Université de Ouagadougou Université Libre de Bruxelles Unité de ...

Université de Ouagadougou Université Libre de Bruxelles
Unité de Formation et de Recherche Institut de Pharmacie
en Sciences de la Santé (UFR/SDS)
3 ème Cycle Spécialisé et Doctoral Laboratoire de Chimie Bioanalytique,
- Pharmacologie Appliquée de Toxicologie, et de Chimie Physique
- Toxicologie Appliquée Appliquée
et
Laboratoire de Pharmacologie Laboratoire de Pharmacie Galénique
et de Toxicologie et de Biopharmacie
DEVELOPPEMENT D’UN IMPLANT BIODEGRADABLE A
BASE DE GENTAMICINE ET DE MONOLEINE DESTINE AU
TRAITEMENT DES OSTEOMYELITES CHRONIQUES
Promoteur : Prof. Jacques DUBOIS
Par
OUEDRAOGO Moustapha
Pharmacien
Co-promoteur : Prof. Innocent Pierre GUISSOU
Prof. Karim AMIGHI
Thèse présentée en vue de l’obtention du Grade de
Docteur en Sciences Biomédicales et Pharmaceutiques
Année académique 2007/2008

DEDICACES
Je dédie cette thèse à toute ma famille pour l’affection et le soutien qui ne m’ont jamais fait
défaut.
I

REMERCIEMENTS
Au terme de ce travail, je tiens à exprimer toute ma profonde gratitude à Monsieur le
Professeur Innocent Pierre GUISSOU pour la confiance qu’il a placée en moi en acceptant
non seulement de diriger mon programme de Doctorat, mais aussi de guider mes premiers pas
dans l’enseignement et la recherche. C’est pourquoi, je me fais le devoir de lui rendre cette
confiance et de lui porter tout le respect qu’il mérite. Sa grande expérience en recherche et en
enseignement, sa rigueur scientifique, ses conseils et ses encouragements m’ont été et me
seront profitables. Il est pour moi un Maître.
J’exprime aussi toute ma reconnaissance aux Professeurs Jacques DUBOIS, Karim
AMIGHI, Viviane HENSCHEL de l’Université Libre de Bruxelles, Brigitte EVRARD de
l’Université de Liège pour m’avoir accepté dans leur Laboratoire respectif et pour
l’encadrement, les conseils dont j’ai pu bénéficier.
Mes remerciements aussi au Professeur Pierre DUEZ pour m’avoir permis de réaliser
les analyses chimiques par Chromatographie en Phase Gazeuse dans son Laboratoire.
A notre Maître et Juge, le Professeur Amadou DIOUF (de l’Université Cheick Anta
Diop), merci pour l’honneur que vous nous faites en acceptant de présider ce Jury. Vos
grandes qualités scientifiques ont certainement prévalu quant à votre choix par nos maîtres
pour juger ce travail. Veuillez trouver ici l’expression de notre grande estime.
Je remercie également les Professeurs Agrégés Rasmata OUEDRAOGO/ TRAORE
(Laboratoire de Microbiologie/Université de Ouagadougou), Rasmané SEMDE (Laboratoire
de Pharmacie Galénique et de Biopharmacie/ Université de Ouagadougou), Issa T. SOME
(Laboratoire de Chimie Analytique/ Université de Ouagadougou) pour leur participation
active à ce travail. Leurs conseils ne m’ont jamais fait défaut. Toute ma profonde gratitude.
Au Professeur Agrégé Julien Yilboudo (Orthopédie-Traumatologie), je lui exprime ma
profonde gratitude pour avoir été l’un des initiateurs de l’étude, et pour ses précieux conseils
II

quant au choix des caractéristiques que pourrait avoir l’implant que nous tentions de mettre au
point.
Mes remerciements vont aussi aux Docteurs Innocent NACOULMA, Christophe S.
DA, Hamado KAFANDO, tous Chirurgiens au Centre Hospitalier Universitaire de
Ouagadougou (CHU-YO), pour leur participation active aux essais cliniques de l’implant que
nous avons mis au point. Ils ont facilité mes travaux dans le service de Chirurgie à travers le
climat de confiance et de cordialité qu’ils ont su créer. Par la même occasion, je remercie tout
le personnel du Service de Traumatologie/Orthopédie, du Département de la Pharmacie
Hospitalière et des Laboratoires du CHU-YO, et tous les patients ayant spontanément accepté
de participer aux essais cliniques.
Je dois aussi remercier les Professeurs Robert B. SOUDRE, Olga GOUMBRI et les
Docteurs Mélanie SANOU, Norbert RAMDE du Laboratoire d’Anatomie et de cytologie
pathologiques du CHU-YO pour leur participation à la réalisation des études de réaction à
l’hôte de l’implant.
Je remercie tous les Doctorants et le personnel des Laboratoires de Pharmacie
Galénique/Biopharmacie, et de Chimie Bioanalytique/ Toxicologie/ Chimie Physique
Appliquée de l’Université Libre de Bruxelles (Jérôme, Gilles, Charlemagne, Thami, Jamila,
Philippe DELEUZE, Touria, Nancy, Marie, …et j’en oublie certainement) pour le climat de
collaboration plein de cordialité qu’ils ont su créer dans les laboratoires. Mes remerciements
vont aussi à Henri MOTTE, Caroline BRIQUET et Nicole KABORE pour leur participation
au début de nos travaux.
Je remercie le Docteur Moussa OUEDRAOGO, Assistant en Pharmacologie
(Université de Ouagadougou) pour les échanges dignes d’intérêt que j’ai toujours eus avec lui
et aussi pour ses grandes qualités humaines.
travail.
Je remercie tous ceux, qui d’une manière ou d’autres, m’ont permis de réaliser ce
III

Enfin, je garde mes derniers remerciements et non les moindres à la Commission
Universitaire pour le Développement (CUD), au Conseil Interuniversitaire de la Communauté
Française de Belgique (CIUF), à l’APEFE, au CGRI pour leur appui financier à la réalisation
de ce travail. Je m’en voudrai de ne pas citer quelques personnalités, qui à travers leurs
institutions respectives, ont été à nos côtés pour la réalisation de nos travaux: Noëlle
LEJEUNE, Emile Charlier, Francis DEPREZ, Anselme SAWADOGO, …
IV

AVANT-PROPOS
Les travaux de thèse que nous présentons est une des retombées de la Coopération
Nord-Sud entre d’une part l’Université Libre de Bruxelles, l’Université d’Etat de Liège, et
d’autre part l’Université de Ouagadougou.
En effet, L’Université de Ouagadougou, le Centre National de Recherches
Scientifiques et Technologiques (Burkina Faso) et l’Université Libre de Bruxelles (ULB)
entretiennent des relations de Coopération depuis une vingtaine d’années.
Ces relations se sont concrétisées au niveau de la Pharmacie par:
- la création et l’équipement au Burkina Faso, de l’Institut de Recherche sur les
Substances Naturelles (IRSN);
- la construction et l’équipement d’une Unité d’extraction de plantes médicinales au
sein de l’IRSN;
- la formation des Chercheurs par la recherche;
- la construction et l’équipement à l’IRSN d’une unité de production
pharmaceutique (U-PHARMA) destinée à la fabrication de formes
pharmaceutiques sèches (comprimés, gélules…);
- la formation à l’ULB de pharmaciens burkinabé et de docteurs en Sciences
Pharmaceutiques;
- un soutien à la formation de pharmaciens au Burkina Faso.
A travers les présents travaux, les différents acteurs de cette coopération pensent
apporter leur contribution à la résolution d’un problème de santé publique ayant aussi un
intérêt scientifique: le traitement des ostéomyélites chroniques.
Il s’est agi donc pour nous de mettre au point un implant biodégradable susceptible
d’être utilisé efficacement dans le traitement des ostéomyélites chroniques. Pour atteindre cet
objectif, il nous a fallu passer en revue presque toutes les étapes du développement d’un
nouveau médicament. Ce qui nous a permis d’approfondir non seulement nos connaissances
en Pharmacie Galénique, en Physico-chimie, en Chimie Analytique, en Microbiologie, en
Essais cliniques mais aussi et surtout en Etudes toxicologiques in vitro et in vivo d’un
médicament en phase de développement.
Les résultats auxquels nous sommes parvenus sont encourageants quant à une
contribution à une meilleure prise en charge des ostéomyélites chroniques. L’implant mis au
point permettra d’augmenter les chances de traitement des ostéomyélites chroniques.
V

La Salle "Blanche″ installée à l’occasion de nos travaux pourra servir non seulement
comme outil de formation, mais aussi comme site de fabrication d’autres formes
pharmaceutiques stériles.
Ces travaux sont une preuve que Recherche Fondamentale et Recherche Appliquée
peuvent être jumelées pour approfondir les connaissances théoriques et résoudre les
problèmes de santé des populations.
VI

SOMMAIRE
VII

Page
DEDICACES ..........................................................................................................................................................I
REMERCIEMENTS ........................................................................................................................................... II
AVANT-PROPOS.................................................................................................................................................V
SOMMAIRE.......................................................................................................................................................VII
RESUME .......................................................................................................................................................... XIV
ABSTRACT...................................................................................................................................................... XVI
LISTE DES SIGLES ET ABREVIATIONS............................................................................................... XVIII
LISTE DES TABLEAUX ..................................................................................................................................XX
LISTE DES FIGURES ...................................................................................................................................XXII
INTRODUCTION GENERALE ......................................................................................................................... 1
PREMIERE PARTIE: DONNEES BIBLIOGRAPHIQUES............................................................................ 5
I. L’OSTEOMYELITE................................................................................................................................... 6
I.1. CLASSIFICATION DES OSTEOMYELITES.................................................................................................. 6
I.2. PATHOGENESE BACTERIENNE ............................................................................................................... 8
I.3. LE TERRAIN .......................................................................................................................................... 8
I.3.1. Infection osseuse et diabète............................................................................................................. 8
I.3.2. Ostéomyélite et polyarthrite rhumatoïde......................................................................................... 9
I.4. ASPECTS CLINIQUES.............................................................................................................................. 9
I.4.1. L’ostéomyélite hématogène ............................................................................................................. 9
I.4.2. Les ostéomyélites par inoculation directe ou par contiguïté........................................................... 9
I.4.3. L’ostéomyélite chronique .............................................................................................................. 10
I.5. TRAITEMENT....................................................................................................................................... 10
I.5.1. Traitement médical........................................................................................................................ 10
I.5.2. Traitement chirurgical .................................................................................................................. 10
II. LES IMPLANTS ....................................................................................................................................... 10
II.1. LES IMPLANTS NON BIODEGRADABLES ............................................................................................... 11
II.2. LES IMPLANTS BIODEGRADABLES ....................................................................................................... 11
III. REPONSE DE L’HOTE A UN IMPLANT ........................................................................................ 12
III.1. REACTION INFLAMMATOIRE AIGUË..................................................................................................... 12
III.2. REACTION INFLAMMATOIRE CHRONIQUE............................................................................................ 13
III.3. REPARATION TISSULAIRE.................................................................................................................... 13
III.4. REACTION GRANULOMATEUSE ........................................................................................................... 14
IV. LE SULFATE DE GENTAMICINE................................................................................................... 14
IV.1. PROPRIETES PHARMACOCINETIQUES................................................................................................... 15
IV.2. MODE D’ACTION................................................................................................................................. 16
IV.3. PRECAUTIONS ..................................................................................................................................... 16
IV.4. TOXICITE DES AMINOSIDES ................................................................................................................. 17
IV.4.1. Mécanisme d’action toxique au niveau rénal................................................................................ 17
IV.4.2. Caractéristiques sémiologiques de la néphropathie ..................................................................... 17
VIII

