UNIVERSIDAD INTERNACIONAL DE ANDALUCÍA - Justicia Forense

MESA REDONDAACTUACION EN EL ESCENARIO DEL CRIMEN. POLICIA JUDICIAL.LA INSPECCION OCULAR: BUSQUEDA Y RECOGIDA DE INDICIOS.LA VICTIMA. EL AGRESOR.MARIANO PERELLÓ RIUSLaboratorio Biología/ADN de la Brigada Provincial de Policía Científica dela Jefatura Superior de Policía de Andalucía Occidental.INTRODUCCION: LA POLICIA CIENTIFICASe enuncia cual es la misión asignada a las unidades de PolicíaCientífica dentro de la estructura básica de la Dirección General de la Policíaasí como las funciones desarrolladas por las mismas en la práctica habitual.Breve explicación de cómo se incardina la actuación de la PolicíaCientífica en la investigación policial de un hecho delictivo.LA INSPECCION OCULAR TECNICO-POLICIAL: OBJETIVO, FASES YMEDIOSDefinición genérica de la Inspección Ocular Técnico-Policial y suconcreción dentro del campo de actuación de la Biología Forense.Antes de proceder a la Inspección Ocular propiamente dicha, espreceptiva la realización de unas Actuaciones previas que abarcan tanto laasistencia a la víctima como el aislamiento de la zona.La Inspección Ocular tiene un triple objetivo: Comprobar la realidad deldelito y servir de base a la investigación (saber que hecho delictivo haocurrido), Evidenciar los medios empleados (como se ha producido el delito)e Identificar a los autores.La investigación pericial de los indicios en general, y de los biológicos enparticular, consta de tres etapas:- Búsqueda en la escena del delito.- Recogida y envío al Laboratorio de los indicios.- Investigación analítica de los mismos.Es de capital importancia señalar que el resultado final de “la prueba delADN” va a depender en gran medida de la correcta ejecución de los procesos

de recogida y envío de muestras al laboratorio; y además, la admisibilidad dedicha prueba en los Tribunales de Justicia también vendrá condicionada por elcumplimiento de la cadena de custodia.En cuanto a los medios que habitualmente se emplean en el examen dellugar de los hechos, a efectos de la búsqueda y recogida de indicios biológicospodemos englobarlos en dos apartados:- Medios que facilitan la búsqueda y localización de los indicios(reactivos químicos y equipos de iluminación).- Medios empleados para la recogida de muestras (maletines deInspecciones Oculares y Kits de recogida).BUSQUEDA DE INDICIOS BIOLOGICOSComo introducción se enumeraran cuales son los indicios biológicos másfrecuentes en los Laboratorios Forenses.La metodología a seguir en la búsqueda vendrá condicionada por lascircunstancias particulares de cada caso en concreto; si bien es muyconveniente efectuar una interpretación “in situ” de los indicios antes demanipular nada, ya que una correcta valoración de los mismos exige su estudiodentro del contexto del lugar en que se ha producido el delito.La búsqueda en sí debe de ser minuciosa, ordenada y sistemática,extremando las precauciones para no pasar por alto algún indicio o destruirloinadvertidamente; siendo muy recomendable seguir los métodos de dividir laescena en cuadrículas, que se irán examinando sucesivamente, o bien encírculos concéntricos, tomando como centro el lugar que consideremos másimportante, por ejemplo, la ubicación del cadáver.En cualquier caso, antes de proceder a la recogida, se debe documentarla localización de todos los indicios biológicos que se vayan a recoger medianteesquemas, fotografías o vídeo, lo cual nos podrá servir para poder plantear unahipótesis sobre los hechos.En cuanto a los lugares de búsqueda, vendrán condicionados por lascircunstancias particulares de cada caso en concreto. A título de ejemplo, se

describirá como se procedería en los casos más comunes (lugar cerrado,abierto, vehículos, víctima y agresor).RECOGIDA DE INDICIOS BIOLOGICOSDurante el proceso de recogida es muy conveniente adoptar una seriede precauciones que abarcan un doble ámbito: La protección del personalencargado de la recogida y la protección de las muestras (esta última paraevitar distintos procesos que puedan afectar a su integridad, fundamentalmentela posible contaminación de las mismas).Como complemento a la práctica de la Inspección Ocular, en muchoscasos se efectúa la toma de las denominadas muestras de referencia oindubitadas, que serían aquellas de las que sabemos de qué personaproceden (víctima, sospechoso, cadáver) para su cotejo con las evidenciasrecogidas en el lugar del delito (muestras dubitadas).En lo referente a la recogida de indicios biológicos en el lugar de loshechos, se enumerarán las normas básicas a seguir para efectuar una correctarecogida de los indicios, con ejemplos de la casuística mas frecuente (manchasen soportes pequeños y de fácil transporte, en soportes no transportables,soportes absorbentes y no absorbentes, indicios húmedos, líquidos, pelos, etc.)

MESA REDONDAACTUACIÓN EN EL ESCENARIO DEL CRIMEN. POLICÍA JUDICIAL.INSPECCIÓN OCULAR: BÚSQUEDA Y RECOGIDA DE INDICIOSLA VÍCTIMA. EL AGRESORFÉLIX SÁNCHEZ UGENADirector del Instituto de Medicina Legal de Badajoz.La existencia de una persona fallecida en condiciones extrañas o deforma violenta, supone un acontecimiento desde el punto de vista Policial yJudicial que pone en marcha un dispositivo específico encaminado a esclarecerlas causas y circunstancias de ese fallecimiento.Entre las actuaciones previstas está la práctica de la autopsia MédicoLegal, conforme a lo establecido en la Ley de Enjuiciamiento Criminal (Art. 343)La autopsia judicial no se limita al examen interno del cadáver comopodría pensarse, sino que comprende una serie de pasos bien diferenciados yde gran trascendencia cada uno de ellos, a saber:- Inspección ocular y levantamiento del cadáver.- Examen externo y examen interno del cadáver.- Pruebas y estudios de laboratorio complementarios.EL LEVANTAMIENTO DEL CADÁVERSe trata de una actuación judicial por la que se constituye en el lugar delos hechos la Comisión Judicial, formada por el Juez, el Secretario, el MédicoForense y el Agente Judicial. Una vez practicada, el Juez ordena elLEVANTAMIENTO DEL CADÁVER y su traslado al lugar donde vaya arealizarse la autopsia.La diligencia de inspección ocular y levantamiento del cadáver es deextraordinario interés médico forense ya que como dice el profesor Gisbert unexamen a la ligera del cadáver en el lugar de los hechos puede invalidar yhacer ineficaz la más minuciosa y perfecta de las autopsias.En primer lugar, se trata de proceder al examen del cuerpo paracomprobar la realidad de la muerte, el momento estimado del fallecimiento y elposible origen (natural o violento) de la misma. A continuación habrá que

ecoger aquellos datos e indicios que nos permitan la posibilidad de reconstruirlos hechos, una aproximación a la causa, circunstancias de la muerte y laposible intervención de terceros.Para ello se tomará nota de los siguientes datos: posición del cuerpo yrelaciones con el entorno, examen somero de las ropas, apreciación delesiones de forma general, búsqueda y recogida de indicios biológicos y nobiológicos y cualquier otra circunstancia de interés. Es fundamental apoyar larecogida de estos elementos con croquis, esquemas, fotografías o videos.Ciñéndonos al tema que nos ocupa es evidente que en el estudiobiológico forense de un determinado caso nosotros somos el primer eslabón dela cadena. De nada sirve un extraordinario laboratorio, con los mejoresrecursos humanos y materiales, sí el médico forense no sabe que indiciosbuscar, como los tiene que recoger y conservar y enviar y que tiene quesolicitar al laboratorio.VESTIGIOS DE INTERÉS MÉDICO LEGALBIOLÓGICOSNO BIOLÓGICOS- Sangre - Ropas- Semen - Balas, tacos, perdigones- Restos - Fibras diversas.- Tejidos - Restos de pintura- Uñas - Fragmentos de vidrio- Mordeduras / saliva - Tierra-Otros- OtrosCONSERVACIÓN DE LOS VESTIGIOSA.- DURANTE EL TRASLADO- Evitar pérdidas y contaminaciones.- Proteger las manos- Envolver el cuerpo.B.- EN EL DEPÓSITO- Mínima manipulación.- No retirar envoltorio.- No desnudar ni lavar.- No obtener la necrorreseña.

RECUPERACIÓN DE LOS VESTIGIOSI.- EXAMEN CUIDADOSO DEL CUERPO- Búsqueda de elementos adheridos en ropa / piel.- Toma de muestras de sangre.- Toma de muestras de uñas- Toma de muestra de boca / ano / vagina.II.- RECOGIDA DE VESTIGIOS BIOLÓGICOSIII.- RECOGIDA DE VESTIGIOS NO BIOLÓGICOSRECONOCIMIENTO Y RECOGIDA DE MUESTRAS DEL POSIBLE AUTORINSPECCIÓN GENERAL. Encaminada a la búsqueda de lesiones o signos delucha o defensa, que puedan orientarse hacia su participación en los hechos.RECOGIDAS DE INDICIOS.• Ropas que llevaba en el momento de la agresión.• Muestras de pelos: cabellos, barba, bigote, vello púbico...• Muestras de sangre y/o saliva.• Hisopo lavado de glande.OTROS PROBLEMAS MÉDICO LEGALES QUE NOS PUEDE RESOLVERLA BIOLOGÍA FORENSE− INVESTIGACIÓN BIOLÓGICA DEL PARENTESCO.− INDIVIDUALIZACIÓN DE RESTOS HUMANOS.− IDENTIFICACIÓN DE RESTOS ÓSEOS.− ESTUDIO BIOLÓGICOS DE LA MUERTE POR SUMERSIÓN.

ENVÍO DE MUESTRAS AL LABORATORIO FORENSEVICTORIA PRIETO RUIZ-CANELAFacultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología yCiencias Forenses. Departamento de SevillaEl estado actual de las técnicas de identificación genética hace posible elanálisis de cantidades trazas de restos biológicos y la convierten en unaherramienta imprescindible en la investigación de vestigios biológicos deinterés forense. Desde una colilla dejada en el lugar del crimen, un pelo o unosescasos restos epiteliales restantes en unas uñas tras un arañazo son hoyvaliosas “pruebas” que pueden por si solas arrojar la información suficientepara identificar a un sospechoso.Sin embargo, paralelamente al aumento de sensibilidad en las técnicasde detección de ADN, ha crecido el riesgo de contaminaciones exógenas de lasque puede derivarse el fracaso de la investigación. Además, una mala praxisen la toma de muestras o el incumplimiento de la cadena de custodia puedeincurrir en la invalidación de la prueba ante los Tribunales.Conscientes de estos riesgos, se han realizado desde hace tiempomuchos esfuerzos encaminados a mejorar las condiciones de recogida deindicios, su preservación y envío al laboratorio, como son la elaboración derecomendaciones y normas para la recogida de muestras, diseño de protocolosde actuación en su recogida y formularios que permitan sintetizar toda lainformación referente a una muestra concreta.En el año 1996, el Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses(INTCF) elaboró unas “Normas para la preparación y remisión de muestrasobjeto de análisis por el Instituto de Toxicología”, que se publicaron en el BOEnº 308 de 23 de diciembre de 1996 (Orden de 8 de noviembre de 1996) quecontiene, entre otros apartados, información sobre el tipo de muestras quedeben estudiarse, cómo deben enviarse y los formularios que debencumplimentarse cuando se solicitan análisis genéticos. Estas normas se

encuentran hoy en revisión para adaptarlas a las nuevas técnicas y se esperasu pronta publicación en el BOE.Por otro lado, dentro del GEP-ISFG (Grupo Español y Portugués de laSociedad Internacional de Genética Forense) se elaboró un documento de“Recomendaciones para la recogida y envío de muestras con fines deidentificación genética” en el año 1999, cuya misión es la de difundir buenaspracticas en la toma y manejo de muestras que permitan garantizar laautenticidad e integridad de las mismas, así como asegurar el cumplimiento dela cadena de custodia. Este documento se aprobó en la reunión del GEP-ISFGdel 2000 y fue publicado por el Ministerio de Justicia en el 2001 y difundidoentre todos los Médicos Forenses del Estado.No existe aún en España una normativa oficial para la recogida demuestras, aunque esperamos que se derive de actuales proyectos tales comolos de la ley de bases de datos de ADN y los procesos de acreditación de loslaboratorios forenses.Entre los puntos más importantes que observaremos en relación con elenvío de muestras al laboratorio forense destacaremos las precaucionesdestinadas a la protección del personal, las precauciones destinadas a laprotección de las muestras, la documentación necesaria y la toma de muestras.1. Precauciones destinadas a la protección del personal.En la manipulación de evidencias biológicas será necesario tomarprecauciones universales asumiendo que cualquier muestra puede serinfecciosa: uso de guantes, mascarilla, bata u otra ropa protectora; prohibicióndel consumo de bebidas, comidas y tabaco; uso de material desechablesiempre que sea posible y uso de contenedores específicos para residuosbiológicos; vacunación del personal (hepatitis, tétanos, etc.).2. Precauciones destinadas a la protección de las muestras.Todo lo expuesto anteriormente tiene cabida también en cuanto a laprotección de la muestra, que debe ser protegida tanto de la contaminaciónbiológica por otro material genético ajeno al de la evidencia como de ladegradación por una incorrecta manipulación de la misma.

La prevención de contaminaciones biológicas de la muestra debecontemplarse en todos los estadíos de recogida, procesado previo y análisis delas muestras y en este sentido la primera regla de oro a observar será: Nunca,bajo ninguna circunstancia, se permitirá al sospechoso ocupar el mismo áreade la víctima (o viceversa) hasta que todas las evidencias se hayan recogido.Esto incluye vehículos, salas de espera, salas de interrogatorio, etc. La mismaregla cuenta para el envío de muestras dubitadas e indubitadas que jamásdeben compartir el mismo embalaje, e incluso en el laboratorio durante elalicuotado y procesado de las muestras debe observarse una separaciónespacial y temporal entre evidencias y muestras indubitadas.Además, deben preservarse las evidencias de la exposición a condicionesmedioambientales adversas que podrían favorecer la proliferación microbiana,utilizar embalajes de papel con preferencia al plástico y nunca añadirconservantes del tipo del formol.3. Documentación necesaria.- Formularios de envío de muestras en casos de interés criminal y deinvestigación de la paternidad, especificando el tipo de estudio solicitado.- Datos de identificación de la muestra.- Cadena de custodia: nombre y firma del personal que recoge la muestra,fecha y hora, y condiciones de almacenamiento hasta su envío. Fecha deenvío y medio de transporte utilizado.- Documentos adicionales: informe preliminar de autopsia, antecedentesclínicos, fotografías de la localización de los indicios, etc.4. Toma de muestras.- Muestras de referencia en personas vivas: sangre, saliva, pelos.- Muestras de referencia en cadáveres: sangre, saliva, pelos.- Muestras de referencia en cadáveres en avanzado estado de putrefaccióno esqueletizados: dientes, hueso largo.- Otras posibles muestras de referencia: biopsias, preparacioneshistológicas, objetos personales del fallecido.... .- Indicios biológicos: recoger en función de la naturaleza del indicio y delsoporte sobre el que se presenta. Empaquetar cada indicio por separado.

