261Raúl Hernández Hernández, Gladis del Vallín y Doris HernándezAislamiento, identificación y caracterización morfométrica de aislados nativos de hongos mitospóricos nativoscon potencialidad para el control de especies de insectos plaga 265Orestes Elósegui Claro, Jesús Jiménez Ramos y Aidanet Carr PérezEcologíaDispersión, distribución actual y nuevos reservorios de Frankliniella schultzei Trybom (Thysanoptera: Thripidae)en Cuba 273Santiago F. Jiménez Jiménez, Liuva Pérez López, Martha Toro, Criseida Granda, Amelia Mateo,Héctor Sariol, Elisa Rodríguez, Rodney Pérez, Roquelina Jiménez, Ángel Pérez-Alejo y Ransés VázquezVariabilidad de las isoenzimas esterasas de Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin 279María E. Estrada Martínez y Dolores Piñón GómezControl biológicoUn medio simplificado a base de soya más azúcar turbinada de caña para la producción del hongo acaropatógenoHirsutella nodulosa Petch en fase líquida 285Reinaldo I. Cabrera, Marlén Vega y Litzy AyraEstudio del efecto protector de Bacillus spp. sobre el desarrollo de la pudrición blanda de la papa(Solanum tuberosum L.) 289Yaritza Reinoso Pozo, Luis Casadesús Romero, Armando García Suárez, Ernesto García Pérezy Victoria Pazos Álvarez-RiveraProducción de biomasa de Trichoderma harzianum por fermentación líquida 295Rosaima García, María A. Durán y Ramón RieraReseñaCaracterización de Ralstonia solanacearum a través del estudio de su diversidad genética 299Yelaine Tejeda GómezComunicación cortaPrimer registro de cecidómido asociado a síntomas de roya en plantas medicinales en Cuba 305Marlene M. Veitía Rubio, Víctor M. García Infante, Danay López Manes y María O. López MesaObservaciones sobre enemigos naturales de la broca del café (Hypothenemus hampei Ferrari) en Cuba 307Luis L. Vázquez Moreno, Eleazar Blanco Jiménez, Orestes Elósegui Claro, Yaril Matienzo Britoy Janet Alfonso SimonettiResumen de tesisDiagnóstico y saneamiento del Virus Dasheen Mosaic en malanga (Xanthosoma spp. y Colocasia esculenta (L.) Schott) 309Janet Igarza CastroComportamiento y control de la enfermedad tizón de fuego causada por el hongo Corynespora cassiicola(Berk. & Curt.) Wei. en el cultivo del pepino (Cucumis sativus L.) en sistemas de organopónicosen la provincia de Camagüey y su relación con otros patógenos fúngicos presentes en el cultivo 310Carlos A. Ferrer González

ContentsPhytosanitary diagnosisDetection of β-Exotoxin by HPLC in Native Strains of Bacillus thuringiensis 255Yamilé Baró Robaina, Cecilia Linares Jiménez and Gonzalo Dieksmeier CorcueraPhytonematodes Diagnosis on Fruit Crop Soils 261Raúl Hernández Hernández, Gladis del Vallín and Doris HernándezIsolation, Identification and Morphometric Characterization of Native Mitosporic Fungi with Potentialfor the Control of Pest Insects Species 265Orestes Elósegui Claro, Jesús Jiménez Ramos and Aidanet Carr PérezEcologyDispersion, Present Distribution and New Reservoirs of Frankliniella schultzei Trybom(Thysanoptera: Thripidae) in Cuba 273Santiago F. Jiménez Jiménez, Liuva Pérez López, Martha Toro, Criseida Granda, Amelia Mateo, Héctor Sariol,Elisa Rodríguez, Rodney Pérez, Roquelina Jiménez, Ángel Pérez-Alejo and Ransés VázquezVariability of Esterase Isoenzymes from Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin 279María E. Estrada Martínez and Dolores Piñón GómezBiological controlA Simplified Medium Based on Soy and Unrefined Sugar Cane for Liquid Phase Production of FungusHirsutella nodulosa Petch Pathogen to Mites 285Reinaldo I. Cabrera, Marlén Vega and Litzy AyraStudy of Protective Effect of Bacillus spp. on the Development of Potato Soft Rot (Solanum tuberosum L.) 289Yaritza Reinoso Pozo, Luis Casadesús Romero, Armando García Suárez, Ernesto García Pérezand Victoria Pazos Álvarez-RiveraProduction of Trichoderma harzianum Biomass by Liquid Fermentation 295Rosaima García, María A. Durán and Ramón RieraReviewCaracterization of Ralstonia solanacearum by the Study of its Genetic Diversity 299Yelaine Tejeda GómezShort communicationFirst Record of Cecidomide Associate with Rust Symptoms in Cuban Medicinally Plants 305Marlene M. Veitía Rubio, Víctor M. García Infante, Danay López Manes and María O. López MesaObservations on Natural Enemies of Coffee Berry Borer (Hypothenemus hampei Ferrari) in Cuba 307Luis L. Vázquez Moreno, Eleazar Blanco Jiménez, Orestes Elósegui Claro, Yaril Matienzo Britand Janet Alfonso SimonettiThesis abstractDiagnostic and Sanitation of Dasheen Mosaic Virus in Xanthosoma spp. and Colocasia esculenta (L.) Schott 309Janet Igarza CastroBehavior and Control of Fire Blight Disease Caused by Fungus Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.)Wei. in Cucumber Crop (Cucumis sativus L.) in Organoponic Systems of Camagüey Province and its Relationwith others Fungi Pathogens Present in the Crop 310Carlos A. Ferrer González

FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006Diagnóstico fitosanitarioDETECCIÓN DE β-EXOTOXINA EN CEPAS NATIVASDE BACILLUS THURINGIENSIS POR HPLCYamilé Baró Robaina, Cecilia Linares Jiménez y Gonzalo Dieksmeier CorcueraInstituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Calle 110 no. 514 e/ 5. a B y 5. a F, Playa, Ciudadde La Habana, CP 11600, ybaro@inisav.cuRESUMENSe analizó por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) lapresencia de β-exotoxina en nueve cepas de Bacillus thuringiensis,pertenecientes a la colección del Instituto de Investigaciones deSanidad Vegetal. La concentración de β-exotoxina en el patrón fuede 25 µg.mL –1 , y en el producto comercial empleado como controlpositivo fue de 6 µg.mL –1 . En las cepas evaluadas solo la LBT9 yLBT47 mostraron la presencia de este metabolito a concentracionesde 34 y 4,5 µg.mL –1 respectivamente.Palabras claves: Bacillus thuringiensis, β-exotoxina, cromatografíalíquida (HPLC), detecciónABSTRACTThe presence of β-exotoxin in nine Bacillus thuringiensis strainsbelonging to Plant Health Research Institute collection was analyzedby high performance liquid chromatography (HPLC). β-exotoxinconcentration in the standard was 25 µg.mL -1 , and in a commercialproduct, used as positive control, was 6 µg.mL -1 . β-exotoxin was onlydetected in LBT9 with 34 µg.mL -1 and LBT47 with 4.5 µg.mL -1 , amongthe strains proved.Key words: Bacillus thuringiensis, β-exotoxin, liquid chromatography(HPLC), detectionINTRODUCCIÓNAlgunas cepas de Bacillus thuringiensis producen ademásde la δ-endotoxinas o proteínas Cry una exotoxinatermoestable denominada β-exotoxina, la cual se secretaal medio de cultivo al inicio del proceso deesporulación. Esta molécula es un análogo nucleotídicode ADN con un peso molecular de 701 Da y se le atribuyeacción insecticida contra diferentes órdenes deinsectos como Lepidópteros, Dípteros, Coleópteros,Hemípteros, además de ácaros, nematodos, protozoariosy platelmintos [Hernández et al., 2003].Diversos métodos como la cromatografía de intercambioiónico, electroforesis capilar, ELISA y la cromatografíalíquida de alta resolución (HPLC) se han descritopara la determinación de la β-exotoxina, comoalternativas al bioensayo tradicional con Musca domestica,el cual resulta más trabajoso, prolongado en eltiempo y presenta algunas limitaciones como estimacionesinexactas de la potencia de la toxina impura ypoca reproducibilidad. De todos estos métodos la RP-HPLC se emplea más frecuentemente para la detección ycuantificación de este metabolito [Gohar y Perchat, 2001].El presente trabajo tuvo como objetivo detectar y cuantificarla presencia de la β-exotoxina en nueve cepascubanas de Bacillus thuringiensis.MATERIALES Y MÉTODOSComo material biológico se emplearon nueve cepas deB. thuringiensis pertenecientes a la colección del Institutode Investigaciones de Sanidad Vegetal, las cualesse seleccionaron de acuerdo con su serotipo flagelar, y latoxicidad exhibida en el sobrenadante del cultivo esterilizadoa 121ºC frente a un grupo de organismos plaga(Tabla 1).El estándar de β-exotoxina I lo suministró el doctor JorgeIbarra (Laboratorio de Bioinsecticidas del Centro defitosanidad/255

Baró y otrosInvestigación y Estudios Avanzados del Instituto PolitécnicoNacional de México), obtenido a partir de lacepa HD2 Berliner Bacillus thuringiensis var.thuringiensis. La concentración final de la solución deβ-exotoxina I inyectada en el HPLC fue de 25 µg.mL –1 .Como control positivo se utilizó un producto comercialruso que contiene β-exotoxina, producido a partir deuna cepa de B. thuringiensis var. thuringiensis, y comocontrol negativo se tomó la cepa HD1, estándar internacionalde B. thuringiensis que no produce β-exotoxina.Tabla 1. Serotipos de las cepasen estudio [Fernández-Larrea, 1999]CepasLBT-4LBT-5LBT-7LBT-9LBT-12LBT-13LBT-16LBT-25LBT-47Serotipokenyae (H4)thuringiensis (H1)kenyae (H4)thuringiensis (H1)thuringiensis (H1)no determinadothuringiensis (H1)israelensis (H14)no determinadoLas cepas se cultivaron en medio caldo triptona soya,en zaranda orbital a 150 r.min –1 a una temperatura decrecimiento de 30ºC durante 48 h hasta que se completóel proceso de esporulación.Una vez transcurrido el tiempo de incubación el cultivose centrifugó 10 000 r.min –1 en centrifuga refrigeradadurante 20 min. El precipitado se descartó y elsobrenadante se trató en autoclave a 121ºC durante 15 min.El pH de las muestras se ajustó a 3 con ácido fosfórico85%. El sobrenadante se clarificó por centrifugacióna 10 000 r.min –1 y se guardó a –20ºC hasta su uso.El proceso de separación se realizó según Levinson etal. (1990), para lo que se utilizó una columna LiChrospherRP-18 de fase reversa. La corrida se efectúo a 30ºCen 50 milimoles.L –1 de KH 2PO 4(pH 3) a una velocidadde flujo de 2 mL.min –1 , con detección a 260 nm. El volumende inyección fue de 100 µL. Se empleó un detectorUV, inyector Rheodyne 7725i, bomba water 0,01A.Para el análisis de los cromatogramas se utilizó el softwareEZChrom versión 6.8.Con el objetivo de evaluar si la β-exotoxina se eliminabadurante el procesamiento de la muestra, se adicionaron100 µL de β-exotoxina estándar a la cepa LBT5de B. thuringiensis una vez iniciado el crecimiento delmicroorganismo y concluido su desarrollo. La cromatografíase desarrolló en las condiciones descritas anteriormente.RESULTADOS Y DISCUSIÓNSegún los cromatogramas obtenidos en la detección deβ-exotoxina para las cepas en estudio, se observó elpico correspondiente al patrón de β-exotoxina estándara una concentración de 25 µg.mL –1 (Fig. 1(A)). El picoque se observa en la muestra patrón apareció a un tiempode retención de 11,33 min. El mismo pico aparecióen la muestra correspondiente al producto comercialruso a base de β-exotoxina, cepa utilizada como testigopositivo. Su concentración fue de 6 µg.mL –1 (Fig. 1(B)).La exotoxina no se detectó en la cepa HD1 estándarinternacional de B. thuringiensis var. kurstaki (Fig. 2),la cual no produce esa exotoxina [Galán et al., 1994;Glare y Callaghan, 2000].En el resto de las cepas en estudio, solo se observó elpico correspondiente a la β-exotoxina en las cepas LBT9(Fig. 3(A)) y LBT47 (Fig. 3(B)). Los niveles de produccióndel metabolito en estas cepas fueron de 34 y4,5 µg.mL –1 respectivamente. En la cepa LBT7 tambiénse observó la presencia de un pico que pudiera correspondera la β-exotoxina, ya que presenta uno similaral del patrón y un tiempo de retención muy cercano.Las cepas evaluadas presentan serotipos que están informadosen la literatura como productores de la β-exotoxina[Galán et al., 1994; Glare y Callaghan, 2000];sin embargo, estos resultados reafirman lo obtenido porLevinson et al. (1990) y Hernández y Ferré (2001), loscuales mostraron que la producción de la exotoxinatermoestable es más una propiedad específica de la cepade B. thuringiensis que una propiedad serotipo específica.Se ha probado además que su presencia en unacepa en particular no implica la producción de la exotoxinapor otras cepas pertenecientes al mismo serovar.Aunque los estudios que relacionan la producción de laβ-exotoxina y el tipo de serovar que presenta la cepa deB. thuringiensis son muy escasos, y en la mayoría deellos se incluyen muy pocas cepas, algunos autores planteanque la producción de β-exotoxina está limitada aciertos serotipos flagelares presentes en las cepas deB. thuringiensis [Hernández y Ferré, 2001].256/fitosanidad

Detección de β-exotoxina en cepas...Figura 1. Cromatogramas obtenidos para el patrón de β-exotoxina (25 µg.mL –1 ) (A) y para el producto comercial (6 µg.mL –1 )(control positivo) (B). Columna LiChrospher RP-18, 5 mm (250 x 4,6 mm), flujo 2 mL.min –1 , λ 260 nm, volumen de inyección100 µL, fase móvil KH 2PO 4, pH 3,0.Figura 2. Cromatograma obtenido por HPLC para la cepa HD1 (control negativo). ColumnaLiChrospher RP-18, 5 mm (250 x 4,6 mm), flujo 2 mL.min –1 , λ 260nm, volumen de inyección100 µL, fase móvil KH 2PO 4, pH 3,0.Figura 3. Cromatogramas obtenidos por HPLC para las cepas LBT9 34 µg.mL –1 (A) y LBT47 4,5 µg.mL –1 (B).Columna LiChrospher RP-18, 5 mm (250 x 4,6 mm), flujo 2 mL.min –1 , λ 260 nm, volumen de inyección 100 µL, fasemóvil KH 2PO 4, pH 3,0.fitosanidad/257

260/fitosanidad

FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006DIAGNÓSTICO DE FITONEMATODOS EN SUELOSDE CULTIVOS FRUTALESRaúl Hernández Hernández 1 , Gladis del Vallín 2 y Doris Hernández 21Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Calle 110 no. 514 e/ 5. a B y 5. a F, Playa, Ciudadde La Habana, rhernandez@inisav.cu2Instituto de Investigaciones en Fruticultura Tropical. Ave 7. a no. 3005 e/ 30 y 32, Playa, Ciudadde La Habana, CP 11300RESUMENSe diagnosticaron campos agrícolas en fase de presiembra paraconocer los principales géneros de nematodos en suelos previamentesembrados de piña (Ananas comosus Lin. Merr.), papaya (Caricapapaya Lin.), guayaba (Psidium guajava Lin.), aguacate (Persea americanaLin.), mango (Manguifera indica Lin.) y uva (Vitis vinifera Lin.)de las provincias de Ciudad de La Habana, La Habana, Ciego deÁvila, Matanzas y el municipio especial de Isla de la Juventud. Parala extracción de los nematodos móviles se utilizó el método deBaermann, mientras el índice de infestación del suelo con el nematodode las agallas se valoró mediante la prueba de la planta indicadoracon la contribución de los agricultores. En todas las muestras desuelo y raíces se observaron nematodos parásitos de plantas condiversos niveles de densidad de población. Los géneros detectadoscon mayor frecuencia fueron Meloidogyne Goeldi (100%), RotylenchulusLinford & Oliveira (72%), Helicotylenchus Steiner (33%) yPratylenchus Filipjev (22%). Las mayores densidades de poblaciónse correspondieron con los suelos que anteriormente habían sidocultivados con guayaba.Palabras claves: Meloidogyne, Rotylenchulus, Helicotylenchus,Pratylenchus, guayaba, piñaABSTRACTPre sowing agricultural fields which were planted with fruits aspineapple (Ananas comosus Lin. Merr.), papaya (Carica papaya Lin.),guava (Psidium guajava Lin.), avocado (Persea americana Lin.), mango(Manguifera indica Lin.) and grape fruit (Vitis vinifera Lin.) from fourprovinces of Cuba and especial county Isla de la Juventud, werenematolgically essayed in vitro, to know current status of nematodesmain genera. Motile nematodes extraction was achieved by usingBaermann method, while root-knot nematodes soil infestation wasvalorised with indicator plant test and farmers contribution. Differentpopulation densities of plant-parasites nematodes were detected inall soil and roots samples. Most frequently nematodes wereMeloidogyne Goeldi (100%), Rotylenchulus Linford & Oliveira (72%),Helicotylenchus Steiner (33%) y Pratylenchus Filipjev (22%). Soilsbefore cultivated with guava showed the highest nematode population.Key words: Meloidogyne, Pratylenchus, Rotylenchulus, Helicotylenchus,guava, pineappleINTRODUCCIÓNEn la agricultura cubana actual se incrementa el fomentoy la diversificación de frutales, pero para lograrcosechas productivas y consistentes es necesario enfrentarsea las plagas desde el vivero o ya en la plantación.Entre ellas se encuentran los nematodos parásitos quepueden ocasionar pérdidas de rendimiento entre 10 y30% en los cultivos susceptibles [Fernández, 1991;INIFAP, 2002].El fruticultor debe valerse del diagnóstico nematológicopara conocer el tipo y la cantidad de nematodos en elsuelo antes de sembrar o plantar, a fin de adoptar medidaspreemergentes cuando se detectan poblaciones porencima de los niveles que causan daño económico. Poresa razón el análisis de laboratorio y campo proporcionala ventaja de realizar tratamientos al suelo con unahorro en el costo de la estrategia de manejo [Stirling yKopittke, 2000]. Además de lo señalado, se deben teneren cuenta otros aspectos como la topografía y eldrenaje del campo, la eficacia del sistema de riego y lacapacitación de los agricultores.El presente trabajo muestra la situación nematológicade diversos campos de producción de frutales, lo quepermite facilitar la aplicación del manejo preventivo denematodos en los campos evaluados.fitosanidad/261

Diagnóstico de fitonematodos...densidad de población, que en la mayoría fueron bajoso moderados, aunque en las muestras correspondientesa los campos de Bejucal y Alquízar de la provinciade La Habana previamente sembrados de guayaba losniveles alcanzaron valores elevados o muy elevados (Tabla2).Figura 1. Frecuencia de aparición de los diferentes géneros de nematodos en cultivos frutícolas.El análisis de laboratorio reveló que en los campos defrutales en fase de presiembra los géneros más frecuentesfueron Meloidogyne y Rotylenchulus. Ambos estuvieronpresentes en todos los cultivos en algunas de susestadios infectivos (Fig. 1), lo que permite asumir laexistencia de una estrecha asociación entre estos organismosy los cultivos frutícolas. Estos resultados sonsimilares a los obtenidos en Venezuela por Petit (1990)en los estudios de biodiversidad nematológica. Los complejosformados por estos géneros pudieran representarun peligro potencial, fundamentalmente para frutalescomo el guayabo y la piña, debido a los daños quepueden causar en su sistema radical, que limitan sensiblementela absorción de los nutrientes y por consiguienteel desarrollo y la productividad.Helicotylenchus y Pratylenchus no estuvieron presentesen las áreas agrícolas que anteriormente se cultivaroncon aguacatero y uva; Helicotylenchus tampoco sepresentó en campos de papayo, y Patylenchus no sedetectó en campos de mango (Tabla 2).En general las mayores poblaciones de nematodos seapreciaron en los campos de guayabo, con predominanciade Meloidogyne sobre Pratylenchus, lo cualcoincide con Fernández (1991), quien aseveró que estecultivo es un buen hospedero de ambas especies, y quelas pérdidas económicas que ocasionan estos nematodospueden alcanzar 20 t/ha en plantaciones jóvenes, segúnSuárez et al. (1998) con valores máximos entre 48 y 57%en plantaciones establecidas. Los daños incluso puedenser aún mayores en la fase de producción, cuandose emplean posturas contaminadas, pues la alimentacióny reproducción del nematodo tiene lugar desde elmismo inicio del crecimiento del cultivo en la fase devivero. En este trabajo se observó una tendencia descendentedel índice de agallamiento de Meloidogynedesde la máxima densidad de población hasta 240 J 2/250 g de suelo, a partir de la cual no se presentó unainfestación visible en raíces (Tabla 2).En las muestras de los suelos dedicados a la piña seobservaron poblaciones de Rotylenchulus y Meloidogyne.Estos géneros de nematodos usualmente están asociadosal cultivo con una incidencia negativa en el desarrollode la planta y el rendimiento agrícola, por lo quees muy útil realizar el diagnóstico nematológico antesde la siembra [Gandoy y Ortega, 1980; MINAGRI,1989; Araya, 2006].CONCLUSIONES• Meloidogyne y Rotylenchulus con 100 y 72% respectivamentefueron los géneros de nematodos más frecuentesen las muestras de suelos de frutales en fasede presiembra.• Los suelos procedentes del guayabo se distinguieronnotablemente por las elevadas densidades de poblaciónde Meloidogyne en comparación con los de piña,uva, papayo, mango y aguacatero.• Helicotylenchus y Pratylenchus no estuvieron presentesen las áreas agrícolas anteriormente cultivadascon aguacatero y uva, mientras el primero tampocoestuvo en papayo y el segundo en mango.fitosanidad/263