IV.4.3. Histologie ...................................................................................................................................... 18
IV.4.4. Toxicité auditive ............................................................................................................................ 18
V. LA MONOLEINE ..................................................................................................................................... 19
V.1. PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES....................................................................................................... 19
V.2. TOXICITE ............................................................................................................................................ 20
V.3. LES METABOLITES DE LA MONOLEINE................................................................................................. 20
V.3.1. Le glycérol..................................................................................................................................... 20
V.3.2. L’acide oléique.............................................................................................................................. 21
VI. ETAPES DE DEVELOPPEMENT D’UN MEDICAMENT............................................................. 22
VI.1. LES PRE-REQUIS A L’EXPERIMENTATION CLINIQUE............................................................................. 22
VI.1.1. Dossier technique et analytique .................................................................................................... 22
VI.1.2. Etudes pharmacologiques ............................................................................................................ 23
VI.1.3. Etudes toxicologiques.................................................................................................................... 23
VI.2. L’EXPERIMENTATION CLINIQUE.......................................................................................................... 27
VI.2.1. Phase I........................................................................................................................................... 27
VI.2.2. Phase II ......................................................................................................................................... 27
VI.2.3. Phase III........................................................................................................................................ 28
VI.2.4. Etudes après AMM........................................................................................................................ 28
VII. BONNES PRATIQUES DE FABRICATION DES MEDICAMENTS STERILES ....................... 28
VII.1. GENERALITES ..................................................................................................................................... 28
VII.2. SURVEILLANCE MICROBIOLOGIQUE DES ZONES A ATMOSPHERE CONTROLEE...................................... 30
VII.3. PRODUITS STERILISES DANS LEUR RECIPIENT FINAL............................................................................ 31
VII.4. PREPARATION ASEPTIQUE................................................................................................................... 31
VIII. ESSAIS DE STERILITE ET DES ENDOTOXINES BACTERIENNES DE MEDICAMENTS
STERILES ........................................................................................................................................................... 32
VIII.1. ESSAIS DE STERILITE........................................................................................................................... 32
VIII.2. ESSAIS DES ENDOTOXINES BACTERIENNES.......................................................................................... 33
VIII.2.1. Historique, nature et toxicité des endotoxines............................................................................... 33
VIII.2.2. Techniques de recherche et de quantification des endotoxines bactériennes................................ 34
VIII.2.3. Mise en œuvre d’un test LAL par la technique de gélification ...................................................... 34
DEUXIEME PARTIE : NOTRE ETUDE......................................................................................................... 38
CADRE DE L’ETUDE ....................................................................................................................................... 39
OBJECTIFS ........................................................................................................................................................ 40
CHAPITRE I: FABRICATION D’IMPLANTS BIODEGRADABLES DESTINES AU TRAITEMENT
D’OSTEOMYELITES CHRONIQUES............................................................................................................ 41
INTRODUCTION............................................................................................................................................... 42
I. MATERIEL ET METHODES ................................................................................................................. 42
I.1. DETERMINATION DE LA CONTAMINATION PARTICULAIRE DE L'AIR DES DIFFERENTS COMPARTIMENTS
DE LA "SALLE BLANCHE" .................................................................................................................................. 44
I.2. CONTROLE DE LA BIOCONTAMINATION DE L'AIR DES DIFFERENTS COMPARTIMENTS DE LA "SALLE
BLANCHE" ......................................................................................................................................................... 45
I.3. CONTROLE DE LA BIOCONTAMINATION DES SURFACES DE TRAVAIL ................................................... 47
IX

I.4. PREPARATION DES IMPLANTS.............................................................................................................. 47
II. RESULTATS ET DISCUSSIONS............................................................................................................ 50
II.1. DETERMINATION DE LA CONTAMINATION PARTICULAIRE ET DE LA BIOCONTAMINATION L'AIR DES
DIFFERENTS COMPARTIMENTS DE LA "SALLE BLANCHE"................................................................................... 50
II.2. CONTROLE DE LA BIOCONTAMINATION DES SURFACES DE TRAVAIL ................................................... 52
II.3. PREPARATION ..................................................................................................................................... 53
CONCLUSION.................................................................................................................................................... 53
CHAPITRE II: CARACTERISATION PHYSICO-CHIMIQUE DES IMPLANTS ET CINETIQUE DE
LIBERATION DE LA GENTAMICINE.......................................................................................................... 54
INTRODUCTION............................................................................................................................................... 55
I. MATERIEL ET METHODES ................................................................................................................. 55
I.1. CARACTERISATION PHYSICO-CHIMIQUE.............................................................................................. 55
I.1.1. Observation macroscopique.......................................................................................................... 55
I.1.2. Microscopie sur platine chauffante (Hot Stage Microscopy ou HSM).......................................... 55
I.1.3. Calorimétrie différentielle à balayage (Differential Scanning Calorimetry ou DSC)................... 55
I.1.4. Diffraction des rayons X (DRX) .................................................................................................... 56
I.1.5. La thermogravimétrie (TGA)......................................................................................................... 56
I.1.6. Etude rhéologique ......................................................................................................................... 57
I.1.7. Détermination de la teneur en eau ................................................................................................ 57
I.1.8. Détermination de la teneur en éthanol résiduel ............................................................................ 57
I.1.9. Identification et dosage des acides gras libres.............................................................................. 58
I.2. CINETIQUE DE LIBERATION DU SULFATE DE GENTAMICINE ................................................................. 60
I.3. ETUDE DE STABILITE........................................................................................................................... 62
II. RESULTATS ET DISCUSSIONS............................................................................................................ 63
II.1. CARACTERISATION PHYSICO-CHIMIQUE.............................................................................................. 63
II.1.1. Observation macroscopique.......................................................................................................... 63
II.1.2. Observation microscopique........................................................................................................... 64
II.1.3. Calorimétrie différentielle à balayage (Differential Scanning Calorimetry ou DSC)................... 65
II.1.4. Diffraction des rayons X (DRX) .................................................................................................... 67
II.1.5. La thermogravimétrie (TGA)......................................................................................................... 68
II.1.6. Etude rhéologique ......................................................................................................................... 71
II.1.7. Détermination de la teneur en eau ................................................................................................ 73
II.1.8. Détermination de la teneur en éthanol résiduel ............................................................................ 74
II.1.9. Identification et dosage des acides gras libres.............................................................................. 75
II.2. CINETIQUE DE LIBERATION DU SULFATE DE GENTAMICINE ................................................................. 76
II.3. ETUDE DE STABILITE........................................................................................................................... 80
CONCLUSION.................................................................................................................................................... 82
CHAPITRE III: CONTROLE MICROBIOLOGIQUE DES MATIERES PREMIERES ET DU
PRODUIT FINI................................................................................................................................................... 83
INTRODUCTION............................................................................................................................................... 84
I. MATERIEL ET METHODES ................................................................................................................. 84
I.1. ESSAI DE STERILITE............................................................................................................................. 84
I.1.1. Choix des milieux de culture ......................................................................................................... 84
I.1.2. Etude des propriétés nutritives des milieux de culture.................................................................. 85
X

I.1.3. Etude de la stérilité des milieux de culture.................................................................................... 86
I.1.4. Etude de la fertilité des milieux en présence des échantillons à tester.......................................... 86
I.1.5. Essais de stérilité du myristate d'isopropyle et de l'eau peptonée additionnée de polysorbate 80
(Tween 80 ® ) à 1%........................................................................................................................................ 87
I.1.6. Essai de stérilité de l’eau utilisée pour la préparation de l’implant............................................. 88
I.1.7. Essai de stérilité de la monoléine.................................................................................................. 88
I.1.8. Essai de stérilité du sulfate de gentamicine................................................................................... 88
I.1.9. Essai de stérilité de l’implant........................................................................................................ 89
I.2. RECHERCHE ET DOSAGE DES ENDOTOXINES BACTERIENNES IN VITRO ................................................. 90
I.2.1. Vérification de la sensibilité déclarée du lysat.............................................................................. 90
I.2.2. Détermination de la Concentration Limite en Endotoxines bactériennes (CLE) de l'implant, et de
la Dilution Maximale Significative (DMS) .................................................................................................. 91
I.2.3. Extraction, recherche et dosage in vitro à proprement dits des endotoxines bactériennes dans les
implants 91
II. RESULTATS ET DISCUSSIONS............................................................................................................ 92
II.1. ESSAIS DE STERILITE........................................................................................................................... 92
II.1.1. Etude de la fertilité et de la stérilité des milieux de culture .......................................................... 92
II.1.2. Etude de la fertilité des milieux en présence des échantillons à tester.......................................... 92
II.1.3. Essais de stérilité du myristate d'isopropyle et de l'eau peptonée additionnée de polysorbate 80
(Tween 80 ® ) à 1%........................................................................................................................................ 93
II.1.4. Essais de stérilité des matières premières..................................................................................... 93
II.1.5. Essai de stérilité de l’implant........................................................................................................ 93
II.2. RECHERCHE ET DOSAGE DES ENDOTOXINES BACTERIENNES IN VITRO ................................................. 94
II.2.1. Vérification de la sensibilité déclarée du lysat.............................................................................. 94
II.2.2. Détermination de la Concentration Limite en Endotoxines bactériennes (CLE) de l'implant, et de
la Dilution Maximale Significative (DMS) .................................................................................................. 94
II.2.3. Recherche et dosage in vitro à proprement dits des endotoxines bactériennes dans les implants 95
CONCLUSION.................................................................................................................................................... 96
CHAPITRE IV : ETUDES TOXICOLOGIQUES IN VITRO ........................................................................ 97
INTRODUCTION............................................................................................................................................... 98
I. MATERIEL ET METHODES ................................................................................................................. 98
I.1. TEST D’HEMOLYSE IN VITRO................................................................................................................ 98
I.2. TEST DE CYTOTOXICITE IN VITRO ........................................................................................................ 99
I.3. TEST DE GENOTOXICITE IN VITRO ...................................................................................................... 100
I.4. ANALYSE STATISTIQUE..................................................................................................................... 102
II. RESULTATS ET DISCUSSIONS.......................................................................................................... 103
II.1. TEST D’HEMOLYSE IN VITRO.............................................................................................................. 103
II.2. TEST DE CYTOTOXICITE IN VITRO ...................................................................................................... 104
II.3. TEST DE GENOTOXICITE IN VITRO ...................................................................................................... 106
CONCLUSION.................................................................................................................................................. 109
CHAPITRE V: ETUDES TOXICOLOGIQUES PRECLINIQUES CHEZ L’ANIMAL .......................... 110
INTRODUCTION............................................................................................................................................. 111
I. MATERIEL ET METHODES ............................................................................................................... 111
I.1. ANIMAUX D’EXPERIENCE.................................................................................................................. 111
XI