CRITERIOS DE ORGANIZACIÓN Y CALIDADPILAR SANZ NICOLÁSDirectora de Departamento de Sevilla del Instituto Nacional de Toxicologíay Ciencias Forenses.El Laboratorio Forense reúne una serie de requisitos que lo hacen muydiferente de otros tipos a los que estamos más acostumbrados como son los decentros de investigación, universitarios o incluso los de algunas empresas.Estos requisitos se refieren al propio tipo de trabajo, que por ser judicialestá sujeto a absoluta confidencialidad. El perito también tiene que reunir unaserie de requisitos, independientemente de su preparación técnica, y no puedeparticipar en una pericia si existen relaciones de parentesco, consanguíneo ode afinidad, o amistad o enemistad, con el acusado o la víctima, tampoco sitiene algún tipo de interés en la causa judicial. Y por último una de lasdiferencias más importantes en el trabajo pericial lo constituyen las propiasmuestras, sobre todo en los casos criminales.Por tratarse de pruebas para el esclarecimiento de un delito, se lesdenomina vestigios, suelen ser únicas, las más de las veces irrepetibles (salvolas muestras de referencia que se toman a un acusado o a una víctima viva),son limitadas y muy frecuentemente muy escasas, sobre todo desde quedisponemos de la tecnología del ADN y podemos analizar muestras mínimas.Todo ello exige por parte del experimentador (facultativo o auxiliar delaboratorio) altas dosis de cuidado y responsabilidad. Pero además, comonecesariamente tienen que estar perfectamente autentificadas, es obligatorioconservar al menos una parte para futuros análisis y muchos de los objetos sontambién piezas de convicción que hay que aportar al momento del juicio (unarma, unas ropas), es necesario tener rigurosamente establecida y controladala cadena de custodia.

La cadena de custodia no debe presentar ni una sola discontinuidad;debe en todo momento estar documentada la localización exacta de lasmuestras originales, de las muestras de análisis, sus alícuotas y extractos.Esta custodia abarca desde la entrega al Centro por el transportista, la entregaal laboratorio, la conservación hasta el momento del análisis y durante elmismo y la custodia postanálisis hasta la devolución de las muestras originalesal Juzgado cuando procede o su destrucción. Todos los cambios de ubicacióno de mano deben estar registrados y los posibles envíos al exteriordocumentados (devoluciones al Juzgado o envío a otros Laboratorios paraampliación de análisis).El informe escrito está también estipulado y la LEC exige que conste unadescripción detallada de las muestras y de su estado, una relación detallada delos análisis y de los resultados. Esto y la necesaria rigurosidad de los estudioshace que se disponga de protocolos normalizados de trabajo para todas lasoperaciones del laboratorio, de hojas de recogida de datos en los que seconsignan todas las circunstancias de cada ensayo y sus resultados y queestos estén contrastados por los dos peritos que firman el informe. Ellaboratorio forense debe estar por tanto sometido a medidas de control de lacalidad basadas en la norma internacional ISO17025 y a la larga tendrá queestar acreditado.Por último y como ya se ha dicho al comentar la necesidad de conservaruna parte de las muestras originales, las pruebas periciales pueden estarsometidas a contraanálisis por otros peritos, para confirmar resultados noaceptados por alguna de las partes (acusación o defensa). Por ese motivo ypara que los análisis puedan ser comparativos, los laboratorios forenses debenutilizar Métodos Normalizados Oficiales desarrollados por Centros deReferencia y regirse por normativas de carácter internacional. En el caso de laGenética Forense estas normas las dicta la Sociedad Internacional de GenéticaForense a los que todos los miembros de los laboratorios de Biología Forensede España pertenecemos. Para revalidar la calidad de nuestras periciasrealizamos además controles de calidad internos y ejercicios anualesinterlaboratorios.

TIPOS DE ESTUDIOS EN UN LABORATORIO DE BIOLOGÍA FORENSEVICTORIA PRIETO RUIZ-CANELAFacultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología yCiencias Forenses. Departamento de SevillaSi nos dejásemos llevar por nuestra imaginación, uno pensaría que nohay nada imposible para un laboratorio de biología, en este caso forense, yesto es porque la visión que la sociedad recibe de la biología moderna sueleser a menudo una simplificación llena de falsedades procedentes delsensacionalismo periodístico y de la ciencia-ficción. A pesar de los avancestecnológicos, aún quedan cuestiones por resolver, tales como la data exacta deuna mancha, por ejemplo. Los tipos de estudios solicitados másfrecuentemente en un laboratorio de biología forense son:Estudios de filiación: el caso más simple sería la investigaciónbiológica de la paternidad o maternidad en un trío hijo-madre-padre o biencontando únicamente con el progenitor cuestionado y el hijo. Lascomplicaciones aparecen cuando no es posible contar con el progenitorcuestionado por fallecimiento, siendo necesario en tal caso recurrir al análisisde otras muestras biológicas del fallecido, al análisis de familiares directos deéste que permitan reconstruir su genotipo o incluso a la exhumación delcadáver.Estudios de identificación de restos cadavéricos: se realiza medianteel análisis biológico de maternidad o paternidad o en su defecto análisis deotros familiares que compartan la línea materna o paterna. También puederecurrirse al análisis de otras muestras biológicas del fallecido o de objetospersonales del mismo.Identificación de indicios biológicos de interés criminal: son el tipode análisis más solicitado en el laboratorio de biología forense. Todos losindicios recogidos sobre la víctima, el sospechoso o el lugar de los hechosdeben ser objeto de un minucioso y exhaustivo estudio que permita localizar,conocer o confirmar la naturaleza de los indicios, que variaran en función de las

características del suceso investigado. Los vestigios biológicos más frecuentesson los restos de sangre, fluidos seminales, fluidos vaginales, saliva, pelos yrestos orgánicos en uñas. Otro tipo de restos biológicos menos frecuentes sonla orina, las heces, la caspa, las uñas... . En el próximo tema de este cursotendremos ocasión de conocer en detalle cuales son los métodos de detecciónde estos indicios en función de sus características, los tipos de soporte másfrecuentes sobre los que se encuentran así como sus posibilidades deindividualización.Identificación de especie: determinados restos hallados casualmentepueden ser indicios de hechos delictivos que puedan ser causa para abrir unainvestigación. La solicitud de identificación de especie suele ir frecuentementeligada al hallazgo de restos óseos muy fragmentados o cualquier otro restoorgánico del que pueda sospecharse un origen humano.Estudios complementarios en casos de muerte por sumersiónasfixia:siempre que se recupera un cadáver del agua o cuando se sospechaque la causa de la muerte puede haber sido la sumersión, será necesarioconfirmar los datos macroscópicos obtenidos en la autopsia mediante estudioanatomopatológico y considerar otros datos tales como la existencia dehidremia ( hemodilución de la sangre del ventrículo izquierdo respecto de la delderecho) y la existencia de elementos formes en las vísceras del cadáver quedeben compararse, siempre que sea posible, con las del líquido de sumersión.Estudios bioquímicos en casos de muertes súbitas eintoxicaciones: En casos de shock anafiláctico, los marcadores biológicos quese investigan son la histamina, la triptasa y la IgE total y la específica. En casosde muerte súbita interesa la determinación de glucosa, urea, creatinina ycloruros. En casos de intoxicación por organofosforados y carbamatos seprocederá a la determinación de acetilcolinesterasas y/o pseudocolinesterasas.Identificación de setas y plantas superiores en casos deintoxicación: cuando se sospecha una intoxicación debida a setas o plantastóxicas es necesario la identificación del elemento tóxico para confirmar si es elresponsable de los síntomas observados. La confirmación del origen de laintoxicación servirá para adecuar el tratamiento médico al tóxico concreto en

función de su naturaleza. A tal fin, deben enviarse al laboratorio losespecimenes completos responsables de la intoxicación, si se cuenta con ellos,o restos cocinados o de contenido gástrico. Es posible identificar restos desetas en contenido gástrico o en otras muestras utilizando técnicas de ADN,como veremos a lo largo de este curso.Estudios microbiológicos en muestras postmortem en casos deetiología no aclarada: en el caso concreto del INTCF se realizan únicamenteen el Departamento de Madrid y su finalidad es intentar arrojar algo de luz enaquellos casos de muertes de etiología desconocida en los que se sospeche unorigen infeccioso. Si durante el curso de la investigación se detecta algúnpatógeno de reconocida alarma social tal como el meningococo, encolaboración con otros centros de referencia se procederá a informar a laconsejería de salud correspondiente y a la puesta en marcha de losdispositivos de control epidemiológico.Estudio del contenido gástrico: en algunos casos, conocer el estadode la digestión así como la naturaleza de la última comida puede aportar datosen una investigación. A menudo, la integridad de los fragmentos de alimentohallados en un contenido gástrico podría indicar un período corto de digestión,sin embargo, este dato no puede correlacionarse con una ingesta inmediata almomento de la muerte ya que pueden confluir muchos factores que hacen estacorrelación muy inexacta. Los estados emocionales del individuo así como lapropia naturaleza de los alimentos influyen en el tiempo de digestión ypermanencia de los alimentos en el estómago.

IDENTIFICACIÓN DE INDICIOSVICTORIA PRIETO RUIZ-CANELAFacultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología yCiencias Forenses. Departamento de SevillaLos tipos de indicios más comúnmente estudiados en el laboratorio debiología forense son los restos de sangre, semen, fluidos vaginales, saliva ypelos, que se presentan sobre una amplia variedad de soportes. Casi todostienen en común que son escasos, están degradados o contaminados y sonúnicos e irrepetibles. La localización de una determinada evidencia de asiste amenudo con el uso de una fuente de luz forense que nos permite la utilizaciónde diversas longitudes de onda y diversos filtros para detectar la fluorescenciatípica de los fluidos orgánicos. En nuestro laboratorio contamos con una deestas fuentes (MCS-400 de Spex Forensics) basadas en el uso de distintosfiltros, que han ido reemplazando a las fuentes laser por sus ventajas en elcampo forense. Tras ser localizado, realizaremos una serie de pruebaspreliminares, específicas para cada tipo de indicio, con las que estableceremosel diagnóstico de orientación o de certeza sobre la naturaleza del indicio.Sangre: es un tipo de indicio fácilmente reconocible sobre determinadossoportes. Existe una amplia variedad de tests de diagnóstico previo que ponende relieve su presencia (luminol, benzidina, fenolftaleina, o-toloidina, guayacol,verde leucomalaquita...). Los tipos de soporte más comunes sobre los que sepresenta son ropas, armas, uñas, en el lugar de los hechos (tierra, suelo,piedras, paredes..). El estudio de la morfología de las manchas en la escenadel delito proporciona información a cerca de cómo se produjeron los hechos.Semen: el principal componente celular del semen es elespermatozoide, célula especializada flagelada que suele medir entre 50 y 55µm, distinguiéndose básicamente dos partes: cabeza y cola. Su número puedevariar entre 50 x 10 6 y 150 x 10 6 por mililitro de eyaculado, con una media deunos 100 x 10 6 /ml en individuos normospermos. El volumen de eyaculadotambién varía entre unos 2 ml y 6 ml con un valor medio de unos 3,5 ml. Existe

una gran variabilidad en estos datos no sólo entre individuos, sino tambiéndentro del mismo individuo según la edad o entre distintos eyaculados. Ademásde los espermatozoides, en el semen podemos encontrar otros elementosformes tales como leucocitos y células epiteliales del tracto urinario aunque ennúmero mucho menor. Así, si en un individuo normospermo podemos esperarunos 450 µg de ADN/ml de eyaculado, en un individuo azoospérmicoesperaremos unos 30 µg, esto es, sólo un 6,3% del normal.Otros rasgos característicos del semen son su pH básico (8,3) y sucapacidad de fluorescer en la región visible del espectro cuando es irradiadocon luz ultravioleta. La presencia característica de altas concentraciones defosfatasa ácida y de una proteína específica (proteína P30 ó PSA) serán rasgosque se utilicen en el diagnóstico previo ( test presuntivos) en la investigación derestos de semen. Las técnicas de confirmación implican la observación deespermatozoides en preparaciones microscópicas realizadas a partir de lasmuestras a analizar.Fluidos vaginales: las células del epitelio vaginal sintetizan glucógenobajo la acción de los estrógenos. La identificación de estos restos se basa enesta particularidad (Reacción de PAS (+) Periodic Acid-Schiff) así como en lapresencia de flora bacteriana característica (bacilos de Döderlein). Sinembargo, este carácter glucogenogénico está ausente en mujeresamenárquicas (aunque las terapias con estrógenos pueden afectar esto) ysufre variaciones durante el ciclo menstrual, alcanzándose los niveles másaltos de glucógeno durante la ovulación. Estas células no son exclusivas delepitelio vaginal ya que se encuentran también en menor cantidad en la boca yen el tracto uretral de hombres (en concreto en la fosa navicular). Por tanto, elhallazgo de unas pocas células puede ser comprometido, hecho que se da aveces cuando se solicita la localización de células procedentes del epiteliovaginal en un hisopo penil.Saliva: a menudo estos restos se hallan en cantidades mínimas, por loque es comprometido decidir entre la identificación del tipo de vestigio o laobtención del perfil de ADN. Los humanos producimos entre 1 y 1,5 litros desaliva al día y, acompañando a la saliva, se encuentran las célulasdescamadas del epitelio bucal que serán el sustrato para la extracción de ADN

en estos restos. Las pruebas de orientación se basan en la detección deactividad alfa-amilasa. Esta enzima no es específica de la saliva, se encuentratambién en el páncreas, en el sudor, en la leche materna, en el semen y en losfluidos vaginales. Puede considerarse un buen marcador para la presencia desaliva ya que sus niveles son 50 veces más altos en saliva que en el resto defluidos orgánicos. Las amilasas se encuentran también en animales (tipo alfaamilasas)y en plantas (tipo beta-amilasas). Para la confirmación de presenciade restos de saliva deberán observarse células del epitelio bucal en losextractos de las muestras. Los soportes más comunes son colillas, sellos,sobres, mordazas, mordeduras, manchas en ropas, chicles, vasos... .Pelos: en los mamíferos, el pelo atraviesa tres fases en su ciclo decrecimiento, anágena, catágena y telógena. La fase anágena es la fase decrecimiento activo del pelo, en ella las células del folículo se multiplican pormitosis y forman el pelo al queratinizarse completamente. Un cabello humanocrece a un ritmo aproximado de 0.35 mm por día. La fase catágena es unatransición entre el estado de crecimiento activo y el estado de no crecimiento.En la fase telógena, ha cesado la actividad del folículo.Una cabeza humana tiene aproximadamente entre 100.000 y 150.000folículos pilosos, de los cuales entre el 80 y el 90% estarán en fase anágena yentre el 10 y el 20% en fase catágena o telógena. En nuestra actividad diaria,los humanos perdemos entre 50 y 100 pelos. A menudo un perito esconsultado sobre la cuestión de sí un determinado pelo hallado en la escena deun crimen puede haber sido arrancado o simplemente cayó allí. Si el pelo fuearrancado por la fuerza muy probablemente quedará tejido folicular adherido ala base del pelo, sin embargo es posible arrancar pelos que estuviesen en fasetelógena o que no cuenten con ningún tejido adherido a la base. Por tanto, laausencia de tejido folicular no prueba necesariamente que el pelo fuese caído yno arrancado. A diferencia de los cabellos, los pelos púbicos pasan más tiempoen fase telógena que en anágena. La mayoría de los pelos que encontraremosen casos de agresión sexual serán telógenos. De entre todas las evidencias,los pelos son los más susceptibles de transferencias secundarias.

