ESTUDIO EXPERIMENTAL DEL EFECTO ... - BVS - INS

Table of ContentsTITLEPAGEGeneral Information ................................................... -1-1Specifications ......................................................... 2.1Dimensions and Clearances ........................................... -3-1Assembly Torques and Special Tools ................................... -4-1Engine Troubleshooting ............................................... -5-1Oil System ............................................................ 6.1Fuel System .......................................................... -7-1Ignition and Battery Charging ........................................... 8.1Starting System ........................................................ 9.1Engine Disassembly .................................................. 10-1iii

ESTUDIO EXPERIMENTAL DEL EFECTO INMUNOMODULADOR DEL EXTRACTO HIDROALCOHÓLICO DECAPSICUM ANNUNM SOBRE LA ARTRITIS INDUCIDA EN RATASpilot did not demonstrate significant changes in the levels of TNF - αwith regard. Conclusions:The purification and identification of the active beginning hidroalcohólico, anti-inflammatory. tothe (capsaicina) of the extract hidroalcohólico, because the rats Sprague-Dawley did notdevelop completely the induction for colágeno the arthritis rheumatoid (AR) is necessary toobtain rats with capable vine-stocks (AR), rats specifically with vine-stocks LEWIS.Key word: Capsicum annuum L., hidroalcohólico, antiinflammatory extract.INTRODUCCIÓNLas plantas con acción medicinal son popularmente utilizadas debido a sus propiedadestradicionalmente atribuidas, los cuales han mostrado validez científica de alguna de suspropiedades tradicionales atribuidas.El ají de trueno (Capsicum Annuum), familia Solanacea, de la Selva de Bagua, su principalprincipio activo capsaicina (8-metil-N-vanilil-6-nonenamida; C 18 H 27 NO 3 ), sustancia quepertenece a la familia de los vaniloides, grupo de sustancias con actividad irritante natural(Wekh J M, Simon S A, Reinhart P H. 2000; 97(25):13889-13894) (Johnston J J, Goldade D A,Chipman R B 2002; 21:1109-1112.), ocasiona la pungencia y es capaz de irritar cualquier tejidocon el que se ponga en contacto. Se ha encontrado que la capsaicina es capaz de reducir la"sustancia P", un químico que lleva los mensajes de dolor desde las terminales nerviosas de lapiel al sistema nervioso central. Las investigaciones clínicas han demostrado que el 75 % delos pacientes a los que se ha aplicado crema de capsaicina en sus zonas enfermasexperimentaron una disminución sustancial del dolor, con solo una ocasional sensación dequemadura. Por esta propiedad está siendo investigado el uso de la capsaicina en otrosproblemas de la piel que ocasionan dolor, (Keville, 1992: 57-58).En el Perú se aconseja el consumo en las comidas por sus efectos digestivos, colagogos ycarminativos. Para aprovechar las propiedades analgésicas y rubefacientes, el fruto y lassemillas deben ser macerados en alcohol de 70%, y el líquido resultante se debe aplicar comolinimento en las zonas del cuerpo afectadas (Palacios Vaccaro 1992: 4).Externamente se usa como revulsivo en pomadas y linimentos contra los dolores reumáticos ylas neuralgias.

ESTUDIO EXPERIMENTAL DEL EFECTO INMUNOMODULADOR DEL EXTRACTO HIDROALCOHÓLICO DECAPSICUM ANNUNM SOBRE LA ARTRITIS INDUCIDA EN RATASOBJETIVOSObjetivos Generales:Identificar y aislar del extracto hidroalcohólico de Capsicum annum.Determinar el efecto inmunomodulador de un extracto hidroalcohólico de Capsicumannum en la artritis inducida por colágeno en ratas.Objetivos específicos:Presentar evidencias para considerar la evaluación del uso de esta planta medicinalCapsicum annum (Ají de trueno) como tratamiento alternativo en la AR en humanos. Medir los niveles de Factor de Necrosis Tumoral tipo alfa como indicador del efectoinhibidor de la respuesta inflamatoria inducida por el extracto hidroalcohólico deCapsicum annumMATERIAL Y MÉTODOSPreparación de la muestra y extracto hidroalcoholicoLa muestra de Capsicum Annuum (ají de trueno) se recolecto en la zona de Bagua Chica, setransporto la planta completa a la ciudad de Lima, la cual fue llevada al Museo de la HistoriaNatural de UNMSM, para ser identificada taxonómicamente, mediante la Constancia Nº 079-USM-02 DE LA Universidad Nacional Mayor de San Marcos, MUSEO DE HISTORIANATURAL. (anexo 1)Así mismo se colecto frutos de la planta las cuales fueron desinfectadas, secadas y preparadaspara la obtención del extracto hidroalcoholico.Se pulverizo la muestra y luego se peso 50 g agregando 500 mL de Etanol durante 24 horas enagitación constante.Para la comprobación de la presencia de alcaloides se ha desarrollado ensayos de coloración yde precipitación; con la reacción a los reactivos deDragendorf, Mayer, Warner. (Olga lockUgaz 1994:5-7)