I.2. PROCEDURE D’IMPLANTATION.......................................................................................................... 112
I.3. MONITORING CLINIQUE DES SOURIS.................................................................................................. 112
I.4. EVALUATION DE LA REACTION TISSULAIRE LOCALE ......................................................................... 112
I.4.1. Evaluation de l’œdème................................................................................................................ 112
I.4.2. Examen histologique ................................................................................................................... 112
I.5. EVALUATION DES EFFETS RENAUX ET HEPATIQUES........................................................................... 113
I.5.1. Examen macroscopique............................................................................................................... 113
I.5.2. Examen histologique ................................................................................................................... 113
I.5.3. Exploration fonctionnelle............................................................................................................ 113
I.6. EFFET SUR LE METABOLISME DES TRIGLYCERIDES............................................................................ 114
I.7. ANALYSE STATISTIQUE..................................................................................................................... 114
II. RESULTATS ET DISCUSSIONS.......................................................................................................... 114
II.1. MONITORING CLINIQUE DES SOURIS.................................................................................................. 114
II.2. EVALUATION DE LA REACTION TISSULAIRE LOCALE ......................................................................... 115
II.2.1. Evaluation de l’œdème................................................................................................................ 115
II.2.2. Examen histologique ................................................................................................................... 120
II.3. EVALUATION DES EFFETS RENAUX ET HEPATIQUES........................................................................... 121
II.4. EFFET SUR LE METABOLISME DES TRIGLYCERIDES............................................................................ 123
CONCLUSION.................................................................................................................................................. 124
CHAPITRE VI: ETUDE D’EFFICACITE ET DE TOLERANCE CLINIQUES ...................................... 126
INTRODUCTION............................................................................................................................................. 127
I. PROTOCOLE EXPERIMENTAL ........................................................................................................ 127
I.1. CRITERES D’INCLUSION DES PATIENTS.............................................................................................. 128
I.2. BILAN PRE-THERAPEUTIQUE ............................................................................................................. 129
I.2.1. Bilan clinique .............................................................................................................................. 129
I.2.2. Bilan radiologique....................................................................................................................... 129
I.2.3. Bilan biologique.......................................................................................................................... 129
I.3. TRAITEMENT REÇU ........................................................................................................................... 130
I.4. SUIVI DES PATIENTS TRAITES ............................................................................................................ 131
I.5. CRITERES D’EFFICACITE ET DE TOLERANCE DU TRAITEMENT............................................................ 132
I.6. CONSIDERATIONS ETHIQUES ............................................................................................................. 133
II. RESULTATS ........................................................................................................................................... 133
II.1. EFFICACITE DU TRAITEMENT ............................................................................................................ 133
II.2. TOLERANCE AU TRAITEMENT............................................................................................................ 136
III. DISCUSSIONS.................................................................................................................................... 136
III.1. EFFICACITE DU TRAITEMENT ............................................................................................................ 136
III.2. TOLERANCE AU TRAITEMENT............................................................................................................ 138
CONCLUSION.................................................................................................................................................. 139
CONCLUSION GENERALE .......................................................................................................................... 140
XII

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES........................................................................................................ 143
ANNEXES ..............................................................................................................................................................I
NOTE D’INFORMATION AU PATIENT ........................................................................................................ II
FORMULAIRE DE CONSENTEMENT............................................................................................................V
CAHIER D’OBSERVATION ............................................................................................................................ VI
PUBLICATIONS ...............................................................................................................................................VII
XIII

RESUME
L’ostéomyélite chronique est une infection chronique du tissu osseux et de la moelle.
C’est une infection grave du fait de sa localisation au sein d’un tissu profond, de la
complexité de sa prise en charge thérapeutique et de la mise en jeu du pronostic fonctionnel.
L’incidence de l’ostéomyélite chronique est accrue sur certains terrains (drépanocytose,
diabète, et polyarthrite rhumatoïde entre autres). Son traitement classique repose sur un
curettage chirurgical associé à une antibiothérapie par voie générale durant au moins 6
semaines. Ce traitement est marqué le plus souvent par des échecs du fait de la difficulté de
faire parvenir des antibiotiques à doses efficaces et de manière prolongée ou continue au
niveau de l'os infecté.
Le but de notre travail était de développer une formulation pharmaceutique
biodégradable susceptible de libérer de manière prolongée et in situ au niveau du foyer
infectieux l'antibiotique qu’est le sulfate de gentamicine. Cette formulation devait être
efficace pour le traitement des ostéomyélites chroniques et présenter une grande innocuité
pour le patient.
Quatre formulations d’implants à base de sulfate de gentamicine et de monoléine ont
été préparées en Salle blanche dont le niveau de contamination particulaire et microbiologique
a été conforme aux normes européennes. Ces implants se présentaient sous forme de gels
bioadhésifs, d’apparence homogène. Ils se prenaient en masse au contact de l’eau. Des
observations au microscope optique, des études de Calorimétrie différentielle à balayage
(DSC), de Diffraction des rayons X, de thermogravimétrie, de dosage d’eau (méthode Karl
Fischer) des gels ont montré que deux formes de monoléine co-existent dans les gels :
monoléine liée à l’eau et monoléine libre; aussi, les gels se présentent sous forme de cristaux
liquides. Les tests de dissolution ont montré que seul l’implant renfermant 5% de
gentamicine, 80% de monoléine et 15% d’eau a libéré la presque totalité de la gentamicine en
continu sur 20 jours. Celui-ci a été sélectionné pour la suite des travaux. Le mécanisme de la
libération de l’antibiotique a été celui d’une diffusion contrôlée. Ces implants ont été
physiquement instables à 30 °C mais stables lorsqu’ils sont conservés au réfrigérateur (2-6
°C) pendant au moins 10 mois. La cinétique de libération des implants reste inchangée dans
les mêmes conditions de conservation (2-6 °C pendant 10 mois).
Les essais de stérilité réalisés sur membrane filtrante ont montré que les implants
fabriqués étaient stériles. En outre, ils se sont révélés apyrogènes à travers le test LAL (Lysat
d’amoebocyte de Limule).
XIV

Le test de cytotoxicité in vitro (test MTT) des implants a été réalisé en utilisant la
méthode de contact direct. Ils n’ont présenté aucune toxicité vis-à-vis des fibroblastes et des
macrophages qui ont été utilisées comme cellules tests. Par ailleurs, ils ont été compatibles
avec les érythrocytes d’hémoglobine AA ou SS. L’évaluation in vitro de la génotoxicité des
implants a été réalisée en utilisant la technique des essais comètes. Ils n’ont présenté aucun
potentiel génotoxique.
L’infiltration de l’implant (renfermant 5% de gentamicine, 80% de monoléine et 15%
d’eau) sous l’aponévrose plantaire des souris n’a pas perturbé les paramètres biologiques du
foie et des reins (bilirubinémie libre, bilirubinémie totale, créatininémie) au bout de 52 jours
de test. Le métabolisme des triglycérides n’a pas été affecté. Les études histologiques n’ont
révélé ni de signes d’inflammation chronique de l’aponévrose, ni de lésions rénales ou
hépatiques.
Pour l’étude de la tolérance et de l’efficacité de l’implant dans le traitement des
ostéomyélites chroniques, une autorisation préalable du Comité d’Ethique pour la Recherche
en Santé (CERS) du Burkina Faso a été obtenue. Une cohorte de 19 patients souffrant
d’ostéomyélites chroniques et ayant donné son consentement a été incluse dans l’étude. Tous
les patients ont bénéficié d’une séquestrectomie accompagnée d’un curetage et d’un
comblement de la cavité osseuse avec l’implant. Les signes cliniques, radiologiques et
biologiques obtenus après le traitement ont été en faveur d’une guérison des patients traités
dans un délai de 30 à 70 jours. Avec un recul de 2 à 12 mois (une médiane de 10 mois), les
suivis cliniques, biologiques et radiologiques ont permis de conclure à l’innocuité de
l’implant.
Un implant à base de monoléine et de gentamicine ayant montré son efficacité et son
innocuité dans le traitement des ostéomyélites chroniques a été ainsi développé. Après la
réalisation d’un essai clinique multicentrique randomisé, il fera l’objet d’une demande
d’Autorisation de Mise sur le Marché.
XV

ABSTRACT
Chronic osteomyelitis is a chronic infection of bone and its marrow. It is commonly
associated with some diseases like sickle cells disease, diabetes, and arthritis. Chronic
osteomyelitis treatment is complex, due to the difficulty to achieve therapeutic drug levels at
the site of infection by systemic administration.
Our objective was to develop a biodegradable implant based on gentamicin and
monoolein. It should be able to make a sustained release of the gentamicin in the site of
infection. This novel formulation should be biocompatible and efficacious to treat chronic
osteomyelitis.
Four formulations of implants based on gentamicin and monoolein were made. The
final products were homogenous gels, becoming more solid in contact with water. Hot stage
microscopy, DSC, thermogravimetric analysis (TGA), X-ray diffraction, and determination of
moisture contents (Karl Fischer titration) showed cubic liquid crystalline and eutectic
structures of the implants. Only the formulation consisting of 80-15-5% w/w monoolein-
water-gentamicin sulfate progressively released the totality of the antibiotic for a period of
twenty days without burst effect. This formulation was selected for the following studies. The
implants were physically instable at room temperature by stable when they were kept cool (2-
6 °C) during at least 10 months. Their in vitro drug release characteristics were not changed
in the same conditions (after storage for 10 months at 2 – 6 ° C).
The Lysat d’amoebocyte de Limule (LAL) and sterility assays proved that the
implants were made according to the Good Laboratory Practice. They were sterile and
apyrogen.
The MTT and comet assays performed with fibroblasts and macrophages revealed that
the implants were non-cytotoxic and were not potentially genotoxic. They were also
compatible in vitro with blood erythrocytes.
The biocompatibility and toxicity of the implants assessed in vivo revealed that they
were well tolerated and had acceptable biocompatibility at long-term.
As for clinical assessment of the implants, 19 patients with chronic osteomyelitis
caused by a microorganism sensitive to gentamicin were included. After surgical curettage of
the infected bone, the dead space was filled in with the implants. To prevent post-operative
septicaemia, a systemic antibiotherapy was prescribed for 3 days following the operation.
Clinical, biological and radiological follow-up (range from 2 to 12 months) revealed that 18
XVI

patients recovered from chronic osteomyelitis (within 30-70 days) without adverse events.
The wound of one patient whose bone was exposed did not scar over after 10 months.
However, it was no longer infected.
Further investigations through randomized multicentric trials will be done in order to
obtain trade license.
XVII

LISTE DES SIGLES ET ABREVIATIONS
ADN: Acide désoxyribonucléique
ALAT: Alanine-aminotransférase
AMM : Autorisation de Mise sur le Marché
ASAT: Aspartate amino-transférase
ATCC: American Type Culture Collection
Cf.: Confère
CHU-YO: Centre Hospitalier Universitaire Yalgado Ouédraogo
CLE: Concentration Limite en Endotoxines
CMI: Concentration minimale inhibitrice
DL50: Dose Létale 50%
DMM: Dose Minimale Mortelle
DMS: Dilution Maximale Significative
DMSO: Diméthyle sulfoxide
DO: Densité Optique
DRX: Diffraction des rayons X
DSC: Differential Scanning Calorimetry
EEB: Essai des Endotoxines Bactériennes
FDA: Food and drug administration
Fig.: Figure
HSM: Hot Stage Microscopy
HSP: Hématéine-phloxine-safran
LAL: Lysat d’Amœbocytes de Limule
LPS: Lipopolysaccharides
MTT: 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide
NFS: Numération Formule Sanguine
Ph. Eur.: Pharmacopée européenne
PMMA: Polyhmétyleméthacrylate
ppm: partie par million
RPM: Rotation par minute
TGA: Thermogravimétrie
TSA: gélose Trypto-caséine soja
XVIII

TSB: Bouillon trypto-caséine soja
UE: Unité d’Endotoxine
UFC: Unité Formant Colonie
UI: Unité Internationale
VIH: Virus d’Immuno-déficience Humaine
VS: Vitesse de Sédimentation
ZS: Zone Stérile
ZT: Zone Technique
XIX

LISTE DES TABLEAUX
Page
Tableau I: Classification des ostéomyélites selon Cierny-Mader. ............................................. 7
Tableau II: Tests de biomcompatibilité d'implant à libération contrôlée (Mallapragada SK et
Narasimhan B, 1999)........................................................................................................ 27
Tableau III: Recommandations pour la surveillance microbiologique des zones à atmosphère
contrôlée durant la production.......................................................................................... 31
Tableau IV : Dose seuil d’endotoxines (K) par kg de masse corporelle et par heure, en
fonction de la voie d’administration................................................................................. 35
Tableau V: Composition du mélange contenu dans le ballon (début de la préparation) ......... 48
Tableau VI: Composition des différents implants.................................................................... 49
Tableau VII: Nombre de particules par m 3 d’air en fonction du site de prélèvement (en
période de repos) .............................................................................................................. 51
Tableau VIII: Nombre de particules par mètre cube d’air en fonction du site de prélèvement
(pendant la production) .................................................................................................... 51
Tableau IX : Nombre de colonies isolées (UFC) pour 1 000 L d'air en fonction du type de
contamination et du site de prélèvement en période de repos.......................................... 52
Tableau X : Nombre de colonies isolées (UFC) pour 1 000 L d'air en fonction du type de
contamination et du site de prélèvement en période de production ................................. 52
Tableau XI: Contrainte de cisaillement (mPa) des implants (moyenne ± écart-type, n = 3) en
fonction de la vitesse de cisaillement............................................................................... 72
Tableau XII: Pourcentage (m/m) en eau (moyenne ± écart-type, n = 3) des implants 1, 2, 3 et
4 déterminé par la méthode Karl Fischer (KF) et par TGA ............................................. 74
Tableau XIII: Teneur (ppm) des implants en éthanol (moyenne ± écart-type, n = 3) ............. 74
Tableau XIV: Concentrations des implants (% m/m) en acides gras libres (moyenne ± écart-
type, n = 3) ....................................................................................................................... 75
Tableau XV: Teneurs (% m/m) en sulfate de gentamicine (moyenne ± écart-type, n = 5) de
l’implant 2 fraîchement préparé et de celui conservé pendant 10 mois ........................... 81
Tableau XVI: Composition des tubes pour la vérification de la sensibilité du lysat ............... 90
Tableau XVII: Résultats du test de vérification de la sensibilité déclarée du lysat ................. 94
Tableau XVIII: Résultats de recherche et de dosage des endotoxines dans les implants ........ 95
Tableau XIX : Composition des tubes ayant servi au test d’hémolyse in vitro ...................... 99
XX

Tableau XX : Pourcentage d’hémolyse (moyenne ± SEM, n = 10) provoqué par l’implant 2 en
fonction de la dose et du type d’hématie (hématies provenant de sujets homozygotes AA
et de d’homozygotes SS)................................................................................................ 104
Tableau XXI: Pourcentages d’ADN dans la queue des comètes (moyenne ± SEM) en fonction
de la cellule et du produit ............................................................................................... 108
Tableau XXII: Volume des pattes (mL) des souris avant et après administration de 0,05 mL
de produits sous l’aponévrose plantaire. ........................................................................ 117
Tableau XXIII:Concentrations sériques (moyenne ± S.D, n = 10) en substances endogènes
pour les lots de souris ayant reçu de l’eau physiologique, de la monoléine et l’implant 2
en administration sous-plantaire (52 jours après administration). ................................. 121
Tableau XXIV: Résultats du traitement de 19 patients soufrant d’ostéomyélite chronique par
un implant biodégradable à base de gentamicine et de monoléine. ............................... 135
XXI

LISTE DES FIGURES
Page
Figure 1: Ostéomyélite chronique du tibia d'un homme âgé de 50 ans...................................... 6
Figure 2: Formules chimiques de la gentamicine..................................................................... 15
Figure 3: formule chimique de la monoléine (Mono-oléate de glycéryle) .............................. 20
Figure 4: formule chimique du glycérol (propan-1,2,3-triol ou 1,2,3-propanetriol ................. 21
Figure 5: formule chimique de l'acide oléique......................................................................... 22
Figure 6: Plan détaillé de la "Salle blanche" ............................................................................ 44
Figure 7: Visualisation des sites de prélèvement pour les comptages particulaire et
microbiologique de l'air.................................................................................................... 46
Figure 8 : Photo d’échantillon d’un implant ............................................................................ 64
Figure 9: HSM (lumière non polarisée, 37 °C) de monoléine et d'implant (grossissement x
500)................................................................................................................................... 65
Figure 10: Thermogrammes (enregistrés lors de la 1 ère chauffe) de la monoléine et des
implants 1, 2, 3, 4 ............................................................................................................. 66
Figure 11: Spectre de diffraction des rayons X de sulfate de gentamicine (a), de monoléine
(b), d’implant blanc 1 (c), d’implant blanc 2 (d), d’implants 1 (e), 2 (f), 3 (g), 4 (h) et
d’implant 2 conservé pendant 10 mois au réfrigérateur (2-6°C) (f’). .............................. 68
Figure 12 : Perte de poids des échantillons d’implants 1 (a) et 2 (b) en fonction de la
température....................................................................................................................... 70
Figure 13: Perte de poids des échantillons d’implants 1 (c) et 2 (d) en fonction de la
température....................................................................................................................... 71
Figure 14 : Rhéogrammes des implants 1, 2, 3 et 4 ................................................................. 72
Figure 15: Les principaux comportements rhéologiques des fluides....................................... 73
Figure 16: Chromatogramme typique des implants obtenu par chromatographie en phase
gazeuse. ............................................................................................................................ 74
Figure 17 : Chromatogramme typique d’acides gras estérifiés dans les implants ................... 76
Figure 18: Cinétique de libération du sulfate de gentamicine à partir des implants ................ 79
Figure 19: Pourcentage de libération du sulfate de gentamicine à partir de l’implant 2 en
fonction de la racine carrée du temps............................................................................... 79
Figure 20: Thermogrammes DSC de la monoléine (glyceryl monooleate) et des implants 1, 2
immédiatement après préparation ( ____ ) et après 10 mois de conservation (------)..... 80
Figure 21 : Cinétique de libération du sulfate de gentamicine à partir d’implants fraîchement
préparé et conservé........................................................................................................... 81
XXII

Figure 22: Etapes de réalisation des essais comètes .............................................................. 102
Figure 23: Pourcentage de lyse des hématies de sujets homozygotes AA (n = 10) et SS (n =
10) en fonction de la dose d’implant.............................................................................. 104
Figure 24: Viabilité des fibroblastes V79-4 ATCC en fonction des concentrations d’implants :
implant 2 (gentamicine 5%, eau 15%, monoléine 80%), implant 4 (gentamicine 10%,
eau 15%, monoléine 75%). Chaque point représente la moyenne de viabilité cellulaire
dans 4 puits (Données obtenues de 3 expériences séparées).......................................... 105
Figure 25: Viabilité des macrophages P388D1 ATCC en fonction des concentrations
d’implants. Chaque point représente la moyenne de viabilité cellulaire dans 4 puits
(Données obtenues de 3 expériences séparées).............................................................. 106
Figure 26: Viabilité des fibroblastes V79-4 ATCC et des macrophages P388D1 ATCC en
fonction des concentrations de méthanol. ...................................................................... 106
Figure 27: Box Plot des pourcentages d’ADN dans la queue des comètes (Tail DNA%) des
fibroblastes V79-4 témoins et des fibroblastes V79-4 traités avec du méthanol dilué ou
avec des implants (n= nombre de comètes analysées). .................................................. 108
Figure 28: Box Plot des pourcentages d’ADN dans la queue des comètes (Tail DNA%) des
macrophages P388D1 témoins et des macrophages P388D1 traités avec du méthanol
dilué ou avec des implants (n= nombre de comètes analysées). .................................... 109
Figure 29: Box Plot de l’évolution du volume des pattes de souris ayant reçu 0,05 mL d’eau
physiologique en fonction du temps (n = 10)................................................................. 118
Figure 30: Box Plot de l’évolution du volume des pattes de souris ayant reçu 0,05 mL de
carraghénine en fonction du temps (n = 10)................................................................... 118
Figure 31: Box Plot de l’évolution du volume des pattes de souris ayant reçu 0,05 mL de
monoléine en fonction du temps (n = 10) ...................................................................... 119
Figure 32: Box Plot de l’évolution du volume des pattes de souris ayant reçu 0,05 mL
d’implant en fonction du temps (n = 10)........................................................................ 119
Figure 33. (A): microscopie optique d’aponévrose plantaire de souris ayant reçu de l’eau
physiologique (a), de la monoléine (b), et de l’implant (c) sous l’aponévrose plantaire120
Figure 34: Diagrammes des concentrations sériques (moyenne ± S.D, n = 10) en créatinine, en
bilirubine directe et en bilirubine totale chez les lots de souris ayant reçu respectivement
0,5 mL d’eau physiologique, de monoléine et d’implant 2............................................ 122
Figure 35 : Diagrammes des concentrations sériques (moyenne ± SD, n = 10) en triglycérides
chez les lots de souris ayant reçu respectivement 0,5 mL d’eau physiologique, de
monoléine et d’implant 2................................................................................................ 124
XXIII

Figure 36: Séquestrectomie (a), curetage (b), comblement de la cavité osseuse par un implant
(c), et suture de la plaie chirurgicale (d)......................................................................... 131
Figure 37: Ostéomyélite chronique de l'avant bras avant traitement (a) et 35 jours après le
début du traitement......................................................................................................... 135
Figure 38: Radiographie d’une fibula avant (a) et après intervention chirurgicale. .............. 136
XXIV