Restos en uñas: una excoriación leve en la piel, cuyas señalesdesaparezcan a las 24 horas, puede dejar restos epidérmicos en las uñassuficientes para obtener un perfil de ADN por PCR.Un estudio realizado entre voluntarios que se produjeron excoriacionesleves y superficiales que desaparecieron dentro de las 24 horas posteriores alexperimento concluyó que: los dedos índice y medio producen los arañazosmás largos y profundos; a igual fuerza aplicada, en los arañazos sobreregiones de piel más suave tales como el cuello o zona superior del brazo serecuperaron restos epidérmicos pero no así en zonas de piel muy curtidascomo el antebrazo; se encontró una correlación entre la fuerza aplicada y lacantidad de ADN recuperado.Otros tipos de indicios menos frecuentes en el laboratorio: a vecesse solicita al laboratorio el análisis de restos que, aunque no son habituales,pueden aportar datos importantes a la investigación de un caso determinado.Entre estos restos podemos citar:Restos de orina: La identificación de la orina se basa en la detección deiones o compuestos orgánicos que se hallan más concentrados en orina que enotros fluidos fisiológicos, tales como la urea o creatinina, también presentes ensudor, sangre, saliva, semen... pero en menor concentración. Contiene célulasepiteliales del tracto urinario, así como leucocitos y eritrocitos, muy diluidas enla orina, por lo que la esperanza de recuperar ADN a partir de manchas deorina es muy baja. Además, la flora bacteriana propia de la orina acelera losprocesos de degradación en la muestra.Heces: La identificación de restos fecales se basa en la presencia depigmentos biliares y de restos alimenticios no digeridos. Son un pésimosustrato para la extracción de ADN. No es posible el estudio de ADN nuclear enestos restos debido a la extrema degradación y a su contaminación natural(aproximadamente la tercera parte del peso seco de las heces son bacterias).Sin embargo, si se han conseguido resultados en ADN mitocondrial, enconcreto la región HV1, partiendo de 10 mg de heces frescas.Otros restos también analizados en el laboratorio son secrecionesnasales, uñas, restos de tejido, caspa...

TECNOLOGÍA DEL ADN EN EL PROCESADO DE MUESTRAS FORENSESMANUEL LÓPEZ SOTOFacultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología yCiencias Forenses. Departamento de Sevilla.De todas las partes que comprende una investigación criminal, ésta quea continuación desarrollaremos, pondrá de manifiesto la capacidad pericial yprofesional del laboratorio de biología forense. De forma general y una vez quetenemos seleccionadas las muestras objeto de análisis, todo el procesoanalítico se puede dividir en tres grandes bloques: EXTRACCIÓN de ADN,AMPLIFICACIÓN (PCR) y DETECCIÓN.Extracción de ADNPosiblemente, de los tres bloques citados anteriormente, la extracciónconstituya el paso más crítico, ya que cualquier manipulación errónea de lamuestra en esta etapa inicial del proceso puede conducirnos a su descarte,siendo en algunos casos, el único indicio biológico de que se dispone pararesolver un delito.Cualquier laboratorio forense debe contar con diferentes métodos deextracción que permitan obtener en cantidad y calidad suficiente ADN de laenorme variabilidad muestral que recibe. Los métodos de extracción se puedendividir en tres grupos:a) Aquel que comprende una digestión, una extracción orgánica y unapurificación-concentración o, como alternativa, una precipitación conetanol. Se utiliza para la mayoría de las muestras biológicas deinterés forense.b) Aquel que comprende una etapa de digestión seguida de unaprecipitación con etanol. Se usa, principalmente, para obtener muchacantidad de ADN a partir de sangre en buen estado.

c) Aquel que comprende solo una extracción directa mediantemembranas especiales o bolas de sílice o similares. Su uso se limitanormalmente a muestras de sangre líquida.Centrándonos en el primer método de extracción, y en concreto en ladigestión lo que se consigue con ella es romper toda la estructura celular, esdecir, se alteran todos los sistemas membranosos de la célula así como todaslas estructuras en las que estén implicadas proteínas (nucleosomas,citoesqueleto celular, etc.), dejando el ADN libre. Para ello, se utiliza untampón de lisis con detergente (SDS) para solubilizar los lípidos y una enzimaproteolítica (Proteinasa K) para lisar las proteínas.Una vez que se encuentran todos los componentes celulares libres entresí, pasamos al proceso de extracción propiamente dicho, donde se recuperaráel ADN de todo ese “caldo molecular”. El método más extendido de todos es elde extracción orgánica con fenol cloroformo isoamílico (FCI). Al mezclar estasolución de FCI con el lisado celular obtenido de la etapa de digestión segenera una emulsión, que después de un centrifugado, permitirá separar elADN de todo el material celular, aunque a veces junto con el ADN se separenotras moléculas que ser una fuente potencial de inhibidotes para el proceso deamplificación. Seguidamente, se añade N-butanol para eliminar los posiblesrestos de fenol que pudieran haber quedado en la solución acuosa. Acontinuación, esta solución acuosa se pasa por unidades de microfiltraciónpurificaciónpara obtener un ADN lo más “limpio” posible, óptimo para elproceso de amplificación. Alternativamente a esta última etapa podremos llevara cabo una precipitación con etanol.Como ejemplo de métodos de extracción directa expondremos laextracción con Chelex y con columnas GFx, entre otros.Por último, realizaremos un recorrido por los distintos tipos de muestrasque llegan al laboratorio y por los métodos de extracción que se aconsejaaplicar en cada caso. Además, se abordará brevemente la cuantificación delADN humano y sus diferentes métodos.

Amplificación de ADNSin lugar a dudas, posiblemente el desarrollo de esta tecnología de laReacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y su aplicación a la biologíamolecular ha permitido que este campo de la ciencia se haya desarrollado a unritmo espectacular. El proceso en sí mismo es muy sencillo; utilizando solounos cuantos “ingredientes” se puede multiplicar (en millones de copias)cualquier fragmento de ADN que queramos. Desde el punto de vista molecularse requiere exclusivamente dNTPs, Cl 2 Mg, cebadores, polimerasatermorresistente, agua y el molde de ADN que se quiera multiplicar. El procesode amplificación se puede dividir en tres etapas:a) Desnaturalización del ADN a 95ºCb) Annealing o unión de los cebadores al molde de ADNc) Extensión, es decir, la polimerasa empieza a fabricar la nuevacadena de ADN.Como requerimiento instrumental se necesitará un Termociclador.En definitiva, la PCR constituye un método fiable, sencillo, rápido yeconómico.Sistemas de detección de ADNHace unos años, la gran mayoría de los laboratorios de genéticamolecular utilizaba como principal sistema de detección, geles de poliacrilamidaseguidos de una tinción con plata. Sin embargo, con el desarrollo de lossecuenciadores automáticos, que combinan química y fluorescencia tanto ensu formato de gel como de capilar, no solo se ha mejorado en gran medida lacalidad y la rapidez en la detección de un producto amplificado, sino queademás ha permitido incluso analizar simultáneamente fragmentos de ADN delmismo peso molecular. Dentro de los secuenciadores automáticos parece queha tomado ventaja en el mercado el de capilar respecto al de gel entre otrasrazones porque requiere una menor manipulación de la muestra y permitereanalizarla sin tener que volver a prepararla. En la actualidad existen variosmodelos de secuenciadores del formato de capilar: uno, cuatro, dieciséis ynoventa y seis capilares.

APLICACIÓN FORENSE DE MICROSATÉLITES AUTOSÓMICOSMARÍA JOSÉ FARFÁN EspunyJefa del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y CienciasForenses. Departamento de SevillaLa primera aplicación de la tecnología del ADN a la resolución de uncaso judicial data de 1985, cuando las autoridades británicas exigieron unaprueba biológica de filiación en un asunto de inmigración en el que con labatería de ensayos disponibles en ese momento se pudo deducir que el jovenghanés investigado pertenecía al entorno familiar de su supuesta madre, perono se podía resolver si era su hijo biológico o su sobrino. Para resolver el casose solicitó la colaboración de Alec Jeffreys que acababa de publicar laposibilidad de aplicar el análisis de determinadas regiones repetitivas y muypolimórficas del ADN a cuestiones de identificación humana, incluidos losestudios de filiación. Mediante el análisis de la huella genética del joven y desus presuntos madre y tres hermanos pudo confirmarse la maternidad.Desde entonces, la tecnología del ADN ha experimentado unespectacular avance del que se ha visto beneficiada enormemente la GenéticaForense. Actualmente la “prueba del ADN” constituye una pericia de enormetrascendencia en muchos casos judiciales lo cual ha supuesto en los últimosaños un incremento considerable en la intervención de este tipo de pericias enlos tribunales de justicia.En una célula humana, el ADN se localiza principalmente en el núcleo,aunque también existe una pequeña cantidad de ADN en las mitocondrias, decuya aplicación forense se hablará en otro capítulo. El ADN nuclear seencuentra dividido y muy compactado en los cromosomas, que son unasestructuras muy densas formadas por ADN y proteínas. El genoma humanonuclear está constituido por 22 pares de cromosomas autosómicos y un par decromosomas sexuales, X e Y, cuya combinación determina el sexo femenino(XX) o masculino (XY).

La mayor parte de los análisis de identificación genética humana secentra en marcadores polimórficos localizados en regiones no codificantes delos cromosomas autosómicos. Casi la mitad del ADN no codificante estáconstituido por ADN repetitivo, en el que destacan las secuencias repetidas entándem, constituidas por una secuencia determinada que se repiteconsecutivamente una detrás de la otra un número variable de veces.Atendiendo al tamaño de la unidad de repetición, estas secuencias sedenominan satélites (unidad de repetición: 1 000-10 000 nucleótidos),minisatélites (unidad de repetición: 7-100 nucleótidos) y microsatélites o STRs(“Short Tandem Repeats”) (cuya unidad de repetición contiene de 2 a 6nucleótidos), siendo éstos últimos los más ampliamente utilizados en GenéticaForense.Análisis de STRs mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR)La introducción de la PCR en Genética Forense ha hecho posible elanálisis de una gran variedad de muestras cuyo estudio resultaba imposiblemediante las técnicas convencionales. La PCR permite la obtención in vitro demillones de copias de un fragmento de ADN específico a partir de una cantidadínfima de ADN mediante una reacción enzimática cíclica.Dados los espectaculares avances científicos y tecnológicosexperimentados en los últimos años (que incluyen el desarrollo de múltiplesfluorocromos para el marcaje diferencial de fragmentos de ADN y plataformascomplejas de detección capaces de discriminar selectivamente entre ellos), hoyen día se pueden analizar de forma conjunta 15 STRs o más a partir de tansólo 0,1-1 ng de ADN, obteniéndose un perfil genético suficiente para laindividualización de un resto biológico.La principal ventaja de la aplicación de la PCR al laboratorio forensereside en el espectacular incremento en la sensibilidad de la técnica deindividualización por ADN. No obstante, ello conlleva el inconveniente de unelevado riesgo de contaminación. Además, aunque la PCR ha supuesto unarevolución en biología forense, presenta una serie de limitaciones que a vecesson muy difíciles de salvar y que se refieren principalmente a las posibilidades

de degradación, inhibición de la reacción de PCR o la modificación del ADN.Por otra parte hay que tener en cuenta que durante la amplificación por PCR demarcadores STRs pueden originarse una serie de artefactos que puedeninterferir con una clara interpretación de los resultados y cuya consideración esnecesaria para garantizar un correcto genotipado.Por otra parte, con cierta frecuencia llegan al laboratorio muestras en lasque se detectan perfiles genéticos que reflejan la presencia de una mezcla decélulas procedentes de más de un individuo cuyo análisis es más complicado ylaborioso que en casos de perfiles únicos y requiere un alto grado de formacióny experiencia por parte del perito para distinguir entre los alelos verdaderospresentes en la mezcla y los posibles artefactos, lo cual no siempre es posible.STRs autosómicos de uso generalizado en genética forenseCon fines de identificación humana es importante disponer demarcadores de ADN que exhiban una alta variación entre individuos y que enconjunto permitan discriminar entre ellos. Actualmente existen miles de STRsidentificados y se calcula que en el genoma humano existe un STR cada 10 000pares de bases. En los criterios a seguir para la selección de STRs conaplicación en identificación humana deben primar los siguientes factores: altopoder de discriminación, alta heterocigosidad, localización en distintoscromosomas para evitar el ligamiento entre marcadores, robustez yreproducibilidad de resultados en reacciones múltiplex, baja tasa de mutación ylongitud de alelos en el rango de 90-450 pares de bases.Para un intercambio y comparación de resultados efectivo entre distintoslaboratorios es necesaria la utilización de una batería de marcadores genéticoscomunes. Actualmente, los marcadores más extendidos en el ámbito mundialson los 13 STRs autosómicos integrados en el sistema CODIS (“CombinedDNA Index System”) establecido en 1997 por el FBI para la creación de unbanco de datos nacional. La probabilidad de coincidencia al azar entreindividuos no relacionados mediante el análisis de los 13 marcadores delCODIS es inferior a uno en un billón.

APLICACIÓN FORENSE DE LOS CROMOSOMAS X e YMARÍA JOSÉ FARFÁN ESPUNYJefa del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y CienciasForenses. Departamento de SevillaAparte de los STRs autosómicos, estrellas de la individualizaciónmediante técnicas de ADN y a los que hemos dedicado el capítulo anterior,existen marcadores genéticos de especial relevancia en los cromosomassexuales, cuyas peculiaridades los hacen idóneos para determinadasaplicaciones concretas.Un marcador de sexo: amelogeninaLa amelogenina es un locus localizado en una región homóloga de loscromosomas sexuales. Existe una diferencia de 6 pares de bases entre eltamaño del alelo presente en el cromosoma X y el Y, que se debe a unapequeña deleción en el cromosoma X. El resultado de la amplificación por PCRde este locus en un ADN femenino (XX) será de una única banda, mientras quesi el ADN es masculino (XY), el resultado serán dos bandas de distinto tamaño.La mayoría de los kits comerciales actuales incluyen este marcador, quepermite la designación del sexo del individuo donante de la muestra. Noobstante, hay que tener en cuenta que, aunque ocurre con muy bajafrecuencia, se ha detectado la existencia de deleciones en esta región delcromosoma Y, de tal forma que una muestra masculina podría asignarseerróneamente como femenina. En este caso, el análisis de marcadoresespecíficos del cromosoma Y permitirían una correcta asignación del sexo.STRs del cromosoma YEl cromosoma Y presenta una diferencia importante respecto al resto decromosomas, su herencia es exclusivamente paterna, es decir, se transmite depadres a hijos varones sin que exista la posibilidad de recombinación. Por

tanto, la información genética contenida en el mismo se hereda como haplotipo,o sea, los genotipos para cada uno de los marcadores del cromosoma Y setransmiten en bloque y no de forma independiente. De esta forma, salvoposibles mutaciones, todos los individuos varones emparentados por víapaterna comparten el mismo haplotipo para el cromosoma Y.En los últimos años, el análisis de marcadores del cromosoma Y se haextendido en los estudios de evolución humana para trazar linajes paternos. EnGenética Forense, estos marcadores han demostrado también su utilidad encasos de mezclas complejas, en estudios de filiación cuando los individuosimplicados son varones y resultan de especial utilidad en los casos de agresiónsexual. En éstos es común encontrar indicios donde existe una mezcla decélulas femeninas de la víctima y masculinas del agresor. Aunque existenmétodos de extracción basados en una lisis diferencial que permite laseparación del ADN de las células epiteliales (normalmente vaginales) del ADNde los espermatozoides, esta separación no siempre es posible, especialmentesi los espermatozoides están muy deteriorados o el agresor es azoospérmico.En estos casos, el uso de marcadores específicos del cromosoma Y aumentalas posibilidades de detectar pequeñas cantidades de ADN masculinopresentes en un fondo de abundante ADN femenino, el cual en otro tipo deanálisis (STRs autosómicos, por ejemplo) enmascararía la obtención deresultados a partir del ADN masculino.La limitación de este tipo de análisis reside en que, dado que elcromosoma Y no está sujeto a recombinación, es menos variable entreindividuos, por lo que es necesario el análisis de muchos marcadores paraobtener un alto poder de discriminación.STRs del cromosoma XEn las células femeninas existe una pareja de cromosomas X de formaque éstos pueden recombinar entre sí comportándose de la misma forma quelos cromosomas autosómicos, hablando en términos de su herencia. Noobstante, los individuos varones transmiten a su descendencia femenina todoslos marcadores localizados en su cromosoma X en bloque, es decir, uno de loscromosomas X de cada mujer es idéntico al de su padre. Esta peculiaridad

proporciona una herramienta útil en casos de paternidad con descendenciafemenina así como en estudios de filiación o identificación en los que elpresunto padre no está disponible y hay que recurrir a familiares en primer osegundo grado de parentesco.