Hernández y otrosTabla 2. Fauna de nematodos parásitos de los cultivos frutales detectados. Individuospor 250 g de sueloMunicipio/provinciaAlquízar/La HabanaBejucal/La HabanaLa Lisa/Ciudad de LaHabanaCiego de Ávila/Ciego de ÁvilaJagüey Grande/MatanzasIsla de laJuventudUnidad agrícolaEstaciónExperimentalde FruticulturaFincaLa MilagrosaFincadeautoconsumoEmpresade la PiñaEstaciónExperimentalde FruticulturaCultivoprecedenteVariedad Meloidogyne sp. Rotylenchulussp.Helicotylenchussp.Pratylenchussp.J 2 M G J 4 MGuayabo Enana EEA 2756 4 2518-401305 2620 1305 0,3 100Guayabo Enana EEA 240 0,3 5018-40 130 0 15 5 15110 0 10100 0 40 35Mango Super 70 0 10 5HaydenHyden 30 0 35 10 5Aguacatero Catalina- 10 0 5GovinPiña Española roja 160 10 0 110 205 0 5Cayena lisa 53 5 0 85 10 5Papayo Solosunrise 100 10 5Maradol 60 5 0 5 5Finca orgánica Uva AramónJ2: Larva infectiva del segundo estadio. M: Espécimen adulto macho.G: Grado de infestación con agallas. J4: Hembra adulta joven infectiva.140 090 030 0 200REFERENCIASAraya, M.; Comunicación personal, 2006.Fernández, E. «Los nematodos del género Meloidogyne Goeldi en elcultivo de la guayaba (Psidium guajava L.) y su control». Tesis deDoctorado en Ciencias Agrícolas, Instituto de Investigaciones deSanidad Vegetal, La Habana, 1991.Gandoy, P.; J. Ortega: «Nematodos parásitos del cultivo de la piña enCuba y posibilidades de su control», Ciencias de la Agricultura7:19-28, 1980.INIFAP: «Control de nematodos fitoparásitos en piña. Ficha tecnológicapor sistema tecnológico», estado de Veracruz, México, 2002.http://www.inifap.gob.mx/contenido/innovaciones/innovaciones.html#sanidad.MINAGRI: Instructivo técnico para el cultivo de la piña, DepartamentoIndependiente de Frutales. Área No Cañera, Centro de Información yDocumentación Agropecuaria, La Habana, 1989.Petit, P.: «Reconocimiento de nematodos fitoparásitos asociados a frutalesde importancia económica en Venezuela», Fitopatol. Venez.3(1):2-5, 1990.Püntener, W.: Manual para ensayos de campo de protección vegetal,2. a ed. revisada y ampliada, Documenta CIBA-GEIGY, Basilea, Suiza,1981.Siddiqi, M. R.: Tylenchida. Parasites of Plants and Insects, 2th Ed.,CABI Publishing, Wallingford, Inglaterra, 2000.Stirling, G. R.; R. Kopittke: «Sampling Procedures and DamageThresholds for Root-Knot Nematode (Meloidogyne javanica) onPineapple», Aust. J. Exp. Agric. 40(7):1003-1010, 2000.Suárez, H. Z.; L. C. Rosales; M. S. González: «Nematodos asociados alos frutales de importancia y su control. I: frutales perennes», FonaiapDivulga. 59:13-18, 1998.Zeck, W. M.: «El esquema de valoración del ataque de cecidiosradicícolas», Pflanzenchutz Nacrichten Bayer 24(1):147-150, 1971.264/fitosanidad

FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓNMORFOMÉTRICA DE AISLADOS NATIVOS DE HONGOSMITOSPÓRICOS CON POTENCIALIDAD PARA EL CONTROLDE ESPECIES DE INSECTOS PLAGAOrestes Elósegui Claro, Jesús Jiménez Ramos y Aidanet Carr PérezInstituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Calle 110 no. 514 e/ 5. a B y 5. a F, Playa, Ciudad deLa Habana, CP 11600RESUMENSe realizó una prospección de hongos entomopatógenos a partir deespecies de insectos plaga sospechosos de micosis en cultivos degran importancia económica y de muestras de suelo. De un total de53 muestras se obtuvieron 17 útiles que correspondieron a 15 aisladosde Beauveria bassiana (Bals.) Vuill., una de Paecilomyces lilacinusSamson y una de Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin. El predominiode aislados de Beauveria fue consecuencia en parte del ampliorango de hospedantes de esta especie fúngica y a la cantidad demuestras procesadas que pertenecieron a Hypothenemus hampei(broca del café), donde este microorganismo es un patógeno muyhabitual. Solamente se obtuvo un aislado de hongo de las 15 muestrasde suelo procesadas mediante el trampeo con insectos patrones.Todos los aislados se incorporaron a la Colección de Cepas deHongos Entomopatógenos del Instituto de Investigaciones de SanidadVegetal (INISAV), donde se registraron sus característicasmacroculturales, microculturales, origen y especie a que pertenecen,con el objetivo de conservarlos para futuros estudios comoagentes potenciales de biocontrol de insectos plaga.Palabras claves: hongos entomopatógenos, hongos mitospóricos, controlbiológico, plagasABSTRACTA screening for entomopathogenic fungi from both mycosis suspectinsect cadavers in crops of economical importance and soil sampleswas carried out. Of a total out of 53 samples collected 17 resultedsuccessful which belonged to 15 isolates of Beauveria bassiana (Bals.)Vuill., one of Paecilomyces lilacinus Samson and one of Metarhiziumanisopliae (Metsch.) Sorokin. The predominance of Beauveria isolateswas a consequence in part of the large amount of samples taken fromHypothenemus hampei (coffee berry borer) where this microorganismhas been found as a very common pathogen as well as the broad hostrange this fungal species exhibits in nature. Only one fungal isolateof fifteen different soil samples tested by insect bait method wasobtained. All the isolates recovered were stored in the Plant HealthResearch Institute (INISAV) Culture Collection being previouslyrecorded in a datasheet with the micro and macro culturalcharacteristics, origin and species name, for further research for apotential use as biological control agents of insect pests.Key words: entomopathogenic fungi, mitosporic fungi, biological control,pestsINTRODUCCIÓNLos hongos mitospóricos están catalogados como ungrupo mundialmente reconocido de agentes microbianosa usarse tanto en los programas de control biológico deplagas como en los de manejo integrado de plagas (MIP).Esto es debido a su forma de actuar, que es por contactodirecto con la cutícula del hospedero y por la disponibilidadde tecnologías para producirlos masivamente.Algunos géneros además se pueden formular enaceites y así aplicarse con técnicas de volumen ultrabajo[Bateman et al., 1993; Bateman et al., 1996].Está demostrado que para llegar a obtener un productoaltamente efectivo para controlar una especie plagase debe partir de un amplio rango de aislados, seleccionadosen principio en cuanto a su virulencia. Los aisladosque causan epizootias espectaculares, como es elcaso de algunos de los géneros fúngicos imperfectosentomopatogénicos, son candidatos promisorios parausarse en el control de plagas, siempre y cuando logrenclasificar sobre la base de otras características esencialescomo son un nivel de especificidad de hospedanteestrecho, buena tolerancia a factores ambientales adversos,facilidad de producción, comportamiento en almacenajeadecuado y alta seguridad en mamíferos[Bateman et al., 1996].Clásicamente hay tres vías de enriquecer el número deaislados fúngicos para utilizarse como candidatos en elfitosanidad/265

Aislamiento, identificación y caracterización...Tabla 1. Aislados de hongos entomopatógenos obtenidos. Principales características macro y microculturalesAislado(número deregistro de origen)Bb-102Bb-103Bb-105Bb-106Bb-107Bb-SPOrigenMetamasiushemipterusceriseus(coleóptero),MatanzasMetamasiushemipterus(coleóptero),Santiagode CubaHypothenemushampei(coleóptero),cafetal, zonamontañosa,GranmaHypothenemushampei(coleóptero),café, zonamontañosa,GranmaHypothenemushampei(coleóptero),café, zonamontañosa,GranmaSpodopterafrugiperda(lepidóptero),maíz,CamagüeyIdentificaciónBeauveriabassianaBeauveriabassianaBeauveriabassianaBeauveriabassianaBeauveriabassianaBeauveriabassianaCaracterísticasmacroculturalesEn PDA colonias al inicioblancas afieltradas que con eltiempo se tornan cremapolvorientas. Reverso amarilloligeroCaracterísticasmicroculturalesCélulas conidiógenas muy típicasde la especie, con bases globosas.2,0-3,0 (2,3 µm) x 2,0-2,5(2,1 µm). Conidios hialinos,globosos a subglobosos1,0-2,5(1,9 µm) x 1,0-2,0 (1,7 µm)En PDA colonias algodonosas Muy abundantes conidioforosy blancas al inicio que se con grupos densos de célulastornan crema y polvorientas fialídicas. Células conidiógenascon el tiempo. Reverso amarillo globosas unas y otras en formaligerode botella con formas intermedias,1,5-3,0 (2,7 µm) x 2,0-3,0(22 µm). Conidios hialinos, aveces con un ápice muydefinido, globosos a elipsoidales1,5-3,0 (2,3 µm) x 1,5-3,0(21 µm)Colonias en PDA que al inicio Células conidiógenas muy típicasde la especie, con bases glo-son blancas y algodonosas y setornan beis claro y ligeramente bosas. 2,0-3,0 (2,3 µm) x 2,0-2,5polvorientas, según esporulan (2,2 µm). Conidios muy homogéneos,hialinos, globosos,con el tiempo. Reverso amarilloligeroalgunos subglobosos,2,0-2,0 µmColonias en PDA que al inicioson blancas y algodonosas y setornan crema claro yligeramente polvorientas segúnesporulan con el tiempo.Algunos coremios. Reversoamarillo ligeroColonias en PDA que al inicioson blancas y algodonosas y setornan beis claro y ligeramentepolvorientas según esporulancon el tiempo. Algunoscoremios Reverso amarilloligeroEn PDA colonias algodonosasy blancas al inicio que setornan beis y ligeramentepolvorientas con el tiempo.Reverso mielCélulas conidiógenas globosas unasy otras en forma de botella conformas intermedias, 2,0-3,5(2,3 µm) x 1,0-2,5 (1,9 µm).Conidios hialinos, globosos asubglobosos1,5-2,0(1,9 µm)x1,0-2,0 (1,7µm)Células conidiógenas globosasunas y otras en forma de botellacon formas intermedias, 2,0-3,5(2,3 µm) x 1,0-2,5 (1,9 µm).Conidios hialinos, globosos asubglobosos1,5-2,0 (1,9 µm) x1,0-2,0 (1,7µm)Células conidiógenas muytípicas de la especie, con basesglobosas, 2,0-3,0(2,4 µm) x 2,0-2,5 (2,3 µm).Conidios muy homogéneos, hialinos,globosos, algunos ligeramentesubglobosos, 2,0-2,0 µmfitosanidad/267

Elósegui y otrosBb-200603Bb-cepa2Bb-cepa3Bb-cepa4Bb-cepa5Bb-1234Bb-SIMHypothenemushampei(coleóptero),café, zonamontañosa,HolguínHypothenemushampei(coleóptero),café, zonamontañosa,Santiago deCubaHypothenemushampei(coleóptero),café, zonamontañosa,Santiago deCubaHypothenemushampei(coleóptero),café, zonamontañosa,Santiago deCubaHypothenemushampei(coleóptero),café, zonamontañosa,Santiago deCubaHypothenemushampei(coleóptero),café, Guamá,Santiago deCubaBeauveriabassianaBeauveriabassianaBeauveriabassianaBeauveriabassianaBeauveriabassianaBeauveriabassianaHypothenemus Beauveriahampei bassiana(coleóptero), café,Tercer Frente,Santiago de CubaColonias en MEA que al inicioson blancas y algodonosas y setornan beis y polvorientassegún esporulan con el tiempo.Reverso amarillo claroColonias en MEA que al inicioson blancas y algodonosas y setornan beis y polvorientassegún esporulan con el tiempo.Reverso amarillo pálidoColonias en MEA que al inicioson blancas y algodonosas y setornan beis y polvorientassegún esporulan con el tiempo.Reverso amarillo muy pálidoCélulas conidiógenas,predominan las de forma de botella,3,0-4,0 (3,3 µm) x 3,0-2,0(2,3 µm). Conidios variables,aunque predominan formaselipsoidales, base apiculada enocasiones, hialinos, 2,0-3,0(2,3 µm) x 2,0-3,0 (23 µm)Células conidiógenas típicas dela especie, con bases globosas,2,0-3,0 (2,2 µm) x 2,0-2,5 (2,3 µm).Conidios globosos a subglobosos,hialinos, algunos apiculados,2,0-2,5(2,2 µm) x 1,5-2,0(1,8 µm)Células conidiógenas típicas dela especie, con bases globosas,2,0-3,0 (2,3 µm) x 2,0-2,5 (2,4 µm).Conidios subglobosos aligeramente elipsoidales,predominando estos últimos,hialinos, 2,0-3,0 (2,6 µm) x 2,0Colonias en MEA que al inicio Células conidiógenasson blancas y algodonosas y se predominan las de forma detornan beis claro y polvorientas botella, 3,0-4,0 (3,2) x 3,0-2,0según esporulan con el tiempo. (2,4 µm). Conidios, predominanReverso amarillo pálido formas elipsoidales, algunosglobosos a subglobosos,hialinos, en ocasionesapiculados, 2,0-3,0(2,5 µm) x 2,0-2,5 (2,2 µm)Colonias en MEA que al inicio Células conidiógenas, predominanson blancas y algodonosas y se las de forma de botella, 3,0-4,0 (3,3)tornan beis claro y polvorientas x 3,0-2,0 (2,5 µm). Conidios,según esporulan con el tiempo. predominan formas elipsoidalesTendencia discreta a formar con ápice definido, algunoscoremios. Reverso amarillo subglobosos, hialinos, 2,0-3,0miel(2,6 µm) x 2,0Colonias en MEA que al inicioson blancas y algodonosas y setornan beis medio y polvorientassegún esporulan con eltiempo. Tendencia a formarcoremios. Reverso amarilloCélulas conidiógenas típicas dela especie, con bases globosas,2,0-3,0 (2,3 µm) x 2,0-2,5 (2,4 µm).Conidios globosos a subglobososligeramente, hialinos, 2,0 x2,0 µmColonias en MEA que al inicio Células conidiógenas con basesson blancas y algodonosas y se globosas, 2,0-3,0tornan beis pálido y polvorien- (2,1 µm) x 2,0-2,5 (2,4 µm).tas según esporulan con el tiempo.Reverso amarillo pálido ligeramente elípticos, hialinos,Conidios subglobosos a2,0-3,0 (2,3) x 1,5-2,5 (2,1) µm268/fitosanidad

Aislamiento, identificación y caracterización...Bb-SLBb-InvBb-1212Pl-01M2Ma-30Hypothenemushampei(coleóptero),café,San Luis,Santiago deCubaCylasformicarius(coleóptero),boniato,CamagüeyHypothenemushampei(coleóptero),café,Los Llanos,Guisa, GranmaHypothenemushampei, café,Santiago de CubaMuestra desuelo (insectotrampa Galleriamellonella), IPAVillena, LaHabanaBeauveriabassianaBeauveriabassianaBeauveriabassianaPaecilomyceslilacinusMetarhiziumanisopliaeColonias en MEA que al inicioson blancas y algodonosas y setornan beis pálido yligeramente polvorientas segúnesporulan con el tiempo.Tendencia a formar coremios.Reverso amarillo pálidoColonias en PDA que al inicioson blancas y algodonosas y setornan beis pálido yligeramente costrosas segúnesporulan con el tiempo.Reverso amarillo pálidoColonias en PDA que al inicioson blancas y algodonosas y setornan beis y polvorientassegún esporulan con el tiempo.Reverso amarilloColonias en PDA al inicioblanco lanoso que se tornanvioleta grisácea con la edad ycon micelio aéreo irregular.Reverso vináceoColonias en PDA blancas yalgodonosas al inicio que setornan amarillo verdoso yfinalmente verde olivo oscuro ycostroso con zonas con micelioaéreo abundante blanquecino.Reverso amarillo intensoCélulas conidiógenas predominanlas de forma de botella3,0-4,0(3,3) x 3,0-2,0 (2,7 µm).Conidios subglobosos aligeramente elípticos y hastaelipsoidales, hialinos,2,0-3,0(2,3) x 2,0 µmCélulas conidiógenas predominanlas de forma de botella, 3,0-4,0(3,4) x 3,0-2,0 (2,8 µm). Conidiosligeramente elípticos hastaelipsoidales, ápice discreto,hialinos, 2,0-3,0 (2,5) x 1,0-2,0(1,6) µmCélulas conidiógenas con basesglobosas, 2,0-3,0 (2,2 µm) x 2,0-2,5 (2,3 µm). Conidios globosos asubglobosos, hialinos, 1,5-2,0(1,8) x 2,0µmConidioforos solos o en grupos,forman sinemas con verticilosde hasta seis fiálides, con laedad se tornan rugosos. Célulasconidiógenas típicas, 7,0-13,0(9,5 µm) x 1,5-3,0 (2,8 µm).Conidios catenulados, gris-violetaclaro, elipsoidales a fusiformes,algunos con un ápice, 1,5-3,0(2,2 µm) x 1,5-3,0 (2,4 µm)Patrón conidioforo típico de laespecie con verticilos de 2-3ramas cada uno, con tonosverde olivo oscuro que aclara alápice.Células conidiógenas 6,0-10,0(8,1 µm) x 2,0-2,5 (2,1 µm).Conidios subhialinos aligeramente verdes, cilíndricosa ligeramente elipsoidales,5,0-8,5 (6,6 µm) x 2,0-3,0(2,4 µm)De un total de 53 muestras procesadas de las que 15fueron de suelo de zonas donde se habían observadoepizootias, 17 resultaron muestras exitosas. De los aisladosobtenidos solamente uno correspondió a unamuestra de suelo, que fue obtenido por trampeo conlarvas de Galleria mellonella (Fig. 1).Con respecto a las especies de interés detectadas se puedeobservar que hubo una predominancia de aislados pertenecientesa la especie Beauveria bassiana (Balsamo)Vuillemin (Tabla 1, Fig. 2).En contraste, solo se obtuvo un aislado de Metarhiziumanisopliae (Metschnikoff) Sorokin y otro de Paecilomyceslilacinus (Thom.) Samson (Fig. 1).Este comportamiento se puede atribuir a la efectividaddel método de trampeo con insectos susceptibles,donde se requiere de una cantidad de propágulos viablesque garantice la infección, los que deben ser delorden de 10 4 unidades por insecto como mínimo segúnBateman et al. (1996) y Moore y Caudwell (1997). Sesabe que el establecimiento de poblaciones de hongosfitosanidad/269

Elósegui y otrosentomopatógenos en el suelo está determinado tantopor las propiedades físicas y químicas de cada suelocomo por las de la cepa fúngica en cuestión [Rhodes ySmith, 1992]. También existe la posibilidad de que losmicroorganismos competidores con su producción demetabolitos activos afecten la viabilidad de estospropágulos fúngicos deseados [Jenkins y Grzywacz,2000]. Por ello, el trampeo puede fallar si no existe unaconcentración alta de esporas viables del microorganismode interés en el sueloFigura 1. Larva momificada de Galleria mellonella en cámara húmeda infectado con el aislado Ma-30 deMetarhizium anisopliae a partir de muestra de suelo. Nótese la emersión temprana del micelio en blanco.Figura 2. Colonia de Beauveria bassiana aislado Bb-105 obtenido de Hypothenemus hampei.Sun (2002) logró 6,7% de éxito para Metarhizium y10% de éxito para Beauveria en trampeos con el termiteCoptotermes formosanus, a partir de 90 muestras originalesde suelo, porcentajes superiores de éxito con respectoal procesamiento de termites muertos sospechososde micosis; sin embargo, Zimmermann (1986) [citadopor Sun, 2002] se refiere al método de trampeo conGalleria como uno de los más exitosos para detectarentomopatógenos en termites.Por otro lado, Dhoj et al. (2006) recomiendan tambiénel método de trampeo con Galleria en contacto conmuestras de suelo, porque fundamentalmente es el quelleva poca especializacion y el tiempo del ensayo es cortocon un porcentaje de éxito alrededor de 75% para270/fitosanidad