INTRODUCTION GENERALE
1

Introduction générale
L’infection du tissu osseux ou ostéomyélite est définie par la présence et la
multiplication d’un microorganisme pathogène implanté par voie hématogène ou par un foyer
contigu au niveau de la médullaire et/ou de la corticale osseuse, aboutissant à sa destruction et
à l’apposition d’os pathologique (Brause BD, 1997; Lew DP et Waldvoimplant FA, 1997;
King RW et Johnson D, 2005). L’ostéomyélite est de principe une infection grave du fait de
sa localisation au sein d’un tissu profond, de sa tendance évolutive naturelle à la chronicité,
des difficultés de prise en charge thérapeutique et de la mise en jeu du pronostic fonctionnel
(Ciampolini J et Harding KG, 2000 ; Mader JT et coll., 2001). L’incidence de l’ostéomyélite
chronique est accrue sur certains terrains (drépanocytose, diabète, polyarthrite rhumatoïde)
(Habibou A et coll., 1999 ; Ader F et coll., 2004, Springer ING et coll., 2007). Elle représente
5,3% des causes d’hospitalisation dans le Service de Traumatologie et d’Orthopédie du
Centre Hospitalier Universitaire de Ouagadougou / Burkina Faso. L’âge moyen des patients
est de 18 ans, avec des extrêmes allant de 2 à 60 ans, selon une étude réalisée dans le même
Service entre 1996 et 2000 (Nacoulma SI et coll., 2007).
Bien que sa physiopathologie et sa clinique soient bien connues, l’ostéomyélite
chronique reste une maladie difficile à traiter (Ciampolini J et Harding KG, 2000 ; Mader JT
et coll., 2001). Si le traitement chirurgical est maintenant bien codifié, les modalités du
traitement par antibiotiques, complément indispensable au traitement chirurgical sont
discutées. Pour atteindre des taux osseux efficaces, les antibiotiques doivent être administrés
par voie générale, pendant au moins six semaines, à des doses à la limite des toxicités rénale,
hépatique ou auditive. Les taux d’échec consécutifs à ce type de traitement avoisinent 30%
(Anderson JM et Horn KM, 1970; Hedstrom SA, 1974; Blaha J et coll., 1993 ; Nelson CL et
coll., 1993 ; Traoré O et coll., 1997). Ces forts taux d’échec sont dus au fait qu’il est difficile
de faire parvenir par voie générale les antibiotiques à des concentrations efficaces au niveau
du foyer infectieux sans risque de toxicité. En effet, Les concentrations sériques
d’antibiotiques requises pour obtenir des concentrations efficaces au niveau des os, ou le
traitement prolongé par voie générale peuvent entraîner une toxicité systémique. La demi-vie
courte des antibiotiques et la faible vascularisation des os infectés compliquent donc
l’antibiothérapie par voie générale de l’ostéomyélite chronique (Stephens D et coll., 2000 ;
Jain JP et coll., 2005).
2

Introduction générale
Ainsi, l'antibiothérapie par voie locale se présente comme un complément voire une
alternative au traitement par voie générale (Rosenberg A, 1994; Stephens D, 2000). De
nombreuses méthodes ont déjà été utilisées.
Des implants de polyméthyleméthacrylate (PMMA) imprégnés d’antibiotiques ont été
développés (Jain JP et coll., 2005). L’inconvénient majeur de ces implants est qu’ils ne sont
pas résorbés in vivo. Une seconde intervention chirurgicale est donc nécessaire pour extirper
l'implant de l’organisme. Cette seconde intervention est non seulement inconfortable pour le
patient mais présente aussi un risque de réinfection des tissus cicatrisés (Dion A et Coll.,
2005). Elle contribue aussi à augmenter le coût du traitement de l’ostéomyélite chronique.
Dès lors, d’autres études se portent sur le développement d'implants biodégradables.
Les plus étudiés dans ce sens sont les poly(L-lactide), les poly(DL-lactide-co-glycolide), les
polyanhydrides, et le collagène imprégnés d’antibiotiques (Zhang X et coll., 1994, Meyer JD
et coll., 1998; Sansdrap P, 1996; Jain JP et coll., 2005). Parallèlement, des greffes d’os
imprégnées d’antibiotiques et des pompes implantables sont expérimentées pour assurer une
libération prolongée d’antibiotiques au niveau de l’os infecté (Ruttle PE et coll., 1984; Perry
CR et coll., 1988). En dépit de ces avancées, les taux de succès au traitement de
l’ostéomyélite chronique restent insatisfaisants (Wirganowicz PZ, 1999). En outre, même si
les implants à libération contrôlée sont développés depuis des décennies, ils en sont encore à
leurs balbutiements au point de vue commercial. Peu de systèmes implantables de libération
contrôlée d’antibiotiques existent actuellement sur le marché pour une utilisation clinique
(Désévaux C., 2002).
Pour notre part, notre objectif était de développer un implant biodégradable à base de
gentamicine et de monoléine, qui pourrait être utilisé dans le traitement des ostéomyélites
chroniques.
La monoléine a été choisie comme véhicule de l’antibiotique pour ses propriétés
physico-chimiques: elle est un monoglycéride biorésorbable pouvant assurer une libération
prolongée de principes actifs (Sallam A et coll., 2002 ; Esposito E et coll., 1996). Elle se
présente sous forme de gel et pourrait se prendre en masse en présence d’eau. Cette propriété
lui permettrait de combler la cavité osseuse laissée par le curetage, empêchant du même coup
la formation d’hématome. Cet hématome pourrait entretenir l’infection locale. Le choix de la
gentamicine comme principe actif s’est justifié par le fait que les germes les plus souvent
isolés dans les ostéomyélites chroniques sont sensibles à la gentamicine (Traoré O et coll.,
1997; Talbert M et coll., 1998 ; Habibou A et coll., 1999).
3

Introduction générale
L’objectif de nos travaux de thèse a été de mettre au point des implants biodégradables
destinés au traitement des ostéomyélites chroniques et d’étudier leurs propriétés physico-
chimiques dans un premier temps, puis d’étudier la stérilité, l’apyrogénicité, la toxicité in
vitro et in vivo de l’implant ayant présenté les meilleures caractéristiques et enfin, d’évaluer
cliniquement sa tolérance et son efficacité chez le patient atteint d’ostéomyélite chronique.
4

PREMIERE PARTIE: DONNEES BIBLIOGRAPHIQUES

L’OSTÉOMYÉLITE
Données bibliographiques
L’ostéomyélite est une infection du tissu osseux (Fig.1). Elle est caractérisée par la
présence et la multiplication d’un ou de plusieurs microorganismes pathogènes au niveau de
la médullaire et/ou de la corticale osseuse. L’agent pathogène atteint la médullaire et/ou la
corticale de l’os par voie hématogène ou par un foyer contigu. L’infection entraîne une
destruction de la médullaire et/ou la corticale et l’apposition d’os pathologique (Brause BD,
1997; Lew DP et Waldvoimplant FA, 1997; King RW et Johnson D, 2005).
L’ostéomyélite est une infection grave du fait de sa localisation au sein d’un tissu
profond, de sa tendance évolutive naturelle à la chronicité, des difficultés de prise en charge
thérapeutique et de la mise en jeu du pronostic fonctionnel. La compréhension de ses
mécanismes physiopathologiques est une aide importante à l’élaboration d’une stratégie
thérapeutique reposant le plus souvent sur une étroite collaboration médicochirurgicale (Ader
F et coll., 2004).
I.1. Classification des ostéomyélites
2001):
Figure 1: Ostéomyélite chronique du tibia d'un homme âgé de 50 ans
On peut distinguer plusieurs types de classification (Flückiger U et Zimmerli W,
- Classification physiopathologique: On distingue les ostéomyélites hématogènes
survenant à la suite d’une bactériémie ou d’une septicémie, des ostéomyélites secondaires à
une infection de contiguïté.
- Classification en fonction du temps: ostéomyélite aiguë et ostéomyélite chronique.
L’ostéomyélite aiguë dure au plus quatre semaines tandis que dans l’ostéomyélite chronique,
on distingue deux tableaux différents: (a) une infection symptomatique d’une durée de plus de
6

Données bibliographiques
5-7 semaines, dont l’évolution ultérieure est occasionnellement marquée par des fistules et
des signes inflammatoires locaux pouvant persister durant des années et (b) l’ostéomyélite qui
se manifeste à nouveau après un long intervalle sans symptôme. Un tel intervalle libre de
symptôme peut durer des années, voire des décennies jusqu’à la récidive. Il se forme des
nécroses osseuses (séquestres) où des bactéries pouvant persister durant des années. Le
mécanisme en est une pression intra-osseuse élevée du fait d’amas de bactéries et de
leucocytes conduisant à une ischémie osseuse localisée.
- Classification de Cierny-Mader prenant en considération le terrain sous-jacent, le
type d’atteinte osseuse, les cofacteurs associés (Tableau I).
- Classification en fonction de la présence de matériel: on distingue les infections
osseuses sur prothèse ou non (Ader F et coll., 2004).
Tableau I: Classification des ostéomyélites selon Cierny-Mader.
7

I.2. Pathogenèse bactérienne
Données bibliographiques
Les bactéries atteignent l’os soit de manière hématogène par le courant sanguin, soit
par inoculation directe, par exemple lors d’un traumatisme ou d’une intervention chirurgicale.
Pour provoquer une infection, les bactéries doivent d’abord être capables d’adhérer aux
structures osseuses. Dans les 2/3 des cas d’ostéomyélite, on isole Staphylococcus aureus.
Ce germe possède plusieurs adhésines qui permettent l’adhésion à l’os et par conséquent sa
colonisation et infection. Après Staphylococcus aureus, les principaux germes responsables
de l’ostéomyélite sont les entérobactéries, Pseudomonas spp, des streptocoques et des
anaérobies (Flückiger U et Zimmerli W, 2001).
Le concept classique de la physiopathologie de l’ostéomyélite est que l’os infecté n’est
plus vascularisé, se nécrose et forme ainsi un séquestre. Ce séquestre, non vascularisé
entretien l’infection du fait de l’impossibilité d’y faire parvenir des antibiotiques par voie
générale (Nelson CL et coll., 1997).
I.3. Le terrain
Les spécificités de l’hôte jouent un rôle dans le développement d’une infection
osseuse. À cet égard, une attention particulière doit être accordée à certaines situations.
I.3.1. Infection osseuse et diabète
Le pied diabétique est une des plus fréquentes et des plus sévères complications du
diabète. Il s’agit au début d’une ostéite puisqu’elle affecte la corticale osseuse. L’ostéomyélite
n’est effective qu’avec l’atteinte de la médullaire. Outre l’altération de la microcirculation,
aboutissant à une baisse de l’oxygénation tissulaire périphérique, la neuropathie diabétique
joue aussi un rôle prépondérant. La neuropathie sensitive d’abord, dont la conséquence est
une hypoesthésie du pied, facilite les blessures ou traumatismes locaux (agression thermique,
coupures, ulcérations). Deuxièmement, la neuropathie motrice modifie les répartitions
musculaires du pied avec des déformations anatomiques et des zones de portance hétérogènes.
Les zones d’appui soumises à des pressions excessives vont s’ulcérer. Enfin, l’hypersudation
de la neuropathie sera source de macération et une cause supplémentaire d’ulcérations et de
colonisation fongique cutanée (Ader F et coll., 2004).
En plus du diabète, toute autre pathologie entraînant une perturbation de la
microcirculation sanguine est un facteur favorisant la survenue d’ostéomyélite chronique. En
effet la diminution du flux sanguin favorise la fixation et le développement des germes. Le
cas le plus évocateur est la drépanocytose (Mader JT et coll., 2001).
8