APLICACIÓN FORENSE DEL ANALISIS DEL ADN MITOCONDRIALMANUEL CRESPILLO MÁRQUEZFacultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología yCiencias Forenses. Departamento de Barcelona.Todo el patrimonio genético que poseemos los seres humanos seencuentra confinado en dos orgánulos celulares: núcleo y mitocondria dandonombre al ADN que en dichos estructuras se localiza: ADN nuclear (ADNn) yADN Mitocondrial (ADNmt). La mayor parte del ADN celular se encuentraempaquetado en el núcleo, sin embargo, las mitocondrias, que se encuentranubicadas en el citoplasma y constituyen las autenticas plantas generadoras deenergía de la célula, poseen un ADN propio dispuesto circularmente y cerradoque se encuentran en múltiples copias dentro de la célula (1000 a 10000copias).Por su composición bioquímica, las dos cadenas son diferentes, ya queen la secuencia nucleotídica de una de ellas prevalecen las bases púricas(adenina y guanina), por lo que es más pesada que su complementaria donde,para respetar la complementariedad han de predominar las pirimidínicas (timinay citosina). Así la primera de las hebras se denomina H (Heavy o pesada) y a lasegunda L (Light o ligera).El ADNmt tiene 16569 pares de bases y en esa secuencia se distribuye37 genes que codifican aproximadamente para el 10 % de las proteínasconstitutivas de la mitocondria. Únicamente un 10% del genoma mitocondriales no codificante.El ADNmt fue secuenciado completamente en 1981 por Anderson et al.La mayor parte de las variaciones entre individuos aparecen en una región nocodificante del ADNmt de aproximadamente 1112 pares de bases ydenominada bucle de desplazamiento (displacement loop, D-loop o región decontrol) (1-3 nucleótidos diferentes cada 100 bases), y dentro de esta regiónaparecen dos regiones descritas como región hipervariable I (HVR1) y regiónhipervariable II (HVRII) que son las que más interés han suscitado para lacomunidad forense.

Pero, ¿Por qué interesa el ADNmt?. Tres son las características que hacen delADNmt una herramienta útil para el laboratorio forense.1. El número de copias de ADNmt por célula puede oscilar entre 1000 y10000 dependiendo del tipo de célula y su actividad metabólica. Estapeculiaridad permite que ante muestras degradadas o con escasa o nulacantidad de ADNnuclear (pelos caídos) por una cuestión de meraprobabilidad siempre puedan presentarse moléculas de ADNmt íntegrasdispuestas para ser analizadas.Posiblemente, características estructurales como la disposición circular y suescasa extensión (sólo 16569 pb) la hacen también ser más difícilmentevulnerable a la acción de nucleasas, de manera que esta “resistencia” alproceso de degradación, tan usual en las muestras procesadas en ellaboratorio forense, aumenta extraordinariamente el atractivo del ADNmt.2. La ubicación de la molécula de ADNmt en zonas próximas a la membranainterna de la mitocondria, lugar donde se lleva a cabo la fosforilaciónoxidativa, expone de forma permanente al ADN a la acción de los radicaleslibres generados con el consiguiente efecto mutagénico. A diferencia de loque ocurre con el ADN nuclear el ADNmt no posee histonas, de manera quedicho ADN quedará mucho más expuesto a la acción mutagénica. Porúltimo la ADNmt polimerasa tiene una pobre actividad reparadora.El resultado de todo ello es un ADN con unos índices de mutaciónsuperiores al ADNn (5-10 veces superior). Esta gran variabilidad essiempre una propiedad interesante en el ámbito forense a efectos de poderdiscriminar entre individuos.3. El ADNmt se hereda exclusivamente por vía materna, por tanto todosaquellos individuos emparentados por vía materna poseerán, salvomutaciones de “novo” puntuales, idéntico ADNmt.Esta propiedad es especialmente útil en casos de identificación decadáveres en los que no se dispone de muestras de familiares próximos yse tiene que recurrir a familiares lejanos emparentados por vía materna.Hay un caso que ilustra a la perfección lo expuesto, se trata de la

identificación de los restos del último zar de Rusia Nicolás II y parte de sufamilia, los cuales fueron ejecutados y sepultados tras la Revoluciónbolchevique en 1918 y el hecho de poder contar con muestras de referenciade parientes maternos, algunos de ellos aún vivos, permitió su identificacióncertera mediante el análisis del ADNmt.Por tanto, el tipo de muestras en las que el análisis de ADNmt resultaespecialmente útil son en aquellas que presentan un avanzado estado dedegradación o en aquellas que la cantidad de ADN nuclear sea escasa o nula(por ej. pelos caídos o carentes de raíz).Actualmente el análisis del ADNmt se lleva a cabo mediantesecuenciación directa de las regiones HVR1 (~400pb) y HVR2 (~400pb) tras lareacción de PCR.En los últimos años y gracias a un importante avance tecnológico, losmétodos y procedimientos de secuenciación han experimentado unespectacular avance que ha permitido rápidos y precisos procesos de análisis ygran culpa de ello lo ha tenido especialmente la aparición de secuenciadoresautomáticos y el empleo de fluorocromos.Sin embargo, recientemente, la comunidad científica forense ha fijadosus esfuerzos en el análisis de otro tipo de polimorfismo que se presenta en elgenoma (ADNn y ADNmt) con gran frecuencia, se trata de los SNPs (SingleNucleotide Polymorphisms).En este caso las variaciones entre individuos están basadas enmutaciones puntuales en la base ubicada en una cierta posición del genoma.Las estrategias así como las plataformas de análisis desarrolladas para elanálisis de SNPs son muy variadas. El análisis de este tipo de polimorfismodentro del ADNmt supone una herramienta muy útil cuando analizamosmuestras altamente degradadas y el análisis de secuenciación no es viable oen aquellos casos en los que la secuencia obtenida es altamente frecuente yrequerimos una mayor discriminación.El análisis del ADNmt presenta también una serie de limitaciones queconvienen describir aunque sea sucintamente:

1. En primer lugar nos encontrado con la temida contaminación, que suponeuno de los auténticos caballos de batalla de los laboratorios forenses. Elanálisis de ADNmt es mucho más sensible a la acción de contaminaciones,pensemos que la incorporación accidental de una sola célula aportandoADN exógeno al propio de la evidencia supone la adición de miles de copiasde ADNmt. Esta circunstancia supondrá la aparición de resultados nointerpretables y en el peor de los casos resultados erróneos. Es por tantofundamental extremar al máximo las medidas encaminadas a evitarcontaminaciones.2. El ADNmt se hereda exclusivamente por vía materna, de manera, que en unindividuo cabe esperar un único tipo de ADNmt, sin embargo esto no essiempre así y en ocasiones podemos encontrar individuos en los quecoexisten más de un tipo de ADNmt. A este fenómeno lo denominamosheteroplasmia. Estas pueden clasificarse en dos grandes tipos: desecuencia, caracterizadas por ser moléculas que discrepan en unadeterminada base en una posición concreta, y las llamadas heteroplasmiasde longitud, cuya característica es diferenciarse unas de otras en el númerode citosinas presentes en determinados tractos de las regiones HV1 y HV2.La aparición de una heteroplasmia en una muestra de referencia y no en ladubitada o viceversa puede, en ocasiones, complicar la interpretación yposterior valoración de resultados sin embargo en otros casos cuando laheteroplasmia se presenta tanto en la muestra dubitada como en la dereferencia puede dar más peso, si cabe, al hecho de la coincidencia.3. El análisis de ADNmt se muestra como una prueba realmente eficiente encasos de exclusiones, sin embargo cuando detectamos una coincidenciaentre las muestras dubitadas y las muestras de referencia se haceimprescindible un tratamiento estadístico, y por tanto darle un peso a dicho“match”. El hecho de que la herencia del ADNmt sea exclusivamentematerna, lo que implica una ausencia de recombinación, obliga a tratar lasecuencia de ADNmt como un único locus. La práctica corriente y por otraparte recomendada por la Internacional Society of Forensic Genetic (ISFG)consiste en determinar la “rareza”de una determinada secuencia mediante

comparación con bases de datos poblacionales, y determinar el número desecuencias idénticas a la de la muestra problema que hayan sidodetectadas en dicha base de datos. Las bases de datos que actualmente sedisponen están nutridas con un número de secuencias relativamenteescaso (3500-4000), el resultado es un bajo poder de discriminación si locomparamos con el que el análisis del ADNn nos ofrece. Es por tanto muyimportante hacer crecer dichas bases de datos y en esa línea ha volcandola comunidad forense sus esfuerzos con el fin de generar una gran base dedatos mundial que contenga secuencias perfectamente contrastadas(EMPOP -EDNAP mtDNA population database-www.empop.org).En resumen, hemos de señalar que la molécula de ADNmt reúne unaserie de características que hacen de ella una herramienta imprescindible enlos laboratorios forenses. La comunidad científica ha hecho y sigue haciendograndes esfuerzos para que en la actualidad su uso ante los Tribunales deJusticia de todo el mundo esté ampliamente aceptado.El análisis del ADNmt ha posibilitado emitir conclusiones y dictámenes encasos, que sin este tipo de estudio, hubiera sido del todo imposible, es portanto justo darle la importancia que requiere este tipo de análisis con lasventajas e inconvenientes que hemos descrito anteriormente.

NUEVAS TECNOLOGÍAS EN GENÉTICA FORENSELOURDES PRIETO SOLLALaboratorio de Biología-ADN de la Comisaría General de Policía Científica.IntroducciónLa genética forense es una ciencia que no ha dejado de evolucionar yque sigue en constante cambio. Desde sus comienzos en España a principiosde los años 90, hasta hoy, se han producido muchos avances en el campomolecular que se han ido incorporando a la rutina de los laboratorios forenses.Hace unos años se requería una mancha de sangre de considerable tamañopara poder realizar una identificación y hoy se puede obtener un perfil genéticode un filtro de cigarrillo e incluso de los restos epiteliales presentes en lasprendas de vestir producidas por el contacto continuado con la piel.Pero ¿qué podemos esperar en los próximos años?; si el análisis deADN con fines forenses es una técnica tan estandarizada y establecida ¿porqué buscar nuevas tecnologías?Aunque es verdad que la tecnología del ADN ha permitido mejorar lasinvestigaciones criminales, todavía existen limitaciones que actualmente estántratando de superarse. En la mayoría de los casos, los resultados de “la pruebadel ADN” son claros y no están sujetos a debate. Sin embargo, no podemosobviar que los resultados analíticos de algunos casos son ambiguos.Desgraciadamente, las muestras biológicas relacionadas con el delito seencuentran a veces, diluidas, degradadas o proceden de varios contribuyentes.En estos casos, el análisis estándar de ADN y las búsquedas en las bases dedatos son menos productivas y los resultados que ofrecen no son de elevadaconfianza. Por otro lado, el tiempo que transcurre desde que las evidenciasbiológicas llegan al laboratorio hasta que se emite el informe pericial puede serconsiderablemente largo si el número de muestras involucradas en el caso eselevado. Por ello, las nuevas tecnologías en el análisis forense de muestrasbiológicas con fines identificativos se centran fundamentalmente en: posibilitar

el análisis de muestras degradadas, facilitar el análisis de mezclas y aumentarla rapidez y eficacia de los análisis.Estrategias en el estudio de muestras degradadasLa identificación genética puede complicarse cuando existen largosperíodos de tiempo entre la muerte y la aparición del cadáver, cuando lamuerte ocurrió en unas condiciones críticas (explosiones por ejemplo), ocuando las muestras han estado sometidas a condiciones ambientales muydesfavorables (temperatura, humedad, cambios en el pH, agentes oxidantes,radiación, etc.), incluso aunque el tiempo transcurrido no sea muy largo. Enestos casos el escaso ADN que pueda permanecer en las muestras seencuentra totalmente degradado (rotura de hebras, pérdida de nucleótidos,etc.).En estas muestras críticas, el análisis de STRs convencionales esproblemático, pues los de mayor tamaño (300-400 pares de bases) no selogran amplificar en la reacción PCR. Actualmente, para evitar este problema,muchos laboratorios están centrándose en el diseño de nuevas PCRmultiplexes con el fin de obtener amplicones más cortos (miniSTRs) que no denproblemas en muestras de ADN de escasa calidad. Los miniSTRs, por tanto,son polimorfismos STR que se analizan mediante el diseño de los “primers” enuna zona cercana al propio polimorfismo, evitando grandes regionesflanqueantes. Con ello se pueden analizar muestras degradadas quetípicamente producen perfiles genéticos parciales y ausencia de informaciónpara loci grandes.Otro tipo de polimorfismos que pueden utilizarse en muestrasdegradadas son los SNPs (single nucleotide polymorphisms). Se trata decambios de una única base dentro de una secuencia concreta de ADN. Puedenamplificarse mediante PCR produciendo amplicones muy cortos (50-100pb),pero además presentan otras ventajas como: su abundancia en el genomahumano, su baja tasa de mutación (característica muy importante en los casosde paternidad e identificación cadavérica) y la posibilidad de automatizar suanálisis. Es ya una realidad en muchos laboratorios el estudio de SNPssituados en el ADN mitocondrial y el cromosoma Y, pues al tratarse en estos

casos de genomas haploides, su análisis es menos dificultoso. Sin embargo, yase están comenzando a estudiar SNPs autosómicos, sobre todo con fines defenotipaje. Cuando no disponemos de una muestra de referencia paracomparar con una evidencia, no se puede deducir ninguna información útil apartir del ADN que habitualmente estudiamos (excepto el sexo). Por ello,actualmente se están buscando SNPs que ofrezcan información sobre elindividuo que dejó la evidencia en el lugar del delito. Así se podrá orientar lainvestigación hacia uno u otro sospechoso en casos delictivos, pero tambiénserá una herramienta útil a la hora de facilitar la investigación de la identidad deuna víctima en casos de cadáveres en mal estado de conservación. Aunque laciencia forense está encaminada hacia estas investigaciones, el tipaje de SNPsautosómicos probablemente tardará años en ser aceptado en los tribunales.Estrategias en el análisis de mezclasEl análisis de mezclas de ADN es una práctica habitual en la rutinaforense. Su interpretación es delicada dado que se hace imposible diferenciarqué alelos pertenecen a cada contribuyente a la mezcla. Si además la mezclaestá desequilibrada (uno de los contribuyentes aportó más cantidad de fluidobiológico que el otro u otros) podemos cometer errores al asignar alelos que enrealidad son artefactos de la amplificación (sttuters) o al no detectar alelos querealmente existen en la mezcla (drop out alélico).Si la mezcla está formada por el mismo tipo de fluido procedente de doso más individuos la posibilidad de separar los perfiles genéticos se complica,pero si los fluidos que formaron la mezcla presentan diferentes característicaspuede lograse la separación. Tal es el caso de las agresiones sexuales, en lascuales nos encontramos mezclados el perfil genético de la víctima procedentedel fluido vaginal con el perfil genético del sospechoso procedente del semen.Habitualmente estas muestras se procesan extrayendo su ADN mediante lisisdiferencial, basada en la resistencia que presentan los espermatozoides (y nolas células del epitelio vaginal) a la digestión mediante proteinasa K. Sinembargo, cuando el número de espermatozoides es escaso (bien por que latoma de muestra se realizó transcurrido un tiempo desde la agresión, porque la