Aislamiento, identificación y caracterización...aislar Beavuveria y Metarhizium. Estos mismos autoresusaron 15 g de suelo aproximadamente por cadaindividuo de Galleria y pusieron en contacto con el sueloal insecto trampeador hasta 18 días; sin embargo, eneste trabajo se obtuvo una sola muestra de suelo útilpor trampeo con Galleria, lo que representó 7% de éxito.Este comportamiento puede deberse a que la cantidadde suelo por individuo fue de 6-10 g, y el tiempo encontacto con este solo fue de nueve días, además de quela cantidad de propágulos del hongo de interés presenteen el suelo es muy variable y depende de condicionesespecíficas de cada ecosistema (Tabla 1 y Fig. 1).Un método más efectivo para obtener nuevos aisladosde hongos es el aislamiento de colonias fúngicas únicas(ufc) a partir de muestras de suelo por dilucionesseriadas, según procedimiento detallado por Lecuona(1996). No obstante, es ampliamente aceptado que estemétodo es muy caro y se prefiere usar en el aislamientoy selección de especies bacterianas, como por ejemploBacillus thuringiensis [Johnson y Bishop, 1996], de ahíque se decidiera no emplearlo para enriquecer el númerode aislados de la Colección de Hongos Entomopatógenosdel INISAV.El porcentaje de éxito obtenido en este trabajo paralas muestras de insectos sospechosos de micosis o conuna evidente fue de 42%. Jackson et al. (2000) planteanque aunque este método de aislamiento directoconlleva mucho tiempo de muestreo en campo y experiencia,la realidad es que entre los más exitosos agentesde control con microorganismos se encuentranaquellos aislados obtenidos directamente de los insectoshospederos, y no de las colecciones de cultivos o demétodos indirectos a través de medios de cultivo selectivos.La frecuencia alta de aparición de Beauveria bassianase debió al amplio rango de hospedantes de este patógeno,además de que la mayoría de los aislamientos sehicieron a partir de Hypothenemus hampei (broca delcafé), y se conoce que esta especie fúngica regularmentese ha encontrado que atacan las poblaciones del insectode forma natural en los cafetales. De hecho, esesta la razón de que sea uno de los entomopatógenosmás estudiados para el control de esta plaga [Bustilloet al., 1999].Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. así como Metarhiziumanisopliae (Metsch.) Sorok. y Metarhizium flavovirideGams and Rozsypal están entre los hongos entomopatógenosmás usualmente encontrados en la naturaleza.Por ello, colecciones de cultivo internacionalmentereconocidas cuentan con varios cientos de aislados deestas tres especies como la Colección de HongosEntomopatógenos para Investigaciones Agrícolas delDepartamento de Agricultura de Estados Unidos(ARCEF), la ATCC (American Type Culture Collection)y la Colección del IMI (International MycologicalInstitute) en el Reino Unido [Humber, 1992; Batemanet al., 1996]. En Cuba más del 85% de la Colección deHongos Entomopatógenos del INISAV está representadapor aislados de Beauveria y Metarhizium.En relación con el aislamiento de Paecilomyces lilacinusobtenido de Hypothenemus hampei se sabe que estehongo se encuentra comúnmente en las crías de brocaen laboratorio, donde es posible que las condiciones dehacinamiento, la alta humedad relativa y la falta dedesinfección de las cerezas favorezcan la invasión de estaespecie para atacar a la broca, si bien en la planta decafé en el campo no se ha encontrado [Posada et al.,1998]. También es cierto que P. lilacinus está catalogadocomo hongo entomopatógeno oportunista y se hausado exitosamente en el control de nematodosfitopatógenos [López, 1995]. Por esta razón se decidióincorporarlo a la Colección de Hongos Entomopatógenosdel INISAV para futuras investigaciones.Los productos exitosos a base de hongos desarrolladosen el mercado han surgido a partir de un monitoreo deaislados obtenidos de las regiones geográficas yagroecosistemas, donde está el organismo plaga porcontrolar, así como de las colecciones de cultivos.Bateman et al. (1996) reportaron la selección de unasola cepa de M. anisopliae, después de haber ensayado159 aislados de Beauveria y Metarhizium contraSchistocerca gregaria (langosta del desierto). Esto confirmala necesidad de contar con abundante cantidadde aislados de los más diversos orígenes cuando se precisaobtener agentes microbianos efectivos comobiocontroladores de plagas [Bateman et al., 1996;Jenkins y Grzywacz, 2003].Como se puede apreciar, de acuerdo con las característicasmacro y microculturales, para los aislados deBeauveria existió una alta similitud, por lo que unaseparación entre estos por los métodos tradicionalesmorfométricos no es factible (Tabla 1). Para lograr ladistinción entre aislados hay que recurrir a métodos debiología molecular como RFLP y PCR-RAPDS [Bridgeet al., 1993; Bridge y Arora, 1998; Bielikova et al.,2002]. Estos métodos moleculares también se usan comouna forma altamente reproducible de reconocer cadafitosanidad/271

Elósegui y otrosaislado para patentar, registrar los productos ymonitorear tanto su destino en el ecosistema donde selibere como las posibles interacciones negativas quepuedan existir entre el aislado liberado y el resto de losaislados de la misma especie [Jenkins y Grzywacz, 2000;Bielikova et al., 2002].Finalmente todos los aislados de interés obtenidos seincorporaron al banco de cepas de hongos entomopatógenos,y en la base de datos de esa colección se registraronlas características macroculturales, microculturales,origen y especie a que pertenecen, con elobjetivo de conservarlos como agentes potenciales debiocontrol de insectos plaga para futuros estudios.CONCLUSIONES• Se obtuvieron 17 nuevos aislados de hongos entomopatógenosde los que uno fue de Metarhiziumanisopliae, uno de Paecilomyces lilacinus y el restode Beauveria bassiana.• El método de aislamiento directo a partir de insectosmicosados tuvo 42% de efectividad.• El método de aislamiento a partir de muestras desuelo de hongos entomopatógenos mediante trampeocon larvas de Galleria y Corcyra fue muy inefectivo,con 7% de éxito solamente.REFERENCIASBarnett, H. 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FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006EcologíaDISPERSIÓN, DISTRIBUCIÓN ACTUAL Y NUEVOSRESERVORIOS DE FRANKLINIELLA SCHULTZEI TRYBOM(THYSANOPTERA: THRIPIDAE) EN CUBASantiago F. Jiménez Jiménez, 1 Liuva Pérez López, 2 Martha Toro, 3 Criseida Granda, 4 Amelia Mateo, 5Héctor Sariol, 6 Elisa Rodríguez, 7 Rodney Pérez, 8 Roquelina Jiménez, 9 Ángel Pérez-Alejo 10 y RansésVázquez 111Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Calle 110 no. 514 e/ 5. a B y 5. a F, Playa, Ciudadde La Habana, CP 11600, sjimenez@inisav.cu2Centro Nacional de Sanidad Vegetal. Laboratorio Central de Cuarentena Vegetal. Ayuntamiento 231e/ San Pedro y Lombillo, Plaza de la Revolución, Ciudad de La Habana3Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Carretera a Santiago de Cuba Km 2½, Guantánamo4Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Carretera Siboney Km 6, Ternerito Lindo, Santiago de Cuba5Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Prolongación de Carbó 40, Alturas de Perera y calleHolguín, Holguín.6Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Carretera Central vía Santiago de Cuba Km 3½, Bayamo,Granma7Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Genaro Rojas 86 e/ Marcelino Diéguez y Antonio Barrera,Las Tunas, CP 75200.8Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Ave Finlay Km 2½ e/ Planta de Nitrógeno y CircunvalaciónNorte, Camagüey9Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Carretera Palmira Km 4, Cienfuegos10Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Carretera Maleza Km 2½, Santa Clara, Villa Clara11Instituto de Meteorología. Apdo. 17032, Habana 17, Ciudad de La Habana, CP 11700RESUMENDurante el período 2001-2006 se realizaron muestreos en diferentesprovincias de Cuba que permitieron actualizar la situación de F.schultzei en relación con el grado de dispersión logrado por la especie,así como las plantas que le sirven de reservorios y su distribución.Se detectó la presencia de esta especie de trips en la mayoríade las provincias del país, y se reconoció que su mayor distribuciónla alcanza en la región oriental, especialmente en Camagüey, Granma,Holguín, Santiago de Cuba y Guantánamo. Las especies botánicassobre los que se detectó F. schultzei alcanzaron la cifra de 94, de lascuales 84 se informan por primera vez para el país. No obstante, elinsecto se detectó de forma mayoritaria solamente sobre 24 especiesde plantas, básicamente vegetales, hortalizas y ornamentales.El mayor número de detecciones correspondió a las rosas de diferentescolores, y se realizó también un número considerable de ellassobre quimbombó, abrojo, margaritas japonesas, lirios, espinaca,tomate, claveles, calabaza, carolá, berenjena y habichuelas, lo queapunta a las preferencias de F. schultzei. Debido a la posibilidad deinfectarse con tospovirus, que presentan algunas de estas especiesde plantas, y dada la capacidad vectora de estos patógenos –demostradapor este trips en numerosos países, incluidos algunos de estehemisferio–, se considera que son ellas las que actualmente poseenel mayor peligro potencial de resultar afectadas por esas enfermedadesvirales.Palabras claves: distribución, Frankliniella schultzei, reservorios,tripsABSTRACTSamplings in different provinces of Cuba were carried out during theperiod 2001-2006 that allowed upgrading the status of F. schultzei inrelation with the dispersion grade achieved by the species, as well asthe plants that serve it as reservoirs and their distribution. The presenceof this trips species was detected in most of the provinces and it wasrecognized that its biggest distribution is reached in the orientalregion, especially in Camagüey, Granma, Holguín, Santiago de Cubaand Guantánamo. Botanical species on those F. schultzei was detectedreached the figure of 94 and 84 of them are informed the first time forthe country. Nevertheless, the insect was only detected in a majorityway on 24 species of plants, basically vegetables and ornamentals.The biggest number of detections corresponded to different coloursroses, and a considerable number of them on quimbombó (lady’sfingers), thistle, Japanese daisies, irises, spinach, tomato, carnations,pumpkin, carolá, eggplant and kidney beans, what points out to thepreferences of F. schultzei. Keeping in mind the possibility to beinfected with tospovirus that present some of these species of plantsand given the vector capacity of these patogens –demonstrated bythis thrips in numerous countries, including some of our hemisphere–, itis considered they possess the biggest danger potential to be affectedby this viral group at the moment.Key words: distribution, Frankliniella schultzei, reservoirs, thripsfitosanidad/273

Jiménez y otrosINTRODUCCIÓNFrankliniella schultzei Trybom (Thysanoptera:Thripidae) es una especie de trips que, además defitófago, se incluye entre las confirmadas como vectoresde tospovirus [Mound, 2002], razón que la convierte enun insecto plaga doblemente peligroso.Según Vierbergen y Mantel, 1991 [citados porKormelink et al., 1998], F. schultzei se distribuye en lostrópicos, extendida a lo largo de África, Asia, Australia,Caribe, Pacífico y América del Sur. También se informaen la Florida y en zonas de clima templado (introducida)como Gran Bretaña, Italia y Países Bajos.Palmer et al. (1992) le atribuyen hábitos polífagos (flores),y la informan en ají chile, algodón, compuestas,cebolla, sorgo y tomate, entre otras.En Cuba Suris et al. (2001) realizaron el primer informede la presencia de F. schultzei en sus formas clara y oscurasobre los cultivos de papa y tomate. PosteriormentePérez et al. (2004) confirmaron su presencia y la informaronsobre Phaseolus vulgaris L. (habichuela) y Cucumissativus L. (pepino). En ambos casos los autores se refierena muestras colectadas en provincias de la zona occidentaldel país (La Habana y Ciudad de La Habana), ymencionan una baja intensidad de la especie.La forma oscura de F. schultzei está reconocida comovector de los cuatro tospovirus Tomato Spotted WiltVirus (TSWV) [Samuel et al., 1930; Sakimura, 1969;Wijkamp et al., 1995], Tomato Chlorotic Spot Virus(TCSV), Groundnut Ringspot Virus (GRSV) [Wijkampet al., 1995] y Chrysanthemum Stem Necrosis Virus(CSNV) [Nagata y de Ávila, 2000]. Esta forma oscuraestá extendida a lo largo de América del Sur y se indicacomo un vector importante de tospovirus en Brasil (DeÁvila et al., 1998) y Argentina [Williams et al., 2001].Más recientemente Sakurai (2004) demostró también quela forma oscura de F. schultzei, originaria de Paraguay,puede transmitir TSWV eficazmente, y puede ser unvector importante del virus en los campos de tomate.Este trabajo se realizó como una contribución al conocimientodel grado de dispersión, la distribución actualy la diversidad de hospedantes que posee F. schultzeien Cuba, dado el peligro potencial que representa estaespecie, más que como fitófago, como vector de enfermedadesvirales, particularmente de tospovirus.MATERIALES Y MÉTODOSEl trabajo se llevó a cabo en dos etapas durante el períodocomprendido entre los años 2001-2006, y mediantemuestreos efectuados en las diferentes provincias delpaís, en los que se realizó la inspección local de áreassembradas con plantas ornamentales (jardines domésticos,jardines botánicos, jardines de instalaciones vinculadasal turismo y otros); áreas productoras de cultivosen empresas y cooperativas agrícolas; semillerosy viveros; áreas de floricultura; huertos intensivos,organopónicos y cultivos protegidos y áreas citrícolas.En la primera etapa, que comprendió del 2001 al 2003,los muestreos mensuales se realizaron en el período comprendidoentre septiembre y marzo, y se tomó unamuestra compuesta por no menos de 10 especies botánicaspor provincia. En la segunda etapa, entre el 2004y el 2006, los muestreos se extendieron a lo largo detodo el año, y en cada inspección mensual se observaronno menos de 20 especies botánicas.En los dos períodos se revisaron vegetales, hortalizas,viandas, frutales, ornamentales y otras. Las muestrasestuvieron compuestas tanto de hojas como de hojas yflores, según el caso. Cada una de ellas, después de colectada,se introdujo de modo independiente en bolsasplásticas que se identificaron de acuerdo con el sitio deprocedencia y la fecha de muestreo.El material vegetal con los trips se revisó en las EstacionesTerritoriales de Protección de Plantas (ETPP)de las diferentes provincias, con la finalidad de extraerde cada muestra los especímenes presentes e introducirlosen viales con alcohol al 70%, en los que se anotó,para cada caso, el hospedante, el sitio de procedenciade la muestra y la fecha en que se obtuvo. Posteriormentelos viales se enviaron a los Laboratorios Provincialesde Sanidad Vegetal (LAPROSAV) para su identificacióny/o al Laboratorio Central de Cuarentenapara su identificación y/o confirmación, según correspondiera.Para la ejecución del diagnóstico se utilizaronlas claves de Palmer et al. (1992), Mound y Marullo(1996), Rodríguez et al. (1997) y Mound y Kibby (1998).En la mapificación de las muestras con detecciones deF. schultzei se utilizó el Sistema de CuadrantesCartográficos [CNSV, 1997], según su versión digitalizada[Vázquez et al., 2003]. Todo el trabajo se realizóen estrecha relación con la encuesta nacional de especiespeligrosas de trips, que patrocina el Centro Nacionalde Sanidad Vegetal.RESULTADOS Y DISCUSIÓNDurante el período comprendido entre el 2001 y el 2003,de un total de 4818 muestras positivas para trips, solose identificó F. schultzei en 33 de las muestras revisadas,274/fitosanidad

276/fitosanidadJiménez y otrosTabla 2. Relación de especies de plantas encontradas como nuevosreservorios de F. schultzei en CubaNombre científicoAcalypha sp.Allamanda cathartica Lin.Allium cepa Lin.Allium schoenoprassum Lin.Althaea rosea Car.Amaranthus spinosus, Lin.Angelonia cubensis RobinsonArgyreia nervosa Boj.Bastardia viscosa (L.)Begonia sp.Benincasa hispida Cong.Beta vulgaris L. var. ciclaBidens pilosa L.Cajanus indicus SpregCalendula officinalis Lin.Callotropis procera (Ait.) R. Br.Capsicum frutescens L.Cassia fistulaCestrum nocturnum Lin.Citrullus vulgaris Schrad.Codiaeum variegatum Blume.Crinum sp.Cucurbita pepo L.Dahlia coccinea Cav.Datura metel L.Daucus carota sativa D. C.Dianthus caryophyllus L.Gardenia jasminoides EllisGerbera jamesonii Hort.Gliricidia sepium L.Gossypium hirsutum L.Helianthus annuus Lin.Helychrysum bracteatum Andr.Hibiscus esculentus L.Hibiscus rosa-sinensis Lin.Hibiscus sp.Nombre comúnRabo de gatoAlamandaCebollaCebollinoVarita de San JoséBledo espinosoNomeolvides malvaCordón de sedaMalva brujaBegoniaCalabaza chinaAcelgaRomerilloFrijol guandulMarigolAlgodón de sedaAjíCañandongaGalán de nocheMelónCrotonLirio florCalabazaDalia malvaClarínZanahoriaClavelJazmín del cabo (gardenia)Margarita japonesaJúpiterAlgodónGirasolSiemprevivaQuimbombóMarpacíficoHibiscus, MarpacíficoTabla 3. Especies botánicas sobre las que se detectó F. schultzei en cuatro o más ocasiones y procedenciade las muestrasNombre común Nombre científico ProcedenciaCebolla A. cepa GuantánamoAcelga B. vulgaris var. cicla Holguín, Santiago de Cuba, GuantánamoRomerillo B. pilosa Ciudad de La Habana, Holguín, GuantánamoMelón C. vulgaris HolguínLirio flor Crinum sp. Santiago de CubaPepino C. sativus Holguín, GuantánamoCalabaza C. pepo Camagüey, Holguín, Santiago de Cuba, Guantánamo

Dispersión, distribución actual...Dalia D. coccinea Granma, Santiago de CubaClavel D. caryophyllus La Habana, HolguínMargarita japonesa G. jamesonii Cienfuegos, Camagüey, Santiago de CubaQuimbombo H. esculentus Holguín, GuantánamoMarpacífico H. rosa-sinensis Matanzas, Camagüey, Santiago de CubaJazmín Jasminum sp. Holguín, Santiago de CubaLechuga L. sativa Ciudad de La Habana, Holguín, Santiago de CubaTomate L. lycopercisi Holguín, Santiago de Cuba, GuantánamoFrijol Phaseolus sp. Holguín, GuantánamoRosa Rosa sp. Ciudad de La Habana, Las Tunas, Granma, Santiago de Cuba,GuantánamoBerenjena S. melongena Santiago de Cuba, GuantánamoEspinaca S. oleracea Holguín, Santiago de Cuba, GuantánamoCarolá T. erecta Pinar del Río, La Habana, Santiago de Cuba, GuantánamoCopetúa T. patula HolguínAbrojo terrestre T. cistoides Santiago de CubaHabichuela V. sesquipedalis Villa Clara, Holguín, Santiago de Cuba, GuantánamoVicaria V. rosea Santiago de CubaFigura 1. Distribución por cuadrantes cartográficos de F. schultzei en Cuba según la ubicación geográfica de sus reservorios (2001-2006).CONCLUSIONES• F. schultzei se dispersó a lo largo de Cuba entre el2001 y el 2006, y diversificó sus reservorios hastaalcanzar la cifra de 92 especies botánicas.• La más amplia distribución de la especie se registróen los territorios de las provincias de Camagüey,Granma, Holguín, Santiago de Cuba y Guantánamo.• Se informan 84 especies de plantas que constituyennuevos reservorios de F. schultzei para Cuba, entrelas cuales quimbombó, abrojo, margaritas japonesas,lirios, espinaca, tomate, claveles, calabaza, carolá,berenjena, habichuela y especialmente las rosas resultanpreferidas por el insecto.REFERENCIASCNSV: «Vigilancia fitosanitaria por cuadrantes cartográficos», Centro Nacionalde Sanidad Vegetal, Ministerio de la Agricultura, La Habana, 1997.fitosanidad/277

