BIOTOOLS Pfu DNA POLYMERASE 1 U/µl

GARANTÍABIOTOOLS garantiza la conformidad de los productos con la cantidad y contenido indicado en el vial y etiquetas exteriores durantesu periodo de vida media. La obligación de BIOTOOLS y los derechos del comprador bajo esta garantía están limitados bien alreemplazo por parte de BIOTOOLS de cualquier producto que sea deficiente en fabricación, y que deberá ser retornado aBIOTOOLS (portes pagados) o a opción de BIOTOOLS, devolución del precio de adquisición. Las reclamaciones por mercancíadañada durante el transporte han de ser dirigidas al transportista.Este producto debe ser utilizado únicamente por profesionales cualificados y para uso exclusivo en investigación. Es laresponsabilidad del usuario asegurarse que un producto determinado es adecuado para una aplicación determinada. Cualquierproducto que no cumpla con las especificaciones indicadas en la hoja informativa de producto será reemplazado. Esta garantíalimita nuestra responsabilidad al reemplazo del producto. Ninguna otra garantía, de ningún tipo, expresa o implícita, incluyendo, sinlimitación, garantías implícitas de capacidad de comercialización o adecuación para un propósito determinado, son dadas porBIOTOOLS. BIOTOOLS no tendrá responsabilidad sobre ningún daño directo, indirecto, consecuencia o incidental resultante deluso, mal uso, los resultados del uso o la incapacidad de uso de ningún producto.Fabricado por:BIOTOOLS, Biotechnological & Medical Laboratories, S.A. han sido evaluados y certificados en cuanto acumplimiento de los requisitos de la ISO 9001:2000 para las siguientes actividades: investigación y desarrollo deproductos de biotecnología, fabricación de productos de biotecnología y fabricación de productos para diagnóstico invitro (IVDs). Valle de Tobalina – 52 – Nave 39, 28021 Madrid – Spain© 2009 BIOTOOLS, Biotechnological & Medical Laboratories, S.A. Todos los derechos reservadosBIOTOOLS B&M Labs, S.A.Valle de Tobalina - 52 - Nave 3928021 MadridSpainTel. (34) 91 710 00 74Fax (34) 91 505 31 18E-mail: info@biotools.euwww.biotools.euBIOTOOLSPfu DNA POLYMERASE 1 U/µlREF. FORMATO CONTENIDO10.501 100 U10.502 250 U10.511 100 U10.512 250 UBIOTOOLS Pfu DNA Polymerase (1 U/µl)10X Standard Reaction Buffer with MgCl 2BIOTOOLS Pfu DNA Polymerase (1 U/µl)10X Standard Reaction Buffer with MgCl 2BIOTOOLS Pfu DNA Polymerase (1 U/µl)10X Reaction Buffer MgCl 2 FREEBIOTOOLS Pfu DNA Polymerase (1 U/µl)10X Reaction Buffer MgCl 2 FREEAlmacenar a -20ºCAviso a usuarios: Algunas de las aplicaciones que pueden llevarse a cabo con este producto están cubiertas porpatentes aplicables en ciertos países. La adquisición de este producto no incluye o provee de una licencia pararealizar aplicaciones patentadas. En algunos casos, los usuarios tienen la obligación de adquirir una licencia,dependiendo del país y/o la aplicación.Ed 11.Marzo 20101. DESCRIPCIÓN DEL PRODUCTOBIOTOOLS Pfu DNA Polymerase es una polimerasa termófila con actividadcorrectora de errores (proof-reading) debido a su actividad 3’-5’ exonucleasa. Esuna proteína recombinante procedente de la bacteria hipertermófila Pyrococcusfuriosus, expresada en E. coli (ver Nota 1).BIOTOOLS Pfu DNA polimerasa está indicada para todas aquellas aplicaciones querequieren una polimerasa con actividad proof-reading, altamente termoestable yprocesiva, adecuada para reacciones de amplificación o similares (p.ej. primerextension). Esta enzima posee una tasa de error un orden de magnitud menor quela tasa de error de otras polimerasas que carecen de actividad proof-reading.Esta enzima no presenta actividad endonucleasa, de tipo nicking, ni actividad 5’-3’exonucleasa. Tampoco presenta actividad nucleotidil transferasa terminal por locual los productos de amplificación de Pfu se pueden utilizar directamente paraclonar en cualquier vector con extremos romos.La enzima incluida se suministra a una concentración 1 U/µl en el buffer dealmacenamiento. Esta concentración facilita el pipeteo sin error de pequeñas cantidadesde Pfu DNA Polymerase, de forma que no es necesario llevar a cabo diluciones ulteriores.Aplicaciones del producto:• Reacciones de PCR estándar u otras reacciones que requieran síntesis deADN a alta temperatura.• PCR Multiplex• PCR in situ2. CARACTERÍSTICAS DE LA ENZIMAConcentración: ........................................... 1 U/µlActividad óptima:Concentración de enzima .. 20-40 mU/µlpH ...................................... 8-9Temperatura de extensión . 