Tècnicas de histoquimica ,IHQ y utilidad diagnostica en patología ...

Técnicas de Histoquímica e Inmunohistoquímicaen Patología Neuromuscular: utilidaddiagnósticaSoraya Barrera Cabañeros ( TEAP)Servicio de Anatomía Patológica y Neuropatología. Hospital MeixoeiroComplexo Hospitalario Universitario de Vigo – CHUVIInstituto de Investigación Biomédica de Vigo

¿QUÉ SON LAS ENFERMEDADESNEUROMUSCULARES?• Son enfermedades crónicas de evolución variable• La mayoría son de origen genético y algunas adquiridas• Se caracterizan por debilidad muscular, miotonía,calambres…• Afectan al SNC, SNP, unión n-m y fibra muscular• Pueden afectar a otros órganos• Su aparición puede ser en cualquier etapa de la vida

SARCÓMERO: Unidad contráctil del músculo

Enfermedades Neuromusculares

Biopsia muscular+Historia clínicaDatos paraclínicosDisección - OrientaciónLaboratorio MiopatologíaM/EInmunogoldCongelaciónBanco de TejidosCortes criostatoExtracción de DNABanco de DNAHistoquímicaInmunohistoquímicaMicroscopía ConfocalWbBioquímicaPCR multiplexRFLPSecuenciaciónOtrasDIAGNÓSTICOConsejo genético

250-300 biopsias de músculo y nervio/año(85% de la Comunidad Gallega)

MorfologíaHistoquímicaInmunohistoquímicaEstudio de proteínasMicroscopía electrónicaEstudio genéticoEstudio bioquímico

ALTERACIONES MORFOLÓGICAS BÁSICAS ITAMAÑO Y FORMA• Fibras atróficas, anguladas o no• Fibras hipertróficas• Fibras hipercontraídas• Fibras redondeadas• Figuras de “splitting”NÚCLEOS• Múltiples• Internalizados• Agregados (“clumps”nucleares)

ALTERACIONES MORFOLÓGICAS BÁSICAS IICITOPLASMA• Degeneración – necrosis• Miofagia• Vacuolización: lípidos, glucógeno, vacuolas autofágicas• Invasión parcialESPACIO EXTRACELULAR• Infiltrados inflamatorios• Fibrosis• Sustitución adiposa

TRICRÓMICO DE GOMORI(Modificado por Engel y Cunningham, 1963) Patrón intermiofibrilar Mitocondrias (RRF) Bastones nemalínicos Cuerpos citoplásmicos Retículo sarcoplásmico Vacuolas autofágicas

Fibras(“ragged red fibers”)Bastones nemalínicosVacuolas ribeteadas

TÉCNICAS HISTOQUÍMICAS1- Valorar el exceso de un sustrato determinado:glucógeno, lípidos2- Mostrar cambios estructurales no visibles contécnicas histológicas3- Evaluar los tipos de fibras musculares:1, 2A, 2B, 2C4- Ausencia de un enzima determinado

OIl REDGotas lipidicas, lipofucsinaPASTipos de fibrasGlucógeno (lisosomal, libre)

HISTOQUÍMICA. PRINCIPIOS BÁSICOS IVENZIMAS OXIDATIVAS• NADH (Nicotinamida adeninadinucleótido)– Patrón intermiofibrilar:• Retículo sarcoplásmico• Mitocondrias• SDH (Succino-Deshidrogenasa)– Mitocondrias• COX-SDH (Citocromo oxidasa )– Mitocondrias

NADHCentral coreFibras apolilladasTargetsFibras anulares

Miopatía mitocondrialSDHCOX-SDHHEGomori

Miopatía por agregados tubularesHETRINADHSDH

ATP-asas9.4 4.6Fibrastipo 1Fibrastipo 2aFibrastipo 2bFibrastipo 2cATPasa9.4ATPasa4.63ATPasa4.35MarrónclaroMarrónoscuroMarrónoscuroMarrónoscuroBlancasMarrónoscuroMarrónclaroMarrónoscuroMarrónclaroBlancas Blancas Marrónclaro4.3

Atrofia por denervación4.3

Atrofia neurógena

HEPASMiofosforilasaMiofosforilasa

Mioadenilato DesaminasaCONTROL (MAD+)MAD NEGATIVOMiopatía por déficit de MAD

INMUNOHISTOQUÍMICA• Permite visualizar y localizar proteínas específicas déficit primario déficit secundario• Debe valorarse conjuntamente con las técnicashistológicas e histoquímicas

Guillaume- BenjaminAmand Duchenne(1806-1875)1868: Paralysie pseudo-hypertrophique,or myosclerotique, de l’Enfance(Archives Générales de Médecine)

ANTICUERPOS• Espectrina• Distrofina (Dys 1, 2 y 3)• DRP1• DRP2• Alfa-SG• Beta-SG• Gamma-SG• Delta-SG• Alfa-DG• Beta-DG• Disferlina• Calpaína 3• Merosina• Alfa2-laminina• Emerina• LAMP2• Caveolina• Miotilina• Miosina (slow, fast)• Troponina PGP 9.5• Colágeno VI• Notch 3• Serie linfoide, desmina,marcadores vasculares,actina, etc

DuchenneDistrofinaEspectrinaUtrofina (DRP2, Control)Utrofina

BeckerDystrophinDRP

CMDMerosinSpectrin

Emery DreyfussEmerinEmerin, Control

Emery DreyfussEmerina, ControlEDMDEmerina, ControlEDMD

-DISTROGLICANOControlAntibody: clon VIA4 (glycosylated epytope)

INMUNOHISTOQUÍMICADIFICULTADES DE INTERPRETACIÓN Y SOLUCIONES• Interacción de varias proteínas (distrofina-sarcoglicanos;disferlina-otras)• Pueden obtenerse falsos resultados si se usa un únicoanticuerpo• La ausencia de una proteína puede dar lugar a lasobreexpresión de otras (distrofina y dystrophin-relatedprotein)• Las proteínas nucleares se expresan en cualquier tipode célula (emerina, lamina A/C)

PRINCIPIOS PARA EL MANEJO DE LAS MUESTRAS• LA MUESTRA DEBE SERVIR PARA TODOS LOS ESTUDIOS• CUALQUIER MUESTRA DEBE PODER RETOMARSE EN ELFUTURO (Bancos de tejidos y ADN)