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FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006VARIABILIDAD DE LAS ISOENZIMAS ESTERASAS DE BEAUVERIABASSIANA (BALSAMO) VUILLEMINMaría E. Estrada Martínez y Dolores Piñón GómezInstituto Nacional de Investigaciones de la Caña de Azúcar. Carretera CAI Manuel Martínez PrietoKm 2½, Boyeros, Ciudad de La Habana, CP 19390, fax: (53-7) 260 2571, meem@inica.edu.cuRESUMENSe determinó la variabilidad de las isoenzimas esterasas delhifomiceto entomopatógeno Beauveria bassiana (Balsamo) Vuilleminmediante electroforesis vertical en gel de poliacrilamida a 8,5%. Seanalizaron los zimogramas de 21 aislamientos de diferentes orígenesgeográficos y entomológicos. A partir de la matriz de los datosoriginales se calculó la distancia genética y se realizó el análisis deagrupamiento de los individuos mediante el método de los promediosde las distancias no ponderadas. La presencia de 24 bandas diferencialesy de seis grupos de diversidad molecular evidenciaron la variabilidadgenética de B. bassiana para el sistema enzimático estudiado.Palabras claves: Beauveria bassiana, variabilidad, esterasas, Diatraeasaccharalis, caña de azúcarABSTRACTIsoenzyme esterases variability of hyphomycete fungus Beauveriabassiana (Balsamo) Vuillemin was determinated by means verticalelectrophoresis on 8.5% polyacrylamide gel. Twenty one isolates fromdifferent geographical and entomology origin groups were analyzed.Starting from the matrix of the original data the genetic distance wascalculated. The analysis of individuals cluster was carried out bymeans of the unweighted pair–group method, arithmetic average. Thepresence of 24 differential bands and six groups of molecular diversityevidenced the genetic variability of B. bassiana for the studiedenzymatic system.Keys words: Beauveria bassiana, variability, esterases, Diatraeasaccharalis, sugar caneINTRODUCCIÓNBeauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin es un hifomicetoentomopatógeno ampliamente utilizado en lalucha biológica contra los insectos plaga de los cultivosagrícolas [Moino et al., 2002; Sáenz de Cabezón et al.,2003; Estrada et al., 2004; Kauffman et al., 2005]. EnCuba se utiliza para disminuir las poblaciones larvalesde Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Cambridae), barrenadorde la caña de azúcar (Saccharum sp. híbrido).El estudio de las isoenzimas esterasas contribuye alconocimiento de la variabilidad genética de diferentesespecies entomopatógenas [Estrada et al., 1997;Bruce et al., 2003]. Este análisis permite establecerdiferencias no detectables desde el punto de vistamorfológico.El interés agronómico y ecológico de las aplicaciones deB. bassiana en el cultivo de la caña de azúcar precisaconocer las diferencias isoenzimáticas entre los aislamientosdel hifomiceto, de forma tal que estos puedanser identificados luego de su aplicación en el agroecosistemacañero. En este sentido en el presente trabajose determina la variabilidad de las isoenzimasesterasas de B. bassiana, sistema enzimático reportadopolimorfo para esta especie [Fernandes et al.,2006].MATERIALES Y MÉTODOSSe analizaron 21 aislamientos (Tabla 1) de B. bassiana,los cuales se cultivaron en 50 mL de medio de cultivoestático Adamek (1965) e incubados a 25 o C durantesiete días.El micelio obtenido se pesó húmedo y seco, después defiltrarlo por papel Filtrak 390 y llevarlo a sequedad atemperatura ambiente durante tres días. Un gramo delsecado se maceró con tampón fosfato a pH = 6,5 consacarosa a 20% en una proporción de 1:3. El maceradose centrifugó a 10 000 rpm durante 10 min.fitosanidad/279

Estrada y PiñónTabla 1. Relación de los aislamientos de Beauveria bassiana(Bals.) Vuill. utilizados en el trabajoAislamientos País de origen Hospedante de origen1 Cuba Diatraea saccharalis2 Cuba Diatraea saccharalis3 Cuba Diatraea saccharalis4 Cuba Diatraea saccharalis5 Francia Leptinotarsa decemlineata6 Cuba Diatraea saccharalis7 Guadalupe Insecta8 Estados Unidos Artiples flloridus9 Cuba Diatraea saccharalis10 Cuba Diatraea saccharalis11 Cuba Diatraea saccharalis12 Francia Sitona discoideus13 Cuba Diatraea saccharalis14 Cuba Insecta15 Cuba Diatraea saccharalis16 Cuba Diatraea saccharalis17 Cuba Diatraea saccharalis18 Cuba Hysipyla grandella19 Cuba Diatraea saccharalis20 India Insecta21 Bulgaria InsectaSe realizaron seis extracciones para cada aislamiento,las que se examinaron comparativamente por electroforesisvertical en gel de poliacrilamida a 8,5%. Laelectroforesis se realizó entre 50-60 mA durante 4 h.Para el revelado de los geles se utilizaron como sustratosα y β-naftil acetato, y se analizaron visualmente, paralo cual se tuvo en cuenta el número y la posición de lasbandas de cada aislamiento. Las movilidades relativasde las manchas se calcularon a partir del punto de aplicacióncomo:Rf = Movilidad de la mancha / Movilidad del frente de corridaCada banda enzimática se consideró como una variablecualitativa presente (1) o ausente (0). Se utilizó elprograma NTSYS versión 2.01, y a partir de la matrizde los datos originales se calculó la distanciagenética mediante el coeficiente de similitud SM y serealizó el análisis de agrupamiento de los individuospor el método de los promedios de las distancias noponderadas (Unweighted Pair-Group Method,Arithmetic Average). Los patrones de marcadoresmoleculares se determinaron según Cornide et al.(2000).RESULTADOS Y DISCUSIÓNLa Fig. 1 corresponde a los zimogramas para esterasasde los 21 aislamientos de B. bassiana estudiados. Se apreciaun total de 41 bandas. De ellas 24 son polimórficas,es decir, son bandas únicas para diferentes aislamientosque representan 58,53% del total de las bandas reveladas.La presencia de 18 patrones de bandas evidencia elpolimorfismo para esterasas de B. bassiana, lo que hasido demostrado por diferentes autores para esta especieentomopatógena [Liu et al., 2003; Meyling y Eilenberg,2005].280/fitosanidad

Variabilidad de las isoenzimas...Figura 1. Zimograma para esterasas de 21 aislamientos de Beauveria bassiana (Bals.) Vuill.(1-41: bandas; I-XVIII: patrones)De acuerdo con lo obtenido mediante el análisis de agrupamientode los 21 aislamientos de B. bassiana estudiados,se formaron seis grupos de diversidad molecular(I, II, III, IV, V y VI) (Fig. 2), donde los aislamientosno aparecen agrupados por su origen geográfico yentomológico.La presencia de bandas diferenciales (Tabla 2) permitiódistinguir las bandas de los grupos de diversidadmolecular. Así, por ejemplo, en el grupo I, formado porlos aislamientos 1, 3, 18, 2, 4 y 5, se puede diferenciarel aislamiento 3 del 5 por la presencia de las bandasB14 y B34 en el primero, y la ausencia en el segundo.En el grupo II se evidencia la presencia de bandas diferencialesentre los aislamientos que conforman en estegrupo. En el caso del grupo III los aislamientos 11 y 12se identifican del resto de los aislamientos por presentarlas bandas B11, B25 y B35; sin embargo, estos aislamientosno pudieron diferenciarse entre sí. El restode los aislamientos que conforman los grupos IV, V yVI presentaron bandas diferenciales que permitieronidentificarlos entre sí.fitosanidad/281

Estrada y PiñónFigura 2. Análisis de agrupamiento de los 21 aislamientosde B. bassiana basado en la matriz de similitud.Tabla 2. Patrones de descriptores moleculares de los aislamientos de B. bassiana conisoenzimas esterasasGrupos dediversidadmolecularAislamientos B11 B12 B25 B28 B35 B38 B39 B41I 1 0 1 0 0 1 0 0 03 0 1 0 0 0 0 0 018 0 1 0 0 0 0 0 02 0 1 0 0 0 0 0 04 0 1 0 1 0 0 0 05 0 0 0 0 0 0 0 0II 6 0 0 0 1 1 0 1 07 0 0 0 1 0 0 1 015 0 0 0 1 0 0 1 019 0 0 0 1 0 0 0 120 0 0 0 1 0 0 0 18 0 0 0 1 0 0 1 013 1 0 0 1 0 0 0 09 0 0 0 0 0 1 0 010 0 0 0 1 0 1 0 1III 11 1 0 1 0 1 0 0 012 1 0 1 0 1 0 0 0IV 16 0 0 0 0 0 0 1 017 0 0 0 0 0 0 0 0V 21 0 0 0 0 0 0 0 0VI 14 0 0 0 0 0 0 0 0282/fitosanidadBandas diferenciales entre grupos de diversidad molecular.Bandas diferenciales entre aislamientos de un mismo grupo de diversidad molecular.

Variabilidad de las isoenzimas...La caracterización basada en el estudio de las isoenzimasesterasas evidenció la variabilidad genética de B. bassianay permitió contar con otro criterio para diferenciarlos aislamientos del hifomiceto por sus patrones debandas, lo que resulta de utilidad práctica para la colecciónde microorganismos entomopatógenos.La determinación de un carácter discriminante paraB. bassiana a partir de las bandas diferenciales resultade interés agronómico, pues fue posible diferenciar elaislamiento 3 que se aplica en el cultivo de la caña deazúcar del 5 que se aplica en la agricultura no cañera.Como B. bassiana se ha aislado a partir de larvas ycrisálidas de D. saccharalis colectadas en diferentespartes de la planta y a partir de muestras de suelo (Tabla1), la evaluación de la aplicación del aislamiento 3en el campo requiere de su caracterización para la diferenciaciónde los aislamientos que aparecen naturalmenteen el agroecosistema cañero.Generalmente los patrones isoenzimáticos no secorrelacionan con los insectos hospedantes, con el paísde origen ni con otro carácter. Ellos pueden emplearsecomo marcadores individuales, y se han utilizados paraconocer la estabilidad genética de especies de hifomicetosentomopatógenos sometidas a diferentes presiones deselección [Rakotoniainy et al., 1994].El conocimiento de la variabilidad de las isoenzimasesterasas constituye una herramienta para la caracterizaciónde los aislamientos de B. bassiana en el ProgramaNacional de Lucha Biológica contra el barrenadorde la caña de azúcar D. saccharalis.CONCLUSIONES• La caracterización basada en el estudio de lasisoenzimas esterasas evidenció la variabilidad genéticade B. bassiana y permitió contar con otro criteriopara diferenciar los aislamientos del hifomiceto porsus patrones de bandas.• Fue posible diferenciar el aislamiento 3, que se aplicaen el cultivo de la caña de azúcar, del aislamiento 5que se aplica en la agricultura no cañera.• La evaluación de la aplicación del aislamiento 3 en elcampo requiere de su caracterización para la diferenciaciónde los aislamientos que aparecen naturalmenteen el agroecosistema cañero.REFERENCIASAdamek, L.: «Submerse Cultivation of the Fungus Metarhiziumanisopliae (Metsch.) Sorok», Folia Microbiológica 10: 255-257, 1965.Bruce, L.; M. Skinner; S. D. Costa; S. Gouli; W. Reid; M. El Bouhssini:«Entomopathogenic Fungi of Eurygaster integriceps Puton (Hemiptera:Scutelleridae): Collection and Characterization for Development»,Biological Control 27 (3):260-272, 2003.Cornide, M. T.; O. Coto; D. Calvo, E. Canales; F. de Prada; G. Pérez:«Molecular Markers for the Identification and Assisted Managementof Genetic Resources for Sugarcane Breeding», Plant Varietiesand Seeds 13:113-123, 2000.Estrada, M. E.; D. Piñón; M. Capote: «Variabilidad de las esterasas deMetarhizium anisopliae», Revista Iberoamericana de Micología14(1):29-30, 1997.Estrada, M. E.; M. Romero; M. J. Rivero; F. Barroso: «Presencia naturalde Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin en el cultivo de la cañade azúcar (Saccharum sp hibrido) en Cuba», Revista Iberoamericanade Micología 21(1):42-43, 2004.Fernandes, E. K.; G. L. Costa; A. M. Moraes, V. Zahner; V. R. Pinheiro:«Study on Morphology, Pathogenicity and Genetic Variability ofBeauveria bassiana Isolates Obtained from Boophilus microplusTick», Parasitology Research 98 (4):324-832, 2006.Kauffman, P. E.; R. Collen; A. Donald; J. Rutz; K. Ketzis; J. James:«Evaluation of Beauveria bassiana Applications Against Adult HouseFly, Musca domestica, in Commercial Caged-Layer Poultry Facilitiesin New York State», Biological Control 33 (3):360-367, 2005.Liu, H.; M. Skinner; M. Brownbridge; B. L. Parker: «Characterization ofBeauveria bassiana and Metarhizium anisoplaie Isolates forManagement of Tarnished Plant Bug Lygus lieolaris (Hemiptera:Miridae)», Journal of Invertebrate Pathology 82 (3):139-147, 2003.Meyling, N. V; J. Eilenberg: «Isolation and Characterization of Beauveriabassiana Isolates from Phylloplanes of Hedgerow Vegetation»,Mycological Research 110 (2):188-195, 2005.Moino Jr., A.; S. B. Alves; R. B. Lopes; P. M. O. J. Neves; R. M. Pereira; S.A. Vieira: «External Development of the Entomopathogenic FungiBeauveria bassiana and Metarhizium anisopliae in the SubterraneanTermite Heterotermes tenuis», Scientia Agricola 59 (2):267-273, 2002.Rakotoniainy, M. S.; M. L. Cariou; Y. Brigoo; G. Riba: «PhylogeneticRelationships Within the Genus Metarhizium Based on 28S RNASequences and Isozyme Comparison», Mycological Research 98(2):225-230, 1994.Sáenz-de-Cabezón, J. F.; V. M. Mancebón; I. P. Moreno: «TheEntomopathogenic Fungus Beauveria bassiana and Its Compatibilitywith Triflumuron: Effects on the Two Spotted Spider Mite Tetranycusurticae», Biological Control 26:168-173, 2003.fitosanidad/283

284/fitosanidadEstrada y Piñón

FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006Control biológicoUN MEDIO SIMPLIFICADO A BASE DE SOYA MÁS AZÚCARTURBINADA DE CAÑA PARA LA PRODUCCIÓN DEL HONGOACAROPATÓGENO HIRSUTELLA NODULOSA PETCHEN FASE LÍQUIDAReinaldo I. Cabrera, 1 Marlén Vega 2 y Litzy Ayra 11Instituto de Investigaciones de Fruticultura Tropical. Ave 7. a no. 3005 e/ 30 y 32, Playa, Ciudadde La Habana, entomopatogeno@iift.cu.2Instituto de Investigaciones del Arroz. Autopista Novia del Mediodía Km 16½, Bauta, La Habana,iiarroz@bauta.esihabana.cu; iiarroz@sba.esihabana.cuRESUMENEl hongo Hirsutella nodulosa Petch resulta un importante enemigonatural de muchos ácaros fitófagos. Para su producción comobioplaguicida es muy necesaria la determinación de un medio decultivo sencillo, económico y eficiente. Se ensayaron cinco concentracionesde soya (6, 8, 10, 12 y 14% p/v) con dos de azúcar turbinadade caña (3 y 4% p/v). Cada combinación se distribuyó por separadoen tres erlenmeyers de 300 mL con 100 mL de medio cada uno, yprevia esterilización en autoclave a 121 o C durante 25 min; se inocularoncon una suspensión micelial del hongo a 3% v/v para su fermentacióndurante cuatro días en zaranda de producción continua a27 ± 1 o C y 180 rpm como ocurrió con el inóculo. Seguidamente serecuperó cada biomasa en papel de filtro por filtración al vacío y secolocó en una estufa a 60 o C durante 24 h para determinar su pesoseco en balanza analítica. Los resultados se analizaron mediante unANOVA de clasificación doble, previa transformación de los datos enx +1 , y las medias se compararon entre sí por la prueba de rangosmúltiples de Duncan para p < 0,05. La mejor combinación de soyamás azúcar fue la de 14 y 3% p/v respectivamente, con resultadosque alcanzaron hasta un promedio de 1,14 g (peso seco de micelio)por cada 100 mL de medio, lo que permite considerarlo económico yeficiente para la producción a gran escala de este acaropatógeno ycomo la primera experiencia en Cuba.Palabras claves: Glicine max, Hirsutella nodulosa, cultivo sumergido,azúcar de cañaABSTRACTThe fungus Hirsutella nodulosa Petch is an important natural enemy ofmany phytophague mites and it is very necessary the determination ofa simple, economic and efficient culture medium for its production asbioplaguicide. Five soybean concentrations have been assayed (6;8; 10; 12 and 14% w/v) with turbinated cane sugar (3 and 4% w/v).Each combination has been distributed separately in three erlenmeyersof 300 mL with 100 mL of medium each one. They have been sterilizedin autoclave at 121ºC during 25 min and inoculated with a micelialsuspension of the fungus at 3% v/v. They were fermented four dayswith a continuous shaker at 27 ± 1ºC and 180 rpm as well as theinoculum. Each biomass was recovered on fitter paper by vacuumfiltration. They were put in an oven at 60ºC during 24 h to determinedry weight by analytical balance. The results were analyzed by anANOVA of double classification, previous data transformation in x + 1 .Means were compared by Duncan Multiple Range Test for p < 0.05.The best combination of soybean plus sugar was 14 and 3% w/vrespectively, with a mean up to 1.14 g (dry weight of mycelium) byeach 100 mL of medium. This result allows considering it as economicand efficient for the great scale production of this mite pathogen andwhich the first Cuban experience.Key words: Glicine max, Hirsutella nodulosa, submerge culture, canesugarINTRODUCCIÓNLas investigaciones realizadas en Cuba y otros paísescon el hongo Hirsutella nodulosa Petch, al que se le consideraun importante enemigo natural de muchos ácarosfitófagos [Cabrera y Domínguez, 1987 y 1987a; Mintery Brady, 1980], han motivado el interés por su utilizacióncomo bioacaricida.La llegada al país del ácaro tarsonémido del arrozSteneotarsonemus spinki Smiley a finales de 1997 [Ramoset al., 1998] y los estudios de H. nodulosa comoenemigo natural de este ácaro en Cuba y Sri Lanka[Cabrera et al., 2002 y 2005], así como lo difícil queresulta su control por la vía de la lucha química [Ca-fitosanidad/285

Cabrera y otrosbrera et al., 2002a], potenciaron la necesidad de profundizaren la posible utilización de H. nodulosa en losprogramas de control biológico y manejo integrado contraesta y otras plagas. Para ello se requiere disponer,en primer lugar, de un medio de cultivo y una tecnologíabarata que permitan la producción de este acaropatógenoa gran escala y en las cantidades requeridaspara tales fines.El presente trabajo ofrece los primeros resultados enCuba sobre la búsqueda de un medio simplificado, económicoy eficiente para la producción del hongo H. nodulosaen fase líquida y su importancia en la multiplicaciónacelerada de este control biológico.MATERIALES Y MÉTODOSPara la determinación del medio se pesaron por separado36, 48, 60, 72 y 84 g de soya en grano (Glycine max(Lin.) Merr.) y se echaron en erlenmeyers de 2 L con500 mL de agua destilada para su cocción en autoclavea 121 o C durante 35 min. Luego el contenido de cadarecipiente se batió en una batidora licuadora durante20 s y se filtraron separadamente por un paño de lienzo,con presión manual para la extracción de cada partelíquida, las que se enrazaron con agua destilada a600 mL para que la soya quedara a 6, 8, 10, 12 y 14% p/v,respectivamente.A los primeros 300 mL con cada concentración de soyase le adicionó entonces el azúcar turbinada de caña a3% p/v y a los 300 restantes a 4% p/v, y se filtraron alvacío por papel de filtro Whatmann no.1. Seguidamentese vertieron por separado 100 mL de cada una de lascombinaciones de nutrientes a las diferentes concentracionesen erlenmeyers de 300 mL, y se esterilizarona 121 o C durante 25 min. En las tres repeticiones quetuvo el ensayo, el pH fluctuó entre 5,8 y 7.Como inóculo al 3% v/v se utilizó una cepa de H. nodulosarecién aislada del ácaro S. spinki y reproducida durante96 h en medio H [McCoy et al.,1972, citado por Cabrera,2001], colocado en zaranda de producción continua a180 rpm y una temperatura de 27 ± 1 o C.Transcurridos los primeros cuatro días de fermentación,bajo las mismas condiciones antes señaladas serecuperó por filtración al vacío la biomasa producidaen cada medio, y estas se colocaron en estufa a 60 o Cdurante 24 h para luego determinar, en balanza analítica,la producción micelial que se obtuvo en cada erlenmeyer.Todo el trabajo se realizó bajo un diseño de bloques alazar, en mesa de flujo laminar y con pro pipeta automática.Para el análisis de los resultados se utilizó un ANOVAde clasificación doble, previa transformación de los datosen x +1,y las medias se compararon entre sí por laprueba de rangos múltiples de Duncan para p < 0,05.RESULTADOS Y DISCUSIÓNSe logró la determinación de un medio de cultivo conbuenas características para su utilización en la producciónde H. nodulosa en fase líquida, y cuyos resultadossuperan significativamente a los del testigo, sin la presenciade la conidiación del hongo en los medios líquidosensayados, pero sí una abundante biomasa en lasdiferentes combinaciones de soya más azúcar formadapor sus micelios y conidióforos.Se presentaron diferencias significativas para p < 0,05entre el testigo y todas las concentraciones de soya másazúcar, así como entre algunas de las combinaciones deestas fuentes de nutrientes, con los mayores resultadosa medida que se incrementaba el contenido de soya (Fig. 1).La dinámica de desarrollo de este acaropatógeno en lascombinaciones de nutrientes ensayadas fue muy rápidaen lo que respecta a la producción de biomasamicelial, la que alcanzó hasta un promedio de 1,14 g(peso seco) por cada 100 mL de medio a los cuatro díasde fermentación a 27 ± 1 o C y 180 rpm. La mejor combinaciónde soya más azúcar turbinada de caña fue lade 14% p/v y 3% p/v respectivamente.La selección de los medios de cultivos a partir desustratos naturales y sus buenos resultados no solodependerán de su riqueza nutricional, ya sea en nitrógeno,carbono u otros elementos, sino además de lascaracterísticas del medio como viscosidad, turbidez ypH entre otras, según señalara Cabrera (2001).El procedimiento metodológico utilizado para la extracciónde elementos como el nitrógeno a partir de la soyafue similar al desarrollado por Cabrera (2001); resultóeficaz, lo que permitió disponer de un medio simplificado,eficiente y económico para la reproducción de H. nodulosa,una vez combinada la soya con el azúcarturbinada de caña como fuente de carbono. La ausenciade conidias en este caso no es consecuencia de losmedios utilizados, sino de que este acaropatógeno nopresenta conidiación en cultivo líquido, como ocurre conla mayoría de las cepas de H. thompsonii [Cabrera,2001].286/fitosanidad