72ºCConcentración de MgCl 2 .... 2 mMTamaño de los productos de PCR: ............. Hasta 5 KbTipo de clonaje: .......................................... Extremos romosActividad endonucleasa: ............................. NoActividad reverso transcriptasa: .................. NoActividad 5´→3´exonucleasa: ..................... NoActividad 3´→5´exonucleasa: ..................... SiActividad tipo nicking .................................. NoNota 1:Esta enzima no está recomendada para experimentos que utilicen secuenciashomólogas a E. coli o amplificaciones con temperaturas de annealing muy bajas (p.ej.RAPDs, Random Amplified Polymorphic DNAs)3. CONDICIONES DE ALMACENAMIENTOConservar a -20ºC en un congelador que garantice una temperatura constante(no se recomiendan congeladores frost-free). En estas condiciones, la enzima esestable durante 24 meses. El glicerol del tampón de almacenamiento evita que laenzima se congele a -20ºC. En cualquier caso, si se congela, su actividad nose verá afectada.4. ESPECIFICACIONES DEL PRODUCTODefinición de Unidad- cantidad de enzima que incorpora 10 nanomoles dedNTPs en ADN ácido-insoluble en 30 minutos a 72 ºC.Buffer de almacenamiento- Tris-HCl 20 mM (pH 8.0), KCl 50 mM, NP40,0.25%, Tween 20 0.25%, glycerol 40% (v/v).10X Reaction Buffer- Tris HCl 750 mM (pH 9.0), KCl 500 mM, (NH 4 ) 2 SO 4 200 mM.El buffer llamado 10X STANDARD REACTION BUFFER with MgCl 2 incluye,además 20 mM de MgCl 2 en su composición.5. ASPECTOS GENERALES DE LOS COMPONENTESDE LA REACCIÓNConcentración de EnzimaBiotools Pfu DNA Polymerase es apta para su uso tanto en aplicaciones PCRestándar como aquellas más especializadas. Como guía inicial se recomiendautilizar las siguientes cantidades de enzima por reacción.Volumen de Reacción FinalUnidades de enzimarecomendadas100 µl Hasta 2.5 Unidades50 µl 1-1.25 Unidades25 µl 0.5-0.75 UnidadesEl añadir mayor cantidad de enzima no asegura un mayor rendimiento de lareacción, solamente en algunas aplicaciones como PRIND (Primed In Situ Syntesis)o cuando se amplifica fragmentos de ADN de gran tamaño (mayores de 2 Kb deADN genómico) puede ser necesario aumentar el contenido de la enzima.ADN MoldeTanto la calidad como la cantidad de ADN molde afectan la sensibilidad y laeficiencia de la reacción de amplificaciónLa utilización de altas concentraciones de ADN puede favorece el aumento deproductos de reacción inespecíficos. La reacción de PCR puede ser inhibida porvarios componentes ej. detergentes iónicos, fenol, dyes, etc. Si el ADN moldecontiene trazas de inhibidores, reduzca su presencia diluyendo el ADN molde outilizando menor cantidad de ADN molde. En ciertos casos puede ser necesario repurificarel ADN molde mediante precipitación con etanol seguido de varios lavados.Concentración de dNTPsGeneralmente se utilizan cantidades equimolares de dNTPs. La concentración decada dNTP es de 50-500 µM, siendo la concentración más usual 200 µM.La concentración de dNTPs puede disminuirse (ej. cuando existen amplificacionesinespecíficas) o aumentarse (cuando se amplifican fragmentos de gran tamaño),incluso se pueden desequilibrar a favor de algún dNTP en concreto (ej.experimentos de mutagénesis “in vitro”).Si se incrementa la concentración de dNTPs en una reacción de amplificación, sedeberá aumentar en paralelo la concentración de MgCl 2 , pues los dNTPs secomportan como potentes quelantes del catión Mg 2+ .Biotools Pfu DNA Polymerase puede emplearse en reacciones de amplificación condNTPs modificados con marcajes radioactivos o con fluoresceína. También puedeutilizarse con dUTP u otros análogos.www.biotools.eu

Buffer de ReacciónEl buffer incluido ha sido especialmente formulado para llevar a cabo todo tipo dereacciones de amplificación. El objetivo del buffer es crear las condiciones dereacción apropiadas para que los primers hibriden en un amplio rango detemperatura. En la composición del Standard Reaction Buffer se incluye MgCl 2 a laconcentración óptima para la mayoría de experimentos (2 mM final).Concentración de MgCl 2El usuario tiene que determinar experimentalmente la concentración óptima deMgCl 2 para su ensayo. Biotools recomienda comenzar los ensayos con unaconcentración de MgCl 2 de 1.5-2 mM, pues el óptimo para la mayoría deexperimentos testados ha sido de 2 mM. Concentraciones elevadas de MgCl 2pueden dar lugar a la formación de productos de amplificación inespecíficos y bajafidelidad de copia; en tanto que bajas concentraciones de MgCl 2 pueden reducir elrendimiento