Données bibliographiques
I.3.2. Ostéomyélite et polyarthrite rhumatoïde
Il est prouvé un risque très élevé de développer une infection sur matériel prothétique
ostéoarticulaire chez les patients atteints de polyarthrite rhumatoïde (Ader F et coll., 2004).
I.4. Aspects cliniques
I.4.1. L’ostéomyélite hématogène
Chez l’enfant, l’ostéomyélite hématogène touche surtout la métaphyse des os longs.
En effet, chez les enfants, le flux sanguin se ralentit au niveau de la métaphyse, ce qui
favorise la fixation et le développement des germes. Etant donné qu’avant l’âge de un an
l’épiphyse est aussi irriguée, l’infection peut à travers elle gagner l’articulation adjacente et
entraîner ainsi une arthrite septique d’accompagnement. Les signes cliniques sont très
dépendants de l’âge. L’ostéomyélite néo-natale est typiquement pauci-symptomatique.
Fréquemment, les seuls signes en sont une tuméfaction locale, une mise au repos spontanée
du membre concerné et un épanchement inflammatoire de l’articulation adjacente. Chez
l’enfant de plus de un an, les principaux symptômes sont la douleur, une mobilité entravée du
membre concerné et la fièvre.
A l’âge adulte, l’ostéomyélite hématogène se manifeste principalement par une
spondylodiscite. A l’occasion d’une bactériémie, les bactéries se fixent au niveau du plateau
supérieur ou inférieur d’une vertèbre en suivant la distribution de la circulation artérielle. Il
s’en suit un nouveau foyer infectieux qui s’étend à travers le disque non vascularisé jusqu’au
corps vertébral adjacent. La plupart des patients se plaignent de douleurs vertébrales
localisées (Lew DPet coll., 1997).
I.4.2. Les ostéomyélites par inoculation directe ou par contiguïté
L’infection directe des os est généralement consécutive à une facture ouverte. Elle
peut survenir au cours d’une intervention chirurgicale touchant les os, après implantation
d’une prothèse, ou après infection de tissus voisins. Les principaux signes cliniques sont la
fièvre et les douleurs localisées s’accompagnant souvent d’une fistulisation (Lew DP et coll.,
1997).
Mal traitées, les ostéomyélites hématogènes et celles par inoculation directe ou par
contiguïté évoluent vers la chronicité.
9

I.4.3. L’ostéomyélite chronique
Données bibliographiques
Les principaux signes sont généralement des douleurs chroniques localisées au niveau
du foyer infectieux, une nécrose osseuse, une fistulisation, et parfois une formation de
séquestre osseux (Fig. 1). La vitesse de sédimentation est accélérée, reflétant ainsi
l’inflammation chronique. S’il existe une fièvre, elle est peu élevée (Brause BD, 1997; Lew
DP et Waldvoimplant FA, 1997; King RW et Johnson D, 2005).
I.5. Traitement
Le traitement de l’ostéomyélite est médical et chirurgical.
I.5.1. Traitement médical
Une antibiothérapie précoce, avant extension de la nécrose et de la destruction de l’os
produit de bons résultats. Cette antibiothérapie par voie parentérale dure pendant quatre à six
mois. Elle est relayée par une administration d’antibiotiques par voie orale. Une
administration locale d’antibiotiques par instillation ou par l’utilisation de matériau (implant)
imprégné d’antibiotiques est aussi préconisée (Lew DP et coll., 1997).
I.5.2. Traitement chirurgical
Il comprend le curetage de la fistule, une excision du séquestre et des tissus nécrosés,
et un lavage/drainage. L’espace laissé par ce débridement est généralement comblé par greffe
osseuse suivie d’une greffe cutanée.
En dépit de l’association des traitements médical et chirurgical, le taux de récidive de
l’ostéomyélite à long terme varie de 20 à 30% (Wirganowicz PZ, 1999).
L’innovation dans la prise en charge des ostéomyélites est l’utilisation d’implants
imprégnés d’antibiotiques au niveau du foyer infectieux.
LES IMPLANTS
Les implants sont des préparations pharmaceutiques solides, stériles, de taille et de
forme adaptées à une implantation. Ils assurent la libération des substances actives sur une
période étendue. On les distingue en non biodégradables et en biodégradables (Aiache JM et
coll., 1995). Le terme biodégradable ou biorésorbable désigne la capacité d’une matière à se
10

Données bibliographiques
scinder en segments résorbables et éliminables; cette scission se fait par réaction chimique ou
enzymatique.
I.6. Les implants non biodégradables
Le polymethylmethacrylate (PMMA) est le polymère non biodégradable de référence
utilisé pour assurer une libération contrôlée. A partir du PMMA, un produit a été
commercialisé en Europe par la compagnie pharmaceutique allemande E Merck KGaA sous
le nom de Septopal® en 1977. Depuis, ce produit a été utilisé dans le traitement des plaies
contaminées, des fractures ouvertes, des ostéomyélites chroniques, des arthroplasties totales
infectées et des infections des tissus mous de l’abdomen, du rectum et du cou. Présenté sous
forme de chapelet de billes, le Septopal® contient du sulfate de gentamicine
(Kanellakopoulou K et Giamarellos-Bourboulis EJ, 2000).
Le PMMA présente l’inconvénient majeur de n’être pas biodégradable; une seconde
intervention est requise pour le retirer de l’organisme deux à quatre semaines après
l’implantation (Kanellakopoulou K et Giamarellos-Bourboulis EJ, 2000). L’utilisation des
implants biodégradables permet d’éviter l’inconfort et les risques liés à ce retrait.
I.7. Les implants biodégradables
Le poly(acide lactique-co-acide glycolique) ou PLGA est un excellent candidat pour
remplacer le PMMA parce qu’il est capable de libérer le principe actif au cours de sa
dégradation. En effet, ce polymère a montré une efficacité dans le traitement local de
l’ostéomyélite expérimentale chez l’animal, lorsqu’il contient de la gentamicine (Garvin KL
et coll. 1994), de l’ampicilline (Jacob E et coll., 1991), de la vancomycine (Calhoun J et
Mader JT, 1997), de la céfazoline (Jacob E et coll., 1997), de l’ofloxacine (Nie L et coll.,
1998) ou de la pefloxacine (Kanellakopoulou K et coll., 2000). Par contre, la biodégradation
de ce matériau est rapide, ce qui le limite à une utilisation temporaire notamment quand une
fonction de support est recherchée dans une réduction de fracture (Jain AK et Panchagnula R,
2000 ; Streppa et coll., 2001).
Des éponges en collagène imprégnées de gentamicine sont commercialisées. La durée
d’efficacité de ce type d’implant est limitée du fait de la libération trop rapide de
l’antibiotique. En plus, il existe toujours un risque de réaction immunitaire puisque le
collagène est d’origine animale (Kanellakopoulou et Giamarellos-Bourboulis, 2000; Sterppa
HK et coll., 2001).
11

Données bibliographiques
Des implants en céramique (matériaux minéraux) ont été développés pour pouvoir
assurer un rôle simultané de support dans la reconstruction osseuse. Les ciments
d’hydroxyapatite et de phosphate tricalcique ont permis des libérations constantes
d’antibiotiques tout en accélérant la régénération osseuse (Dash AK et Cudworth II GC, 1998;
Sterppa HK et coll., 2001). Cependant, la fragilité de cette céramique limite son utilisation
comme implant orthopédique dans les situations de compression mécanique élevée (Jain AK
et Panchagnula R, 2000).
Le plâtre de Paris (gypse) est un sulfate de calcium hydraté qui a été utilisé en tant que
système à libération contrôlée d’un antibiotique en chirurgie orthopédique parce qu’il peut
jouer un rôle de support mécanique et n’inhibe pas la croissance osseuse. Malheureusement,
la biodégradation du plâtre de Paris est lente (plusieurs mois) et peut altérer la réparation
osseuse (Sterppa HK et coll., 2001).
Les recherches en matière de libération contrôlée d’antibiotiques au niveau osseux se
poursuivent. Pour notre part, nous avons utilisé la monoléine comme matrice pour assurer une
libération prolongée de la gentamicine au niveau du foyer infectieux tout en comblant les
cavités osseuses laissées par le curetage chirurgical.
RÉPONSE DE L’HÔTE A UN IMPLANT
Une réponse inflammatoire aiguë de quelques jours est observée avec n’importe quel
type d’implant. Tout implant non dégradable va induire chez l’hôte un passage à
l’inflammation chronique et même une réponse à un corps étranger à long terme. Dans le
contexte de l’implantation, ces réponses doivent être perçues comme étant des réponses
locales inévitables. C’est l’étendue et la durée de la réaction inflammatoire qui vont
caractériser la biocompatibilité de l’implant (Woodward SC, 1999).
I.8. Réaction inflammatoire aiguë
Cette inflammation est due à la contribution de l’implant et/ou de l’acte chirurgical
qu’est l’implantation. Quatre signes cardinaux de l’inflammation aiguë peuvent être observés
à divers degrés au niveau du site d’implantation: rougeur (vasodilatation locale), chaleur
(augmentation du flux sanguin local), œdème (augmentation de la perméabilité vasculaire) et
douleur (libération et accumulation des médiateurs chimiques de l’inflammation) (Tizard IR,
1996).
12

I.9. Réaction inflammatoire chronique
Données bibliographiques
Elle apparaît en cas de persistance du stimulus inflammatoire, comme par exemple un
implant non dégradable ou lentement dégradable. La réaction inflammatoire chronique est
caractérisée par une infiltration de cellules mononucléaires (macrophages, lymphocytes et
plasmocytes) avec prolifération de vaisseaux sanguins et de tissu conjonctif (Cotran RS et
coll., 1994).
Le macrophage est certainement la cellule la plus représentative de l’inflammation
chronique causée par un implant (Anderson JM et Miller KM, 1984 ; Anderson JM, 1994a).
Les macrophages activés, en préparation ou en cours de phagocytose, sont systématiquement
observés à la surface d’un biomatériau implanté (Woodward SC, 1999). Cette cellule est
capable de produire et de sécréter une grande variété de substances actives incluant des
enzymes, des protéines plasmatiques, des métabolites de l’acide arachidonique
(prostaglandines et leucotriènes), des cytokines (IL-1, TNF-α, IL-8), des facteurs de
croissance (PDGF, EGF, FGF, TGF-β), de l’oxyde nitrique et des métabolites réactifs de
l’oxygène. Sur le site d’implantation, les macrophages activés détruisent et éliminent les
cellules nécrotiques (neutrophiles) et les tissus endommagés par phagocytose. Aussi, Ils
attirent et activent les fibroblastes pour aider à la réparation tissulaire au site d’implantation
(Cotran RS et coll., 1994).
I.10. Réparation tissulaire
La réparation tissulaire par du tissu conjonctif s’effectue en quatre étapes (Cotran RS
et coll., 1994) :
- formation de nouveaux vaisseaux sanguins (angiogenèse) ;
- migration et prolifération des fibroblastes ;
- production de la matrice extracellulaire ;
- maturation et organisation du tissu fibreux.
La prolifération des fibroblastes et des cellules endothéliales vasculaires peut débuter
dès le premier jour qui suit l’implantation (Anderson JM, 1994a).
Avec un système à libération contrôlée de médicaments, on cherche à obtenir une
fibrose minimale voire même inexistante pour permettre la diffusion d’une molécule de
l’implant, d’autant plus que la capsule n’est pas vascularisée.
13

