SPEEDTOOLS DNA EXTRACTION KIT - Biotools

Fabricado por:BIOTOOLS B&M Labs, S.A.Valle de Tobalina - 52 - Nave 3928021 MadridEspañaTel. (34) 91 710 00 74Fax (34) 91 505 31 18e-mail: info@biotools.euwww.biotools.euSPEEDTOOLS DNAEXTRACTION KITKit para la Extracción y Purificación de ADN Genómicode Cultivos Celulares, Sangre, Plasma, Suero y otrosFluidos OrgánicosInstrucciones de Uso(Cat. No. 21.131/2)ANTES DE USAR ESTE KIT LEA EN SU TOTALIDAD LAS INSTRUCCIONES DE USOESPECIALMENTE SI NO ESTÁ FAMILIARIZADO CON EL PROTOCOLO

1. EXPLICACIÓN DEL KITSPEEDTOOLS DNA EXTRACTION KIT permite una rápida y eficiente extracción de ADN genómico dealta calidad procedente de diversas muestras:• cultivos celulares• sangre• suero• plasma• otros fluidos orgánicosEn un primer paso la muestra se incuba en una solución que contiene de proteinasa K y agentescaotrópicos que produce la lisis celular y prepara la muestra para posteriores pasos. La adición de etanolen el segundo paso de extracción crea las condiciones necesarias de unión del ADN a las partículas desílica de la membrana de la columna. El paso de unión del ADN es específico además de reversible. Loscontaminantes presentes en la muestra son eliminados mediante sucesivos lavados de la columna condiferentes buffers. Finalmente el ADN es eluido específicamente en un buffer de baja fuerza iónica y pHligeramente alcalino.2. REACTIVOS INCLUIDOS EN EL KITSPEEDTOOLS DNA EXTRACTION KITCat. No. 21.131Buffer BB1Reagent BB2Buffer BB5 (concentrado)Buffer BBWBuffer BBEProteinase K (liofilizada)Proteinase BufferColumnasCollecting Tubes de 2 mlEtiqueta (para el Buffer BB3)Protocolo50 Preparaciones10 ml2.5 ml7 ml30 ml13 ml30 mg1.8 ml50100113. USO PREVISTOEl kit SPEEDTOOLS DNA debe utilizarse con los siguientes tipos de muestras: cultivos celulares, sangre,suero, plasma y otros fluidos orgánicos. También es posible purificar ADN de origen viral ya que el ADNviral se co-purificaría junto al ADN celular. En estos casos se recomienda partir de muestras libres decélulas como suero o plasma.El kit puede emplearse en muestras de sangre tratadas con EDTA, citrato, o heparina. Si el material esrico en leucocitos se debe emplear volúmenes menores de muestra o incluso diluir la muestra en soluciónPBS estéril (disolver 8 g de NaCl, 0.2 g de KCl, 1.44 g de Na 2 HPO 4 , y 0.24 g de KH 2 PO 4 en 800 ml H 2 O,ajustar el pH a 7.4 con HCl y añadir H 2 O hasta llegar a un volumen de 1 L).Ed 05 – Junio 08Página 1 de 8SPEEDTOOLS DNA EXTRACTION KIT

El kit permite purificar ADN genómico con una alta pureza. El ratio A260/A280 alcanzado es de alrededorde 1.60 - 1.90 y las concentraciones obtenidas se encuentran en el rango de 40–60 ng por µl.El ADN obtenido es adecuado para posteriores usos como Southern blotting, PCR en Tiempo Real oreacciones con enzimas.Tabla 1: Características Generales del KitMuestraTamaño de la Muestra hasta 200 µlRendimiento Medio 4-6 µgVolumen de Elución 100 µlCapacidad de Unión 60 µgTiempo Empleado / Prep30 minTipo de Columnamini4. PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS E INSTRUCCIONES DEALMACENAMIENTONOTABuffers BB1, BB3 y BBW contienen hidrocloruro de guanidina por lo tanto utilice en todo momento guantes ygafas de protección.Los reactivos incluidos en el kit pueden almacenarse a temperatura ambiente (20-25°C) siendo establesdurante 1 año.Antes de comenzar cualquier ensayo con SPEEDTOOLS DNA EXTRACTION KIT prepare las siguientessoluciones:• Proteinase K: Reconstituya el tubo liofilizado de Proteinase K añadiendo 1.35 ml de ProteinaseBuffer. La solución de Proteinase K es estable a 4°C durante un periodo de 6 meses. Si lasolución no va ser utilizada durante este periodo se recomienda almacenarla a -20°C.• Buffer BB3: Transfiera todo el contenido del Buffer BB1 a Reagent BB2 y mezcle bien. Lasolución resultante será el Buffer BB3. Etiquete el producto con la etiqueta provista en el Kit.Conserve el Buffer BB3 a temperatura ambiente (20-25°C), esta solución es estable durante unaño.• Buffer BB5: Añada 28 ml de etanol (96-100%) al Buffer BB5 concentrado. Almacenar el bufferBB5 a temperatura ambiente (20-25°C) es estable durante un año.El Buffer BB3 y el Buffer BB1 si se conservan a bajas temperaturas precipitan. Disuelva losprecipitados blanquecinos incubando el buffer antes de su uso a 70°C.Ed 05 – Junio 08Página 2 de 8SPEEDTOOLS DNA EXTRACTION KIT

