Método para el Estudio de la Disolución de Cálculos Renales ... - CBI

Método para el Estudio de la Disolución de Cálculos RenalesUsando Microscopía de Fuerza Atómica (AFM)Mario Alberto Ramírez 1 , Miguel Cadena 1 , Sergio Ureta 2 y Nikola Batina 31 Universidad Autónoma Metropolitana / Departamento de Ingeniería Eléctrica, Centro de Investigación enInstrumentación e Imagenología Médica, México D.F., México2 Hospital Español / Servicio de Urología, México D.F., México3 Universidad Autónoma Metropolitana / Departamento de Química, Laboratorio de Nanotecnología e IngenieríaMolecular, México D.F., MéxicoIntroducción. El propósito de este trabajo es desarrollar una nuevametodología para evaluar, a escala nanométrica, la eficiencia de diferentessustancias sobre el proceso de disolución de los cálculos renales, y de estamanera poder desarrollar tratamientos efectivos y no-invasivos para la litiasisrenal.Material y métodos. Se preparó una muestra de aproximadamente 5.6 x 2.4 x2 mm de un cálculo renal extraído quirúrgicamente para someterlo a un estudiode la topografía de su superficie mediante la técnica microscopía de fuerzaatómica (AFM). Se utilizó el microscopio Nanoscope IV, AFM (DI, USA), delcual se obtuvieron imágenes de la superficie de la muestra del cálculo renal.Primero sin tratamiento alguno sobre el mismo y después de aplicarle durantediferentes tiempos una solución de prueba de 3x10 -3 M de un medicamentocomercial usado contra la litiasis renal. La microscopía AFM se aplicó en modointermitente y las imágenes obtenidas fueron de una superficie deaproximadamente 1µm 2 .Resultados. Las imágenes se analizaron cuantitativamente buscando loscambios en la rugosidad de la superficie y el tamaño de las partículas queforman el cálculo renal. Se determinó el efecto de disolución de la sustancia deprueba mediante la cuantificación estadística en la generación de hoyosprofundos y la fragmentación de partículas en la superficie del cálculo.Conclusiones. Se determinó que el efecto de la sustancia de prueba aplana yfragmenta las partículas de la superficie del cálculo renal. Por lo tanto, sedeterminó que le método utilizado si es eficaz para cuantificar el efecto dedisolución para diferentes sustancias de prueba. Sin embargo, aun se requierepruebas extensivas in vitro para corroborar estadísticamente la bondad delmétodo.

Metodología a para el Estudio de la Disolución n de Cálculos CRenalesUsando Microscopía a de Fuerza Atómica (AFM)Mario Alberto Ramírez 1,3 , Miguel Cadena 1 , Sergio Ureta 2 y Nikola Batina 31 Universidad Autónoma Metropolitana / Departamento de Ingeniería Eléctrica, Centro de Investigación en Instrumentación e Imagenología Médica,México D.F., México2 Hospital Español / Servicio de Urología, México D.F., México3 Universidad Autónoma Metropolitana / Departamento de Química, Laboratorio de Nanotecnología e Ingeniería Molecular, México D.F., MéxicoINTRODUCCIÓNUn cálculo renal se puede formar cuando la orina esta muy concentrada conalgunas sales inorgánicas como el oxalato de calcio o algunas sustanciasorgánicas como el ácido úrico; pero en la actualidad los fenómenos deformación y disolución de los cálculos renales no se entiendencompletamente y es importante estudiarlos para poder desarrollartratamientos que sean efectivos y no-invasivos para la litiasis renal. Elpropósito de este trabajo, es desarrollar una metodología innovadorautilizando el microscopio de fuerza atómica (AFM), para estudiar a escalananométrica, el efecto de disolución que algunas sustancias omedicamentos tienen sobre la superficie de los cálculos renales. Se decidióprobar esta herramienta de nanotecnología debido a que las imágenes quese obtienen son en tres dimensiones y por lo mismo se pueden realizarestudios de rugosidad de la superficie.Figura 3. Imágenes de la superficie del cálculo renal antes del tratamientocon Alopurinol. Izquierda, Imagen de altura 3D de AFM; derecha, Imagen defase.PREPARACIÓN N DE LA MUESTRAPara preparar la muestra y poderla someter a la técnica de