Producción de Carne Cultivada In Vitro - AlimentariaOnline

Producción de CarneCultivada In VitroP.D. Edelman, M.SC., 1 D.C. McFarland, Ph.D., 2 V.A. Mironov, Ph.D.,M.D., 3 y J.G. Matheny, M.P.H. 4El cultivo de carne, por lo menos basado en la variedadandamio, aparentemente es técnicamenteviable. Sin embargo, todavía quedan muchosretos antes de que pueda producirse económicamenteTendenciasIntroducciónApesar de que la carne ha mantenidosu popularidad comoalimento, los consumidores hanexpresado su preocupación sobre algunasconsecuencias por el consumoy producción de la carne. Estas incluyenenfermedades relacionadas conla nutrición, enfermedades, recursosutilizados y contaminación, y el uso deanimales de la granja.Aquí se revisa la posibilidad de producirmúsculo de animal apto para consumirse(por ej., carne) in vitro usandotécnicas de ingeniería tisular. Dicha“carne cultivada” puede ser saludabley tener ventajas sobre la carne convencional,las técnicas requeridas paraproducirla no está más allá de la imaginación.Para los ingenieros de tejidoseste tema es de gran interés deda quela producción de carne cultivada es unaaplicación de los principios de ingenieríade tejidos cuyos retos técnicos puedenser menos formidables que aquellos orientadosa aplicaciones clínicas.Producción de carne cultivadaLa mayoría de la carne de consumocontiene tejido de músculo esquelético.La idea de que se pueda aplicar lastécnicas de ingeniería tisular al mús-culo esquelético para producir carne deconsumo data de hace por lo menos 70años, pero sólo se ha perseguido por tresgrupos de investigadores. Sus intentosse pueden dividir en técnicas basadas entécnicas de estructuras de andamio y deorganización propia.En las técnicas basadas en la estructurade andamio, las células de losmioblastos embriónicos o músculo esqueléticoadulto se proliferan, adhieren aun andamio o soporte (carrier) como unamalla de colágeno o perlas microsoporteque después se perfunden en un mediode cultivo dentro de un biorreactor estacionarioo rotatorio. Al introducir unavariedad de indicaciones ambientales,estas células se fusionan a miotubos,los cuales se pueden diferenciar enmiofibras. Las miofibras resultantespueden entonces recolectarse, cocinary consumirse como carne. Van Eelen,Van Kooten, y Westerhof mantuvieronuna patente holandesa por esta propuestapara producir carne cultivada. Sinembargo, Catts y Zurr fueron aparentementelos primeros en producir carnecon este método.La técnica basada en andamio puedeser apropiada para producir carneprocesada (molida, sin hueso) comohamburguesas y salchichas. Pero noes adecuada para producir carnes altamenteestructuradas, como los filetes.Para producir éstos, se necesitará unapropuesta más ambiciosa, crear tejidomuscular estructurado con un armadoauto organizando o proliferando el tejidomuscular in vitro ya existente.La segunda técnica fue utilizadapor Benjaminson, Gilchriest, y Lorenz,los primeros investigadores que aplicarontécnicas de ingeniería tisular paraproducir carne. Colocaron un explantede músculo esquelético de pez dorado(Carassius auratus) en distintos mediosde cultivo por 7 días y observaron unaumento en el área de la superficie deentre 5.2 y 13.8%. Cuando el explantese colocó en un cultivo con células disociadasde músculo esquelético deCarassius, el área superficial del explanteaumentó un 79%.Los explantes tienen la ventaja decontener todas las células para hacer unmúsculo en las proporciones correspondientes,muy parecidas a una estructura invivo. Sin embargo, la falta de circulaciónde sangre en estos explantes hace imposibleun crecimiento sustancial, ya quelas células se necrosan si se separan porlargos periodos de tiempo en más de 0.5info@mundolacteoycarnico.com Noviembre/Diciembre 2008 Mundo Lácteo y Cárnico 15