ESTUDIO EXPERIMENTAL DEL EFECTO INMUNOMODULADOR DEL EXTRACTO HIDROALCOHÓLICO DECAPSICUM ANNUNM SOBRE LA ARTRITIS INDUCIDA EN RATASMarcha fotoquímica preliminarMuestra seca molida2-3 gExtracto+ 20 mL etanolcalentar de 5-10 minutos a ebulliciónfiltrar+ 1 gota de HClAlcaloidesPositivo al reactivo de DragendorfPositivo al reactivo de MayerPositivo al reactivo de WagnerTRATAMIENTO DEL ESTANDAR DE CAPSAICINALa capsaicina fue obtenida de SIGMA-ALDRICH St. Louis Mo, USA, M-2028;con un grado depureza mínima de 97%. Se preparó una solución stock (0,1 mg/mL) usando como diluyenteetanol.‣ AISLAMIENTO DE CAPSAICINA100 g de semillas pulverizadas son agitadas con 200ml de éter de petróleo a temperaturaambiente por 24 horas. Se filtra y el sólido es lavado con 25 ml de éter de petróleo.Se obtiene una solución de color rojo el cual es diluido con el triple de volumen de éter.Posteriormente se adiciona100 ml hidróxido de potasio al 30% en metanol la mezcla esagitada por 8 horas. Las phytoxantinas libres son disueltas en éter: La fase etérea es lavadadespués con agua y secada con sulfato de sodio anhidro y concentrada a un volumen de 20 mlbajo presión reducida a 45 ºC en un rotavapor.El residuo etéreo es diluido con 60 ml de éter de petróleo y dejado en refrigeración por 24 h. Lacapsaicina es filtrada y recristalizada con pequeñas cantidades de metanol.La purificación de capsaicina que a menudo se obtiene acompañada de otros componentes(Zeaxantina, capsorubina etc)

ESTUDIO EXPERIMENTAL DEL EFECTO INMUNOMODULADOR DEL EXTRACTO HIDROALCOHÓLICO DECAPSICUM ANNUNM SOBRE LA ARTRITIS INDUCIDA EN RATASANIMALES DE EXPERIMENTACIÓNRatas hembras Sprague-Dawley de 3 meses de edad, con peso entre 150 – 200 g seobtuvieron del bioterio de la Universidad Peruana Cayetano Heredia. El bioterio mantienelíneas de ratas con parámetros estándar en cuanto a su reproducción y característicasadecuadas de mantenimiento de la línea. Los animales fueron alimentados con alimentobalanceado y agua ad libitum.TOMA DE MUESTRASe realizó la toma de muestra a dos ratas para lo cual se tuvo que anestesiarlas.La toma de muestra se realizó por punción intra-orbital.Se obtuvo muestras de suero de ambas ratas.Realización del ensayo de ELISASe utilizó el kit Rat TNF-αELISA de BD Biosciences, el cual se basa en el inmunoensayoasociado a una encima de tipo “sándwich”que determina la presencia de la citokina TNF- α.El ensayo se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante y todo el ensayo duroaproximadamente 6 horas.Las lecturas se realizaron con equipo de la Sección Inmunología –UPCH.RESULTADOSPreparación del extracto hidroalcoholico:El extracto de Capsicum obtenida tenia el aspecto de un liquido transparente de coloranaranjado rojizo de olor fuerte característico, sabor picante ardiente.Por cromatografía de capa delgada se obtuvo el perfil del extracto comparándolo con elestándar, el color azul y el valor del Rf de la mancha principal obtenida a partir de la solución deprueba corresponde a la propiedad de la mancha principal obtenida a partirde la solucionestándar. (USP 28 2005:336)

ESTUDIO EXPERIMENTAL DEL EFECTO INMUNOMODULADOR DEL EXTRACTO HIDROALCOHÓLICO DECAPSICUM ANNUNM SOBRE LA ARTRITIS INDUCIDA EN RATASEn la tabla 1 se muestran los resultados de las corridas de la cromatografícas en los diferentesextractos estudiados en relación con el estándar.Tabla 1. Índices medidos a los diferentes extractos de extractos de C. annuumLa intensidad y el valor Rf de lamancha principal obtenida de laNª demuestraExtractos R f Mancha azulsolución prueba corresponden alos obtenidos en la soluciónestándar (USP 28 2005:336)1 Estándar 0,73 + Corresponde2 Alcaloides oxindólicos 0,74 + Corresponde3 Capsaicina aislada 0,73 + Corresponde4 n-hexano --- - No se evidencia5 Diclorometano 0,73 + Corresponde6 Metanol 0,73 + Corresponde7 Agua destilada --- - No se evidenciaEn las fig. 1 se presentan los perfiles cromatográficos obtenidos en las diferentes condiciones y se relacionan los intervalos devalores de Rf y el color para cada una de las bandas detectadas como a continuación se describe detallan.Estándar Diclorometano Metanol Alcaloides Purificada