Un medio simplificado a base de soya...Figura 1. Producción de biomasa de H. nodulosa en diferentes concentraciones de soyay azúcar turbinada de caña más un testigo.Como se aprecia en la Fig. 1, se presentaron diferenciassignificativas entre el testigo y todas las concentracionesde soya, en lo que a la producción de biomasa micelialse refiere. Ello confirma la importancia del nitrógenoorgánico en el desarrollo micelial de H. nodulosa, comose señaló para H. thompsonii por Cabrera (2001).La posibilidad de sustituir el extracto de levadura y lapeptona como fuentes portadoras de nitrógeno por lasoya, así como la glucosa y la sacarosa, portadoras decarbono, por el azúcar turbinada de caña, permite disponerde un medio de cultivo mucho más económico yeficiente para la producción de H. nodulosa, con rendimientosde hasta 1,14 g de biomasa (peso seco) por cada100 mL de medio a las 96 h de fermentación. Esta constituyela primera vez que en Cuba se realizan estudiospara la búsqueda de un medio simplificado para la producciónde este hongo en fase líquida, y cuyos resultadosson de vital importancia para la producción aceleradade este control biológico si se toma en consideraciónsu lento crecimiento tanto en fase sólida como líquida.CONCLUSIONES• El medio a base de soya 14% p/v más azúcar de cañaturbinada a 3% p/v resulta el más eficiente y económicopara la producción masiva del hongo H.nodulosa en fase líquida, lo que valida su utilizacióna gran escala.• Las diferentes concentraciones de soya más azúcarque se ensayaron permitieron una buena dinámicade desarrollo del hongo con resultados, en todos loscasos, superiores a los del testigo.• H. nodulosa produce una abundante masa micelialen el medio antes señalado, y en ninguno de los casosse observó la presencia de conidias.REFERENCIASCabrera, R. I.; D. Domínguez: «El hongo Hirsutella nodulosa, nuevoparásito para el ácaro del cocotero Erióphyes guerreronis», Cienc. yTécn. en la Agricultura, Cítricos y Otros Frutales 10(1): 41-51, 1987.––––: «Hirsutella nodulosa e Hirsutella kirchneri, dos nuevos hongospatógenos del moho P. oleivora», Cienc. y Técn. en la Agricultura,Cítricos y Otros Frutales 10(2):139-142, 1987a.Cabrera, R. I.: «Hirsutella thompsonii Fisher y los plaguicidas químicosen una nueva estrategia para el manejo integrado del ácaro del mohoPhyllocoptruta oleivora Asmead (Acarina: Eriophyidae) en cítricos».Tesis en opción al grado científico de Doctor en Ciencias Agrícolas,Instituto de Investigaciones de Cítricos y Otros Frutales, 2001.Cabrera, R. I.; L. Nugaliyadde; M. Ramos: «Presencia de Hirsutellanodulosa sobre el ácaro Steneotarsonemus spinki (Acari:Tarsonemidae) en Sri Lanka». Memorias II Encuentro Internacionalde Arroz, Palacio de las Convenciones, 8-12 de julio, La Habana,2002, pp 186-188.Cabrera, R. I.; J. Hernández; A. García: «Resultado de las aplicacionesaéreas de Triazophos y Bacillus thuringiensis para combatir el ácaroSteneotarsonemus spinki (Acari: Tarsonemidae) en el cultivo delarroz». Memorias II Encuentro Internacional de Arroz, Palacio de lasConvenciones, 8-12 de julio, La Habana, 2002a, pp. 206-208.Cabrera R. I.; A. García; G. Otero Colina; L. Almaguel; A. Ginarte:«Hirsutella nodulosa y otros hongos asociados al ácaro Tarsonemidodel arroz Steneotarsonemus spinki (Acari: Tarsonemidae) en Cuba»,Folia Entomológica Mexicana 44(2):115-121, 2005.Minter, D. W.; B. L. Brady: «Mononematous species oh Hirsutella»,Trans. Br. Micol. Soc. 74(2):271-282, 1980.Ramos, M.; H. Rodríguez; R. Chico: «Steneotarsonemus spinki Smiley(Acari: Tarsonemidae). Nuevo informe para Cuba en el cultivo delarroz», Revista Protección Vegetal. 13(1):25-28, 1998.fitosanidad/287

288/fitosanidad

FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006ESTUDIO DEL EFECTO PROTECTOR DE BACILLUS SPP.SOBRE EL DESARROLLO DE LA PUDRICIÓN BLANDADE LA PAPA (SOLANUM TUBEROSUM L.)Yaritza Reinoso Pozo, 1 Luis Casadesús Romero, 1 Armando García Suárez, 2 Ernesto García Pérez 1 yVictoria Pazos Álvarez-Rivera 11Facultad de Biología, Departamento de Microbiología y Virología. Calle 25 no. 455 e/ I y J, Plazade la Revolución, Ciudad de La Habana, CP 10400, yreinoso@fbio.uh.cu2Laboratorio Central de Cuarentena Vegetal, Centro Nacional de Sanidad Vegetal. Ayuntamiento 231e/ Lombillo y San Pedro, Plaza de la Revolución, Ciudad de La Habana, CP 10400RESUMENLa pudrición blanda bacteriana, causada por Pectobacteriumcarotovorum, ocurre en una amplia variedad de cultivos y es una delas más severas enfermedades poscosecha de la papa (Solanumtuberosum L.) en el mundo entero. El control de esta enfermedad sebasa fundamentalmente en la aplicación de químicos que contaminanel medio ambiente y deterioran la salud humana. Una de lasalternativas ecológicas adoptadas es el uso de microorganismoscomo agentes de control biológico, entre los que se encuentran losmiembros del género Bacillus. El objetivo del presente trabajo fuedeterminar el efecto protector de 23 cepas de Bacillus sp. sobre eldesarrollo de la pudrición blanda de la papa. Para ello se trataronrodajas de papa con cultivos bacterianos de 24 h y posteriormente seinocularon con una cepa de P. carotovorum a dos concentracionesdiferentes. Las rodajas se mantuvieron durante 24 h en condicionesde temperatura y humedad favorables para el desarrollo de lapudrición. Transcurrido este tiempo se evaluó la efectividad de lostratamientos respecto a los controles no tratados, y se tuvo en cuentala aparición o no de los síntomas característicos de la enfermedad.Las cepas G15, G19 y G25 solamente tuvieron efecto protector en lasrodajas tratadas con la menor concentración de P. carotovorum, mientrasque B1, G10, Q7 y Q18 inhibieron el desarrollo de la pudrición enlas dos variantes analizadas. El resto de las cepas estudiadas nomostró protección, y en algunos casos se observó un incremento enla severidad de las lesiones.Palabras claves: Bacillus, control biológico, Pectobacteriumcarotovorum, Solanum tuberosumABSTRACTBacterial soft rot, caused by Pectobacterium carotovorum, happens ina wide variety of cultivations and it is one of the most severe postharvestdiseases of potato (Solanum tuberosum L.) in the world. The control isbased fundamentally on the application of chemical products thatcontaminate the environment and deteriorate human health. One ofthe ecological alternatives adopted in this sense is the use ofmicroorganisms as biological control agents, the members of generaBacillus are among them. The objective of the present work was todetermine the protective effect of 23 Bacillus sp. strains on thedevelopment of the potato soft rot. Potato slices were treated with 24 hgrowth bacterial cultures and were inoculated with a strain of P.carotovorum, using two different concentrations. The slices stayedduring 24 h in conditions of temperature and favourable humidity forthe development of the soft rot. Lapsed this time the effectiveness ofthe treatments was evaluated in comparison with non treated controlsobserving the appearance or not of disease characteristic symptoms.G15, G19 and G25 strains only had protective effect in the slices triedwith the smallest concentration of P. carotovorum. While B1, G10, Q7and Q18 inhibited soft rot development in two analyzed variants. Therest of the studied strains did not show protection, so an increment inlesions severity was observed in some cases.Key words: Bacillus, biological control, Pectobacterium carotovorum,Solanum tuberosumINTRODUCCIÓNLa papa (Solanum tuberosum L.) ocupa el cuarto lugarentre los diez cultivos de mayor importancia en el mundo,superada únicamente por el trigo, el arroz y el maíz.Su producción anual asciende a más de doscientos millonesde toneladas que repercuten en la alimentaciónde gran parte de la población mundial [Estévez et al.,2001]. En la producción de papa el cultivo puede afectarsepor una serie de factores bióticos y abióticos quedisminuyen el rendimiento y calidad de las cosechas,en especial por la presencia de daños en los tubérculos.Los factores bióticos de mayor importancia son la presenciade plagas y enfermedades que generan elevadoscostos de manejo y control [Gregory y Andrade, 1996].Las condiciones tropicales y húmedas resultan pocofavorables para el cultivo de la papa debido a que espropenso a infectarse con numerosos microorganismospatógenos fúngicos y bacterianos, además de las dificultadesque se presentan para conservar los tubércu-fitosanidad/289

Reinoso y otroslos. Las enfermedades bacterianas de la papa provocangeneralmente pudriciones húmedas y pueden ser originadaspor microorganismos pertenecientes a variados géneros[MINAGRI, 2000]. En Cuba la pudrición blanda, causadapor Pectobacterium carotovorum, Dickeya chrysanthemiy Pectobacterium atrosepticum, es una de las enfermedadesbacterianas que se presenta con mayor incidencia enel campo, y las pérdidas durante el almacenamiento delos tubérculos son considerables [Galán, 2004].El control de estos patógenos se dificulta mucho debidoa que la enfermedad se puede presentar en diferentesetapas del desarrollo de la planta. Estas bacteriasademás pueden sobrevivir en el suelo, el agua de riegoy la maquinaria agrícola. Por el momento el control dela calidad fitosanitaria de los tubérculos-semilla y laaplicación de productos químicos son medidas que contribuyena disminuir los daños [Galán, 2004].Actualmente se aboga por el uso de prácticas agrícolasecológicas como el control biológico mediante el uso demicroorganismos antagonistas, los cuales pueden limitarla iniciación y propagación de las enfermedadescausadas por patógenos vegetales mediante mecanismosde competencia, antibiosis, inducción de resistencia,entre otros [Fernández-Larrea, 2001].Varias especies de los géneros Bacillus, Paenibacillus yBrevibacillus producen sustancias antimicrobianas, delas cuales se han descrito más de de setenta antibióticosde bajo peso molecular y naturaleza polipeptídica, entrelas cuales B. subtilis, B. licheniformis, B. pumilus,B. circulans, B. cereus, Brevibacillus laterosporus yPaenibacillus polymyxa son los mayores productores.Los metabolitos secundarios producidos por algunasde estas especies inhiben el crecimiento de bacterias yhongos, por lo que se ha sugerido su uso como un métodosuplementario para la protección de las plantas contramicroorganismos fitopatógenos [Földes et al., 2000].El objetivo de este trabajo fue determinar el efecto protectorde diferentes cepas del género Bacillus sobre eldesarrollo de la pudrición blanda de la papa.MATERIALES Y MÉTODOSSe utilizaron como material biológico 23 cepas del géneroBacillus conservadas en agar nutriente (Biocen) yaisladas de suelos procedentes de regiones paperas dediferentes municipios de la provincia de La Habana(Tabla 1). Estas cepas se seleccionaron en consideracióna su actividad antagónica in vitro frente a cepas dePectobacterium carotovorum, Dickeya chrysanthemi yPectobacterium atrosepticum (datos no publicados). Seempleó además la cepa P. carotovorum 2046 conservadaen medio GYCA (glucosa, extracto de levadura, carbonatode calcio, agar).Tabla 1. Procedencia de las cepas del género Bacillus utilizadasCepas Procedencia Cepas ProcedenciaG1 Municipio de Güines G29 Municipio de GüinesG2 Municipio de Güines G30 Municipio de GüinesG10 Municipio de Güines Q6 Municipio de QuivicánG11 Municipio de Güines Q7 Municipio de QuivicánG12 Municipio de Güines Q12 Municipio de QuivicánG14 Municipio de Güines Q13 Municipio de QuivicánG15 Municipio de Güines Q18 Municipio de QuivicánG17 Municipio de Güines S1 Municipio de San JoséG18 Municipio de Güines B1 Municipio de GüinesG29 Municipio de Güines B2 Municipio de GüinesG23 Municipio de Güines B4 Municipio de GüinesG25 Municipio de GüinesPara el crecimiento de las especies del género Bacillus seutilizaron frascos erlenmeyers de 1 L de capacidad con100 mL de medio caldo nutriente (Biocen). Los frascos seinocularon con una suspensión bacteriana correspondientea un valor de 0,5 en la escala de Mac Farland (1 x 10 8 ufc/mL)preparada a partir de cultivos de 24 h de crecimiento enagar nutriente. Los cultivos se colocaron en zaranda orbitaltermostatada durante 24 h a 30 o C y 120 rpm.290/fitosanidad

Estudio del efecto protector...El inóculo de P. carotovorum se obtuvo a partir de cultivosde 24 h de la bacteria fitopatógena en medio GYCA.Con agua destilada estéril se prepararon suspensionesajustadas a un valor de densidad óptica de 0,05 y 0,1respectivamente, a una longitud de onda de 580 nm.Tubérculos-semilla certificados de la variedad Spuntaprocedentes de Holanda se desinfectaron superficialmentecon alcohol 70%, luego se sumergieron enhipoclorito de sodio a 3% durante 3 min, se lavaroncon abundante agua destilada estéril y se colocaron enun flujo laminar durante 1 h. Rodajas de papa de 1 cmde grosor se sumergieron durante 1 min en los cultivosde Bacillus spp. Las rodajas tratadas se colocaron en elflujo laminar durante 30 min para eliminar la humedadsuperficial. Posteriormente se inocularon con 10 µLde las suspensiones preparadas de la cepa Pectobacteriumcarotovorum 2046. Cada rodaja se inoculó en tres puntosdiferentes, y se emplearon como controles rodajassin tratar inoculadas con la bacteria fitopatógena ypreviamente sumergidas en agua destilada estéril yrodajas tratadas con cultivos de Bacillus spp. sin inocular.Se utilizaron seis rodajas por tratamiento y secolocaron en placas Petri con papel de filtro humedecidocon agua destilada estéril y se incubaron a 30 o C durante24 h. Transcurrido este tiempo se determinó laefectividad de los tratamientos mediante inspecciónvisual y observación de la aparición o no de síntomascaracterísticos de la enfermedad.RESULTADOS Y DISCUSIÓNEl control biológico de P. carotovorum mediante especiesde microorganismos antagonistas se ha estudiadopor varios grupos de investigación debido al amplio rangohospedero y a la gran importancia económica queposeen los cultivos que esta bacteria puede afectar. Sehan utilizado como alternativas el empleo de Erwiniaherbicola [Vanneste et al., 1995], Pseudomonas fluorescens[Abdel-Alim et al., 2001] y Trichoderma hamatum[Blom, 2001]; sin embargo, los resultados máspromisorios han sido in vitro e in vivo, con especies delgénero Bacillus productores de sustancias con actividadantibacteriana [Bernal et al., 2002] [Sharga y Lyon,1998] [Abdel-Alim et al., 2001].En el estudio realizado el tratamiento de las rodajas depapa con las cepas B1, G10, Q7 y Q18 previno totalmenteel desarrollo de la pudrición blanda en todas lasvariantes del experimento (Fig. 1).Figura 1. Efecto protector de la cepa G10 en rodajas de papa inoculadas con la mayorconcentración de la cepa P. carotovorum 2046. A la derecha se muestran los controles deP. carotovorum 2046 y G10.En experimentos realizados por otros autores se hanproducido resultados similares. Tal es el caso de Shargay Lyon (1998), quienes emplearon una cepa de Bacillussubtilis productora de antibióticos para tratar rodajasde papa y raíces de la planta, con el objetivo de inhibirel desarrollo de la pudrición blanda ocasionada por P. carotovorumy P. atrosepticum. Estos autores solamenteemplearon en los tratamientos suspensiones de la cepafitosanidad/291

Reinoso y otrosantagonista preparadas con agua y no los cultivos líquidoscomo en este trabajo. Es por esto quizás quesolamente hubo resultados positivos, que se traducenen la disminución de la severidad de las lesiones cuandoemplearon una alta concentración de Bacillussubtilis, mientras que en este estudio se pudo evitarcompletamente la aparición de lesiones característicasde la pudrición blanda con las cepas antes mencionadas,lo cual pudiera deberse a la acción antibacterianade los metabolitos producidos por estos aisladosbacterianos que son excretados al medio de cultivo.Las cepas B2, G15 y G25 solamente mostraron efectoprotector en aquellas rodajas inoculadas con la menorconcentración de P. carotovorum (Fig. 2). Esta diferenciarespecto a los resultados con las cepas B1, G10, Q7y Q18 puede estar relacionada con la producción demetabolitos antibacterianos de menor actividad biológicainhibitoria, cuya acción se ve limitada por la densidadde bacterias fitopatógenas presentes en el medio alque son vertidos. También es posible que la producciónde estos compuestos en las cepas antes mencionadas comienceen etapas más tardías del crecimiento, por lo queen el momento de tratar las rodajas sus concentracionesen el medio de cultivo no son suficientes como para lograrun efecto igual al obtenido con B1, G10, Q7 y Q18.De hecho se plantea que la producción de sustancias conactividad antimicrobiana por parte de especies del géneroBacillus está muy relacionada con la fase estacionariadel crecimiento microbiano y en particular con la etapade esporulación [Schallmey et al., 2004].Figura 2. Efecto protector de la cepa B2 en rodajas de papainoculadas con la menor concentración de la cepa P. carotovorum2046. A la derecha se muestran los controles de P. carotovorum2046 y B2.El resto de las cepas de Bacillus spp. estudiadas noinhibieron el desarrollo de la pudrición blanda. Algunascomo G11, G12 y G14 provocaron cambios de coloraciónde color beis a pardo oscuro en las rodajas tratadas,aunque no se observaron síntomas de pudriciónblanda. La cepa B4 produjo modificaciones drásticasen las rodajas tratadas y el control; se observaron cambiosde color de beis a marrón con presencia de fetidezy una gran maceración del tejido del tubérculo. Conanterioridad otros autores han aislado algunas especiesdel género Bacillus, productoras de enzimaspectinolíticas y proteolíticas, causantes de la pudriciónblanda en algunos cultivos [US EPA, 1997] [Kararahet al., 1985].292/fitosanidad