Tendenciasmm de su fuente de nutrientes.Futuras investigaciones en cultivode carne se tendrán que enfocar en laslimitaciones de las técnicas actuales através de los avances que se realizan enel cultivo celular, andamios, medios decultivos y factores de crecimiento apropiadosy asequibles.CélulasEl músculo esquelético es un tejidoque consiste en varios tipos de células.Las fibras del músculo se forman porla proliferación, diferenciación y fusiónde mioblastos embriónicos y, en losanimales después de su nacimiento,células satelitales, para formar grandessincitios multinucleados. Intentar forzarlas fibras del músculo esqueléticopara que proliferen es contraproducenteya que la mayoría de los mionúcleospermanecen postmitóticos. Lascélulas madre embriónicas tienen elinconveniente que a pesar de su altaproliferación y diferenciación, se debehacer un impulso para forzarlos a diferenciarse;el rendimiento celular de lacosecha es bajo.Además, no queda claro si las célulasmadre embriónicas forzadas para formarun linaje de músculo esquelético que tendránlas características de proliferaciónde las células madres embriónicas o sevolverán indistinguibles de los mioblastos.Por esto, la fuente más práctica parael cultivo de carne es probablementelos mioblastos embriónicos o células delmúsculo esqueléticos posnatales llamadascélulas satelitales.Se han aislado células satelitalescon una alta capacidad de proliferacióny caracterización del músculo esqueléticode pollos, pavos, cerdos, borregos,ganado. En cada caso los investigadoreshan establecido las condicionesdel medio para apoyar la proliferacióny diferenciación de células para formarfibras de músculo inmaduro llamadosmiotubos cultivados.El sistema de cultivo de carne mássimple generalmente usaría un sola líneade célula miogénica de uno de estosanimales, o un cocultivo con célulasgrasas. Después de cultivar y recolectar,las células pueden entonces estarpreparadas para su consumo como carneprocesada. El replicar el sabor y texturade carnes sin procesar es un objetivo másambicioso, ya que se necesitarían célulasvasculares y fibroblastos para la producciónde tejido conectivo. Además, estotendría que estar bien organizado en unaestructura tridimensional. Un entorno decrecimiento apropiado será esencial paradirigir la construcción de la estructura deltejido del músculo esquelético.No queda claro el rendimiento quetendría una sola célula para el cultivode carne. Se cree que las células madreen el cultivo sufren un número fijo deduplicaciones llamadas límite Hayflick.El límite Hayflick de las células madre16 Mundo Lácteo y Cárnico Noviembre/Diciembre 2008 info@mundolacteoycarnico.com

de un músculo de animal de granja nose han establecido. Se ha demostradoque las células satelitales clonadas delmúsculo de pechuga de pavo expresantelomerasa. Esto sugiere que las célulassatelitales de animales domésticospueden generar suficientes células hijaspara producir grandes cantidades decarne cultivada. (Por ejemplo, cálculosrápidos sugieren que una sola célulamadre con un limite Hayflick de 75 podríateóricamente satisfacer la demandaactual global de carne). Para otras especies,puede ser necesario el proliferar unnúmero suficiente de células madre enel cultivo antes de la diferenciación demioblastos – o usar células a las que seles haya introducido el gen telomerasa,que tiene límites Hayflick mayores.CamposSe ha encontrado que los campos deflujo de fluidos, gravitacional, electromagnéticoy mecánico afectan la proliferacióny diferenciación de mioblastos.Powell y otros encontraron que unarelajación y encogimiento repetitivo igualal 10% de longitud, seis veces por hora,aumenta la diferenciación en miotubos.Yuge y Kataoka sembraron mioblastoscon micropartículas magnéticas e indujeronla diferenciación colocándolas enun campo magnético sin añadir factoresde crecimiento o cualquier medioacondicionado. La estimulación eléctricatambién contribuye a la diferenciación,así como a la formación de sarcómerosdentro de los miotubos establecidos.AndamiosLos mioblastos son dependientes desus adherencias, lo