del producto deseado.Si las muestras incluyen en su composición agentes quelantes de metales comoEDTA, se recomienda aumentar la concentración de MgCl 2 en la reacción.Diseño de los PrimersLos primers utilizados en experimentos de PCR convencionales poseen un tamañode 15-30 nucleótidos con un contenido en G+C de 40-60%. Para evitar la formaciónde dímeros de primer o de horquillas, los primers no deben de ser complementariosconsigo mismos o con otros primers de la reacción.La temperatura de anillamiento de los primers debe de ser similar con un máximode 5 ºC de diferencia entre ellos. Cuando se realice la selección de primers se debetener en cuenta el contenido en G+C y el tamaño de los mismos. El extremo 5´ delprimer puede contener bases desapareadas con el ADN molde, sin embargo no esrecomendable que esto ocurra en el extremo 3´.Aditivos de la Reacción de PCREn algunos casos en los que la optimización de la reacción de PCR presentadificultades, la presencia de DMSO, betaína, formamida u otros aditivos puede sernecesaria. Tanto la enzima como el buffer de reacción incluidos son compatiblescon la mayoría de aditivos. Tener en cuenta que ciertos aditivos disminuyen latemperatura de melting de los primers.6. PROTOCOLO DE USOLas condiciones óptimas deben de ser determinadas para cada experimento.Trabaje en el área de preparación de reactivos en una cabina de flujo laminar. Esta áreadebe de encontrarse separada del área de preparación de ADN y del área de PCR. Paraevitar contaminaciones utilice guantes de examen y puntas de pipeta y tubos de reacciónestériles libres de DNasas y RNasas.1. Descongele los reactivos a temperatura ambiente o en hielo. Después dedescongelar mezcle bien con ayuda de un vortex y centrifugue. Mantenga losreactivos en hielo.2. Prepare la master mix en un tubo de reacción estéril siguiendo las instruccionesde la Tabla 1. En cada experimento incluya al menos un control negativo (NTC sinADN molde). Para tener suficiente volumen, prepare la master mix para variasreacciones más de las necesarias.Se recomienda incorporar la Pfu DNA polimerasa al final a fin de evitar que su actividad 3’-5’ exonucleasa degrade los primers (sobre todo si se añade en ausencia de los dNTPs).TABLA 1. Preparación de la Master MixVOL FINALCOMPONENTE CONC FINAL 50 µl rxn 20 µl rxnMaster Mix10X REACTION BUFFER 1X 5 µl 2 µlMgCl 2 solution (50 mM)* 1.5-4 mM 1.5-4 µl 0.6-1.6 µldNTP Mix 10 mM each 200 µM de cada dNTP 1 µl 0.4 µlPrimers variable variable variablePfu DNA Polymerase (1 U/µl) 20-40 mU/µl 1-2 µl 0.4-0.8 µlAgua bidestilada estéril -Hasta volfinalHasta volfinalADN Molde Variable Variable Variable*no es necesario para 10X Standard Reaction Buffer, pues este buffer incluye MgCl 23. Mezcle bien la master mix y manténgala en hielo. Distribuya el volumenapropiado en cada vial.Proceda a trabajar en el área de purificación de ADN separada de otras fuentes de ADN.4. Añada el ADN molde a cada vial de reacción. Cierre los viales y mezcle cuidadosamente.Para termocicladores sin tapa calefactora, añadir aceite mineral en los tubos de reacción.Proceda al área de amplificación o PCR5. Programe el termociclador según la guía de la tabla 2. Coloque los viales en eltermociclador y ejecute el programa de PCR seleccionado.TABLA 2. Programa de Amplificación EstándarPASOS Nº CICLOS TEMPERATURA TIEMPODesnaturalización Inicial 1 94ºC 3-10 min**DesnaturalizaciónAnillamientoExtensión25-35*94ºCT m -5ºC72ºC5-30 seg30-60 seg2 min/1 KbExtensión Final 1 72ºC 5-15 minEnfriamiento ∞ 4ºC ∞*Optimice el tiempo, la temperatura y el número de ciclos de la PCR.**Dependiendo del molde.7. GUÍA PARA EL PROGRAMA DE AMPLIFICACIÓNDesnaturalización Inicial- Si el paso de desnaturalización inicial es incompletola eficiencia del primer ciclo de amplificación se verá afectado y como consecuenciael rendimiento final de la reacción. La desnaturalización inicial no debe prolongarsemás de lo estrictamente necesario a fin de evitar que la enzima se inactive.Generalmente una temperatura de 94ºC durante 3-5 minutos suele ser suficiente.Cuando el ADN molde posea un elevado contenido de G+C se recomiendaincrementar el tiempo de desnaturalización hasta 10 minutos.Paso de Desnaturalización- El producto de amplificación obtenido es menorque el ADN molde por lo cual el periodo de desnaturalización es más corto que elde desnaturalización inicial. Un periodo de desnaturalización de 5-30 segundos a94ºC suele ser suficiente.Paso de Anillamiento- Si los primers tienen