microscopía defuerza atómica (debido a las especificaciones del microscopio), se cortó unpedazo del cálculo extraído a manera de rebanada (dimensionesaproximadas 5.6 x 2.4 x 2 mm), se montó en resina epóxica dejando libre lasuperficie externa del cálculo y se colocó en un disco porta-muestras delmicroscopio AFM; tal como se muestra en la figura 1. Es importante resaltarque la superficie de la muestra no fue pulida (alterada), con la finalidad deevitar modificar de alguna manera su superficie durante su preparación.Figura 4. Imágenes de la superficie del cálculo renal después de 1 hr y 20min de tratamiento con Alopurinol. Izquierda, Imagen de altura 3D de AFM;derecha, Imagen de fase.Figura 1. Fotografías: Izquierda, un cálculo renal; derecha, una muestra delcálculo montada para su estudio en AFM. Ambas imágenes muestran lacomparación con una moneda de 1 peso mexicano.OBTENCIÓN N DE IMÁGENES DE LA SUPERFICIE DELCÁLCULO RENAL UTILIZANDO MICROSCOPÍA A AFMSe utilizó un microscopio Nanoscope VI (DI, USA). La microscopía AFM seaplicó en modo de contacto intermitente (tapping mode), y se obtuvieronimágenes de altura y de fase de un área aproximada de 1_m 2 .El tratamiento no se aplicó in vitro dentro del microscopio, pero se marcó lazona de estudio de la superficie del cálculo renal, tomándole imágenesópticas con un sistema de video de alta resolución (ver figura 2).Figura 5. Imágenes de la superficie del cálculo renal después de 64 hr detratamiento con Alopurinol. Izquierda, Imagen de altura 3D de AFM; derecha,Imagen de fase.Tabla 1. Resultados de análisis de rugosidad de la superficie del cálculo renaly diámetro de partículasTiempo de aplicación n deltratamiento conAlopurinol al cálculocrenal.R q (RMS)(nm)R máx(nm)Intervalo dediámetros delmayor número ndepartículas de lasuperficie (nm)Sin tratamiento62.291335.6840 – 1001hr 20min97.743655.4135 – 100Figura 2. Imagen de la superficie del cálculo renal y la punta de AFM (Tamaño:540 x 400µm) que muestra la zona de la superficie que será estudiada.64 hrs56.364306.5213 – 50TRATAMIENTO DEL CÁLCULO CRENAL Y RESULTADOSPrimero se obtuvieron las imágenes de la superficie sin tratamiento (figura3). Después se sumergió la muestra del cálculo renal durante 1 hr y 20 minen una solución de 3x10 -3 M de un medicamento a base de Alopurinol y seobtuvieron las imágenes superficiales de la figura 4; y por último se sacaronlas imágenes de superficie de la figura 5 después de que la muestra fueratratada con la solución de Alopurinol durante 64 hr.Se procesaron las imágenes de AFM para obtener la rugosidad de lasuperficie y el tamaño de las partículas que la forman (tabla 1). De acuerdoa estos resultados se cree que el primer efecto del Alopurinol, es lageneración de hoyos profundos en la superficie del cálculo; y al pasar eltiempo de exposición, la sustancia aplana y fragmenta las partículas con lasque tiene contacto.CONCLUSIÓN N Y DISCUSIÓNSe observó que el microscopio de fuerza atómica es una herramienta muyútil para el estudio de la disolución de los cálculos renales, ya que pudimoscuantificar el efecto de la sustancia de prueba y determinar que aplana yfragmenta las partículas de la superficie de la piedra. Por lo tanto, lametodología desarrollada y aplicada por primera vez, tiene el potencial deconvertirse en un estudio eficaz para cuantificar el efecto de disolución queocasionan diferentes sustancias de prueba y a partir de estos datos,identificar los mecanismos de disolución de las piedras de riñón. Elsiguiente paso a seguir, es aplicar el medicamento sin sacar la muestra delmicroscopio para darle seguimiento continuo al efecto de disolución que seproduce y realizar pruebas extensivas in vitro para corroborarestadísticamente la bondad del método. Los resultados obtenidos nos danuna gran confianza para desarrollar un sistema modelo de evaluación demedicamentos, que sería de gran interés para la industria farmacéutica.RECONOCIMIENTOSAgradecemos la beca de estudios de maestría al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT).