SEBBM DIVULGACIÓN LA CIENCIA AL ALCANCE DE LA MANO

ENERO 2012Estimulación: las células sonestimuladas (normalmente entre 1-30minutos) con citoquinas o factores decrecimiento presentes en la sangre yfrente a los cuales se sospecha quelas células leucémicas tienen unarespuesta alterada. Se compara laactivación de las proteínas entrecélulas sanas y cancerígenas paraidentificar qué proteínas estánalteradas.Inhibición: las células sonincubadas con fármacos oinhibidores a dosis óptimas (o bien adosis crecientes para determinar laconcentración óptima) durante 30-60minutos o incluso 24, 48 ó 72 horaspara determinar el efecto de losinhibidores para bloquear laactivación de las proteínas que sesospechan responsables de convertirla célula en célula leucémica. Estopermite estudiar el efecto defármacos y agentesquimioterapéuticos in vitro antes deusarlos en pacientes.Identificación de las células deinterés mediante citometría deflujo: las células poseen distintosreceptores (marcadores desuperficie) según sean célulasmadres, progenitoras, linfoides,mieloides… algunos específicos decélulas cancerígenas. Paraidentificar las células de interés, lasmuestras celulares se incuban conanticuerpos unidos a fluoróforos (queemiten luz al ser estimulados conláser) que reconocen dichosmarcadores y se analizan porcitometría de flujo. Las células ensuspensión en tubos sonintroducidas en el citómetro a flujosde hasta 10.000 células/segundo.Ahí son excitadas una a una porhasta cuatro láseres de distinta λ(azul, rojo, violeta, ultravioleta) yunos sensores cuantifican la luzemitida por cada fluoróforo así comoel tamaño y complejidad de cadacélula.Análisis de proteínasintracelulares a nivel de célulaúnica mediante citometríamultiparamétrica: hasta aquíllegaba la citometría convencional,pero la citometría multiparamétricaimplementada por el grupo del Dr.Nolan, permite no sólo analizar lacomposición celular de una muestrasino también fijar y permeabilizar lascélulas para introducir anticuerposque reconozcan las proteínas,incluso en su estado fosforilado (esdecir, activado). Cada anticuerpoanti-proteína o anti-fosfoproteínaestá también unido a un fluoróforodistinto. Así, en total se puedenanalizar entre 8 y 18 proteínas(superficiales e intracelulares) porcélula en muestras heterogéneas,limitado sólo por la solapación de losespectros de emisión de losfluoróforos (5-6).Un avance revolucionario ha sido elpublicado en el 2011 por el grupodel Dr. Tanner en colaboración conel Dr. Nolan implementando laCitometría de masas (CyTOF) quesustituye a los fluoróforos por tierrasraras (lantánidos) que solucionaneste problema y que permitencombinar hasta 35 coloressimultáneamente (7-8).En conclusión, ahora cada vez quese descubre una nueva mutacióngénica, se puede investigar el efectode dicha mutación en una o variasproteínas, y en una o variaspoblaciones celulares de muestrasde pacientes y estudiar su respuestade inhibición selectiva por fármacosa nivel de célula única. Parece quese tienen ahora los medios paracomprender la biología del cáncer.¡Queda por ver si ésta es la décadaen la que por fin comprendamos elefecto de las distintas mutaciones enlas funciones que gobiernan unacélula para permitirla crecer,multiplicarse, dividirse, diferenciarseo morir!Referencias1) Saiki, Gelfand, Stoffel, Scharf, Higuchi, Horn,Mullis and Erlich. Primer-directed enzymaticamplification of DNA with a thermostable DNApolymerase Science 29: 1988, Vol. 239 no. 4839pp. 487-491.2)http://en.wikipedia.org/wiki/Human_Genome_Project3) Mardis, Ding, Dooling and Ley. Recurringmutations found by sequencing an acute myeloidleukemia genome Nat. Eng J Med., Sep 10; 2009,361(11):1058-66.4) Irish JM, Hovland R, Krutzik PO, Perez OD,Bruserud Ø, Gjertsen BT, Nolan GP. Single cellprofiling of potentiated phospho-protein networksin cancer cells. Cell. Jul 23; 2004, 118(2): 217-28.5) Sachs, Perez, Pe'er, Lauffenburger and Nolan,Causal Protein-Signaling Networks Derived fromMultiparameter Single-Cell Data. Science 22April 2005.6) Kotecha N, Flores NJ, Irish JM, Simonds EF,Sakai DS, Archambeault S, Diaz-Flores E, CoramM, Shannon KM, Nolan GP, Loh ML. Single-cellprofiling identifies aberrant STAT5 activation inmyeloid malignancies with specific clinical andbiologic correlates. Cancer Cell. 2008 Oct7;14(4):335-43.7) Bendall SC, Simonds EF, Qiu P, Krutzik PO,Sachs K, Pe'er D, Tanner SD, Nolan GP. Singlecellmass cytometry of differential immune anddrug responses across a human hematopoieticcontinuum. Science. 2011 May 6;332 (6030):687-96.8) Qiu P, Simonds EF, Bendall SC, Gibbs KD Jr,Bruggner RV, Linderman MD, Sachs K, NolanGP, Plevritis SK. Extracting a cellular hierarchyfrom high-dimensional cytometry data withSPADE. Nat Biotechnol. 2011 Oct 2;29(10):886-91.Figura. Muestras de sangre o demédula ósea obtenidas de pacientesson incubadas con anticuerposmarcados con fluoróforos o conlantánidos. Las muestras sonentonces analizadas mediante A)citometría de flujo multiparamétricarepresentando los datos mediantehistogramas o bien mapas de calor(heatmaps) o bien mediante B)citometría demasas (CyTOF).Los niveles deproteínas son enambos casosmedidos a nivelde célula únicaensubpoblacionescelulares.SEBBM DIVULGACIÓN