Estudio del efecto protector...CONCLUSIONES• Las cepas B1, G10, Q7 y Q18 inhibieron el desarrollode la pudrición blanda en las rodajas inoculadas conambas concentraciones de P. carotovorum utilizadas.• Las cepas B2, G15 y G25 solamente tuvieron efectoprotector en las rodajas inoculadas con la menor concentraciónde P. carotovorum.• La cepa B4 produjo un incremento en la severidadde los síntomas de la enfermedad.REFERENCIASAbdel-Alim, A.; M. Mikhail; P. Laux; W. Zeller: «Biological Control ofErwinia carotovora subsp. carotovora on Potatoes by FluorescentPseudomonads and Bacillus subtilis», IOBC WPRS Bulletin, 25:139-144, 2001.Bernal, G.; A. Illanes; L. Campi: «Isolation and Partial Purification of aMetabolite from a Mutant Strain of Bacillus sp. with Antibiotic ActivityAgainst Plant Pathogenic Agents», Electronic Journal ofBiotechnology (online), vol. 5, no. 1, 2002. Disponible en http://www.ejbiotechnology.info/content/vol5/issue1/full/4/index.html#12Blom, T. J.: «Studies on the Epidemiology of Erwinia Soft-Rot and TheirControl in Ornamental Crops», Special Research Program, CanadaMinistry of Agriculture and Food, 2003, pp. 24-27.Estévez, A.; M. González; M. Hernández; J. Castillo; O. Moré; M. Cordero:«Estrategia para el desarrollo del mejoramiento de la papa»,Granma Ciencia 5:21-30, 2001.Fernández-Larrea, O.: «Microorganismos antagonistas para el controlfitosanitario», Manejo Integrado de plagas 62:96-100, 2001.Földes, T.; I. Banhegyi; Z. Varga; J. Szageti: «Isolatin of Bacillus Strainsfrom the Rhizosfere of Cereals and in vitro Screening for AntagonismAgainst Phytopathogenic, Food-Borne Pathogenic and EpoilageMicroorganisms», Journal of Applied Microbiology 89:840-845, 2000.Galán, I.: «Bacillus spp., antagonistas de las bacterias de podredumbreblanda de la papa». Tesis de Diploma, Facultad de Biología, Universidadde La Habana, 2004.Gregory, P.; H. Andrade: «Principales enfermedades, nematodos e insectosde la papa», CIP, 1996.Kararah, M.; F. Barakat; M. Mikhail; H. Fouly: «Pathophysiology in GarlicCloves Inoculated with Bacillus subtilis, Bacillus pumillus andErwinia carotovora», Egyptian Journal of Phyopathology 17:131-140, 1985.Ministerio de la Agricultura: «Guía técnica para la producción de papaen Cuba» Instituto de Investigación Hortícolas Liliana Dimitrova, 2000,pp. 1-37.Schallmey, M.; A. Singh; O. Ward: «Development in the Use of BacillusSpecies for Industrial Production», Canadian Journal of Microbiology50:1-17, 2004.Sharga, B.; G. Lyon: «Bacillus subtilis BS 107 as an Antagonist ofPotato Blackleg and Soft Rot Bacteria», Canadian Journal ofMicrobiology 44:777-783, 1998.US EPA: «Final Risk Assessment of Bacillus subtilis», www.epa.gov/oppt/biotech/pubs/pdf/fra009.pdf, 1997.Vanneste, J.; J. Perry; L. Perry-Meyer; R. Bedford: «Erwinia herbicolaEh252 as a Biological Control Agent of Bacterial Soft Rot on Potatoes»,NZPPS Paper 12:13-16, 1995.fitosanidad/293

Fitosanidad tiene como objetivo divulgarde forma sistemática el quehacer de losinvestigadores y especialistas del Institutode Investigaciones de Sanidad Vegetal,así como de otros centros del paíso extranjeros, vinculados al trabajo dela sanidad vegetal.El Comité Editorial de esta publicación,que se edita trimestralmente, agradeceel envío de colaboraciones y observacionesque ayuden a hacer mejor nuestralabor.Los artículos deben reflejar los resultadosde investigaciones básicas o de aplicaciónpráctica, asimismo aquellos quese encuentren en proceso de extensióno generalización.Igualmente resultan de importancia lostrabajos en que se comuniquen nuevosprocedimientos o innovaciones, asícomo los que aborden temas novedosos.• Tipo de artículosLa revista acepta manuscritos originales(inéditos) en cualquiera de las especialidadesdirecta e indirectamente vinculadasa la sanidad vegetal. Estospueden ser: artículos científicos, reseñas,comunicaciones cortas, resúmenesde tesis, informes técnicos. Los artículoscientíficos no deben exceder de sietecuartillas, las reseñas de quince, lascomunicaciones de dos y los informestécnicos de cinco.• LenguajeEl lenguaje oficial de la revista es español,aunque excepcionalmente se aceptaráncontribuciones en inglés, francésy portugués. El estilo de escritura debeser totalmente impersonal, con criteriode exactitud, brevedad y párrafos cortos.Debe utilizarse el sistema métricodecimal. Los nombres científicos se escribiráncompletos, incluyendo el autor,y siguiendo los códigos internacionales(ejemplo: Leucoptera coffeella GuerinMeneville). Si es necesario utilizarlos envarias partes del texto, entonces se escribiráncompletos la primera vez queaparezcan y luego se abrevian (ejemplo:L. coffeella). Se escriben en cursiva o sesubrayan.• Estructura de los artículosLos artículos científicos tendrán la estructurasiguiente: título, autor(es),afiliación de los autores, resumen ypalabras claves (español e inglés), introducción,materiales y métodos, resultadosy discusión, conclusiones (si lashubiera), agradecimientos (si los hubiera),referencias.Las reseñas adoptarán la siguiente estructura:título, autor(es), afiliación de294/fitosanidadNormas Editorialeslos autores, resumen y palabras claves(español e inglés), introducción, el contenidose estructura a criterio del autor,agradecimientos (si los hubiera),referencias.Las comunicaciones cortas incluirán: título,autor(es), afiliación de los autores,texto de la comunicación, incluyendolas referencias principales.La estructura de los informes técnicosserá: título, autor(es), afiliación de losautores, resumen y palabras claves (españole inglés), introducción, desarrolloy referencias.• Elaboración del textoEl título debe ser claro y conciso, procurandoque no sea extenso. Debe tenercorrespondencia con el contenido.No se incluirán abreviaturas.De los autores se escribirán nombres ydos apellidos. Si el autor tiene un segundonombre, este se abrevia con lainicial. La afiliación de los autores seescribirá con su nombre completo, lassiglas sólo se emplearán entre paréntesis,si lo consideran necesario. Debe incluirsela dirección postal, fax y correoelectrónico si los posee.El resumen no debe exceder de 250 palabras,y debe tener una síntesis de losmétodos y resultados, mencionándoselos nombres científicos completos yvalores cuantitativos de los resultados,es decir, debe tener el contenido suficientede forma comprimida.Las palabras claves son aquellas que permitenidentificar el contenido del artículoy que facilitan la identificación enlos índices de materia. Debe incluir lastaxas de los entes biológicos.La introducción debe tener una brevereferencia de los antecedentes específicosdel trabajo, así como una revisiónbreve de las referencias más recientesque se relacionan con el tema que sepresenta. También se incluirá el objetivodel trabajo.Los materiales y métodos deben ser clarosy concretos, se redactarán según unorden lógico de los métodos empleados.De igual forma se escribirán claramentelos procedimientos analíticos y estadísticosutilizados. Se pueden citar los métodosy procedimientos, siempre que hayansido publicados en revistas científicas.Los resultados se pueden expresar apoyadosen tablas y/o figuras, con una discusióna partir de referencias actuales.Deben presentarse de manera lógica,interpretando las conclusiones. Las figurasse deben elaborar solamente enWord u otro programa compatible.Las referencias sólo serán de publicacionesdisponibles en las bibliotecas, yse presentarán en orden alfabético. 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Calle 110 no. 514 e/ 5a.B y 5a.F,Playa, Ciudad de La HabanaNo se aceptan manuscritos que no esténacompañados de la Declaración delAutor.También pueden enviarse por correoelectrónico: lvazquez@inisav.cu• Revisión de los manuscritosLos trabajos enviados al Comité Editorialserán sometidos a un proceso dearbitraje y corrección de estilo. Los autorescolaborarán con los árbitros y correctoresa evacuar cualquier duda alrespecto y efectuar, si es preciso, lasmodificaciones que se le sugieran. ElComité Editorial se reserva el derechode aprobar o rechazar los trabajos propuestos,lo cual será notificado oportunamentea los interesados.

FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006PRODUCCIÓN DE BIOMASA DE TRICHODERMA HARZIANUMPOR FERMENTACIÓN LÍQUIDARosaima García, 1 María A. Durán 1 y Ramón Riera 21Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas. Mérida, Venezuela, AP 25, teléf. 0251-2630090,rgcrespo@inia.gov.ve.2Servicio Autónomo de Sanidad Agropecuaria. Mérida, VenezuelaRESUMENCon el objeto de mejorar la eficiencia en la producción masiva deTrichoderma harzianum Rifai se evaluó la metodología de producciónpor fermentación líquida estática en forma artesanal. Para ello seutilizó como sustrato melaza de trapiche de caña panelera fresca ylevadura panadera granulada (Saccharomyces cerevisiae). Se usaronfrascos de vidrio transparente de 500 mL donde se colocaron 100 mLde solución de melaza a 5%, se llevó a 200 mL con agua destilada yse ajustó el pH a 5,5. Se esterilizaron en autoclave a 121ºC y 15 PSIpor 20 min, se dejaron reposar 24 h y luego se agregó 10 g de levadura(5%). Se inoculó con 5 mL de suspensiones de conidios deTrichoderma harzianum (1 x 10 10 ufc), se agitaron e incubaron enforma estática inclinada durante 14 días hasta obtener la produccióncompleta de conidios. Se encontró desarrollo de diferentes estructuraso biomasa del hongo (micelio, conidios y clamidosporas) a partirde dos días. La producción de conidios se completó entre 8-14días, de acuerdo con la cepa T 12= 1,8 x 10 9 ufc, T 3= 5,8 x 10 8 ufc,IUTE = 5,4 x 10 8 ufc, Natibiol = 4,2 x 10 8 ufc, T 8= 5,8 x 10 8 ufc, Inprodica= 6,4 x 10 8 ufc, T 2= 3,0 x 10 8 ufc, T 11= 2,8 x 10 8 ufc, T 1= 2,6 x 10 8 ufcy Bioagrícola = 5 x 10 7 ufc. Con este proceso se acelera la obtenciónde inóculo del hongo para el proceso de producción, lo que se lograantes de tres días en relación con la producción normal de conidiospor fermentación sólida usados para resuspender y aplicar comoinóculo, el cual se alcanza entre seis y siete días.Palabras claves: biomasa, Trichoderma, fermentación líquidaABSTRACTIn order to improve the efficiency of Trichoderma harzianum massiveproduction a methodology by static liquid fermentation in handmadeform was evaluated. French brown sugar loaf cane molasses andgranulated Bakery yeast (Saccharomyces cerevisiae) were utilizedas substratum. In glass bottles of 500 mL were place 100 mL of 5%molasses solution, it was added distilled water to 200 mL, and pH wasadjusted to 5.5. These were sterilized in autoclave at 121ºC and 15PSI for 20 minutes, putting at rest for 24 h and then were added 10 g ofyeast (5%). The inoculation was made with 5 mL of Trichodermaharzianum conidia suspensions (1 x 10 10 ufc), shaked and incubatedin inclined static form during 14 days until getting complete productionof conidia. Develop of different structures or fungus biomass(mycelium, conidia and clamidosphora) since two days was found.Conidia production finished between 8 and 14 days, in accordancewith strain T 12= 1.8 x 10 9 ufc, T 3= 5.8 x 10 8 ufc, IUTE = 5.4 x 10 8 ufc,Natibiol = 4.2 x 10 8 ufc, T 8= 5.8 x 10 8 ufc, Inprodica = 6.4 x 10 8 ufc, T 2=3.0 x 10 8 ufc, T 11= 2.8 x 10 8 ufc, T 1= 2.6 x 10 8 ufc and Bioagrícola = 5 x 10 7ufc. With this process is speeded up the obtaining of fungus inoculumsfor the production process, and it is obtained before three days withregard to normal conidia production by solid fermentation used toresuspend and apply as inoculums, which is reached between sixand seven days.Key words: biomass, Trichoderma, liquid fermentationINTRODUCCIÓNLa versatilidad, adaptabilidad y la fácil manipulaciónde las especies del hongo Trichoderma permite su usoefectivo en el control biológico. Trichoderma spp. producetres tipos de propágalos como son hifas, clamidosporasy conidios, que son activas contrafitopatógenos en diferentes fases del ciclo de vida, desdela germinación de las esporas hasta la esporulación[Fernández-Larrea, 2002].De acuerdo con Fernández-Larrea (2002) existen diferentesformulaciones de hongos antagonistas, las cualesse usan en dependencia del mecanismo de acción parauso comercial; pero el material seco es el preferido, debidoa que uno de los aspectos más importante en lacomercialización es el peso y la manipulación de los productos.Las hifas son poco resistentes al secado, por loque se trabaja en las formulaciones de las formasreproductoras (conidios y clamidosporas) como polvoshumedecibles, polvos secos, formulaciones en aceite yencapsulados que contienen el hongo.Los conidios son más resistentes que las clamidosporasy se producen en mayor cantidad por diferentes vías:sobre soporte sólido y en cultivos líquidos estáticos yfitosanidad/295

García y otrosagitados, aunque más débil debido a que la pared celulares más delgada, de tal manera que son menos resistentesa las condiciones adversas del ambiente, comolos rayos ultravioletas del sol y a la tecnología de aplicación,ya que se puede romper más rápidamente ydañarse antes de realizar su efecto de biocontrol.Sin embargo, la producción de Trichoderma líquido representauna alternativa para cuando la demanda es alta,ya que de esta manera se acelera el proceso de producciónmasiva y se obtiene el producto en un tiempo máscorto, con mayor cantidad y variedad de propágalos, locual indiscutiblemente aumenta su eficiencia.Por otro lado, una de las formas de acelerar el proceso deproducción es el uso de métodos combinados, es decir, através de fermentación bifásica, en que se utiliza un procesode fermentación líquida para la obtención de un bueninóculo que luego se inocula sobre sustratos sólidos.Estudios realizados por Wei Lin et al. (2006) demuestranque en el proceso de fermentación líquida de T. harzianumse obtienen sustancias promotoras de crecimiento(ácido indolacético, ácido giberélico, citoquininas yvitaminas), las cuales son una clase de péptido. Cuandoaplicaron T. harzianum sobre la rizósfera de plantasinoculadas con bacterias fijadoras de nitrógeno selogró un aumento del tamaño de los nódulos radicularesy se produjo un incremento en la eficiencia de la fijaciónde nitrógeno.El método más comúnmente utilizado en Venezuelapara la producción masiva del hongo Trichoderma espor fermentación sólida monobásica, con el uso desustrato alimenticio sólido tanto para la producción deinóculo como para la obtención final del biopreparado.En otros casos se obtienen formulaciones líquidas porresuspensión de los conidios proveniente de una fermentaciónsólida [Zambrano, 2005].El presente trabajo tuvo por objetivo evaluar la metodologíade producción líquida estática en formaartesanal mediante el uso de melaza de caña panelera,obtenida en la zona (estado de Mérida), más levadurapanadera como sustrato alimenticio líquido para la obtencióndel inóculo del hongo T. harzianum, a fin demejorar la eficiencia en tiempo y producción de biomasadentro del proceso de producción masiva.MATERIALES Y MÉTODOSSe utilizaron 10 cepas de T. harzianum pertenecientes ala Colección de Hongos Antagonistas del Laboratoriode Fitopatología del Instituto Nacional de InvestigacionesAgrícolas del estado de Mérida (INIA-Mérida).Para iniciar el trabajo se hizo una reactivación de lascepas; se sembró por duplicado en el medio de cultivoagar papa dextrosa (PDA) y se incubaron a 27 o C detres a cinco días. Las cepas de T. harzianum utilizadasfueron siete no comerciales (T 1, T 2, T , T , T , T ,3 8 11 12IUTE) y tres comerciales (Natibiol, Inprodica yBioagrícola). La producción del inóculo del hongo enforma líquida se realizó a partir de una solución de 100 mLde melaza a 5%, que se aforó a 2000 mL con agua destilada,y se ajustó a pH 5,5. La solución se dispensó enfrascos de vidrio de 500 mL, en una cantidad de 200 mLpor frasco y se esterilizó en autoclave a 121ºC y 15 PSIpor 20 min, se dejaron reposar 24 h y entonces se leañadió 5% de levadura (Saccharomyces cerevisiae) enforma aséptica bajo la cámara de flujo laminar.La producción del hongo en forma líquida se llevó a caboa partir de una solución de 100 mL de melaza de trapichede caña panelera fresca a 5% que se diluyó a 2000 mLde agua destilada y se ajustó el pH a 5,5. La solución sedispensó en frascos de vidrio de 500 mL, a razón de 200mL por frasco, se esterilizó en autoclave a 121 o C, 15 PSIpor 20 min y se dejaron reposar 24 h; luego se le añadió5% de levadura (Saccharomyces cerevisiae) en formaaséptica bajo la cámara de flujo laminar.A las placas de Petri con los cultivos de Trichoderma seles agregaron 10 mL de agua destilada estéril, se agitóun poco, se tomaron 5 mL de suspensiones de conidiosde cada cepa (1 x 10 10 ufc) y se inoculó en cada frascoque contenía la solución de melaza más levadura.Una vez inoculados los frascos con la melaza se taparoncon algodón y papel aluminio, y sellaron con parafilmpara proporcionarles condiciones asépticas. Se sometierona agitación y se incubaron en forma estática inclinadadurante 14 días hasta obtener la produccióncompleta de conidios. Cada tratamiento se repitió diezveces. Las observaciones se hicieron todos los días paradetectar tipo de estructuras producidas y luego medirlas cantidades.La determinación de la concentración de conidios pormililitros se realizó en cámara de Newbauer por mediodel microscopio óptico y un objetivo de 40X, en una diluciónde 10 2 , y se calculó por la fórmula [Lecuona, 1996]:Concentración (ufc.mL = Número de conidios x 4 x 10 6 x dilución)Se realizaron observaciones directas al microscopio ópticode muestras tomadas a las 24 h de incubación de296/fitosanidad

Producción de biomasa de Trichoderma...las siembras realizadas en placas con PDA para descartarlas posibles contaminaciones. Los datos sobreconcentración de conidios se analizaron a través delprograma Estadística 6.0.RESULTADOS Y DISCUSIÓNEn la Tabla 1 se observan los resultados sobre producciónde biomasa de Trichoderma bajo fermentación líquida.Se encontró que todas las cepas lograron producirbiomasa del hongo a partir de dos días. La producciónde conidios se alcanzó entre 8-14 días. Hubo alta producciónde micelios y clamidosporas, y además se encontróuna alta concentración de conidios que variódesde 5,7 x 10 7 en la cepa comercial Bioagrícola hasta1,81 x 10 9 ufc/mL. Se obtuvieron diferencias significativasentre las cepas en cuanto a producción de conidios.También se observaron diferencias en forma cualitativasen cuanto a la producción de micelios y clamidosporas.De acuerdo con la prueba de medias de LDS a 5%, todaslas cepas tuvieron diferentes comportamientos encuanto a producción de conidios. La que presentó mejorproducción fue T 12, seguida de la comercial Inprodica,T 8y IUTE. Se encontraron también diferencias significativasen el tiempo necesario para la obtención finalde conidios. Estas mismas cepas alcanzaron la producciónen solo ocho días, que fue la más rápida, seguidasde T 8, T 2y T 3que lo lograron en diez. Las demás necesitaronentre 12 y 14 días.Lo anterior indica que existe una alta variación en cuantoa la obtención final de estructuras reproductivas deTrichoderma cuando se usa medio líquido, y que elloestá estrechamente relacionado con el comportamientode la cepa a pesar de que todas son T. harzianum.Trabajos similares se han realizado en Cuba para laobtención de Trichoderma por fermentación líquida conel uso de melaza de caña de azúcar y levadura torula, yse logró producir una concentración de 2-3 x 10 8 conid./mL[Fernández-Larrea, 2002; Fernández-Larrea et al., 1992;Stefanova et al., 1999].Asimismo Prakash y Lumsden (2006), con el objeto deobtener un preinóculo líquido de especies de Trichodermautilizaron 0,3 g melaza y 0,05 g extracto de levaduraen 100 mL de agua, y lograron una producción de10 3 -10 8 ufc. En tanto, en el proceso de producción debiomasa, cuando utilizaron 2,5 g de extracto de levaduray 500 mL de melaza en 1 L de agua, lograron unaproducción de 10 6 a 10 7 clamidosporas/mL.Tabla 1. Producción de biomasa y conidios de diferentes cepas de T. harzianumbajo fermentación líquidaCepasProducciónde miceliosTiempo(días)Producción declamidosporasTiempo(días)Producciónde conidiosT 12 +++ 2 ++ 7 1,81 x 10 9 a 8Cepa comercialInprodicaTiempo(días)+ 2 + 8 6,4 x 10 8 b 12T 3 ++ 2 ++ 8 5,8 x 10 8 c 10T 8 +++ 2 ++ 8 5,8 x 10 8 c 10IUTE ++ 2 ++ 8 5,4 x 10 8 d 8Cepa comercialBiogrícolaCepa comercialNatibiol++ 3 + 8 5,0 x 10 7 e 14++ 3 ++ 8 4,2 x 10 8 f 14T 2 +++ 2 + 9 3,0 x 10 8 g 10T 11 ++ 2 + 9 2,8 x 10 8 h 14T 1 ++ 2 + 10 2,6 x 10 8 i 14CV 4,4%Sx 0,378Letras distintas son diferentes en la prueba de LSD con probabilidad menor o igual a 5%.fitosanidad/297