ESTUDIO EXPERIMENTAL DEL EFECTO INMUNOMODULADOR DEL EXTRACTO HIDROALCOHÓLICO DECAPSICUM ANNUNM SOBRE LA ARTRITIS INDUCIDA EN RATASDatos y Resultados del ensayo de ELISADisposición de estándares y muestras:1 2 3A Blanco ST1 (2000 pg/ml) RT1*B ST1 (2000 pg/ml) ST2 (1000 pg/ml) RT2*C ST2 (1000 pg/ml) ST3 ( 500 pg/ml) RT2*D ST3 ( 500 pg/ml) ST4 ( 250 pg/ml) RT1E ST4 ( 250 pg/ml) ST5 ( 125 pg/ml) RT1F ST5 ( 125 pg/ml) ST6 ( 62,5 pg/ml) RT2G ST6 ( 62,5 pg/ml) ST7 ( 31,3 pg/ml) RT2H ST7 ( 31,3 pg/ml) RT1* RT1Donde: ST1-7 : Estándares (Concentración TNF-)RT1 : Rata con Artritis Inducida por ColágenoRT2 : Rata con Artritis Inducida por Adyuvante Completo de Freund* : Sueros que presentaron hemólisisLecturas a 450 nm en unidades de Densidad Óptica (DO):1 2 3A 0,227 1,710 0,218B 1,875 1,011 0,225C 0,995 0,648 0,271D 0,105 0,433 0,234E 0,485 0,357 0,226F 0,360 0,326 0,187G 0,309 0,284 0,201H 0,235 0,197 0,216Lecturas Corregidas con el Blanco:1 2 3A 0 1,483 -0,009*B 1,648 0,784 -0,002*C 0,768 0,421 0,044D -0,122* 0,206 0,007E 0,258 0,130 -0,001*F 0,133 0,099 -0,040G 0,082 0,057 -0,026H 0,008* -0,030 -0,011** Estos valores no se tomaron en cuenta por presentar error o contaminación.Curva estándarElaborada a partir del promedio de las lecturas de los 7 estándares. Gráfica de regresión linear utilizando logaritmos.Concentración Estándar D.O. a 450 nm(pg/ml)2000 1,5661000 0,776500 0,421250 0,232125 0,13262,5 0,09131,3 0,057

ESTUDIO EXPERIMENTAL DEL EFECTO INMUNOMODULADOR DEL EXTRACTO HIDROALCOHÓLICO DECAPSICUM ANNUNM SOBRE LA ARTRITIS INDUCIDA EN RATASEcuación de la curva: DO = -2,486 + 0,793(Conc. TNF-en pg/ml)ELISA para T NF -alfa en s uero d e RatasW = Logt en(Y), Z = Lo gten(X)W = -2. 48589 + 0. 792977 ZR -S q = 99. 1 %1 .5 0Y (DO 450 nm1 .0 00 .8 00 .6 00 .4 00 .3 00 .2 00 .1 50 .1 00 .0 80 .0 630 40 6 0 8 0 1 00 1 5 0 20 0 3 00 4 0 0 60 0 8 0 01 0 00 1 50 0 2 00 0X (T NF pg/mlMuestra D.O. (450 nm) Conc. TNF- α(pg/ml)RT1* -0,030 3,91RT2* 0,044 3.19RT1 0,007 3,14RT2 -0,040 3,08INMUNIZACION DE RATA (CEPA SPRAGUE-DAWLEY) CON COLAGENO TIPO II DE POLLO

ESTUDIO EXPERIMENTAL DEL EFECTO INMUNOMODULADOR DEL EXTRACTO HIDROALCOHÓLICO DECAPSICUM ANNUNM SOBRE LA ARTRITIS INDUCIDA EN RATASMEDICION DEL ESPESOR DE LA PATA DE LA RATACONCLUSIONES1. Los kits para la determinación de TNF en ratas indican que los niveles de dicha citokina sonmuy bajos estando por debajo de la mínima concentración de estándar.2. Debido a que los sueros presentaron hemólisis es muy probable que esta haya contribuido alpoco nivel encontrado de la citokina TNF-αen las muestras.3. Se deben tener en cuenta los errores de pipeteo y de material incorrectamente esterilizado.4. En el caso de las ratas con Artritis Inducida por Colágeno, estas todavía no han concluido suproceso de inducción por lo que también es probable que esta sea la causa del bajo nivel deTNF-α.5. Se volverá a repetir el ensayo en aproximadamente 10 –15 días para dar tiempo a que losanimales se recuperen del traumatizante proceso de toma de muestra.6. Se utilizará la vía por punción cardiaca en vez de la ocular, ya que esta presenta problemasde coagulación y no permite obtener el volumen adecuado de la muestra.