que significa que sedebe proporcionar el substrato o andamiopara que la proliferación y diferenciaciónocurra. Para la carne cultivada,un andamio y sus subproductos debenser comestibles y pueden derivarse defuentes no animales. Un reto posteriorsería desarrollar un andamio que se puedafijar y alargar mecánicamente a lascélulas para estimular la diferenciación.Un sustrato flexible también es necesariopara prevenir desprendimientos demiotubos en desarrollo que normalmentesufren contracción espontánea.Se han utilizado como andamiosen bioreactores rotatorios perlas demicrosoporte Cytodex-3. Sin embargo,estas perlas no tienen capacidad dealargamiento. Una propuesta para elalargamiento mecánico de mioblastossería el uso de microesferas porosassensibles a estímulos elaboradas concelulosa, alginato, chitosan, o colágenoque sufren como mínimo un cambio del10% en el área superficial después depequeños cambios en la temperatura opH. Una vez que los mioblastos se hanadherido a las esferas, se pueden alargarperiódicamente. No queda claro cómola variación en el pH o temperatura, ola tensión mecánica diferencial que lacurvatura de la microesfera aplica a lascélulas podría afectar en la proliferación,info@mundolacteoycarnico.com Noviembre/Diciembre 2008 Mundo Lácteo y Cárnico 17

Tendenciasproliferación de células satelitales depavo en cultivo. Kosnik, Dennis y Vandenburghse refieren a un medio libre desuero desarrollado por Allen et a., Dollenmeieret al., y Ham et al. Benjaminsony otros consiguieron usar un mediolibre de suero elaborado de extracto demaitake (hongos) que alcanzó mayoresíndices de crecimiento que el suero fetalde bovino. Se ha demostrado quelos lípidos como espingosina 1-fosfatopuede reemplazar al suero para ayudarel crecimiento y diferenciación de tejidoembriónico de explantes (W.S. Agraves,Medical University of South Carolina,Charleston, SC; comunicación personal,Mayo 22, 2004).adhesión y desarrollo celular.Teóricamente, grandes láminas detejido muscular se podrían cultivar enmembranas delgadas o arreglos de fibrascon espacios estrechos. Las láminas sepueden condicionar mecánicamente paraun alargamiento mínimo que induzca eldesarrollo de miotubos alineados. Lasmembranas o fibras se podrían extraerde la carne (ej., usar un polímero termoresponsivo,y separar la biocapa delmúsculo del sustrato con un cambio detemperatura).O se podrían hacer de materialcomestible. Las láminas liberadas sepodrían enrollar hasta un grosor determinadoy procesarlas. Desarrollar un andamiopara carnes sin procesar es un granreto técnico porque es necesario vascularizar.Podría ser posible construir unared ramificada de material comestible,elástico y poroso por donde se circulan losnutrientes. Los mioblastos y otros tiposde células se pueden adherir a esta red.Se han sugerido propuestas para crearesta red desarrollando un molde paraesparcir una solución de colágeno o unpolímero biocompatible.Después de solidificar, el materialoriginal se disuelve dejando una redramificada de microcanales los cualesse pueden amontonar una sobre otrapara formar una red tridimensional. Sinembargo, esta propuesta no se presta auna producción en masa.Como alternativa, se podría intentarcrear una carne más estructurada sinandamio. Benjaminson, Gelchriest yLorenz propusieron resolver el problemade vascularización a través de una angiogénesiscontrolada de explantes.Medio de Cultivo y Factores deCrecimientoPara disfrutar muchas de las ventajasde la producción de carne por cultivo,será necesario emplear un medio adecuado.Dicho medio debe contener loscompuestos nutricionales necesarios ydebe presentarse de una forma librementedisponible para los mioblastos ycélulas acompañantes, ya que no estáinvolucrado ningún sistema digestivo.Mejoras en la composición de mediosde cultivo celulares comercialmente disponibleshan ayudado a que se cultivenexitosamente varios tipos de célulasanimales.McFarlan y otros desarrollaron