víctima retirara la mayoría mediante lavado, o porque el agresor seaoligospérmico) la lisis diferencial no es eficaz.Para solucionar estos problemas se han creado programas informáticosque nos ayudan a la interpretación de mezclas (Pendulum) cuando no existe laposibilidad de la separación física de los perfiles genéticos. Por otro lado, encasos de delitos contra la libertad sexual, donde la separación física es posible,es cada vez más frecuente el uso de microscopios capturadores deespermatozoides. Estos microscopios permiten aislar mediante láser cadaespermatozoide que visualizamos e introducirlos en un tubo para extraer suADN independientemente del de la víctima, evitándose así los perfiles mezcla.Automatización y rapidez del análisis forenseUno de los principales problemas hoy en los laboratorios forenses es el grannúmero de datos electrónicos que se generan regularmente. Desde que unamuestra llega al laboratorio hasta que se escribe el informe pericial son muchoslos pasos que se dan y los resultados analíticos que se producen. Hemos detener en cuenta el carácter judicial de las muestras que analizamos, y comotales han de estar controladas en todo momento, siguiendo una cadena decustodia tanto de los efectos como de las sub-muestras que se generan deellos. Por tanto, en los últimos años ha sido necesario desarrollar sistemasinformáticos que permitieran el manejo fácil y seguro de toda esta informacióngenerada, los LIMS (Laboratory Information Management Systems). Estossistemas nos permiten saber dónde están en cada momento las muestras quese analizan y en qué fase del análisis se encuentran (trazabilidad), nosproporcionan las herramientas necesarias para las revisiones administrativasde cada caso y contienen módulos analíticos para estudios de ADN(comparación y almacenamiento de perfiles genéticos, análisis estadísticos,etc.).Las técnicas de análisis en sí también están automatizándose. Existenhoy en día robots para extraer ADN de un elevado número de muestras en unpar de horas, aunque aún no están preparados para muestras críticas.También se está realizando un gran esfuerzo en acortar los tiempos de análisisutilizando tecnologías que permitan realizar PCR multiplexes de un gran

número de loci (zip-code primers) así como técnicas de genotipaje alternativasa la secuenciación. La mayor parte de los nuevos métodos de genotipaje sebasan en dos principios: hibridación con oligonucleótidos específicos de alelo yuso de enzimas modificadores de ADN. Ejemplos del primer tipo serían el usode sondas ASO (allele specific oligonucleotides) o de primers específicos dealelo durante la PCR. Entre los enzimas modificadores de ADN podemosnombrar la ADN polimerasa (minisecuenciación), la ADN ligasa (ligamiento deoligos) y las ya clásicas enzimas de restricción).Estos diferentes métodos de análisis pueden combinarse con multitud denuevos métodos de detección. Los sofisticados biochips en todas susmodalidades (conventional spoting microarrays, electronically activatesmicroarrays) y la espectrometría de masas (MALDI-TOF), son algunos de losejemplos que ya hoy son una realidad en los laboratorios forenses máspunteros.

TÉCNICAS MOLECULARES DE IDENTIFICACIÓNDE SETAS CON INTERÉS FORENSEMª JESÚS ITURRALDE PARDOFacultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología yCiencias Forenses. Departamento de Madrid.IntroducciónA lo largo de los últimos 50 años las intoxicaciones por setas presentanun crecimiento significativo en todo el mundo. Las causas de este hecho sedeben tanto a la mayor afición de recolectar y consumir setas como alincremento del consumo voluntario de setas alucinógenas. En cuanto a laetiología médico legal, la mayor parte son accidentales; le siguen el usointencionado de hongos psicoactivos siendo excepcional la etiología homicida osuicida.La importancia de los micetismos se encuentra, no tanto en la frecuenciacon que se presentan sino porque los pacientes pueden haber ingerido setascon toxinas potencialmente mortales. El análisis de laboratorio no sólo sirvepara confirmar el diagnóstico de un micetismo y aportar nuevos taxones alcatálogo de especies tóxicas, sino también para evitar tratamientos agresivos,hospitalizaciones innecesarias y diagnosticar síndromes mixtos o micetismoscuyos períodos de incubación queden solapados.La identificación tradicional de las setas tóxicas se basa en criteriosmorfológicos y en la detección de toxinas. Estos análisis en ejemplares muydeteriorados e incluso triturados, cocinados y a veces en vómitos o hecessuelen ser muy difíciles. Por ello un método de identificación independientetanto de la calidad del material fúngico como de la cantidad seríaextremadamente útil. La determinación de especie mediante el estudio demarcadores genéticos podría ser una buena herramienta.

Tabla 1. Clasificación de los micetismos en función del periodo de latencia y del órgano sobre elque actúa la toxina.Periodo de latencia Organo diana Tipo de reacción Toxinas EspeciesInferior a 6 horasSistema nervioso- Colinérgico Muscarina Clitocybe/Inocybe- Glutaminérgico Ac. iboténicoMuscimolAmanita muscariaAmanita pantherina- Epileptogénico Hidracinas Giromitra- Alucinogénico PsilocinaPsilocibinaPsilocybeGastrointestinal- Reacción disulfiram Coprina Coprinus atramentarius- Miscelánea gastrointestinal Boletus sp; Entoloma sp, etcAlérgico- Inmunohemolítico Paxilus involutus- Neumónico Lycoperdon sp.Entre 6-24 horasHígado - Hepototóxico Amatoxinas Amanita phalloidesLepiota sp; Galerina sp.Riñón - Nefrotóxico Amanita proximaAmanita smithianaOtros - Eritromelalgia Acidos acromélicos Clitocybe acromelalgaClitocybe amoenolensSuperior a 1 díaRiñón - Nefrotóxico Orellanina Cortinarius spSistema nervioso - Neurotóxico Hapalopilus rutilansMúsculo - Rabdomiolisis Tricholoma equestre (*)(*) considerada gran comestible hasta el año 2001Russula subnigricansRegiones polimórficas del ADN en hongos. De los diferentes genes del ADNque han sido investigados en micología, gen de la Beta-tubulina, gen de laOrotidina descarboxilasa, gen de la Chitina sintetasa, gen de la Actina, gen delFactor de elongación, son las regiones ITS-1 e ITS-2 (internal transcribedspacer) del nrDNA las que más se han utilizado para la identificación molecularde hongos.Metodología de análisis del ADN. Basada en la Técnica de Amplificacióngénica por PCR (Reacción en cadena de la polimerasa). Para amplificar cadauna de las regiones diana de interés en taxonomía se diseñan cebadoresespecíficos para ellas. Los productos amplificados pueden ser caracterizadosde diferentes maneras. Las técnicas más utilizadas en micología son:PCR/RAPD (Análisis del ADN amplificado al azar). Se trata de un método en elque no se necesita tener conocimientos previos sobre el genoma de undeterminado organismo y se realiza a partir del genoma entero. Se utilizandiferentes iniciadores de secuencia arbitraria. Los productos amplificados se

separan mediante electroforesis. Se obtiene un patrón de bandas PCR/RAPDpara cada especie.PCR/RFLP (Análisis del polimorfismo de la longitud de los fragmentos derestricción). Esta técnica permite obtener, para cada organismo, una serie defragmentos del ADN de diferentes tamaños que dan lugar a un patrón debandas PCR/RFLP. Ello se consigue fragmentando la región amplificadamediante el uso de enzimas de restricción. Comentarios: técnicas rápidas yeconómicas pero dan patrones difíciles de interpretar y poco reproducibles.PCR/SSCA (Análisis conformacionales del ADN de una sola cadena). Es unmétodo rápido y económico para detectar polimorfismos de secuencia sinnecesidad de secuenciar. Se basa en la movilidad de las cadenas sencillas deADN. Los cambios en la migración tienen un alto grado de sensibilidad, de talmanera que dos cadenas del ADN que difieran en una sola base migrarán deforma diferente. La región amplificada se desnaturaliza y se realiza unaseparación electroforética en condiciones desnaturalizantes. El patrón debandas PCR/SSCA es propio para cada organismo. Comentarios: Al igual queocurre con las técnicas anteriores, el perfil que se obtiene no es siemprereproducible pero puede utilizarse como método de screening previo a lasecuenciación.PCR/Secuenciación. El método más fiable y sensible para detectar ladiversidad genética es la secuenciación directa de los productos deamplificación de la región diana. La técnica más utilizada es la secuenciacióncíclica con terminadores de cadena marcados con fluorocromos. Lassecuencias de nucleótidos que se obtienen para la región diana en cadaorganismo y en diferentes laboratorios pueden ser publicadas en bases dedatos electrónicas (GENBANK, EMBL, etc). Comentarios: en ocasiones puedeque el material de herbario no esté identificado correctamente o que no seutilice la misma nomenclatura sin olvidar las contaminaciones del laboratoriodebido a una mala praxis. Estas situaciones dan lugar a que existansecuencias erróneas en las bases de datos públicas. Por ello sería convenientedisponer de bases de datos propias, cuidadosamente generadas, de lasespecies tóxicas.

Análisis de las secuencias de la región ITS para la identificación dehongosEl análisis comparativo de una secuencia desconocida con las bases dedatos públicas, EMBL o Gen Bank, puede ser un método útil de identificaciónde especie. Estas bases de datos disponen, via Internet, de programas decomparación de secuencias: FASTA y BLAST (Based Local Alignment SearchTool). Comentarios: aunque existen muchas secuencias publicadas de lasregiones ITS todavía son insuficientes para identificar algunos hongos. Elconstante aumento de secuencias permitirá ir identificando las setasresponsables de producir intoxicaciones.Diseño de test rápidos para la identificación de especieEl alineamiento y comparación de las secuencias nucleotídicas de unadeterminada región diana entre ejemplares de la misma y de distinta especie,permite conocer la variabilidad de la región y si es apta para el diseño denuevos test. Cada vez se investiga más el diseño de iniciadores específicos deespecie o sondas TaqMan mediante Real-Time PCR (RT-PCR). Comentarios:son sistemas de identificación menos problemáticos y más rápidos que lasecuenciación.

GENETICA FORENSE NO HUMANA: IDENTIFICACIÓN DE ESPECIESLOURDES PRIETO SOLLALaboratorio de Biología-ADN de la Comisaría General de Policía CientíficaLa necesidad de estudiar ADN no humano con fines forenses se hacecada día más patente y actualmente es frecuente que se solicite a loslaboratorios el análisis de muestras de origen no humano. Existen multitud desituaciones en las que cabe este tipo de análisis: restos de origen no humanoen la escena del crimen (pelos de animales domésticos, restos vegetales, etc),tráfico ilegal de especies protegidas o en peligro de extinción, identificación defauna cadavérica con el fin de estimar la data la muerte (identificación de larvasde insectos), fraude en la composición de alimentos procesados, investigaciónde accidentes de tráfico causados presuntamente por animales, negligenciamédica en casos de infecciones (transmisión de VIH o hepatitis C),bioterrorismo (ántrax), etc.El análisis de restos biológicos no humanos con interés forense se haabordado tradicionalmente mediante estudios inmunológicos o análisis deproteínas. Estos métodos encuentran su limitación cuando las muestras aestudiar no se encuentran en condiciones idóneas de conservación. Con eldesarrollo de la biología molecular han surgido nuevos métodos basados en lasdiferencias genéticas entre especies. El análisis de ADN mitocondrial (ADNmt)es el más apropiado para estudiar restos no humanos fundamentalmente pordos motivos: (i) la gran cantidad de copias por célula permite que muestrascríticas, que no dan resultados con el estudio de ADN nuclear, puedan seranalizadas (pelos, alimentos tratados) y (ii) su tasa de mutación es más rápidaque la del ADN nuclear, hecho que permite encontrar diferencias en lassecuencias de especies muy cercanas.Las regiones de ADNmt más utilizadas en genética forense con fines deidentificación de especie son el gen responsable del citocromo b (cytb) y losADNs ribosómicos 12S y 16S. Los análisis se realizan mediante PCR yposterior secuenciación del producto amplificado. Para ello, dentro de estastres regiones se han buscado dos tipos de zonas nucleotídicas: (i) zonas muy

conservadas (con poca variabilidad entre especies) con el fin de poder diseñarprimers universales que permitan la amplificación de ADN de los principalesgrupos taxonómicos y (ii) zonas menos conservadas que permitan ladiscriminación entre las muestras estudiadas al menos a nivel de género. Así,con un único par de primers se puede amplificar cada región en distintasespecies y la secuencia obtenida tras la amplificación puede comparase consecuencias conocidas de diferentes especies.El uso de esta técnica implica el conocimiento de la filogenia de lasespecies involucradas, el manejo de las bases de datos de secuencias de ADNdisponibles en la red (GenBank, EMBL), así como el uso de los softwares decomparación de secuencias (ej: BLAST, CLUSTAL). Es fundamental, por tanto,que el biólogo forense se familiarice con las herramientas que la bioinformáticapone a nuestra disposición.Una base de datos biológica es una lista de datos persistentes larga yorganizada, asociada generalmente a un software automatizado diseñado paraactualizar, buscar y recuperar los datos almacenados dentro del sistema.Actualmente existen organismos que proporcionan bases de datos gratuitaspara que los usuarios las puedan utilizar a través de Internet. Uno de losorganismos que más ha desarrollado las bases de datos biológicas y lasherramientas bioinformáticas es el NCBI (National Center for BiotechnologyInformation). Este organismo dispone de una página web(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) muy útil que y que la mayoría de investigadoresdel campo de la genómica y la proteómica manejan habitualmente. El NCBItiene múltiples bases de datos biológicas (de secuencias, de proteínas, degenomas, taxonómica, de publicaciones, etc) ligadas entre sí, de tal forma quese puede usar un único sistema de búsqueda y recuperación de datos llamadoENTREZ. Este sistema de búsqueda permite que un usuario tenga acceso yrecupere información de muchas bases de datos a la vez. Por ejemplo, la basede datos de secuencias de ADN Entrez está ligada a la base de datos detaxonomía Entrez. Esto permite al investigador encontrar informacióntaxonómica de la especie a la que pertenece la secuencia.Otro de los recursos que ofrece el NCBI y que más se utilizan en biologíaforense es el software BLAST (Basical Logical Alignment Search Tool). Entreotras aplicaciones este software ofrece la posibilidad de comparar la secuencia

que hemos obtenido en el laboratorio con las secuencias presentes en lasbases de datos de manera automática.Aunque las bases de datos de ADN están en constante crecimiento,para ciertos organismos no existen datos de las secuencias que nos interesan.Como consecuencia de esto, el éxito en la identificación del origen de unamuestra forense no humana depende en gran medida de la disponibilidad de lasecuencia de interés en la base de datos. Sin embargo, este problema puedesuperarse cuando en la base de datos existen secuencias de especiesrelacionadas con nuestra muestra problema o tenemos idea de qué especiepuede tratarse mediante datos no genéticos del caso en cuestión (por ejemplo,el análisis de pelos encontrados en un vehículo involucrado en el robo deabrigos de visón). En estas situaciones podemos recurrir al análisis de unamuestra indubitada de la especie que sospechamos y a la comparación dedicha muestra de referencia con nuestra muestra problema.Por otro lado, no es extraño que tanto cytb, como 12S y 16S presenten ciertonivel de polimorfismo, lo cual complica la interpretación de los resultados. Así,secuencias similares en un 98% de sus nucleótidos pueden derivarse tanto dedistintos miembros de la misma especie como de dos especies estrechamenterelacionadas que se han separado recientemente.En ocasiones el problema que se nos plantea es comprobar si los restosbiológicos encontrados en el lugar de los hechos coinciden en cuanto a especiecon los restos encontrados en, por ejemplo, las ropas de un sospechoso. Enlos casos en los que no tenemos idea de a qué tipo de organismo puedenpertenecer o el posible organismo está pobremente caracterizado a nivelgenético en las bases de datos, podemos recurrir al análisis de sus ADNs pormedio de RAPDs (random amplified polimorphic DNA). La técnica consiste enel desarrollo de una reacción PCR en la que los primers se han diseñado alazar. Estos primers de corta longitud (8-12 nucleótidos) anillan en diferentesregiones del genoma del organismo problema generando productosamplificados al azar de diferente longitud. Los fragmentos pueden separarsemediante electroforesis dando un patrón de bandas característico de laespecie.Muchos laboratorios forenses españoles tienen ya la tecnologíanecesaria para el análisis de los fragmentos mitocondriales cytb, 12S o 16S.