ESTUDIO EXPERIMENTAL DEL EFECTO INMUNOMODULADOR DEL EXTRACTO HIDROALCOHÓLICO DECAPSICUM ANNUNM SOBRE LA ARTRITIS INDUCIDA EN RATASRECOMENDACIONESAnte la dificultad de la adquisición de las ratas cepas lewis, y para cumplir con el objetivosolicitamos una adenda, donde planteamos el uso de un modelo in vitro en el que se usaranCélulas Mononucleares de Sangre Periférica (CMSP) humanas para que sean cultivadas,tratadas con el mismo principio activo del Capsicum annum, capsaicina y luego estimuladascon Liposacaridos (LPS), el cual es un potente inductor de producción TNF-alfa para luegoevaluar cual fue el efecto inmunomodulador de capsaicina sobre los niveles de citokinas, consu respectivo presupuesto (excluyendo la compra de las ratas), dicha Adenda fue aprobadamediante MEMORANDO Nº 675-2004-DG-OGITT-OPD/INS (09-12-2004), pero a la fecha nose han comprado los materiales solicitados.Para el cumplimiento de dicho trabajo es necesario contar con el material solicitado.ANEXO 1

ESTUDIO EXPERIMENTAL DEL EFECTO INMUNOMODULADOR DEL EXTRACTO HIDROALCOHÓLICO DECAPSICUM ANNUNM SOBRE LA ARTRITIS INDUCIDA EN RATASREFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS1. Wekh J M, Simon S A, Reinhart P H. The activation mechanism of rat vanilloid receptor 1 bycapsaicine involves the pore domain and differs from the activation by either acid or heat.Neurobiology 2000; 97(25):13889-13894.2. Johnston J J, Goldade D A, Chipman R B. Capsaicine migration through maple sap collectiontubing. Crop Protection 2002; 21:1109-1112.3. Keville, Kathi. The Illustrated Herb Encyclopedia . New York: Mallard Press, 1992;http://www.ucv.ve/cenamb/siamaz/SPT-TCA-PER-28.pdf4. Palacios Baccaro, Julio. Plantas Medicinales Nativas del Perú I Lima: CONCYTEC, 1993;http://www.ucv.ve/cenamb/siamaz/SPT-TCA-PER-28.pdf.5. CAPÍTULO XIII TRATAMIENTO FARMACOLÓGICO DEL DOLOR Dra. C. Busquets JuliàServicio de Anestesiología. Unidad de Dolor.Hospital Universitario de Girona “Dr. JosepTrueta” Dra. M.ª V. Ribera Canudas Servicio de Anestesiología. Unidad de Dolor. HospitalUniversitario Vall d’Hebron. Barcelona Pág 149,http://64.233.179.104/search?q=cache:x6WJjlP5hWcJ6. Berg L, Lampa J, Rogberg S, van Vollenhoven R and Klareskog L. 2001. Increased peripheralT cell reactivity to microbial antigens and collagen type II in rheumatoid arthritis after treatmentwith soluble TNF αreceptors. Ann Rheum Dis; 60 133-139.7. Gotlieb D. 2001. Enbrel / Etanercept by drdoc on-line. www.arthritis.co.za/Default.htm8. Aguilar J, Rojas P, Marcelo A, Plaza A, Bauer R, Reininger E, Cristoph A K and Merfort I.2002. Anti-inflammatory activity of two different extracts of Uncaria tomentosa (Rubiaceae).Journal of Ethnopharmacology 00(2002) 1- 6. Article in press.www.elsevier.com/locate/jethpharm9. Dallel R y Pelissier T. Capsaicina: Propiedades farmacológicas y terapéuticas. Año 8 Nº34.Artículo on-line de la Asociación Chilena para el Estudio del Dolor. Marzo2001.www.ached.cl/html/revista/articulo1.htm10. USP 28, NF 23, THE UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2005:33611. Olga Lock de Ugaz, Investigacion Fitoquimica, Metodos en el estudio de productos 1994:5-7.12. Coligan J E. Current protocols in immunology. John Wiley and Sons, Inc. Vol.1. 2002.