SEBBM DIVULGACIÓN LA CIENCIA AL ALCANCE DE LA MANO

ENERO 2012SEBBM DIVULGACIÓNLA CIENCIA AL ALCANCE DE LA MANOCitometría multiparamétrica y de masas: tecnología láser en buscade células madre leucémicasErnesto Díaz-FloresUniversidad de California, San FranciscoBiografíaErnesto Díaz-Flores se licenció enBioquímica por la UniversidadComplutense de Madrid en el año1998. Realizó sus estudios dedoctorado bajo la dirección de la Dra.Isabel Mérida en el Centro Nacionalde Biotecnología estudiando el papelde las lípido-kinasas en la activaciónde linfocitos. Se doctoró en BiologíaMolecular por la UniversidadAutónoma de Madrid en el año 2003.Tras recibir su doctorado se trasladóa Estados Unidos para incorporarseal grupo del Dr. Kevin Shannon de laUniversidad de California SanFrancisco para estudiar el papel deloncogen K-Ras en las leucemiasmieloides agudas. En el año 2006recibió el premio al JovenInvestigador (Young InvestigatorAward) por parte de la Children’sTumor Foundation. Actualmentetrabaja en el grupo de la Dra. MignonLoh como científico especialistabuscando nuevas terapias para lasleucemias linfoides B hipodiploidesagudas, las cuales no responden aningún tratamiento de quimioterapia.http://www.sebbm.es/HEMEROTECA:http://www.sebbm.es/ES/divulgacionciencia-para-todos_10/la-ciencia-alalcance-de-la-mano-articulos-dedivulgacion_29ResumenEl sistema hematopoiéticocontiene un grupo heterogéneo desubpoblaciones celulares. Laalteración de una o variasproteínas es suficiente para queuna sola célula proliferedescontroladamentetransformándose en leucemia. Eladvenimiento en los últimos añosde la citometría de flujomultiparamétrica y de masas hasido clave para identificaralteraciones en las proteínas anivel de célula única.SummaryThe hematopoietic systemcontains a heterogeneous Groupof cellular subpopulations.Alterations in one or severalproteins is enough for a single cellto trigger uncontrolledproliferation resulting in leukemia.The advent in recent years ofmultiparametric flow cytometryand mass cytometry has been keyto identify protein alterations at asingle cell level.En la década de los 80 Kary Mullisrevolucionó el mundo de lasecuenciación genética con sudesarrollo de la actual PCRpermitiendo incluso amplificarpicogramos de ADN (1). Los 90vieron nacer el “Human GenomeProject” que culminó en el 2004 conla secuenciación completa del primergenoma humano (2). Era el primerpaso para entender las claves de labiología y el desarrollo humanos.Cuatro años más tarde, el Dr. TimLey publicó la secuencia génica deuna paciente con leucemia mieloideaguda. Un trabajo pionero yfascinante de un año entero quecostó un millón de dólares y con elque se esperaba identificar todas lasmutaciones que hasta entonceshabían conseguido burlar lasmejores técnicas de secuenciación(3). Sin embargo no se encontraronmuchas más mutaciones de las yaconocidas y eso rebajó las ilusionespuestas en la secuenciación. Sehabía encontrado el arca perdidapero ahí no estaba el santo grial.Seguíamos sin saber las claves de lavida y también de la muerte, en estecaso por leucemia.Recordemos, sin embargo, que losgenes sólo encierran la informaciónpara producir proteínas que son lasque en realidad controlan lasfunciones celulares y por tanto de losseres vivos. Es imprescindible, portanto, conocer cómo las mutacionesafectan las funciones proteicas enpequeñas poblaciones celularesgenerando una leucemia, algo querequiere del campo de la bioquímica.Hasta el segundo milenio lastécnicas bioquímicas requeríancantidades elevadas de células paraanalizar el contenido proteico en lascélulas y su activación. En el año2004, un trabajo del laboratorio delDr. Garry Nolan publicado en Cellmostraba la capacidad de analizarproteínas a nivel de célula únicausando citometría de flujo (4). Seabría así una nueva era en el campode la bioquímica.El concepto es sencillo: obtenermuestras de un paciente con célulassanas y leucémicas, bien de sangreo de médula ósea e identificar lascélulas con una función alterada.SEBBM DIVULGACIÓN