Sin embargo queda mucho trabajo por hacer en identificaciones de restosvegetales o de microorganismos. Sin duda, la genética forense no humana esuna nueva puerta que se abre para responder a las preguntas aquí expuestas,pero el campo es tan amplio que se necesitarán grandes inversiones parasatisfacer tan amplia demanda.

VALORACIÓN ESTADÍSTICA DE LA PRUEBA DE ADNMARÍA JOSÉ FARFÁN ESPUNYJefa del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y CienciasForenses. Departamento de Sevilla.Una vez obtenidos los perfiles genéticos resultantes de laindividualización de una muestra biológica mediante la aplicación de latecnología del ADN, éstos carecen de valor sin una valoración estadísticaapropiada. En otro capítulo se tratará con más detalle la valoración estadísticaen casos de filiación, por lo que aquí nos referiremos sólo a los casos deinvestigación criminal.En la mayoría de estos casos, la prueba del ADN sólo tiene sentido si esposible una comparación de perfiles de un vestigio frente a una muestraindubitada o entre diferentes vestigios. Cuando se trata de investigar si un restobiológico puede pertenecer a un determinado individuo o al donante de otrosvestigios, es necesario realizar un cotejo de los perfiles genéticos obtenidos. Silos perfiles son distintos, puede asegurarse que ese resto biológico nopertenece al individuo en cuestión o que ambos vestigios proceden depersonas diferentes. Pero si existe una coincidencia entre los perfilescomparados es necesario hacer una valoración estadística para estimar elgrado de incertidumbre de que esos perfiles coincidan entre sí sólo porcuestiones de azar y no porque procedan del mismo individuo. Para ello serequiere disponer de datos fiables sobre las frecuencias de los alelos presentesen la población de referencia, las cuales se estimarán mediante la realizaciónde estudios poblacionales basados en el tipado de numerosos individuos norelacionados.Para estimar el valor de la prueba es necesario considerar (al menos)dos hipótesis alternativas para su ocurrencia. La prueba debe evaluarsecalculando su probabilidad bajo cada una de las hipótesis. Por ejemplo, sedetecta una mancha de semen en la prenda de una víctima de agresión sexualy el perfil genético del semen coincide con el del sospechoso. Es necesarioestablecer dos hipótesis alternativas, que en este caso serían: H 0 : el semen

pertenece al sospechoso; H 1 : el semen pertenece a un individuo al azar de lapoblación. A continuación se procede a calcular la probabilidad de obtener eseperfil genético para el semen bajo la hipótesis H 0 , y bajo la hipótesis H 1 . Lavaloración más correcta consiste en calcular, mediante la aplicación delteorema de Bayes, la razón de verosimilitud o LR (“Likelihood Ratio”) que esel cociente entre ambas probabilidades. El resultado obtenido refleja cuántasveces la coincidencia de perfiles es más probable si consideramos la hipótesisH 0 , (o sea, que el semen pertenezca al sospechoso) que si consideramos lahipótesis H 1 , (que el semen pertenezca a un individuo al azar de la población).Un elemento importante en la comparación de perfiles genéticos confines de investigación criminal o en casos de identificación reside en la creaciónde bases de datos de ADN, aspecto que se tratará más detalladamente en otrocapítulo.

ORÍGENES POBLACIONALES MEDIANTE MARCADORES DE HERENCIAUNIPARENTAL: ADN MITOCONDRIAL y CROMOSOMA YMANUEL LÓPEZ SOTOFacultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología yCiencias Forenses. Departamento de Sevilla.La primera pregunta que tal vez pudiera plantearse un alumno de estecurso podría ser ¿qué sentido tiene hablar de los orígenes poblacionales en uncurso de Biología Forense?. La respuesta a esta pregunta hay que buscarla enlos propios fundamentos de la genética forense, que no son sino, la aplicaciónde conceptos de la Genética de Poblaciones a la identificación de individuos.En este sentido, siempre que obtenemos un perfil genético (STRs autosómicos,ADN mitocondrial, STRs de cromosomas X e Y) es necesario realizar unavaloración estadística de dicho perfil mediante comparación con la población dereferencia. Esto requiere, por un lado, conocer qué frecuencias alélicas definena dicha población y por otro, qué distribución haplotípica o de haplogrupospresenta respecto al ADN mitocondrial y al Cromosoma Y. Estos dosmarcadores, como ya se ha explicado a lo largo del curso, se caracterizanentre otras cosas, por presentar un modo de herencia uniparental; el ADNmitocondrial es transmitido por la madre a todos sus descendientes y elcromosoma Y es transmitido por el padre a sus hijos varones. Este hechobiológico nos permite trazar linajes a lo largo de la historia hasta remontarnos alorigen de nuestros antepasados.Con respecto al origen de los humanos anatómicamente modernos (delque derivan las poblaciones humanas actuales) se han expuesto dos hipótesisalternativas. La primera de ellas, llamada multirregional o policéntrica, explicaque los humanos modernos surgieron al mismo tiempo en cuatro regionesdistintas, llevando una evolución paralela a través de largos períodos detiempo, teniendo a la migración y a la selección natural como principalesmotores del proceso evolutivo. La otra hipótesis, conocida como OUT OFAFRiCA, se basa en que los humanos modernos se originaron en África ydesde allí emigraron hacia Asia y Europa y después a América y Oceanía. Esta

segunda hipótesis, más aceptada por la comunidad científica internacional, hasido apoyada por estudios de ADN mitocondrial y de cromosoma Y. En otraspalabras, parece claro que los humanos anatómicamente modernos del quederivan todas las poblaciones actuales surgieron como un único proceso deespeciación originado en África, aunque no está del todo claro si estoshumanos llevaron un reemplazamiento total o parcial de las otras especies dehomínidos existentes, como los neardentales en Europa.Como hemos dicho anteriormente, estos humanos anatómicamentemodernos llegaron a Europa. Existen opiniones contrarias en relación concómo se produjo el poblamiento de este continente. Para muchos genetistas,encabezados por la figura de Cavalli-Sforza, Europa se pobló durante elNeolítico a través de la llegada de colonos agricultores procedentes de OrienteMedio, a juzgar por lo que muestran los análisis genéticos de marcadoresclásicos. Sin embargo, para otros genetistas como M. Richards, V. Macaulay yA. Torroni, basados en los análisis de ADN mitocondrial, y O. Semino en los deCromosoma Y, llegan a la conclusión de que Europa ya estaba pobladadurante el Paleolítico, que además se produjo una expansión desde los pocosterritorios libres de hielo en la última glaciación y que hubo una pequeñacolonización durante el Neolítico.Una controversia parecida se da con respecto al poblamiento deAmérica. Para A. Torroni et al. y basados en estudio de ADN mitocondrial, elpoblamiento llegó procedente de Asia, entrando un haplotipo de cada uno delos haplogrupos existentes en América en tres oleadas diferentes. Sinembargo, para Merriwheter et al. en América entraron varios haplotipos de ADNmitocondrial en una sola oleada.Haremos una pequeña mención a dos poblaciones: la brasileña y losinuits. Brasil se caracteriza por ser la población más diversa del mundo desdeel punto de vista genético-poblacional. De hecho, podemos encontrarnos dosindividuos fenotípicamente muy distintos (blanco y mulato) y presentar ambosel mismo haplogrupo de ADN mitocondrial o de Cromosoma Y. A modo deejemplo, el 28% de la población blanca de Brasil tiene una ADN mitocondrialafricano, que puede explicarse por ser el resultado de la masiva llegada deesclavos desde el Golfo de Guinea ocurrida en siglos anteriores. Algo similar,pasa con la población de los Inuits, en la que al analizar el ADN mitocondrial y

el Cromosoma Y se observa que el marcador materno es amerindio y elpaterno, europeo. Se sabe que a estos territorios de hielo llegaron colonosprocedentes de Europa y que era costumbre en estas poblaciones esquimalesofrecer alimento, alojamiento y la mujer a sus huéspedes, de ahí el haplogrupoeuropeo observado en esta población.Se presentarán los datos obtenidos de un estudio de ADN mitocondrialrealizado por el departamento de Sevilla del Instituto Nacional de Toxicología yCiencias Forenses en la población andaluza. Cuestiones tales como ¿quélegado genético han dejado los ocho siglos de invasión árabe en Andalucía?¿encaja el sustrato mitocondrial en la variabilidad europea? ¿qué origen tienela población andaluza? ¿hay homogeneidad genética entre las provincias?,entre otras, serán resueltas en este curso.Por último, y enlazando con el principio de este resumen, se presentaránejemplos de la aplicación forense que tiene conocer la distribución geográfica oel origen de los patrones de ADN mitocondrial y de Cromosoma Y.

INVESTIGACIÓN BIOLÓGICA DEL PARENTESCOJUAN ANTONIO LUQUE GUTÍERREZJefe del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y CienciasForenses. Departamento de Barcelona.La investigación biológica de la paternidad en un sentido amplio(investigación biológica del parentesco), abarca cualquier estudio de la relaciónbiológica entre dos individuos, ya que una relación genética entre dosindividuos, siempre puede resolverse como una sucesión de relacionespaternofiliales ascendentes y descendentes dentro de un árbol genético, pormuy distantes que sean sus posiciones. Así podemos hablar del estudio mássimple como es el caso estándar (trío Presunto Padre-Madre-Hijo/a), depaternidad/maternidad con un solo progenitor, de estudios con abuelos, estudiode hermanos, paternidades a partir de familiares (cuando el padre está fallecidoo no disponible), etc...Casos especiales de estos estudios son los casos de desastres enmasa, identificaciones de restos cadavéricos, o la búsqueda de familiares delautor de un delito a través de una base de datos, que tienen como base losestudios de paternidad pero que conllevan una problemática asociada adicionalque se verá en otro momento en este mismo curso.También pueden considerarse paternidad/maternidad en su sentidoamplio el estudio de marcadores de cromosoma Y y de ADN mitocondrial,estudiando en este caso no una relación p(m)aternofilial directa, sino unarelación genética de toda una línea genética padres/hijos o madres/hijos. Enocasiones (algunos laboratorios de rutina) emplean estas técnicas comocomplementarias en los estudios de paternidad.El estudio de la paternidad en su sentido más estricto, como es el aclararla paternidad (maternidad) biológica de un hijo cuestionado, tiene unasimplicaciones legales (aunque se haga de forma privada y no judicial) que hayque tener presentes. Por suerte, tanto la legislación como la ciencia han

llegado a un punto en el que es posible la investigación de la paternidad congarantías suficientes, pero no siempre ha sido así.Desde el principio de la historia de una u otra manera se ha permitido oprohibido la investigación de la paternidad. En un principio la ciencia nodisponía de herramientas adecuadas para su resolución, pero se recurría a lainvestigación de otros indicios. Así podemos considerar que el Rey Salomóncelebró el primer juicio de paternidad (en este caso maternidad) documentadohistóricamente (en la Biblia), en el que se recurrió a métodos “psicológicos”.Durante mucho tiempo, la ciencia no pudo aportar métodos adecuados paradicha investigación, recurriéndose a métodos circunstanciales (como el tiempode gestación) o físicos (color de pelo, ojos, parecido...). No fue hasta ladescripción del grupo ABO por Landsteiner en 1900 y la descripción de sutransmisión hereditaria en 1910, que se dispuso de pruebas objetivas, naciendoasí la hemogenética forense. Desde entonces se han utilizado gran cantidad desistemas genético moleculares hasta nuestros días en que los estudios de ADNhan desplazado por su potencia y facilidad al resto de técnicas.En España, no es hasta 1978 que la Constitución Española en suarticulo 39.2 establece que “...La ley posibilitará la investigación de paternidad”,y posteriormente en 1981 se produce la reforma del Código Civil recogiendo ensu artículo 127 que “En los juicios sobre filiación será admisible la investigaciónde la paternidad y de la maternidad mediante toda clase de pruebas, incluidaslas biológicas”. Desde entonces, el desarrollo ha sido vertiginoso, uniéndose, alos escasos laboratorios que por entonces hacían pruebas, un sinfín delaboratorios cada vez más dotados, y que hoy día pueden considerarse deprimer nivel a escala mundial.En cuanto a las técnicas utilizadas, los primeros laboratorios utilizabanuna larga batería de grupos sanguíneos, enzimas y proteínas polimórficas yHLA, mediante reacciones antígeno-anticuerpo o mediante técnicaselectroforéticas. Dichas técnicas suponían un gran trabajo, pero la potenciaobtenida era la justa. La aplicación en el campo forense por Jeffreys en 1985del análisis de VNTR de ADN mediante las llamadas “sondas” supuso unarevolución, ya que permitía poder analizar directamente genotipos y nofenotipos como hasta entonces. Al final de los 80 ya se hacían en España,permaneciendo hoy día un par de laboratorios que todavía mantienen una

variante, dado que tienen gran capacidad de discriminación. Sin embargo, en elmismo 1985, K. Mullis descubrió un proceso al que denominó reacción encadena de la polimerasa (PCR), por la que luego recibiría el premio Nobel, queimita la replicación del ADN de las células en un tubo, consiguiendo hasta unmillón de copias de pequeños fragmentos de ADN. Desde el principio de los 90,la mayoría de los laboratorios trabajan mediante análisis de marcadores dePCR.La prueba biológica la podemos dividir en varias fases:● Toma de muestrasEste punto es fundamental para una buena pericia. No puede haber unanálisis de calidad si las muestras no son adecuadas. Ya antes de comenzarhay que hacer una selección de las personas que realizarán la prueba. Encasos estándar (PP-M-H) los individuos vienen predefinidos, pero hay quetener mucho cuidado en asegurarse de que se toman las muestras con todaslas garantías necesarias, y que se rotulan y se procesan de forma que seminimice la posibilidad de un cambio de muestras o un fraude de identidad. Encasos complejos (cuando no se dispone del padre), la elección de familiares escrucial para poder alcanzar un resultado fiable, siendo uno de los puntos quemás aumentan el resultado final el disponer de la madres del hijo dubitado y deotros hijos “legítimos” si es que se necesita. En ocasiones los individuos vienencondicionados por el propio caso, y por tanto no se pueden elegir teniendo querealizar la prueba con las muestras disponibles.●Obtención de perfiles de ADN y análisis genéticoComo ya hemos comentado anteriormente, la mayoría de laboratoriosusan hoy día marcadores de PCR. Es necesario disponer de una ampliabatería de marcadores para conseguir lo que llamamos un “poder de exclusióna priori” alto, o lo que es los mismo, la probabilidad de excluir de forma directaa un presunto padre falsamente acusado. Para casos de tríos, con 13-15marcadores suele ser suficiente. A partir de ahí, es como un puzzle, cuantasmás piezas tengamos, más fácil es saber que dibujo contiene. Por tanto si lainformación genética que se aporta es baja (por falta de individuos o por

tratarse de relaciones genéticas lejanas), la cantidad de marcadores que seusen debe incrementarse.Los análisis genéticos en estos casos suelen ser fáciles, ya que lasmuestras se suelen recoger en abundancia y en condiciones óptimas. En casosforenses, a veces las muestras no son tan buenas, teniendo que recurrir aestrategias especiales.Hay que tener en cuenta que además de las leyes de la genética y de laestadística, hay que tener en cuenta las leyes de Murphy, y saber que todo elproceso se realiza partiendo de unos supuestos teóricos, que a veces sealteran con anomalías varias como pueden se mutaciones, trisomías,superfecundaciones, etc.Una vez que tenemos unos perfiles genéticos, hay que contrastar losresultados para comprobar la compatibilidad genética antes de pasar a lasiguiente fase, que es la valoración estadística. La valoración genética se basaen los principios de la herencia mendeliana, sabiendo que cada individuo de losdos alelos (variantes) que presenta para cada marcador (pseudogen) heredauno de su padre y otro de su madre. Si sabemos cual es el alelo que transmitela madre, tendremos cual es el alelo “obligatorio” que ha transmitido el padrebiológico, y podremos contrastar con el presunto padre si posee dicho alelo ono. En caso de que no lo posea hablamos de exclusión, y por tanto deincompatibilidad genética. En caso de compatibilidad habrá que valorarestadísticamente los resultados como veremos más adelante. No obstante,debido a que en ocasiones hay anomalías como hemos comentadoanteriormente, en caso de exclusiones aisladas o incluso de únicamente dosexclusiones, se suele valorar igualmente la prueba con las pertinentesmodificaciones.En casos más complejos, la solución se complica, puesto que puede serque la madre no esté disponible, o lo que es peor, que no lo esté el presuntopadre. En estos casos, lo que se hace es reconstruir el posible perfil genético.Si no se obtiene el perfil completo, habrá que valorar todas las combinacionesgenéticas compatibles con los individuos analizados, y a su vez comprobar si almenos una de las combinaciones es compatible con el hijo. Si todas sonincompatibles, volveremos a hablar de exclusión. En caso contrario, habrá quevalorar estadísticamente todas las combinaciones de forma ponderada.