García y otrosCONCLUSIONES• La producción de biomasa del hongo T. harzianum através del proceso de fermentación líquida es variable,depende del comportamiento de la cepa, por loque se requiere realizar pruebas preliminares antesde aplicar este método para reproducción de una cepaen forma masiva.• La melaza de trapiche panelera fresca y levadura decerveza, probada por primera vez en Venezuela comosuplementos nutricionales de T. harzianum para la obtenciónde biomasa por fermentación líquida, resultóexitosa. Se desarrollaron estructuras reproductivas delhongo: micelio, clamidosporas y conidios. Se requierevalidar el método a mayor escala.• Debido a la alta cantidad de estructuras reproductivasobtenidas por este método de fermentación líquida,se puede recomendar su utilización en la fasede preparación de inóculo dentro del proceso de producciónpara agilizarlo, así como para la producciónfinal de propágalos a utilizar en campo para elbiocontrol de enfermedades de plantas.REFERENCIASFernández–Larrea, O.; A. Calderón; M. Fraga: «Metodología de reproducciónde cepas de Trichoderma spp. para el biocontrol dehongos fitopatógenos». Informe Técnico de Investigación, INISAV,1992.Fernández–Larrea, O.: «Control biológico de enfermedades de plantas»,Control Biológico de Plagas Agrícolas, Managua, Serie TécnicaCATIE no. 53, 2002, pp. 160-184.Lecuona, R.: Microorganismos patógenos empleados en el controlmicrobiano de insectos plaga, Talleres Gráficos Mariano MAS, BuenosAires, 1996.Prakash Hebbar, K.; D. R. D. Lumsden: «Formulation and Fermentationof Biocontrol Agents of Cacao Fungal Pathogens: Example ofTrichoderrma Species», http://www.cabi-commodities.org/Acc/ACCrc/PDFFiles/W-BPD/Ch7.pdf. Revisado en marzo del 2006.Stefanova, M.; A. Leiva; L. Larrinaga; M. F. Coronado: «Actividadmetabólica de cepas de Trichoderma spp. para el control de hongosfitopatógenos del suelo», Rev. Fac. Agron. (Luz) 16:509-516, 1999,Wei Lin, Liang Zhi-Huai; Zhang, Zhi-Guang; Luo, He-Rong: «Effects ofPeptide in the Fermentation Liquid of Trichoderma harzianum onNodule Microstructure and Function of Cowpea», Acta Laser BiologySinica 1-1, 2006.Zambrano, C.: «Historia y experiencias del control biológico en Venezuela».Memorias del Curso-Taller Control Biológico: HerramientaBásica en Una Agricultura Sostenible, Trujillo, 29 y 30 de septiembredel 2005.298/fitosanidad

FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006ReseñaCARACTERIZACIÓN DE RALSTONIA SOLANACEARUMA TRAVÉS DEL ESTUDIO DE SU DIVERSIDAD GENÉTICAYelaine Tejeda GómezInstituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Calle 110 no. 514 e/ 5. a B y 5. a F, Playa, Ciudadde La Habana, CP 11600, ytejeda@inisav.cuRESUMENLa bacteria fitopatógena Ralstonia solanacearum es causante de lamarchitez bacteriana en diversos cultivos de importancia económicaen regiones de clima tropical y subtropical, así como en diversospaíses de clima templado. La especie constituye una unidadtaxonómicamente compleja en la que las cepas muestran una ampliadiversidad a nivel fisiológico, serológico, genético y de rango dehospedantes. El análisis por RFLP proporciona un nuevo esquemade clasificación al dividir la especie en los grupos Asiaticum yAmericanum, en relación con el origen geográfico de las cepas. Apartir de estos análisis preliminares se ha incrementado el empleo ydesarrollo de las técnicas moleculares para el estudio de la diversidadgenética dentro de esta especie bacteriana. En el presente trabajose destacan los principales aportes que, con el empleo de técnicasmoleculares, han realizado varios grupos de investigación a lacomprensión de las relaciones filogenéticas y evolutivas entre lascepas.Palabras claves: Ralstonia solanacearum, bacteria, diversidadgenéticaABSTRACTRalstonia solanacearum causes bacterial wilt in many important cropsin tropical and subtropical regions, and some mild climate countries.The species is taxonomically complex and the strains show a highdiversity at different levels as physiological, serological, genetic, andhost range. RFLP analysis has provided a new classification systemin which the species is divided in Americanum and Asiaticum groups,related to the geographic origin of the strains. Since these preliminaryinvestigations were performed, the development of moleculartechniques in the study of Ralstonia solanacearum genetic diversityhas increased. In this paper, the most outstanding contributions ofvarious researches groups in this field are outlined. Theseinvestigations have improved the comprehension of phylogenetic andevolutionary relationships among Ralstonia solanacearum strains.Key words: Ralstonia solanacearum, bacteria, genetic diversityINTRODUCCIÓNLa bacteria fitopatógena Ralstonia solanacearum escausante de la marchitez bacteriana en diversos cultivosen regiones de clima tropical y subtropical[Kelman, 1953], así como en algunos países de climatemplado [Hayward, 1991; Janse, 1996]. La enfermedadafecta a varios cientos de especies vegetales distribuidasen más de cincuenta familias [Hayward,1994]. Dentro de ellas se encuentran cultivos de importanciaeconómica como papa (Solanum tuberosum,Sw.), tabaco (Nicotiana tabacum, Lin.), tomate(Licopersicum esculentum, Mill.), pimiento (Capsicumannuum, L.), plátano y banano (Musa sp.), berenjena(Solanum melongena, L.), además de numerosasplantas ornamentales, medicinales, malezas y algunasespecies silvestres [Kelman, 1953].Ralstonia solanacearum es una especie heterogénea quese encuentra poco relacionada filogenéticamente conotros grupos del género Pseudomonas. Las únicas especiesque muestran relación con ella son P. picketii –patógenoocasional en humanos– y P. syzygii, causante delmarchitamiento del clavo de olor en Sumatra [Seal etal., 1993; Taghavi et al., 1996]. Las evidencias sugierenque R. solanacearum es una especie que surgió tempranoen la historia geológica, posiblemente como un patógenode los ancestros de las plantas modernas[Sequeira, 1994]. Buddenhagen y Kelman (1964) concluyeronque las cepas de R. solanacearum son el productode un largo proceso evolutivo que se ha producidode manera independiente en varias áreas geográficasy en diferentes hospederos. Esta hipótesis se ha confir-fitosanidad/299

Tejeda Gómezmado por estudios del material genético [Cook et al.,1989].La especie R.solanacearum constituye una unidadtaxonómicamente compleja en la que las cepas muestranuna amplia diversidad a diferentes niveles: fisiológico,serológico, genético y de rango de hospedantes. Elgran número de cepas de R. solanacearum existente entodo el mundo dificulta el establecimiento de criteriospara la diferenciación de cepas, aspecto esencial para eltrabajo de los taxónomos y del personal de cuarentena.Con el objetivo de describir esta variabilidad intraespecíficase han propuesto diversos sistemas de clasificación.Se conocen cinco razas de R. solanacearum cuya separaciónestá basada en el rango de los hospedantes y lahabilidad para sobrevivir bajo diferentes condicionesambientales [Buddenhagen et al., 1962; He et al., 1983;Buddenhagen, 1985; Pegg y Moffett, 1971]. La utilizaciónde tres disacáridos y/u oxidación de tres hexosaalcoholes ha permitido la separación de los aislamientosen seis biovares [Hayward, 1964; He et al., 1983;Hayward et al., 1990]. El sistema de clasificación enrazas y biovares es confuso, pues cada biovar contienecepas con diferentes rangos de hospedantes, y variasrazas contienen una amplia diversidad de cepas pertenecientesa diferentes biovares. Solo existe correspondenciaentre la raza 3 y el biovar 2. El análisis de ácidosgrasos [Janse, 1991] y del perfil de proteínas [Dianeseet al., 1994] no ha logrado esclarecer las relaciones entrelas cepas ni el establecimiento de un criterio de clasificaciónuniforme. Esto hace que los métodos tradicionalesde clasificación no sean lo suficientementeefectivos [Poussier et al., 1999; Sequeira, 1994].Estas dificultades condujeron a la búsqueda de un nuevosistema de clasificación basado en el análisis del materialgenético. Muchas de las técnicas moleculares empleadasen la actualidad tienen como fundamento comúnla separación de fragmentos de ADN de diferentes pesosmoleculares. El resultado electroforético se representapor un patrón de bandas en un gel. Estos patrones suelenser muy complejos y de difícil interpretación.Entre las técnicas utilizadas para el estudio de R. solanacearumse encuentran el polimorfismo de longitud defragmentos de restricción (Restriction Fragment LengthPolymorphism (RFLP)) en sus dos variantes: Southernblotting-RFLP y PCR-RFLP, el ADN polimórficoaleatoriamente amplificado (Random AmplifiedPolymorphic DNA or Arbitrary Primed PCR, RAPD),el Rep-PCR, el polimorfismo de longitud de fragmentosamplificados (Amplified Fragment LengthPolymorphism (AFLP)) y la secuenciación de regionesespecíficas del genoma. El empleo de cada una de ellasha contribuido a una caracterización y diferenciaciónmás acertadas de las cepas. El análisis a nivel genéticode las cepas ofrece la posibilidad de estudiar las relacionesfilogenéticas y evolutivas entre ellas.Contribución de los estudios de diversidad genéticaa la diferenciación intraespecífica de las cepasde Ralstonia solanacearumLos primeros trabajos que constituyeron un hito en elestudio de la diversidad genética del patógeno fueronreportados por Cook et al. (1989) y Cook y Sequeira(1994). Estos investigadores utilizaron el Southernblotting-RFLP con nueve sondas, lo que les permitiódetectar y localizar secuencias específicas en el ADN,las cuales contenían información esencial para la virulenciay la respuesta de hipersensibilidad. Estas secuenciasse sometieron a digestión con enzimas de restricciónespecíficas. La ubicación de los sitios de corte parauna enzima de restricción determinada dentro de unlocus de interés puede variar de una cepa a otra, y traercomo resultado fragmentos que difieren en tamaño encepas diferentes [Olive y Bean, 1999]. El análisis de lospatrones electroforéticos obtenidos por este procedimientoposibilitó establecer la existencia de dos gruposo divisiones con un coeficiente de similitud de 13,5%:la división I, que incluyó los biovares 3, 4 y 5, y la divisiónII, formada por las cepas de biovares 1, 2 y N2.Dentro de cada división los coeficientes de similitudresultaron ser muy elevados, y fueron mayores dentrode la división I. Más del 90% de las cepas de ladivisión I procedían de Asia y Australia (divisiónAsiaticum), mientras que 98% de las cepas de la divisiónII eran originarias de las Américas (divisiónAmericanum).Estas divisiones se han confirmado por análisis de lasecuencia del gen que codifica para el ARN ribosomal16 S [Li et al., 1993; Seal et al., 1993; Taghavi et al.,1996]. El análisis de esta secuencia permitió estudiarlas relaciones filogenéticas y evolutivas entre losmicroorganismos, dado su elevado contenido informacional,su naturaleza conservativa, su distribuciónuniversal y la accesibilidad de las secuencias en bancosde genes [Woese, 1987]. Las secuencias de los genes quecodifican para el ARNr 16S son por lo general específicaspara cada especie y están presentes en múltiples300/fitosanidad

Caracterización de Ralstonia...copias en el genoma, lo que las hace excelentes para laidentificación de bacterias a nivel de especie. Taghavi etal. (1996) demostraron la existencia de dos subdivisionesdentro de la división Americanum: la 2b, que contieneaislamientos pertenecientes a los biovares 1, 2 y N2procedentes de Indonesia, y la 2a que incluye el restode las cepas de biovares 1, 2 y N2. En este trabajo sereportó una cepa biovar 2 atípica, similar a las cepas debiovares 3 y 4 estudiadas, por lo que se agrupó dentrode la subdivisión Asiaticum.Fegan et al. (1998) realizaron el análisis de la secuenciade la región intergénica 16S-23S RNA. Dada la elevadasimilitud de secuencia de los genes que codifican paraARNr 16S en las cepas de R. solanacearum, resulta másfactible el análisis de la región espaciadora entre 16S y23S, que produce información filogenética más valiosaal ser mayor su grado de variabilidad entre diferentescepas [Barry et al., 1991; Leblond-Bourget et al., 1996].En este trabajo se analizaron además las secuencias delos genes que codifican para las enzimas poligalacturonasay endoglucanasa. En todos los casos seconfirmó el sistema de clasificación obtenido porTaghavi et al. (1996).El análisis PCR-RFLP de diferentes regiones delgenoma bacteriano demostró también la existencia delas divisiones Asiaticum y Americanum [Gilling et al.,1993]. Poussier et al. (1999), por medio del PCR-RFLP,analizaron regiones del gen hrp relacionado con la respuestade hipersensibilidad, y tuvieron resultados mayormenteconsistentes con lo reportado por Cook et al.(1989); sin embargo, encontraron que las cepas biovar 1del sur de África quedaban agrupadas en una subdivisióndiferente, la cual poseía mayor homología con lascepas de la división Asiaticum que con las de la divisiónAmericanum. Para esclarecer las relaciones entrelas cepas biovar 1 del sur de África y otras cepas de R. solanacearumampliaron el estudio con la inclusión de 59cepas, dentro de las que se encontraban las de biovaresN2 y 5, así como nuevas cepas africanas.Como resultado de estas nuevas investigaciones,Poussier et al. (2000) reportaron por primera vez elempleo de la técnica AFLP para el análisis de una colecciónde cepas internacionales dentro de un estudiode diversidad genética. Este método pertenece a la categoríade las técnicas de amplificación selectiva de fragmentosde restricción, basadas en la ligazón deadaptadores a fragmentos de restricción genómicos seguidode una amplificación por PCR con cebadores específicospara los adaptadores [Olive y Bean, 1999]. ElAFLP permitió una fina discriminación entre los aislamientosy logró diferenciar cepas que resultaronindistinguibles por PCR-RFLP. De las 96 cepas analizadaspor AFLP se obtuvieron 60 patrones diferentes,y se observó el 95% de polimorfismo en las bandas,mientras que en el análisis por PCR-RFLP, de 178 cepasse obtuvieron 20 patrones diferentes. Incluso alcompararse con lo obtenido por Cook et al. (1989, 1991)y Cook y Sequeira (1994), donde se produjeron 46 perfilesdiferentes a partir de 164 cepas analizadas, sedemuestra que el AFLP tiene un nivel de resoluciónsuperior para la diferenciación intraespecíficade R.solanacearum. El AFLP posibilitó una separaciónmás definida entre cepas de biovar 2 y N2, y tambiénentre cepas de biovares 3, 4 y 5. El AFLP y elPCR-RFLP confirmaron que el biovar 2 es el menosdiverso genéticamente entre todos los biovares [Cook etal., 1989; Cook y Sequeira, 1994; Smith et al., 1995; VanDer Wolf et al., 1998; Thammakijjawat, 2001].Pese a que los estudios llevados a cabo por Poussier etal. (2000) confirmaron la clasificación ofrecida por Cooket al. (1989), se encontraron excepciones en este esquema.Los resultados confirmaron la presencia de unasubdivisión formada por cepas biovar 1 del sur de África.Aunque el análisis por PCR-RFLP mostró unamayor homología entre estas cepas y las cepas biovar 1de la división Asiaticum, el análisis por AFLP y lasecuenciación de genes para ARNr 16S arrojaron unresultado opuesto. Las cepas biovar 1 del sur de Áfricafueron por lo tanto incluidas en una nueva subdivisión–2c– con respecto a lo reportado por Taghavi et al.(1996). La explicación más probable a la diferencia existenteentre las cepas biovar 1 africanas y americanas esun desarrollo evolutivo diferenciado debido a la separacióngeográfica. Otros aislamientos africanos quepertenecen a la división Americanum pueden haber sidointroducidas al continente africano por medio de intercambioscomerciales.No obstante la gran cantidad de investigaciones queapoyaron y enriquecieron los estudios preliminares deCook y colaboradores, el análisis de nuevos aislamientosaportó resultados que demuestran el elevado gradode complejidad taxonómica de esta especie bacteriana.En 1998 Tsuchiya y Horita reportaron el análisis de 64cepas japonesas por medio de diferentes técnicasmoleculares: el Southern blotting-RFLP con cuatrosondas específicas para DNAr 23S y 16S (también co-fitosanidad/301

Tejeda Gómeznocido como ribotyping), el PCR-RFLP y el Rep-PCR.Las cepas analizadas correspondían a raza 1 (biovares1, 2, 3 y 4) y raza 3 (biovar 2). Según el esquema declasificación de Cook et al. (1989), las cepas raza 1 debíanpertenecer a la división Asiaticum y las cepas raza 3a la división Americanum. Como resultado del empleode las técnicas mencionadas anteriormente se logróobtener una clara diferenciación entre las cepas de raza1 y raza 3. Con Southern blotting-RFLP el coeficientede similitud entre raza 1 y 3 fue de 15,4%, y dentro dela raza 1 de 75,5%. Los patrones electroforéticos obtenidosa partir de cepas raza 1 (biovares 1, 2, 3 y 4)fueron similares a los patrones de los biovares 3, 4 y 5de la división Asiaticum. Los patrones de las cepas raza3/biovar 2 fueron similares a los de las cepas biovar 1 dela división Americanum, lo que apoya la hipótesis planteadapor Buddenhagen (1985), quien sugirió que la raza3 se originó en la región andina de Sudamérica, de dondees originaria la papa, su principal hospedante, y quela aparición de raza 3 fuera de esta región es resultadodel comercio internacional. La distribución de las cepasjaponesas raza 1 (biovares 1 y 2) no se correspondecon lo reportado por Cook et al. (1989). Las nueve cepasjaponesas raza 1/biovar 2 resultaron ser homogéneasa la cepa atípica perteneciente a la divisiónAsiaticum reportada por Taghavi et al. (1996). Con respectoa las cepas raza 1/biovar 1, fueron semejantes alas cepas japonesas raza 1/biovar 4, y no a los biovares1 americanos. Estas cepas pueden ser mutantes de raza1/biovar 4 que perdieron la capacidad de degradar lastres hexosas alcoholes.Thammakijjawat et al. (2001) realizaron el análisisPCR-RFLP de cepas tailandesas y otras internacionalestuvieron con Cook et al. (1989) resultados consistentes.Las excepciones fueron dos cepas biovar 1atípicas y tres cepas biovar N2 de Japón, que se agruparondentro de la división Asiaticum. Excepciones deeste tipo fueron reportadas por Horita y Tsuchiya(2001).Aunque actualmente existe una mejor comprensión dela diversidad intraespecífica de la bacteria R.solanacearum,las investigaciones en este campo continúancon la búsqueda de nuevas metodologías de mayor sensibilidad.Lee et al. (2001) reportaron el aislamiento deuna secuencia de inserción –IS1405– a partir de unacepa de raza 1. Este tipo de secuencia constituye uncomponente importante de la mayoría de los genomasbacterianos. Las mutaciones y reordenamientos provocadospor las secuencias de inserción es uno de losmecanismos más importantes en la generación de diversidadgenética [Galas et al., 1989]. En algunos casosla localización de secuencias de inserción específicas ensitios definidos del cromosoma es lo suficientementeestable como para permitir su análisis por RFLP[Mahillon y Chandler, 1998]. La caracterizaciónmolecular de cepas con el uso de secuencias de inserciónpuede reflejar mejor la organización del genomabacteriano que la búsqueda de diferencias en las secuencias[Lee et al., 2001]. En este trabajo la IS1405 seempleó como sonda en un análisis por RFLP, lo quepermitió clasificar cepas de raza 1 de Taiwán.El estudio de la diversidad genética entre las cepas deR. solanacearum no solo permitió conocer más claramentelas relaciones filogenéticas y evolutivas entreellas, sino que proporcionaron nuevas herramientaspara el esclarecimiento de numerosas interrogantescomo la posible correlación entre diversidad genética yla virulencia de las cepas [Darrase et al., 1998].CONCLUSIONES• Los métodos de estudio de la diversidad genética deR. solanacearum se han desarrollado vertiginosamentedesde finales del pasado siglo a partir de los estudiospreliminares realizados en este campo, los quelograron suministrar un sistema de clasificación conel empleo del RFLP que fue de gran utilidad paraestudios posteriores.• El sistema de clasificación se ha corroborado por losresultados de otros investigadores, y se ha enriquecidoen el transcurso de los años con la definición denuevas subdivisiones.• Los métodos moleculares para la caracterizacióngenética han probado ser imprescindibles, reflejadoen su amplia adopción por diversos grupos de investigacióny los resultados promisorios de su empleo.REFERENCIASAbdel-Kader, D.; L. Seigner; M. Zellner: «Epidemiological Field Studieson Bacterial Ring Rot (Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus)and Brown Rot (Ralstonia solanacearum) of Potato», GesundePflanzen 52:240-247, 2000.Barry, T.; G. Colleran; M. Glennon; L. K Dunican; F. Gannon: «The 16S/23S Ribosomal Spacer Region As a Target for DNA Probes to IdentifyEubacteria», PCR Methods and Applications 1:51-56, 1991.Buddenhagen, I. W.: «Bacterial Wilt Revisited», Bacterial Wilt Diseasein Asia and the South Pacific. ACIAR no. 13, Canberra, Australia,1985, pp.126-143.Buddenhagen, I. W.; A. Kelman: «Biological and Physiological Aspectsof Bacterial Wilt Caused by Pseudomonas solanacearum», Annu.Rev. Phytopathol. 2:203-230, 1964.302/fitosanidad