NOTAPara muestras respiratorias viscosas (esputos) seguir el siguiente pre-tratamiento de muestras antes de usarSpeedtools DNA Extraction Kit:1.- Añadir a la muestra una solución de NALC (1:1vol); incubar a temperatura ambiente durante 20 min.Solución de NALC:1.45 % citrato sódico2 % hidróxido sódico0.5 % N-acetil-L-cisteina2.- Centrifugar la muestra a 3500 rpm durante 20 min.3.- Recoger y desechar el supernadante4.- Resuspender el pellet en 1 ml de 1% PBS5.- Usar 200 µL para Speedtools DNA Extraction Kit.B. Protocolo de Extracción y Purificación de ADN de Citomegalovirus a partir de PlasmaAntes de comenzar el protocolo prepare un baño de agua o una incubadora a 70°C. Equilibre el BufferBBE a 70°C y prepare el Buffer BB3, el Buffer BB5 y la solución de Proteinase K como se indica en lasección 4 del boletín.PASODESCRIPCIÓN1 LISIS DE LA MUESTRA• En un microtubo de 1.5 ml añada 250 µl de plasma (equilibradoa temperatura ambiente) y 25 µl de la solución de Proteinase K.• Añadir 200 µl de Buffer BB3 de lisis, mezclar vigorosamente lamezcla con el vortex (10-20 seg) e incubar a 70°C durante 10-15min.250 µlPLASMA+25 µlPROTEINASE K+200 µlBUFFER BB3mix70°C 10-15 min2-5 Continue con los pasos 2-5 del Protocolo Estándar. En el paso 3cargue todo el lisado en dos pasos.6 ELUCIÓN Y CONCENTRACIÓN DE DNA DECITOMEGALOVIRUSTransferir la columna a un microtubo de 1.5 ml y añada 40 µl deBuffer BBE precalentado a (70ºC) directamente en la membrana.Incube a temperatura ambiente durante 3 min y centrifugue 1 mina 11,000 x g. El eluido contiene el ADN puro extraído de lamuestra.+40 µlBUFFER BBE(70ºC)Incube 3 min1 min, 11,000 × gC. Otros Protocolos de EluciónEl método estándar descrito en la sección 5 tiene un rendimiento de 70-90%. Es posible adaptar elprotocolo de elución y facilitar así posteriores aplicaciones del ADN purificado.Para los siguientes protocolos utilice siempre el Buffer BBE (buffer de elución) precalentado a 70°C.• Para obtener mayor rendimiento: Realice dos pasos de elución con el volumen indicado en elprotocolo estándar, de esta forma se podrá eluir entre un 90-100% del ADN unido a lamembrana.• Para obtener mayor concentración: Realice un solo paso de elución utilizando un 60% delvolumen de elución (60 µl) indicado en el protocolo estándar. La concentración de ADN obtenidaes 30% superior a la obtenida con el protocolo estándar, siendo el rendimiento de elución deADN unido a la membrana alrededor de un 80%.• Para obtener un rendimiento y una concentración elevada: Divida el volumen de elución endos partes iguales. Utilice la mitad del volumen de elución indicado en el protocolo estándar,incremente el periodo de incubación con el buffer de elución a 3 minutos y centrifugue. Repitaesta operación con la otra mitad del volumen de elución. Así el 85-100% del ADN unido a lamembrana es eluido en el volumen estándar de elución (100 µl).Ed 05 – Junio 08Página 4 de 8SPEEDTOOLS DNA EXTRACTION KIT