● Valoración estadísticaUna vez demostrada la compatibilidad de las personas estudiadas,habrá que valorar dicha compatibilidad.De forma simplificada y genérica podemos decir que el cálculo depaternidad se basa en calcular la probabilidad del genotipo del hijo (aunqueeste cálculo se ve afectado por múltiples circunstancias). Habrá que diferenciarcuando el hijo es homozigoto y heterozigoto.Hijo homozigoto (AA):Prob. genotipo hijo = prob. Padre trasmita A x prob. Madre trasmita APr(AA) = P->A x M->AHijo heterozigoto (AB):Prob. genotipo hijo = prob. Padre trasmita A x prob. Madre trasmita B ++prob. Padre trasmita B x prob. Madre trasmita APr(AB) = P->A x M->B + P->B x M->AEstas fórmulas las vamos a usar continuamente para valorar laspaternidades, y en función de cada tipo de caso este padre (P) y esta madre(M) variarán y por tanto las probabilidades de transmisión variarán.De forma genérica podemos decir que si tenemos un progenitor degenotipo conocido homozigoto la probabilidad de transmisión del alelo es 1, yaque no tiene otra opción y en el 100% de los casos lo trasmite. Si el progenitores heterozigoto, la probabilidad de transmisión de cada alelo es la mitad, o sea0,5. Si el progenitor no tiene el alelo, la probabilidad de transmisión será 0.

Probabilidad de transmisión del aleloAAA -> 1AB -> 0,5BB,BC -> 0Si desconocemos el genotipo del progenitor la probabilidad detransmisión será la frecuencia poblacional para dicho marcador, es decir laprobabilidad de transmisión del alelo A será a.Para la valoración, se establecen siempre dos hipótesis excluyentes:H 1 : el presunto padre (PP) es el padre biológico del hijoH 0 : el presunto padre (PP) no es el padre biológico del hijo y portanto es otro hombreEstas dos hipótesis tienen una probabilidad (condicionada) en función dela información del caso (I) y del análisis genético (E de evidencia genética). Através del teorema de Bayes podemos expresarlas en forma de cociente u“odds”:Pr(HPr(H10| E,I)=| E,I)Pr(E | H1,I)Pr(H1| I)xPr(E | H ,I) Pr(H| I)00(Fórmula 1)Como podemos ver hay tres términos:Odds a posteriori = LR x Odds a prioriEl odds a posteriori es lo que intenta determinar el juzgador, es decir,saber en función de la información del caso que tiene, genética (E) y de otrotipo (I), la relación a favor/en contra de la paternidad. Para ello hay quecombinar el LR (likelihood ratio o coeficiente de verosimilitud) con los odds apriori. El LR es el valor que puede obtener el laboratorio, que en casos de

paternidad de denomina Índice de Paternidad (IP).Los odds a priori es un valor que debe proporcionar el juzgador, y que noviene a ser otra cosa que la relación a favor en contra de la paternidad que setiene antes de realizar la prueba genética (con las evidencias no genéticas).Tradicionalmente se establece, a falta de otra indicación, un a priori neutro, esdecir, que hay las mismas probabilidades a favor que en contra. No obstante,este valor puede no ser adecuado, y de hecho se discute que es inclusoerróneo. En varios países, los tribunales proporcionan un a priori concreto eincluso se hace el cálculo con un panel de a prioris diferentes.En el caso de las paternidadesPr(H 1 |E,I)=1- Pr(H 0 |E,I)Pr(H 1 |I)=1- Pr(H 0 |I) (Fórmula 2)Por lo que sustituyendo nos quedaLR × Pr(H1Pr(H1| E,I)=LR × Pr(H| I)+1| I)[ 1−Pr(H| I) ]1Donde Pr(H 1 |E,I) es la probabilidad de paternidad o W (Wahrscheinlickeitsegún Essen-Möller) y Pr(H 1 |I) es la probabilidad de paternidad a priori. Siconsideramos que la probabilidad de paternidad a priori es igual que laprobabilidad de no paternidad, y por tanto igual a 0,5 (aplicar fórmula 2),tendríamos la ecuación de Essen-Möller:W=LR/(LR+1)=1/(1+1/LR) (por tanto LR=W/(1-W))premisas:En general, para simplificar tendremos que asumir una serie de1. Ambos progenitores biológicos (Padre y Madre) no están relacionadosgenéticamente

2. Hay equilibrio de Hardy-Weinberg en la población de referencia (lo queimplica que no hay subestructuración poblacional, que los marcadores sonindependientes y que no hay alelos silentes)3. No ocurren mutaciones4. La herencia es mendeliana con sistemas codominantesNinguna de las premisas son ciertas en mayor o menor grado, y hay que serconscientes de si conocemos dichas circunstancias y en que manera puedenalterar nuestros resultados.Asumiendo todas las premisas expuestas vamos a abordar el caso mássimple al que podemos enfrentarnos, el caso estándar (trío PP-M-H). Paracalcular el IP (LR) lo que tenemos a nuestra disposición es el tipaje genéticodel presunto padre (padre alegado), madre e hijo para un número adecuado demarcadores. Suponemos la maternidad cierta, y que a priori se excluyecualquier pariente próximo del presunto padre. El IP total será el producto delos IP de cada marcador.Tradicionalmente se expresa el IP como el cociente X/Y siendoX=Pr(E|H 1 ,I) e Y=Pr(E|H 0 ,I). La evidencia genética que tenemos (E) son losgenotipos del presunto padre, madre e hijo (G P , G M , G H ). Por tanto:IP = LR =XYPr(E | H1,I) Pr(GP, G==Pr(E | H ,I) Pr(G, G0PMM, G, GHH| H1,I)| H ,I)0Dónde aplicando la tercera ley de la probabilidadIP =XYPr(G=Pr(G(Fórmula 3)HH| G| GPP, G, GMM, H1,I)Pr(GP, G×, H ,I) Pr(G, G0PMM| H| H10,I),I)En esta ecuación en el segundo término, los genotipos de los padres sonindependientes de las hipótesis, por lo que serán iguales en el numerador y enel denominador, y por tanto su valor será 1. En otros casos (complejos) no seráasí y no se eliminarán de los cálculos. Aun así hay autores que prefieren no

eliminarlos de las fórmulas y por tanto la X y la Y serán algo diferentes a lasque veremos.Para hacer más comprensible la explicación abandonaremos la notaciónestadística a partir de aquí y volveremos a la notación más genética y genéricaque es más intuitiva. El desarrollo completo puede encontrarse en variostextos.Como vimos antes se trata de calcular la probabilidad del genotipo delhijo condicionada al genotipo de los padres bajo ambas hipótesis diferenciandocuando el hijo es homozigoto y heterozigoto.Hijo homozigoto (AA):XIP =Y=PP → A × M → APob → A × M → AHijo heterozigoto (AB):XIP =YPP → A × M → B + PP → B × M → A=Pob → A×M → B + Pob → B × M → AEn la X usaremos los genotipos de los padres (presunto padre: PP ymadre biológica: M) y aplicaremos las probabilidades de transmisión que vimosanteriormente.En el caso de la Y (denominador), consideramos que el padre no es elpresunto padre, sino otro individuo no relacionado (padre alternativo), lo que seconoce como padre de la población (Pob). En este caso la probabilidad detransmisión será la frecuencia poblacional para dicho marcador. Para la madre,que conocemos su genotipo hacemos igual que en el numerador (X).Habrá casos en los que el padre es incompatible con la combinaciónMadre-Hijo, por lo que el valor de X será cero, y por tanto el IP será cero.Para casos más complejos, las premisas modifican los cálculos, y encasos defectivos hay que jugar con el calculo ponderado de todas las

combinaciones posibles. Con unos ejemplos prácticos podremos entendermejor la forma de calcularlo.● Emisión de informe y defensa ante los tribunalesUna vez valorada la prueba, tanto genéticamente comoestadísticamente, hay que emitir un informe. En dicho informe se deben reflejartodos los datos que afecten a la valoración, como técnicas y marcadores, lasreferencias poblacionales empleadas, y las hipótesis valoradas y losresultados.Deben evitarse aseveraciones como “es el padre”, ya que lo que hace ellaboratorio es evaluar únicamente la evidencia genética mediante el IP, y portanto siempre hablamos de probabilidades que no son absolutas.Si es requerido, el perito deberá defender y explicar su informe ante lostribunales, cuestión harto difícil, dado el desconocimiento de personas ajenas ala genética de temas tan complejos.

IDENTIFICACIÓN DE RESTOS CADAVÉRICOSMANUEL LÓPEZ SOTOFacultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología yCiencias Forenses. Departamento de Sevilla.La aparición de restos humanos en lugares tan diversos, la exhumaciónde restos óseos cuando está en litigio alguna prueba de filiación, losaccidentes domésticos y de tráfico, los últimos atentados terroristas que estánconmocionando al mundo, están haciendo que la identificación de restoscadavéricos forme parte de la rutina diaria de un laboratorio de biología legal oforense.Cuando se trata de identificar a individuos vivos podemos recurrir amultitud que mecanismos que permiten resolver esta cuestión de forma rápida,como por ejemplo, los datos fisonómicos, el peso, la talla, el registro de voz, elD.N.I. Sin embargo, cuando queremos identificar un cadáver, es decir,reconocer si una persona es la que se busca, todos esos mecanismos que enprincipio parecen tan obvios para los sujetos vivos, en el caso de loscadáveres, brillan por su ausencia en ocasiones.Cuando nos encontramos ante unos restos cadavéricos quenecesitamos identificar unos restos cadavéricos, es preciso observar en primerlugar el estado de conservación en el que se encuentra. Éste dependerá de sise han puesto en marcha o no los procesos de destrucción natural tales comolos mecanismos de autólisis, originados por la fermentación anaeróbica de lasenzimas propias del organismo y los mecanismos de putrefacción originadospor la contaminación bacteriana. No obstante, en algunos casos, el cadáver sepuede encontrar, de forma natural o artificial, conservado en estados de:momificación, embalsamación, saponificación, corificación o congelación.De forma general, un cadáver se puede identificar siguiendo tres etapasindependientes entre sí o consecutivas: datación de los restos cadavéricosmediante unos criterios morfológicos y químicos; un diagnóstico de especiemediante análisis inmunológicos o de ADN y por último, un diagnóstico

individual mediante la determinación de la etnia, sexo, talla, y por supuesto,ADN.Cuando un laboratorio de biología forense se enfrenta a la identificacióngenética de unos restos humanos, se va a encontrar con el problema de queposiblemente en dichos restos se han puesto en marcha los mecanismos demodificación del ADN postmortem, cuyos agentes causales son los agentesoxidantes, las radiaciones ultravioletas, la humedad, la temperatura, losmicroorganismos y el pH ambiental. Todos estos factores, además de producirdaños moleculares van generar un foco de contaminación y una fuente deposibles inhibidores que requerirá una excelente praxis pericial por parte dellaboratorio.Desde el punto de vista del análisis genético y con relación a qué tipo demuestra se selecciona para su análisis, existe un gran consenso en el ámbitointernacional. El orden más lógico de selección sería, en primer lugar, sangre;en segundo lugar, músculo o pelos con raíz y, en tercer lugar, dientes ohuesos, prefiriendo de estos últimos, los huesos largos a los cortos o planos.Aunque cada laboratorio puede elegir el método de extracción que máscrea más conveniente, nosotros recomendamos para la sangre fenolcloroformo-isoamílico(FCI) seguido de un paso de microfiltración-purificación oprecipitación con etanol (si la sangre está en mal estado) o mediante columnasde extracción del tipo GFx o NSB (si la sangre es líquida y está en buenestado); para el músculo, los pelos, los huesos o los dientes tambiénrecomendaríamos el mismo método de extracción expuesto para la sangre enmal estado. No obstante, tanto los huesos como los dientes necesitarán de unprocesado previo consistente en: limpieza, para eliminar restos de suciedadadheridos a los mismos, exposición a U.V., para eliminar contaminantessuperficiales, pulverización en nitrógeno líquido, descalcificación (opcional) yextracción orgánica con FCI. Los huesos, además, se someterán a un lijado ycorte en secciones transversales de la superficie que se va a analizar entre elpaso de lavado y pulverización.Una vez extraído el ADN de los restos cadavéricos se cuantificará y sedecidirá si analizar marcadores de STRs (autosómicos como de cromosoma Y)o ADN mitocondrial.

Por último, se comentarán algunas de las identificaciones de interéshistórico como fueron las de Josef Mengele y Martin Bormann, las de JesseJames, las de la familia Romanov y las del Tercer Presidente de los EstadosUnidos, Thomas Jefferson. También abordaremos, dado el interés social queha generado en la actualidad, la identificación de los restos óseos de CristóbalColón y de Diego Colón, su hermano, así como las de Hernando Colón, hijo delafamado almirante.