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Tgxkuvc"FitosanidadKPKUCX""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""SOLICITUD DE SUSCRIPCIÓNTgpqxct"uwuetkrekôp Pwgxc"uwuetkrekôp Cevwcnk|ct"fcvquCòqu"swg"uqnkekvc____________________________________ RTGEKQ"FG"UWUETKREKłP"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""Hqtocu"fg"rciq""""""‣ Rciq"gp"nc"kpuvkvwekôp"fktgevcogpvg"q"rqt"kpvgtogfkctkq""‣ Ejgswg"gp"OP

FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006Comunicación cortaPRIMER REGISTRO DE CECIDÓMIDO ASOCIADO A SÍNTOMASDE ROYA EN PLANTAS MEDICINALES EN CUBAMarlene M. Veitía Rubio, Víctor M. García Infante, Danay López Manes y María O. López MesaInstituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Calle 110 no. 514 e/ 5. a B y 5. a F, Playa, Ciudadde La Habana, CP 11600En los cultivos de plantas medicinales como tilo (Justiciapectoralis Jacq.), caléndula (Calendula officinalis L.)y verbena cimarrona (Stachytarpheta jamaicensis (L.)Vahl.) se asocian numerosos patógenos fúngicos, entrelos cuales están los que ocasionan el síntoma denominadoroya.En Cuba se informa sobre tilo a Puccinia sp. [Fornet yGutiérrez, 1984] y Puccinia justiciae, del cual se describensus síntomas, así como su importancia en lascondiciones de la Granja Estatal de Plantas Medicinalesen Alquízar [Veitía et al., 2003]. En caléndula se haregistrado a Puccinia melampodii Diet. & How. en Cuba[Acosta, 1995] y en el resto del mundo [Farr et al., 1995].En verbena cimarrona es de importancia Pucciniaurbaniana P. Henn. por el número de áreas donde sepresenta y los síntomas que provoca en las condicionesdel país [Veitía et al., 2003]. Con anterioridad se registróen este cultivo por Secades et al. (1989), quienesdescriben sus síntomas. Acosta (1995) lo menciona comoun patógeno de importancia porque sus daños intensoslos causa en el follaje y los tallos, que son las partesutilizadas para fines medicinales.En colectas realizadas en áreas de producción de plantasmedicinales y en patios particulares en los municipiosde Alquízar y San Antonio de los Baños, en laprovincia de La Habana, y en la de Cienfuegos, se encontróen la mayoría de las ocasiones las larvas de uncecidómido (Diptera: Cecidomyiidae) cuando se alimentabade las pústulas ocasionadas por especies dePuccinia (Fig. 1).Figura 1. Larvas de cecidómido asociado a pústulas de roya (Puccinia urbaniana) enverbena cimarrona (Stachytarpheta jamaicensis).fitosanidad/305

Veitía y otrosEn más del 50% de las observaciones efectuadas paraeste trabajo, la alta población de larvas coincidió con laelevada infestación por roya (Tabla 1). En verbena cimarronase encontraron hasta nueve larvas asociadas alos síntomas y de una a tres por pústula en tilo.Según Alayo y Garcés (1989), en Cuba se mencionan lasespecies Neolasioptera Felt, Ctenodactylomyia Felt,Bruggmannia Tavares, Johnsonomyia Felt, MeinertomyiaFelt y Retinodiplosis Keiffer, aunque no se descarta lapresencia de otras especies en el resto de las Antillas.Nieves-Aldrey (1998) refiere que los cecidómidos comprendenespecies micófagas y zoófagas. AsimismoBarranco (2003) menciona especies de cecidómidos queviven en asociación con ciertos hongos.Tabla 1. Localidades donde se detectó la presencia de cecidómido asociado a pústulas de royaLugar Cultivo OcurrenciaRoya CecidómidoGranja Estatal de Plantas Tilo +++ ++Medicinales Valle Grande, enAlquízarCaléndula + +División Experimental delInstituto de Investigaciones deSanidad VegetalTilo + –Verbena cimarrona +++ ++Patio en Guanímar, Alquízar Verbena cimarrona +++ ++Estación Experimental de Plantas Tilo (en parcelas) ++ +Medicinales Dr. J. T. Roig, en San Tilo (en vivero a la sombra) +++ ++Antonio de los BañosVerbena cimarrona (en vivero a la + –sombra)Huerto de plantas medicinales del Verbena cimarrona +++ ++Instituto Politécnico AgropecuarioO. Jiménez, en Lajas, CienfuegosLeyenda para población de cecidómido:– No se observan larvas.+ Se observa una larva en una mancha por hoja.++ Se observa más de una larva en varias manchas por hoja.Leyenda para infestación por roya:+ Ligera incidencia de roya en algunas plantas en el campo.++ Incidencia media: plantas con más del 25% y hasta el 50% del follaje con síntomas.+++ Incidencia alta de plantas con más del 50% del follaje con síntomas de roya.REFERENCIASAcosta, L.: Proporciónese salud: cultive plantas medicinales,Ed. Científico-Técnica, La Habana, 1995.Alayo, P.; G. Garcés: Introducción al estudio del orden Diptera enCuba, Ed. Oriente, Santiago de Cuba, 1989.Barranco, P. V.: «Dípteros de interés agronómico. Agromícidos plagade cultivos hortícolas intensivos», Bol. SEA 33: 293-307, 2003. Disponibleen http://entomologia.rediris.es/aracnet/e2/11/21/Farr, D. F.; G. F. Bills; G. P. Chamuris; A. Y. Rossman: Fungi on Plants andPlants Products in the United States, APS Press, St. Paul, Minn., EE.UU.,1995.Fornet, E.; C. Gutiérrez: «Sobre la micoflora de plantas medicinales II»,revista Plantas Medicinales 4:10-13, Cuba, 1984.Nieves-Aldrey, J. L. «Insectos que inducen la formación de agallas enlas plantas: una fascinante interacción ecológica y evolutiva», BoletínSEA 23:3-12, 1998.Secades, M.; C. Gutiérrez; I. de la Osa; M. Martínez: «Hongos patógenos enplantas medicinales IV», Revista Cubana de Farmacia 23 (1-2):173-177,enero-agosto, 1989.Veitía, M. et al.: «Incidencia, comportamiento y control de plagas en loscultivos de caléndula (Calendula officinalis L.), tilo (Justicia pectoralis)y verbena (Staquitarpheta jamaicensis). Informe Final de Proyecto,División Experimental del INISAV, Alquízar, La Habana, enero del 2003.306/fitosanidad

FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006OBSERVACIONES SOBRE ENEMIGOS NATURALES DE LA BROCADEL CAFÉ (HYPOTHENEMUS HAMPEI FERRARI) EN CUBALuis L. Vázquez Moreno, 1 Eleazar Blanco Jiménez, 2 Orestes Elósegui Claro, 1 Yaril Matienzo Brito 1 yJanet Alfonso Simonetti 11Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Calle 110 no. 514 e/ 5. a B y 5. a F, Playa, Ciudadde La Habana, CP 116002Instituto de Ecología y Sistemática. Carretera de Varona Km 3½, Capdevila, Boyeros, AP 8029, Ciudadde La Habana, CP 10800La broca del café (Hypothenemus hampei Ferrari)(Coleoptera: Scolytidae) está considerada como una delas principales plagas del cultivo del cafeto en el mundo[Le Pelley, 1968; Baker, 1999] debido a los daños directosque ocasiona al fruto de esta planta, el nivel tanelevado de sus poblaciones, las dificultades para realizarun control eficiente y las limitaciones para lacomercialización del café afectado, entre otras [Jaramilloet al., 2006].En África, región de origen de H. hampei, se han estudiadodiversas especies de enemigos naturales, las quese han utilizado exitosamente en programas de controlbiológico clásico en otras regiones del mundo, principalmentelos parasitoides Cephalonomia stephanoderisBetrem (Hymenoptera: Bethylidae), Heterospiluscoffeicola Schenedeken (Hymenoptera: Braconidae),Phymastichus coffea La Salle (Hymenoptera: Eulophidae)y el hongo entomopatógeno Beauveria basiana(Balsamo) Vuillemin (Hyphomycetes: Moniliales), entreotros [Baker, 1999; Vega et al., 1999].Con el propósito de conocer la ocurrencia de enemigosnaturales en poblaciones de H. hampei bajo las condicionesde cafetales en Cuba, se realizaron observacionesen frutos perforados en las localidades de Buey Arriba,Granma (agosto de 1998), Trinidad, Sancti Spíritus (febrerodel 2006) y Bahía Honda, Pinar del Río (2005, 2006).Como entomopatógeno solamente se observó a B. bassiana(Fig. 1) que se había detectado anteriormente comocausante de una epizootia en Buey Arriba, Granma[Mario García, comunicación personal]. Posteriormenteesta patología se ha manifestado en todos los municipioscafetaleros del país, entre uno y tres años despuésde la detección de H. hampei en esos territorios.En observaciones realizadas en campos de cafeto dondese manifestaba esta epizootia en Bahía Honda, en Pinardel Río, se pudo comprobar que los campos donde existíasombra de árboles de mayor porte y mixta (Theobromacacao, Citrus spp., Mangifera indica, Musa spp. y otros),la enfermedad se manifestaba más intensa y prolongada,en comparación con los campos donde la sombra erade menor porte y de una especie (Gliricidia sepium).La epizootia por este hongo entomopatógeno se ha observadoigualmente en otros países cafetaleros comoMéxico [Barrera et al., 1990] y Colombia [Bustillo etal., 1998; 2002], entre otros, donde se refiere que sumanifestación es de forma variada en los diferentes años,la que depende de las condiciones climáticas. Se consideraque varios años después de su introducción enColombia, es el principal factor de mortalidad naturalde H. hampei.Como predadores, los más comunes han sido las hormigasPheidole megacephala (F.), Wasmania auropunctataRoger, Solenopsis geminata (F.) y Pseudomyrmex sp.(Hymenoptera: Formicidae), insectos que se introducenen las perforaciones en la etapa en que predominanlos estados inmaduros de la broca, los que devora, y enmuchos casos realizan sus nidos en el interior del fruto,donde además come sus partes, que están necrosadas odonde crecen hongos saprófitos.Otros predadores que se han encontrado en muy bajaspoblaciones han sido Laemophloeus sp. (Coleoptera:Laemophloeidae) y Cathartus sp. (Coleoptera: Cucujidae),cuyas larvas devoran los huevos y las larvas delprimer estadio de H. hampei, principalmente las quehabitan en frutos donde existen altas poblaciones de laplaga y en etapas finales del período de fructificación.fitosanidad/307

Vázquez y otrosFigura 1. Corte de un fruto de café donde se aprecia lahembra adulta de H. hampei infectada con B. bassiana.También se realizó un hallazgo de una chinchitapredadora de la familia Anthocoridae (Hemiptera), laque al parecer picaba y chupaba la hemolinfa de laslarvas de H. hampei, pues estas se observaron deformesy muertas en el interior de las perforaciones.Estos son los primeros informes de tales enemigos naturalesde H. hampei bajo las condiciones de Cuba, ysobre los cuales existen algunos antecedentes en otrospaíses, pues Vega et al. (1999) refirió hallazgos de variasespecies de estas familias en Togo y Costa de Ivore enÁfrica, pero sin atribuirle importancia en la regulaciónde las poblaciones de esta plaga en esa región.Igualmente en Colombia, Bustillo et al. (2002) encontraronhormigas de los géneros Solenopsis, Pheidole,Wasmannia, Paratrechina, Crematogaster, Brachymyrmexy Prenolepis, así como el cucújido Cathartus quadricollis(Guérin-Méneville) y un antocórido no identificado,asociados a perforaciones de H. hampei, los que observaroncon actividad como predadores de inmaduros.En la búsqueda de la posible existencia de parasitoides,en 1998 se hallaron cuatro especies de las familiasBethylidae y Encyrtidae (Hymenoptera) que emergieronde frutos donde había adultos e inmaduros deH. hampei en plantaciones de Buey Arriba, Granma.Aunque estos parasitoides no se lograron identificar,pueden ser nuevas especies de enemigos naturales deotras especies de Hypothenemus, que habitan en losecosistemas donde se cultiva cafeto en el país.De la familia Encyrtidae se ha descubierto a Coccidoctonussp. en Togo y un Anagyrini en Costa de Ivore, mientrasque de la familia Bethylidae hay informes en Áfricade parasitoides de los géneros Prorops, Cephalonomia yGoniozus, los dos primeros utilizados en programas decontrol biológico clásico [Vega et al., 1999].REFERENCIASBaker, P. S.: «La broca del café en Colombia». Informe Final del ProyectoMIP para el café DFID-CENICAFE-CABI BIOSCIENCE (CNTR 93/1536A), Chinchiná, Colombia, 1999.Barrera, J. F.; D. Moore; Y. J. Abraham; S. T. Murphy; C. Prior: «BiologicalControl of the Coffee Berry Borer, Hypothenemus hampei, in Mexicoand Possibilities for Further Action», Brighton Crop Protection Conf.Pests and Diseases, 1990, pp. 391-396.Bustillo, A. E.; R. Cárdenas; D. Villalba; P. Benavides; J. Orozco; F. J.Posada: «Manejo integrado de la broca del café, Hypothenemushampei (Ferrari) en Colombia», Chinchiná, Cenicafé, 1998.Bustillo, A.; R. Cárdenas; F. J. Posada: «Natural Enemies and Competitorsof Hypothenemus hampei (Ferrari) (Coleoptera: Scolytidae) in Colombia»,Neotropical Entomology 31(4):635-639, Oct./Dec."2002.Jaramillo, J.; C. Borgemeister; P. Baker: «Coffee Berry BorerHypothenemus hampei (Coleoptera: Curculionidae): Searching forSustainable Control Strategies», Bulletin of Entomological Research.96 (3):223-233, 2006.Le Pelley, R. H.: Pests of Coffee, Longmans, Londres, 1968.Vega, F. E.; G. Mercadier; A. Damon; A. Kirt: «Natural Enemies of theCoffee Berry Borer, Hypothenemus hampei (Ferrari) (Coleoptera:Scolytidae) in Togo and Cote d Ivoire and Other Insects Associatedwith Coffee Beans», African Entomology 7 (2):243-248, 1999.308/fitosanidad

FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006Resumen de tesisDIAGNÓSTICO Y SANEAMIENTO DEL VIRUS DASHEENMOSAIC EN MALANGA (XANTHOSOMA SPP. Y COLOCASIAESCULENTA (L.) SCHOTT)Janet Igarza CastroLaboratorio de Biotecnología Vegetal. Centro de Investigaciones y Servicios Ambientales y Tecnológicosdel CITMA. Carretera a Mayabe, Jardín Botánico, Holguín, CubaTesis presentada en opción al grado académico de Máster en Biotecnología Vegetal.El cultivo de la malanga es de gran importancia económicaen nuestro país. La propagación acelerada por víasbiotecnológicas de clones de interés comercial es uno delos principales retos en la agricultura, pero este cultivo seha visto afectado por la enfermedad viral conocida comoDasheen Mosaic Virus (DMV), lo que disminuye los rendimientos.Para la obtención de plantas libres del virus seaplican técnicas de saneamiento y se confirman con otrasde diagnóstico, por lo que en esta investigación se comparandistintas técnicas para la eliminación de virus comoson la extracción de meristemos, la termoterapia, laelectroterapia y la quimioterapia en los clones México 8 yCamerún 14, para conocer su efectividad en la obtenciónde plantas libres al DMV, y se confirman con la utilizaciónde diagnósticos de alta sensibilidad.Los resultados permitieron confirmar la efectividadde la electroterapia 5 y 10 vol/5 min y la quimioterapia3 mg/L. El diagnóstico inmunoquímico utilizado,con grandes ventajas sobre otros tipos de análisis, tieneun límite de sensibilidad que puede permitir el escapede material enfermo; pero con la introducción detécnicas moleculares se pueden detectar concentracionesvirales ínfimas en vitroplantas sanas. En la presenteinvestigación se realiza la detección del DMV porRT-PCR, la cual servirá de base para la aplicación futurade una técnica confirmativa de mayor sensibilidaddurante el saneamiento. Finalmente se propone unametodología de diagnóstico y saneamiento al DMV quepermite la introducción de líneas puras en biofábricaspara su propagación en campo.fitosanidad/309

FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006COMPORTAMIENTO Y CONTROL DE LA ENFERMEDAD TIZÓNDE FUEGO CAUSADA POR EL HONGO CORYNESPORACASSIICOLA (BERK. & CURT.) WEI. EN EL CULTIVO DEL PEPINO(CUCUMIS SATIVUS L.) EN SISTEMAS DE ORGANOPÓNICOSEN LA PROVINCIA DE CAMAGÜEY Y SU RELACIÓNCON OTROS PATÓGENOS FÚNGICOS PRESENTES EN EL CULTIVOCarlos A. Ferrer GonzálezLaboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Ave Finlay Km 2½ e/ Planta de Nitrógeno y CircunvalaciónNorte, Reparto Puerto Príncipe, Camagüey, Cuba, sanivecm@enet.cuTesis en opción al grado académico de Máster en Hortalizas.La necesidad de implementar un sistema de manejo dela enfermedad tizón de fuego del pepino, causado por elhongo Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei. dentrode una agricultura sostenible, implica la búsquedadel conocimiento de aspectos relacionados con la incidencia,comportamiento y control que permitan trazarestrategias en la solución de esta problemática. Se realizaroninvestigaciones para determinar la importanciade C. cassiicola en comparación con otros patógenosfúngicos presentes en el cultivo, su comportamiento ycontrol en los organopónicos de la Empresa de CultivosVarios de Camagüey y en el Laboratorio Provincial deSanidad Vegetal durante el período 2001 a 2003. Se determinóque los hongos causantes de afectaciones eneste cultivo son Pseudoperonospora cubensis (Berk. &Curt.) Rostow con 10%, Collectotrichum lagenarium(Pass.) Ell & Halst y Alternaria cucumerina (Ell. & Ev.)S. A. Elliott con 1% cada uno, y C. cassIicola como elde mayor importancia con 100% de incidencia y afectacionesde 85%. Su comportamiento se caracterizó porla permanencia durante todo el ciclo del cultivo con unincremento a medida que avanza la edad fenológica dela plantación, aspecto estrechamente relacionado con loscambios climáticos dentro de los cuales el efecto de la temperaturamáxima entre 28 y 30 o C, y la humedad relativamedia superior a 80% resultaron favorables para el desarrollode esta enfermedad. El crecimiento micelial y laesporulación del hongo en condiciones in vitro coincidencon temperaturas de 30 o C. La mayor circulación y distribuciónde los conidios en condiciones naturales se observaa las diez de la mañana. Los ensayos de sensibilidad deC. cassiicola ante diferentes productos fungicidas en condicionesde laboratorio y campo arrojaron mejores resultadosde inhibición del crecimiento de las colonias y delcontrol de la enfermedad con mancozeb PH 80% ybenomyl PH 80% a 5 ppm y 2 kg/ha i. a. El control biológicocon Trichoderma harzianum R. (cepa A-34) a dosis de10 kg/ha y del producto natural hidrato de cal a dosis de5 kg/ha en tratamientos foliares, alcanzaron eficacias de42 y 47% respectivamente, e incrementaron los rendimientosen 50%. Todos estos resultados fueron utilizados en laelaboración de estrategias de control de la enfermedad convistas a su inclusión en un esquema de manejo integradopara el control de C. cassiicola en el cultivo del pepino.310/fitosanidad