I.11. Réaction granulomateuse
Données bibliographiques
Tous les implants persistants du fait qu’ils soient inertes, très faiblement ou très
lentement dégradés, finissent par induire une réaction inflammatoire de type granulomateux
(Cotran RS et coll., 1994). Ce type de réaction est aussi appelé granulome à corps étranger, ou
encore tout simplement réaction à corps étranger. La réaction granulomateuse est caractérisée
par la formation de cellules géantes multinucléées, ou cellules géantes à corps étranger.
Quand une réaction à corps étranger se développe, elle persiste toute la durée de vie de
l’implant chez l’hôte. A long terme, une fibrose, voire une encapsulation, se développe autour
de l’implant. Ce genre d’inflammation cesse et se cicatrise par du tissu fibreux aussitôt que
l’irritant responsable est éliminé (Woodward SC, 1999).
LE SULFATE DE GENTAMICINE
Le sulfate de gentamicine est un antibiotique constitué par un mélange de sulfates de
substances antimicrobiennes produites par Micromonospora purpurea ou par
Micromonospora echinospora ou une de ses variantes.
La gentamicine comprend trois composés apparentés (gentamicines C1, C2, C1a) mais
aussi de la gentamicine A qui, elle, est similaire à la kanamycine C.
La gentamicine appartient à la famille des aminosides, encore appelés
aminoglycosides, oligosaccharides ou amino-cyclidols. Ils sont constitués de sucres aminés
dérivés du noyau 2 doxystreptamine (Fig. 2) (Bergeron MG, 1992; Budavari S et coll., 1996).
Elle est commercialisée sous forme d’ampoules injectables (intraveineuse, ou
intramusculaire), sous forme de collyres ou d’implants: Duracoll ® (gentamicine sur collagène
bovin), Septopal® (gentamicine sulfate + zirconium). La gentamicine est indiquée dans le
traitement des infections bactériennes causées par des bacilles Gram négatif ou par des cocci
(particulièrement les staphylocoques). Elle peut être appliquée localement pour traiter
certaines infections bactériennes localisées (Medicines Complete Browser, 2004) comme les
ostéomyélites chroniques.
14

R 1
I.12. Propriétés pharmacocinétiques
Données bibliographiques
Figure 2: Formules chimiques de la gentamicine
Gentamicine C1 R1 = R2 = CH3
Gentamicine C2 R1 = CH3, R2 = H
Gentamicine C1a R1 = R2 = H
Par voie orale, les aminosides ne sont pas absorbés, mais ils conservent leur activité
locale. Par voie intramusculaire, les aminosides sont bien tolérés et rapidement absorbés. Les
constantes de distribution et d’élimination sont analogues pour ces deux voies. Par voie sous
cutanée, la réabsorption des aminosides est bonne avec une variation intra et interindividuelle.
Dans le plasma, les aminosides sont sous forme libre. Cette propriété explique en
partie leur rapidité d’action et la corrélation entre l’effet antibactérien et la concentration
minimale inhibitrice (CMI).
HN
R 2
O
NH 2 O
Ils se répartissent dans 3 compartiments : central essentiellement vasculaire, tissulaire
extracellulaire et profond représenté par le parenchyme rénal. Leur élimination totale à partir
des 3 compartiments est lente (évaluée entre 50 et 200 heures). La variabilité interindividuelle
de la pharmacocinétique est très importante. Ainsi, l’élimination des aminosides à partir du
compartiment extracellulaire est allongée chez le sujet âgé, en cas de déshydratation et en cas
d’altération de la fonction rénale. Par contre, l’hyperdynamisme cardiaque et les états
septiques ont des effets inverses. Compte tenu de ces multiples variations, il est indispensable
de contrôler régulièrement les taux sériques pour adapter la posologie.
HO
H 2N
O
O
HO CH 3
H 3C
NH 2
NH
OH
15

Données bibliographiques
Les aminosides sont éliminés sous forme active essentiellement par voie rénale et
faiblement par voie biliaire. L’élimination urinaire représente 80 à 90% de l’élimination sur
24 h. Elle dépend de la vitesse de filtration glomérulaire. Ils subissent ensuite une
réabsorption tubulaire modérée, saturable, suivie d’une excrétion secondaire de faible
intensité (Ezaitouni F et coll., 1999; Medicines Complete Browser, 2004).
I.13. Mode d’action
Les aminosides sont actifs principalement sur les bacilles aérobies à Gram négatif et
les staphylocoques (Davani S et coll., 2002).
Les aminosides se fixent sur des récepteurs bactériens et traversent rapidement la
paroi. Ils sont ensuite transportés vers la membrane cytoplasmique. Dans la cellule, ils se lient
aux ribosomes et induisent une erreur ou une inhibition de la traduction des protéines de la
cellule. La formation de ces protéines anormales augmente la perméabilité bactérienne, altère
la respiration cellulaire et conduit à la mort bactérienne.
Les aminosides sont donc des agents bactéricides. Cette bactéricidie est pic et dose
dépendante. Par ailleurs, ils ont un effet post-antibiotique important, concentration dépendant,
d’où l’intérêt de forte dose unique (Ezaitouni F et coll, 1999).
I.14. Précautions
Des précautions relatives à l’utilisation des aminosides doivent être prises dans
certaines situations:
- Pathologie cochléo-vestibulaire: la gentamicine doit être utilisée avec prudence chez
les sujets porteurs d'une lésion vestibulaire ou cochléaire.
- Insuffisance rénale: la néphrotoxicité et l'ototoxicité de l'antibiotique imposent les
précautions d'emploi suivantes.
En cas d'insuffisance rénale, la gentamicine ne doit être utilisée qu'en cas de stricte
nécessité et la posologie adaptée en fonction de la clairance de la créatinine. Une surveillance
médicale portant sur les fonctions rénale et auditive est nécessaire. Les concentrations
sériques de l'antibiotique seront contrôlées, dans la mesure du possible, afin d'éviter de
dépasser, de façon prolongée, le seuil toxique pour l'appareil cochléovestibulaire que l'on
situe à 10-12 µg/mL.
De même, des concentrations sériques résiduelles supérieures à 2 µg/mL sont à éviter.
- Traitement prolongé et/ou répété à éviter: compte tenu de la pharmacocinétique du
produit et du mécanisme de l'ototoxicité et de la néphrotoxicité, les traitements itératifs et/ou
16

Données bibliographiques
prolongés, particulièrement chez les sujets âgés doivent être évités (Medicines Complete
Browser, 2004).
I.15. Toxicité des aminosides
Les aminosides ont un faible index thérapeutique car les taux d’activité sont proches
des taux toxiques. Leur toxicité est largement dominée par la néphrotoxicité, suivie de
l’ototoxicité. La néphrotoxicité est favorisée par la coadministration de médicaments
néphrotoxiques, par la présence de pathologies sous-jacentes (déshydratation) ou par la
présence d’une diminution de la filtration glomérulaire (insuffisant rénal, vieillard, nouveau-
né). L’évolution après arrêt du toxique est généralement favorable, aboutissant à une guérison
spontanée sans séquelles. L’ototoxicité se manifeste par une atteinte cochléaire et/ou
vestibulaire irréversible.
Mais les aminosides peuvent aussi être responsables de réactions allergiques, d’un
effet curarisant par effet compétitif avec les ions calcium en présynaptique et par inhibition de
la libération présynaptique d’acéthylcholine au niveau de la jonction neuro-musculaire.
D’exceptionnels effets neurologiques, hépatiques ou hématologiques ont été rapportés
(Davani S et coll., 2002, Ezaitouni F et coll., 1999).
I.15.1. Mécanisme d’action toxique au niveau rénal
Après filtration glomérulaire, les aminosides se fixent par la charge cationique des
groupements aminés sur les sites anioniques phospho-inositols des cellules de la bordure en
brosse du tube contourné proximal. Intégrés par pinocytose dans les vacuoles, ils
s’accumulent dans la cellule, puis sont transférés vers les lysosomes. Ils inhibent les
phospholipases et les sphyngomyélinases lysosomiales, induisant une phospholipidose. Ils
altèrent les membranes lysosomiales, le métabolisme mitochondrial et inhibent l’ATPase
Na+/K+ dépendante et les phospholipases C. Une atteinte glomérulaire est possible mais plus
rare, due à une ischémie et à une altération de l’endothélium glomérulaire avec diminution de
l’ultrafiltration (Ezaitouni F et coll., 1999).
I.15.2. Caractéristiques sémiologiques de la néphropathie
Sa survenue est insidieuse. En effet, l’atteinte rénale ne s’accompagne ni d’œdèmes, ni
d’hypertension artérielle, ni de douleurs lombaires, ni d’hématurie macroscopique ni
d’oligoanurie. Seule une polyurie peut être notée, due à un trouble de la concentration des
urines en rapport avec une insensibilité des cellules épithéliales du tube collecteur à l’action
17

Données bibliographiques
de la vasopressine. C’est en fait, bien souvent devant l’élévation de l’urée et/ou de la
créatinine sanguines que l’on découvre l’atteinte rénale (Ezaitouni F et coll., 1999).
I.15.3. Histologie
Les aminosides entraînent une nécrose tubulaire, habituellement limitée aux tubes
contournés proximaux et à la pars recta. La lésion la plus précoce visible au microscope
électronique est une augmentation du nombre et de la taille des lysosomes contenant des
phospholipides appelés corps myéliniques. Ces anomalies lysosomiales ne sont pas toujours
associées à une nécrose cellulaire et à une insuffisance rénale. De plus, elles ne sont pas
spécifiques de la toxicité des aminosides et peuvent se voir dans d’autres tissus et avec
d’autres toxiques. A un stade plus avancé, on note un gonflement des mitochondries et une
diminution ou une perte de la bordure en brosse des cellules épithéliales proximales.
Au microscope optique, les tubes perdent leur bordure en brosse, l’épithélium tubulaire est en
partie nécrosé et les lumières de certains tubes sont élargies, encombrées de débris cellulaires.
Les membranes basales tubulaires persistent, et la régénération cellulaire commence tôt, vers
le 10-12 ème jour. Elle aboutira dans la majorité des cas à la reconstruction ou la régénération
totale de l’épithélium tubulaire. Les signes de régénération peuvent être observés sous forme
de mitoses et de cellules immatures peu différenciées reprenant progressivement une structure
et une hauteur normales. Des foyers interstitiels de cellules inflammatoires sont habituels à ce
stade (Ezaitouni F et coll., 1999).
I.15.4. Toxicité auditive
Les aminosides pénètrent dans les liquides de l'oreille interne et dans le tissu lui-même
par un mécanisme qui, comme dans le cas du rein, est saturable dans les conditions
d'administration clinique. L'accumulation des aminosides dans les cellules ciliées de la
cochlée est responsable du développement d'une toxicité spécifique. La plupart des lésions
induites sont aspécifiques et sont le signe d'une dégénérescence. Les mécanismes sous-jacents
sont encore mal connus mais pourraient englober une inhibition de la cascade des
phosphoinositides (et donc de la régulation du métabolisme cellulaire) consécutive à la liaison
de l'aminoside au lieu de Ca 2+ au phosphatidylinositol bisphosphate sur la face interne de la
membrane plasmique.
La toxicité se manifeste au niveau vestibulaire par des nausées, vertiges, du nystagmus
ou parfois des céphalées. Elle se rencontre surtout avec la streptomycine.
18