IDENTIFICACIÓN GENÉTICA EN GRANDES CATASTROFESANTONIO ALONSO ALONSOFacultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología yCiencias Forenses. Departamento de Madrid.La utilización de bases de datos de ADN cobra también una vitalimportancia en los procesos de identificación humana en grandes catástrofesen los que a menudo se requiere el uso de herramientas bioinformáticascapaces de realizar búsquedas sistemáticas de un alto número de perfiles deADN de acuerdo a diferentes algoritmos y que al mismo tiempo permitanevaluar con rapidez la significación estadística (LR) de los distintos grados decoincidencia observados entre los perfiles genéticos de las muestras postmortemy los perfiles obtenidos de las posibles muestras antemortem de lasvíctimas (utensilios de aseo personal, biopsias,...) o de muestras de referencia(sangre o saliva) de sus familiares vivos.Existe un conjunto interrelacionado de factores y circunstancias quepueden comprometer o dificultar el objetivo final de la identificación genética delas víctimas de una gran catástrofe, tales como: (1) el número de víctimas ymodelo poblacional (población abierta o cerrada), (2) los mecanismos dedestrucción de los cuerpos, (3) el grado de fragmentación, (3) el estado dedegradación del ADN, (4) la accesibilidad a las muestras post-mortem o (5) eltipo de muestra de referencia disponible.En esta lección examinaremos las diferentes fases del proceso deidentificación genética (toma de muestras, análisis de ADN y tecnologíaaplicable, sistemas de búsqueda y comparación de perfiles de ADN en base dedatos, valoración estadística y criterios de significación de los distintos gradosde coincidencia) y revisaremos la problemática de este tipo especifico deanálisis de ADN en diversos casos de grandes catástrofes descritos en laliteratura científica. Pondremos especial énfasis en el progreso científicoobtenido de los esfuerzos de colaboración entre diversos laboratorios públicosy privados de EEUU durante la identificación de victimas del atentado terroristacontra el WTC de Nueva York el 11 de Septiembre de 2001. Incluyendo nosolamente el desarrollo de nuevas tecnologías (Min-STRs, SNPs, ) aplicables

al estudio de muestras post-mortem altamente degradadas, sino tambiéndiversos aspectos de la toma de muestras y su registro y documentaciónelectrónicas, así como de la interpretación estadística de la prueba del ADN ysu significación en distintos escenarios.Analizaremos los principales retos y los posibles obstáculos para laidentificación de las más de 200.000 víctimas producidas por el Tsunami (26de Diciembre de 2004) que afectó a 12 países del sur del continente Asiático.Presentaremos también nuestra propia experiencia y la problemáticasurgida en algunos casos recientes tales como el ataque terrorista en Madriddel 11 de marzo de 2004 que arrojo 191 víctimas, o el accidente aéreo delYakolev-42 en Trabzon (Turquía) el 23 de Mayo de 2003 en el que perdieron lavida 62 militares españoles que volvían a España de una misión de paz enAfganistán.

BASES DE DATOS DE ADNANTONIO ALONSO ALONSOFacultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología yCiencias Forenses. Departamento de Madrid.Las bases de datos de ADN con fines de investigación criminal sonactualmente las bases de datos genéticas de mayor interés para loslaboratorios forenses. Gracias a la experiencia acumulada por un gran númerode países en todo el mundo (que ya han desarrollado una legislaciónespecífica) hoy sabemos que la comparación sistemática de los perfiles deADN provenientes de distintas causas penales estructurados en una mismabase de datos, puede ser una herramienta muy eficaz para reducir el índice decriminalidad de determinados delitos sin autor conocido y, especialmente,aquellos en los que existe una alta reincidencia. De esta forma la prueba delADN ha dejado de ser un mero testigo “a posteriori" de los hechos criminalespara convertirse potencialmente en una herramienta preventiva de lacriminalidad. Serán, por tanto, estas bases de datos las que centren gran partedel contenido de esta presentación en la que realizaremos una revisión de lasituación en Europa para, con posterioridad, hablar de la situación especificade nuestro país en este tema.No debemos de olvidar, sin embargo, que existen otro tipo de bases dedatos genéticas de gran interés para la comunidad científica forense y quetambién serán abordadas en esta lección del curso. Me estoy refiriendo porejemplo a las bases de datos de ADN para la identificación de desaparecidosentre las que destacan los proyectos de identificación de victimas de conflictosbélicos o de victimas de catástrofes. (Los retos a los que se enfrenta la pruebadel ADN en la identificación genética de victimas de grandes catástrofes,serán tratados por el autor en otra lección de la presente edición del curso deBiología Forense).Por otro lado, se abordarán las bases de datos poblacionales demarcadores de ADN humanos utilizados en genética forense (muchas de ellas

públicas y accesibles por Internet) que se han convertido en una herramientaesencial para poder realizar una evaluación bioestadística adecuada del valorde la prueba del ADN, tanto de marcadores STR autosómicos como de datoshaplotípicos (Y-STR o mtDNA).Haremos también una breve referencia a un grupo heterogéneo debases de datos de ADN que emergen en los diversos ámbitos de aplicación delas ciencias forenses y que pueden ser de utilidad en muy diversosdiagnósticos que van desde la identificación genética de vestigios de distintasespecies animales en la escena del crimen a la identificación de especiestóxicas o patógenas.Por último, nos asomaremos al futuro de las bases de datos de ADNforense en la era de la genómica.

MESA REDONDAEL INFORME PARCIAL Y SU DEFENSA ANTE LOS TRIBUNALESPONENTE: CARLOS PUIGCERVER ASORProfesor de Derecho Procesal de la Universidad de ValenciaLA VALORACIÓN DE LA PRUEBA PERICIAL1.- INTRODUCCIÓNCuando un Juez o Tribunal dicta una sentencia realiza un acto depensamiento que es un juicio lógico jurídico que responde a la estructura delsilogismo en el que, la premisa mayor es la norma, la premisa menor es elhecho y la consecuencia es el fallo o parte dispositiva de la resolución judicial.La sentencia es, pues, aplicación del derecho mediante la subsunción deun hecho en una norma jurídica de manera que se produzca una determinadaconsecuencia jurídica.En uno de los estadios de este proceso intelectual el juez debe fijar loshechos ocurridos en la realidad y para ello deberá valorar la prueba practicada.2. LA VALORACIÓN DE LOS MEDIOS DE PRUEBAEn definitiva, para que el juzgador conozca si se han producido o no loshechos afirmados en el proceso debe valorar la prueba practicada lo queimplica dos operaciones, una primera denominada interpretación en la quedeberá extraer cuáles son las afirmaciones, las consecuencias que sedesprenden de las pruebas y una segunda que será la de darles valor para fijaro no unos determinados hechos como producidos o existentes.A) Valoración libre y valoración tasada o legal de los medios depruebaEsa segunda labor que consiste en la de fijar el valor de ese medio deprueba, puede estar reglada por la ley, en el sentido de establecer unasnormas o criterios para valorar, son los llamados medios de prueba de

valoración legal o tasada, o, por el contrario, puede dejarse a la libreapreciación del juzgador, son los llamados medios de prueba de valoraciónlibre.B) La valoración de la prueba pericialLa prueba pericial es un medio de prueba de libre valoración, es decir,desde el plano teórico, los informes periciales, cualquiera que sea la autoridadcientífica de la que emanan no constituyen verdad intangible o incontrovertible,sino que sólo son una opinión científica o técnica que será valorada por el Juezo Tribunal, pues de otro modo, como afirma ALONSO PÉREZ, se le llegaría avincular de tal manera que el perito se convertiría en juez sustituyendo a ésteen su función.Ahora bien, prueba de valoración libre no quiere decir prueba arbitrariade modo que el Tribunal no puede rechazar de manera irrazonada o caprichosaun dictamen pericial, sino que deberá expresar las razones que le llevan a nodarle valor y el proceso lógico llevado a cabo para llegar a esa conclusión, loque no resultará fácil cuando deban de manejarse conocimientos científicos otécnicos de gran precisión o complejidad, por lo que en innumerablesocasiones el juzgador concederá a la prueba pericial un valor absoluto.3. TRATAMIENTO JURISPRUDENCIAL DE LAS PRUEBAS BIOLÓGICASDE PATERNIDADEl valor que se concede por los Tribunales a las pruebas biológicas depaternidad es absoluto, casi de certeza, aunque dicho valor no se atrevan aconfesarlo directamente en todos los casos, disimulando el valor determinantede la misma mediante referencias a otros medios de prueba que valoradosconjuntamente les llevan a la misma conclusión.Es significativo que en todos los casos en que se ha practicado unaprueba de paternidad y su resultado ha dado alta probabilidad de paternidad, lasentencia ha terminado por declarar la filiación, eso sí declarando que no se leestá dando valor absoluto o de certeza.Sirva de muestra la Sentencia del Tribunal Supremo (Sala de lo Civil), de20 mayo 1991 en donde se afirma que la probanza biológica de la paternidadconstituye una prueba directa, pero no plena y absoluta, no obstante ha deatribuírsele valor de casi total aproximación a la verdad, sobre todo, cuando

sucede, como en la presente controversia, que dicho informe pericial, ha sidoemitido por un órgano técnico oficial, dotado de medios y eficacia, para suelaboración más exacta, cual es el Instituto Nacional de Toxicología,dependiente del Ministerio de Justicia y que concurren el 99,9998 por cien deprobabilidad, y con un índice (IP) de paternidad de 840191:1, y según laposición científica de K. Hammel, ello supone una «paternidad prácticamenteprobada».También la Sentencia del Tribunal Supremo núm. 1070/1992 (Sala de loCivil), de 24 noviembre que con un porcentaje del 99,9324% en las pruebasbiológicas afirma que debe entenderse que la paternidad está prácticamenteprobada, encontrándonos con ante una prueba de casi absoluta fiabilidad.Finalmente es de destacar la Sentencia del Tribunal Supremo de 2 deenero de 1991 en donde se decía que «La probabilidad de paternidad (w)obtenida es de 99,91% valor que se encuentra dentro del rango consideradopor K. Hummel y colaboradores como Paternidad prácticamente probada.Asimismo el Índice de Paternidad (IP) obtenido es de 1293,48, valor que seencuentra dentro de rango considerado por los mismos autores comoPaternidad prácticamente probada, y de aquí, que proyectando cuantoantecede al meritado caso de que se trata, es de llegar a la conclusión de queen él, se consiguió una certeza casi absoluta en el resultado de la valoración dela prueba».4. VALORACIÓN JUDICIAL DE LA NEGATIVA A SOMETERSE A LASPRUEBAS BIOLÓGICAS DE PATERNIDADPara concluir debemos hacer una referencia a las graves y negativasconsecuencias que tiene el no someterse a las pruebas biológicas, pues,generalmente, dan lugar a una sentencia declarando la paternidad siempre ycuando en el proceso se hayan acreditado otras circunstancias tales como laexistencia de relaciones, sostenimiento económico o relación personal,habiéndose rechazado todos las excusas alegadas para negarse a su prácticacuando están basadas en los derechos constitucionales a la intimidad personaly familiar o a la integridad física y moral, admitiéndose tan solo en dos casos, asaber, cuando exista un grave peligro para la salud, o cuando no exista unmínimo de prueba que permita deducir la posibilidad de paternidad.

Recogen esta doctrina las siguientes sentencias: Sentencia AudienciaProvincial núm. 14/2004 Asturias (Sección 5ª), de 22 enero de 2004, Sentenciadel Tribunal Supremo de 11 de septiembre de 2003 y Sentencia del TribunalConstitucional 95/1999, de 31 de mayo.BIBLIOGRAFÍA DE INTERÉS:1.- FONT SERRA, EDUARDO; El dictamen de peritos y el reconocimientojudicial en el proceso civil. Ed.: La Ley, 1ª edición, mayo de 2000. Las Rozas(Madrid)2.- LÓPEZ-MUÑIZ GOÑI, MIGUEL; La prueba pericial. Guía práctica yjurisprudencia. Ed.: Colex. 2ª edición. Madrid 2004.3.- ALONSO PÉREZ, FRANCISCO; Medios de investigación en el procesopenal. Ed.: Dykinson, 2ª edición. Madrid 2003.3.- MONTERO AROCA, JUAN; BARONA VILAR, SILVIA; GÓMEZ COLOMER,JUAN-LUIS Y MONTÓN REDONDO, ABERTO, “Derecho jurisdiccional I”, Ed.Tirant lo Blanch. 13ª edición, Valencia 2004.4.- MONTERO AROCA, JUAN; BARONA VILAR, SILVIA; GÓMEZ COLOMER,JUAN-LUIS Y MONTÓN REDONDO, ABERTO, “Derecho jurisdiccional II”, Ed.Tirant lo Blanch. 13ª edición, Valencia 2004.5.- ALMAGRO NOSETE, JOSÉ; GIMENO SENDRA, VICENTE; CORTÉSDOMÍNGUEZ, VALENTÍN Y MORENO CATENA, VÍCTOR, “Derecho procesal”Tomo I (Vol. I), Ed. Tirant lo Blanch. 4ª edición, Valencia 1989.PONENTE: FELIX SÁNCHEZ UGENADirector del Instituto de Medicina Legal de BadajozEl Juez solicitará un informe pericial cuando, para conocer oapreciar algún hecho, fueran necesarios conocimientos científicosespecializados. Aunque tradicionalmente se dice que los Jueces sentenciansegún se les informa, lo cierto es que nuestra Legislación establece que “LosJueces y Tribunales apreciaran la prueba pericial según las reglas de la sanacrítica, sin estar obligados a sujetarse al dictamen de los peritos”.

REQUISITOS Y CUALIDADES QUE DEBE REUNIR EL PERITO1.- CUALIDADES PERSONALESa) Objetividad.b) Capacidad de reflexión y sentido comúnc) Prudencia.d) Imparcialidad..e) Veracidad.2.- FORMACIÓN CIENTÍFICA.3.- CONOCIMIENTOS JURÍDICOS.VALOR JERÁRQUICO DE LA PRUEBA PERICIAL− CERTEZA MATEMÁTICA. Consiste en la comprobación de las leyesmismas del pensamiento, por lo que partiendo de postulados ciertos seha de llegar a resultados exactos.− CERTEZA MORAL. Se trata de una convicción sin pruebas sólidasque la sustenten.− CERTEZA FÍSICA. Se encuentra entre lo absoluto de la certezamatemática y la relatividad de la certeza moral.− CERTEZA LEGAL. A estos tres grado de certeza podemos añadir enla práctica la denominada certeza legal. Es aquella que aunque no esabsoluta, si es suficiente para la administración de justicia, ya que“permite razonablemente fijar una conclusión que responda a criterioscientíficos y lógicos, aunque no alcance una evidencia integral”.

EL INFORME PERICIALEs un documento médico-legal emitido por orden de las autoridades oa petición de particulares sobre el significado de ciertos hechos contrascendencia judicial o administrativa. Puede ser evacuado por un soloperito o por una corporación científica: Instituto Nacional de Toxicología,Cuerpo de Médicos Forenses, Colegios de Médicos, Reales Academias, etc.y suele ser solicitado en actuaciones judiciales ya adelantadas.Sus características fundamentales serian:a) Se trata de un documento oficial, parte integrante e importante en elprocedimiento, que contienen datos médico-biológicos y datossusceptibles de ser discutidos.b) La discusión tiene como objetivo reconstruir un hecho de interés judicialsucedido en el pasado.c) No se trata de aportar una opinión, sino una demostración.d) El informe generalmente se continua en una declaración verbal ante eltribunal.Desde el punto de vista formal, un Informe Pericial debe constar deconsta de las siguientes partesPREÁMBULO. Se inicia con los hombres del perito o peritos, sus títulos,residencia, autoridad o persona que ha solicitado el informe y objeto delmismo, reproduciéndolo literalmente de la orden recibida.RELACIÓN Y DESCRIPCIÓN DE LOS OBJETOS ACERCA DE LOSCUALES DEBE EMITIRSE EL INFORME. Pueden ser documentos médicolegales,objetos (armas, manchas, huellas o cualquier otro tipo de pruebasde convicción) o personas (inculpado lesionado, cadáver). Tanto latrascripción de los documentos como la descripción de los objetos y

personas será minuciosa y fidedigna, y a ser posible acompañarse defotografías, croquis...OPERACIONES PRACTICADAS. Conviene su descripción, puntualizandolas técnicas que se hayan usado en cada caso.VALORACIÓN. Es lo fundamental del informe. Se trata de la discusión deestos resultados, de su estudio científico, doctrinal y técnico. Precisa unrazonamiento lógico y claro que sirva de nexo de unión entre los hechos quese recogen y las conclusiones que se sientan.CONCLUSIONES. Deben ser entresacadas de las consideracionesefectuadas en el razonamiento anterior. Se formulan numerándolas enpárrafos separados, haciendo tantos apartados como afirmaciones onegaciones se hagan.FÓRMULA FINAL. Generalmente es la siguiente: “Lo cual es cuanto puedemanifestar en cumplimiento de la misión que le había sido encomendada”.Fecha y firma.EXPOSICIÓN DE CASOS PRÁCTICOS