unmedio libre de suero que ayuda a laAdemás de suministrar la nutriciónapropiada para el crecimiento de célulasmusculares en cultivo, es necesarioproporcionar un arreglo apropiado defactores de crecimiento. Los factores decrecimiento se sintetizan y liberan por lasmismas células musculares y de tejidospor otros tipos de células locales (efectosparacrinos) y no locales (efectos endocrinos).El hígado es la fuente principaldel factor de crecimiento I similar a lainsulina. Se pueden desarrollar sistemasde cocultivos apropiados de maneraque las células del hígado (hepatocitos)proporcionen los factores de crecimientonecesarios para la producción de músculocultivado (carne). Generalmente,los investigadores inician la diferenciacióny fusión de mioblastos bajandolos niveles de factores de crecimientomitogénicos. Con la proliferación decélulas entonces se comienza la síntesisdel factor de crecimiento tipo II, la cuallleva a la diferenciación y formación demiotubos multinucleados. Así, el sistemacorrecto debe ser capaz de cambiar lacomposición del factor de crecimientodel medio.BiorreactoresLa producción de carne cultivadarequiere del desarrollo de nuevos biorreactoresque mantengan un baja fuerzade corte y una perfusión uniforme en18 Mundo Lácteo y Cárnico Noviembre/Diciembre 2008 info@mundolacteoycarnico.com

grandes volúmenes. La mayoría de lainvestigación en ingeniería tisular demúsculo esquelético se ha realizado conbiorreactores rotatorios de la NASA. Susprincipales ventajas son que las célulasestán casi en suspensión continua, lafuerza de corte de fluido es mínima y esposible la suspensión para la malla detejido de hasta 1 cm. Estos biorreactorespueden sostener concentraciones debiomasa de hasta 10 8 células/ml. Losbiorreactores rotatorios para investigación(tamaño de 10 a 250 ml) se handiseñado a escala para una capacidad dehasta para 3 L y teóricamente, a escalasindustriales la física del sistema no sedebe afectar. Ya existen reactores debiopelículas de tamaños industriales debaja fuerza de corte para partículas, quepermiten concentraciones de biomasa dehasta 30 kg/m3.ConclusionesEn relación a la carne convencional,la carne cultivada podría ofrecer variosbeneficios. Con el cultivo de la carne,el índice de ácidos grasos saturados ypoliinsaturados se podría controlar; laincidencia de enfermedades se podríareducir dramáticamente; y las fuentesse podrían usar eficientemente puestoque las estructuras biológicas requeridaspara la locomoción y reproducciónno se necesitan hacer crecer. Otroargumento es si la carne cultivada seao no económicamente práctica. Se haespeculado mucho sobre los prospectosde la ingeniería tisular.El cultivo de carne, por lo menosbasado en la variedad andamio, aparentementees técnicamente viable. Sinembargo, todavía quedan muchos retosantes de que pueda producirse económicamente.La mayoría de estos retos songeneralmente comunes para la ingenieríatisular de músculo esquelético. Las indicacionesambientales necesarias parapromover el desarrollo de miofibras no secomprenden aun completamente. Y noqueda claro cuáles son esenciales para laproducción de carne cultivada. Por ahora,es seguro asumir que el nivel de funcionalidadnecesario para la mayoría delas aplicaciones clínicas de la ingenieríatisular muscular excede la necesidad deproducir carne cultivada con propiedadesnutricionales y asépticas suficientessimilares a las de la carne convencional.Por esto el cultivo de la carne debería depresentar menos retos técnicos que laingeniería funcional del sistema músculo.Futuras investigaciones podrían ser másfructíferas si se enfocaran en el desarrollode técnicas andamio apropiadaspara productos cárnicos procesados yasequibles; es necesario que se apoyenen medios sin suero.Fuente:Tissue EngineeringVolume 11, Number 5/6.Maryland, 2005.Traducción: I.A. Violeta Morales V.info@mundolacteoycarnico.com Noviembre/Diciembre 2008 Mundo Lácteo y Cárnico 19