ENERO 2012Estimulación: las células sonestimuladas (normalmente entre 1-30minutos) con citoquinas o factores decrecimiento presentes en la sangre yfrente a los cuales se sospecha quelas células leucémicas tienen unarespuesta alterada. Se compara laactivación de las proteínas entrecélulas sanas y cancerígenas paraidentificar qué proteínas estánalteradas.Inhibición: las células sonincubadas con fármacos oinhibidores a dosis óptimas (o bien adosis crecientes para determinar laconcentración óptima) durante 30-60minutos o incluso 24, 48 ó 72 horaspara determinar el efecto de losinhibidores para bloquear laactivación de las proteínas que sesospechan responsables de convertirla célula en célula leucémica. Estopermite estudiar el efecto defármacos y agentesquimioterapéuticos in vitro antes deusarlos en pacientes.Identificación de las células deinterés mediante citometría deflujo: las células poseen distintosreceptores (marcadores desuperficie) según sean célulasmadres, progenitoras, linfoides,mieloides… algunos específicos decélulas cancerígenas. Paraidentificar las células de interés, lasmuestras celulares se incuban conanticuerpos unidos a fluoróforos (queemiten luz al ser estimulados conláser) que reconocen dichosmarcadores y se analizan porcitometría de flujo. Las células ensuspensión en tubos sonintroducidas en el citómetro a flujosde hasta 10.000 células/segundo.Ahí son excitadas una a una porhasta cuatro láseres de distinta λ(azul, rojo, violeta, ultravioleta) yunos sensores cuantifican la luzemitida por cada fluoróforo así comoel tamaño y complejidad de cadacélula.Análisis de proteínasintracelulares a nivel de célulaúnica mediante citometríamultiparamétrica: hasta aquíllegaba la citometría convencional,pero la citometría multiparamétricaimplementada por el grupo del Dr.Nolan, permite no sólo analizar lacomposición celular de una muestrasino también fijar y permeabilizar lascélulas para introducir anticuerposque reconozcan las proteínas,incluso en su estado fosforilado (esdecir, activado). Cada anticuerpoanti-proteína o anti-fosfoproteínaestá también unido a un fluoróforodistinto. Así, en total se puedenanalizar entre 8 y 18 proteínas(superficiales e intracelulares) porcélula en muestras heterogéneas,limitado sólo por la solapación de losespectros de emisión de losfluoróforos (5-6).Un avance revolucionario ha sido elpublicado en el 2011 por el grupodel Dr. Tanner en colaboración conel Dr. Nolan implementando laCitometría de masas (CyTOF) quesustituye a los fluoróforos por tierrasraras (lantánidos) que solucionaneste problema y que permitencombinar hasta 35 coloressimultáneamente (7-8).En conclusión, ahora cada vez quese descubre una nueva mutacióngénica, se puede investigar el efectode dicha mutación en una o variasproteínas, y en una o variaspoblaciones celulares de muestrasde pacientes y estudiar su respuestade inhibición selectiva por fármacosa nivel de célula única. Parece quese tienen ahora los medios paracomprender la biología del cáncer.¡Queda por ver si ésta es la décadaen la que por fin comprendamos elefecto de las distintas mutaciones enlas funciones que gobiernan unacélula para permitirla crecer,multiplicarse, dividirse, diferenciarseo morir!Referencias1) Saiki, Gelfand, Stoffel, Scharf, Higuchi, Horn,Mullis and Erlich. Primer-directed enzymaticamplification of DNA with a thermostable DNApolymerase Science 29: 1988, Vol. 239 no. 4839pp. 487-491.2)http://en.wikipedia.org/wiki/Human_Genome_Project3) Mardis, Ding, Dooling and Ley. Recurringmutations found by sequencing an acute myeloidleukemia genome Nat. Eng J Med., Sep 10; 2009,361(11):1058-66.4) Irish JM, Hovland R, Krutzik PO, Perez OD,Bruserud Ø, Gjertsen BT, Nolan GP. Single cellprofiling of potentiated phospho-protein networksin cancer cells. Cell. Jul 23; 2004, 118(2): 217-28.5) Sachs, Perez, Pe'er, Lauffenburger and Nolan,Causal Protein-Signaling Networks Derived fromMultiparameter Single-Cell Data. Science 22April 2005.6) Kotecha N, Flores NJ, Irish JM, Simonds EF,Sakai DS, Archambeault S, Diaz-Flores E, CoramM, Shannon KM, Nolan GP, Loh ML. Single-cellprofiling identifies aberrant STAT5 activation inmyeloid malignancies with specific clinical andbiologic correlates. Cancer Cell. 2008 Oct7;14(4):335-43.7) Bendall SC, Simonds EF, Qiu P, Krutzik PO,Sachs K, Pe'er D, Tanner SD, Nolan GP. Singlecellmass cytometry of differential immune anddrug responses across a human hematopoieticcontinuum. Science. 2011 May 6;332 (6030):687-96.8) Qiu P, Simonds EF, Bendall SC, Gibbs KD Jr,Bruggner RV, Linderman MD, Sachs K, NolanGP, Plevritis SK. Extracting a cellular hierarchyfrom high-dimensional cytometry data withSPADE. Nat Biotechnol. 2011 Oct 2;29(10):886-91.Figura. Muestras de sangre o demédula ósea obtenidas de pacientesson incubadas con anticuerposmarcados con fluoróforos o conlantánidos. Las muestras sonentonces analizadas mediante A)citometría de flujo multiparamétricarepresentando los datos mediantehistogramas o bien mapas de calor(heatmaps) o bien mediante B)citometría demasas (CyTOF).Los niveles deproteínas son enambos casosmedidos a nivelde célula únicaensubpoblacionescelulares.SEBBM DIVULGACIÓN