NOTASi se utiliza el Buffer BBE de elución a temperatura ambiente el rendimiento obtenido con el kit esaproximadamente un 20% menor que si se utiliza precalentado.El ADN puede eluirse en buffer Tris-EDTA (TE) a pH ≥ 8. El buffer TE aumenta la estabilidad del ADN enmuestras almacenadas a largo plazo, y/o de uso frecuente almacendas a 4°C, o a temperatura ambiente,pues inhibe ADNasas presentes en la muestra. Sin embargo, la presencia de EDTA (dependiendo de laconcentración final) pudiera interferir en ciertas aplicaciones posteriores de la muestra.Para posterior procesamiento de la muestra se recomienda utilizar el buffer de elución BBE incluido en elkit y almacenar las muestras (especialmente por periodos largos de tiempo) a -20°C. En la mayoría deaplicaciones posteriores del ADN la muestra no suele verse influida por ciclos frecuentes de congelación ydescongelación.Si se va a realizar PCR de fragmentos >10 kb, o se va a analizar la presencia de trazas de ADN de otrasespecies en la muestra, la sensibilidad del ensayo puede verse seriamente afectada por las condicionesde almacenamiento de la muestra (Ej. ciclos frecuentes de congelación y descongelación, periodos largosde almacenamiento a 4°C, almacenamiento a temperatura ambiente).6. RESOLUCIÓN DE PROBLEMASProblemaPosible causa y sugerenciasBaja concentración de leucocitos en la muestra• Prepare “buffy coat” a partir de muestras enteras de sangre: centrifugue atemperatura ambiente (3,300 × g; 10 min) y de las tres capas que aparecenrecoja la capa intermedia que corresponde a los leucocitos (buffy coat).Lisis celular incompleta• La muestra no ha sido bien mezclada con el Buffer BB3 / Proteinase K.Después de añadir el Buffer BB3 de lisis vortex vigorosamente la muestra.Bajorendimientode ADN oningúnrendimiento• Subóptima digestión de la Proteinasa K. Nunca añada directamente lasolución de Proteinsa K al Buffer BB3 de lisis. Incube 15 - 20 min a 70°C /56°C.Reactivos no han sido preparados correctamente• Prepare los buffers y la solución de Proteinase K según las instrucciones dela sección 4. Añada etanol al lisado antes de cargar las columnas.Subóptima elución del DNA unido a la columna• El Buffer BBE de elución debe precalentarse a 70°C antes de su uso. Aplicarel Buffer BBE directamente sobre el centro de la membrana de sílica.• La eficiencia de elución disminuye drásticamente si el buffer utilizado paraeluir tiene un pH < 7.0. Así el Buffer BBE posee un pH 8.5.Utilice buffersligeramente alcalinos para eluir el DNA.• Durante el periodo de incubación a 70ºC mezcle vigorosamente la muestraespecialmente si trabaja con muestras viejas o con sangre coagulada.Ed 05 – Junio 08Página 5 de 8SPEEDTOOLS DNA EXTRACTION KIT

ProblemaPosible causa y sugerenciasReactivos no han sido preparados correctamente• Prepare los buffers y la solución de Proteinase K según las instrucciones dela sección 4. Añada etanol al lisado antes de cargar las columnas.Lisis celular incompleta• La muestra no ha sido bien mezclada con el Buffer BB3 / Proteinase K.Después de añadir el Buffer BB3 de lisis vortex vigorosamente la muestra.Se obtiene ADNde mala calidad• Subóptima digestión de la Proteinasa K. Nunca añada directamente lasolución de Proteinsa K al Buffer BB3 de lisis. Incube 15 - 20 min a 70°C /56°C.Existencia de ARN en la muestra• Si se quiere ADN libre de ARN añada 20 µl de RNase A solution (20 mg/ml)antes de añadir el Buffer BB3 de lisis.Las muestras son viejas o la sangre ha coagulado• Para la extracción de ADN de muestras de sangre ya viejas o coaguladas serecomienda incubar la muestra con la solución Proteinase K durante 30 min ymezclar bien con el vortex varias veces durante el proceso de incubación.Presencia de etanol• Antes de pasar al paso de elución del ADN asegúrese que no quedan restosde etanol procedentes del Buffer BB5. Si por alguna circunstancia el nivel delBuffer BB5 ha sobrepasado la columna y ha alcanzado el exterior, descarteel eluido y coloque la columna en un nuevo tubo y centrifugue.El ADNpurificado nofunciona bienen reaccionesenzimáticasContamination del ADN con inhibidores• Si el ADN ha sido eluido con buffer Tris/EDTA (TE), asegúrese que EDTA nointerfiera en posteriores aplicaciones del ADN o repurifique el ADN y utiliceel Buffer BBE.• Si purifica ADN de muestras viejas o sangre coagulada incube la muestracon la solución Proteinase K durante 30 min y vortex una o dos vecesdurante el proceso.• Si el ratio de A 260/280 del eluido es menor de 1.6 repita el proceso depurificación: Añada un volumen de Buffer BB3 y un volumen de etanol aleluido, cargue una columna y continúe con el paso 3 del protocolocorrespondiente.Ed 05 – Junio 08Página 6 de 8SPEEDTOOLS DNA EXTRACTION KIT