Données bibliographiques
Au niveau cochléaire, le développement de la toxicité cause des bourdonnements d'oreille et
des pertes auditives commençant d'abord par les hautes fréquences (effet dont le patient ne se
rend souvent pas compte) et évoluant ensuite vers les fréquences conventionnelles, entraînant
une surdité qui peut être complète.
Contrairement à la toxicité rénale, la toxicité auditive est irréversible (car elle touche
un tissu nerveux) et dès lors cumulative si l'on administre plusieurs traitements au même
patient (Medicines Complete Browser, 2004).
LA MONOLÉINE
Glycérol-1-oleate, mono-oléate de glycéryle, monooléine, α-mono-oléine glycérol sont
des synonymes de la monoléine (Rowe RC et coll., 2003).
I.16. Propriétés physico-chimiques
La monoléine est en réalité un mélange de glycérides d’acide oléique et d’autres acides
gras, constitué principalement de monooléate de glycéryle. C’est un lipide polaire qui gonfle
en présence d’eau pour donner différentes phases aux propriétés rhéologiques différentes. En
présence d’excès d’eau, la monoléine forme une phase cubique. Une telle phase cubique
formée peut servir de forme à libération prolongée de principes actifs hydrosolubles.
En effet, le groupement carboxylique de l’acide oléique est lié à un groupement
hydroxyle du glycérol par une liaison ester. Ainsi, les deux groupements hydroxyles libres
confèrent des propriétés polaires à la monoléine du fait de leur possibilité de créer des liaisons
hydrogène avec l’eau. La longue chaîne hydrocarbonée donne des propriétés hydrophobes à la
monoléine (Fig. 3). La monoléine est soluble dans le chloroforme, l’éthanol, l’éther, et dans
les huiles végétales et minérales. Elle pratiquement insoluble dans l’eau.
Le monoléine est préparée par estérification du glycérol avec des acides gras,
principalement l’acide oléique. Comme les acides gras ne sont généralement pas purs, mais
plutôt un mélange, les produits issus de l’estérification contiendront un mélange d’esters. Des
di- ou des triglycérides peuvent aussi y être présents. La composition et, par conséquent, les
propriétés de la monoléine peuvent varier d’un fabricant à un autre. En exemple, son point de
fusion varie de 10 à 35 °C selon les fabricants (Rowe RC et coll., 2003).
19

I.17. Toxicité
Données bibliographiques
La monoléine est pratiquement sans toxicité, biocompatible et biodégradable (Ganem-
Quintanar A et coll., 2000; Rowe RC et coll., 2003). Elle fait l’objet de nombreuses études en
vue de son utilisation comme matrice de formes à libération contrôlée administrées par voies
orale ou parentérale (Norling T et coll., 1992; Okonogi S et coll., 2004; Puri V et Bansal AK,
2004). La monoléine est aussi utilisée en cosmétologie et en diététique comme émulsifiant.
Aucun signe de toxicité et de létalité n’a été observé chez des rats ayant reçu en
administration orale une dose unique de 13 mL/Kg de produit cosmétique renfermant 5% de
monoléine. Une application unique de la monoléine non diluée sur peau animale a révélé
qu’elle est peu irritante. Des patches occlusifs contenant de la monoléine utilisés chez
l’Homme n’ont pas provoqué de réactions d’irritation. Des irritations oculaires minimes à
modérées ont été observées chez le lapin avec de la monoléine diluée. (Anonymat, 1986).
HO
C12H40O4
P.M : 248 g
OH
O
C21H40O4
O
Figure 3: formule chimique de la monoléine (Mono-oléate de glycéryle)
Dans le milieu biologique, la monoléine peut s’hydrolyser en glycérol et en acide oléique
sous l’action d’estérases (Ganem-Quintanar A et coll., 2000).
I.18. Les métabolites de la monoléine
I.18.1. Le glycérol
1,2,3-propanetriol, glycérine, trihydroxypropane glycérol sont des synonymes du
glycérol (Fig. 4). Il est largement utilisé dans différentes formulations pharmaceutiques:
préparations orales, otiques, topiques et parentérales. Dans les préparations parentérales, le
glycérol est utilisé essentiellement comme solvant. Dans les solutions orales, il est utilisé
20

Données bibliographiques
comme solvant, édulcorant, conservateur antimicrobien, et agent viscosifiant. Il est aussi
utilisé en cosmétologie et comme additif alimentaire.
Le glycérol est considéré comme agent non irritant et non toxique. Il n’a pas d’effets
délétères lorsqu’il administré lentement par voie parentérale. Cependant, administré à une
dose supérieure à 70-80 g en 30-60 minutes chez l’adulte pour réduire la pression crânienne,
le glycérol peut provoquer une hémolyse, une hémoglobinurie, et une insuffisance rénale. Il
peut être utilisé par voie orale (à la dose de 1,0-1,5 g/kg) pour réduire la pression
intraoculaire. La dose létale 50% du glycérol chez la souris par voie intraveineuse est de 6,2
g/kg. (Rowe RC et coll., 2003).
Dans l’organisme, le glycérol issu de l’hydrolyse des triglycérides peut être réutilisé
comme précurseur de la synthèse des lipides ou du glucose (néoglucogenèse) ou suivre la voie
de la glycolyse.
CH2OH
CHOH
CH2OH
Figure 4: formule chimique du glycérol (propan-1,2,3-triol ou 1,2,3-propanetriol
5).
I.18.2. L’acide oléique
Acide 9,10-octadecenoïque, acide oléinique sont des synonymes d’acide oléique (Fig.
Il est utilisé comme émulsifiant dans les aliments et dans les préparations
pharmaceutiques topiques. Il est aussi utilisé dans les préparations pharmaceutiques
transdermiques pour améliorer la biodisponibilité de certaines substances. L’acide oléique
marqué au 131 I et au 3 H est utilisé en imagerie médicale. Des tests in vitro ont montré que
l’acide oléique provoque des hémolyses. Par conséquent, une grande quantité d’acide oléique
administrée par voie intraveineuse ou per os pourrait être préjudiciable. La dose létale 50% de
l’acide oléique chez la souris par voie intraveineuse est de 0,23 g/kg. (Rowe RC et coll.,
2003).
21

H
H
C
H
(CH2)7
Figure 5: formule chimique de l'acide oléique
H
C
H
C
Données bibliographiques
(CH2)7
ETAPES DE DÉVELOPPEMENT D’UN MEDICAMENT
Il existe plusieurs voies de recherche pour mettre au point un médicament:
O
C
- l’extraction d’une substance à partir de produits naturels végétal, animal ou minéral; la
synthèse chimique des molécules à partir de radicaux dont on connaît ou suppose les
OH
propriétés thérapeutiques. Elle peut être totale ou partielle;
- la création de nouvelles substances par le biais des biotechnologies;
- la modélisation de molécules actives. La démarche de ce nouveau concept comporte
un certain nombre d’étapes dont la première est la détermination de la structure
tridimensionnelle d’une substance, qui au sein de l’organisme, agit à un niveau précis
du développement d’une maladie. La seconde étape consiste à " créer " une molécule
dont la structure est en parfaite adéquation avec celle de la cible de la substance
concernée. Une autre approche fait appel à la même démarche mais consiste à
" prendre une empreinte " de cette cible et à fabriquer d’après un moulage la molécule
susceptible d’agir;
- un autre type de recherche est la forme galénique qui permet d'améliorer ce qui existe
déjà en étudiant de nouveaux modes d'administration plus adaptés, plus efficaces, mieux
tolérés, plus faciles d'emploi.
Quelle que soit la voie de recherche, le développement d’un "nouveau" médicament
requiert des études pré-cliniques et cliniques.
I.19. Les pré-requis à l’expérimentation clinique
Il comporte:
I.19.1. Dossier technique et analytique
- la description de la composition qualitative et quantitative du médicament;
22

Données bibliographiques
- la description du mode de préparation du médicament (développement
pharmaceutique);
- la description des méthodes de contrôle des matières premières utilisées (substance
active et excipients;
- la description des méthodes de contrôle du médicament et des formes intermédiaires:
contrôle de la forme (caractéristiques physico-chimiques, cinétique de dissolution…),
l’identification et le dosage du principe actif, de l’excipient et des produits de
dégradation;
- Description des matériaux de conditionnement ;
- Description des substances de référence;
- les essais de stabilité.
La connaissance de ces paramètres permet d’assurer un contrôle de qualité des
médicaments fabriqués (Bourin M et coll., 1993; Allain P, 1999).
I.19.2. Etudes pharmacologiques
Il s’agit de mettre en évidence les effets du principe actif sur différents organes et
appareils. Ces études pharmacologiques comprennent aussi la recherche du mécanisme
d’action du principe actif (Bourin M et coll., 1993).
I.19.3. Etudes toxicologiques
- Toxicité par administration unique (toxicité aiguë) :
L’étude de toxicité aiguë comprend la détermination de la dose minimale mortelle
(DMM) et de la dose létale 50% (DL50), qui la quantité de substance (en mg/kg de poids
corporel) qui provoque la mort de 50% d’animaux d’un lot homogène quant à la race, le sexe,
l’âge et le poids. La voie d’administration choisie est de préférence celle qui sera utilisée pour
l’administration du médicament. La détermination de la DL50 permet de classer la substance
selon une échelle de toxicité.
Bien qu’obligatoire, la détermination de la DL50 a été souvent critiquée pour
différentes raisons: utilité clinique limitée, sacrifice d’un nombre élevé d’animaux, influence
marquée de diverses variables sur les résultats (souche, sexe des animaux, température à
laquelle est réalisé le test, régime alimentaire, conditions d’élevage, etc.), rendant l’exactitude
et la reproductibilité des valeurs de DL50 relativement aléatoires (Giroud JP et coll., 1988 ;
Bourin M et coll., 1993).
23

Données bibliographiques
- Toxicité par administration réitérée :
Le but de ces études est de mettre en évidence les altérations fonctionnelles ou
anatomopathologiques consécutives à l’administration du principe actif, et les organes cibles
sur lesquels s’exerce la toxicité (Giroud JP et coll., 1988 ; Bourin M et coll., 1993).
- Etude de la mutagenèse (ou de génotoxicité) :
Elle permet d’évaluer la capacité d’un produit à induire des altérations du patrimoine
génétique. Outre que ces altérations peuvent entraîner des anomalies permanentes et
héréditaires de la descendance, on sait que 85 à 90% des cancérogènes chimiques connus sont
mutagènes expérimentalement (Allain P, 1999, Viala A et Botta A, 2005). L’intérêt de
l’étude de la mutagenèse n’est plus donc à démontrer. Il existe une batterie de test pour
étudier la mutagenèse.
Test d’Ames
Il utilise des procaryotes. Il consiste à examiner si une substance chimique ou un agent
physique est capable d'induire des mutations spécifiques chez différentes souches de
Salmonella typhimurium. Les souches utilisées dans le test sont des souches porteuses d'une
mutation dans un des gènes gouvernant la synthèse de l'acide aminé histidine. Cette mutation
His- rend les souches incapables de pousser sur un milieu sans histidine. Avec une fréquence
très faible, ces mutations His - reversent spontanément vers His + et donc les cellules
retrouvent leur capacité à pousser sur un milieu dépourvu d'histidine. Cette fréquence de
réversion peut augmenter en exposant les bactéries His - à des agents mutagènes. Ainsi, le test
d'Ames permet de quantifier l'induction de ces mutations reverses His + .
En pratique, Le test d'Ames consiste à préparer une série de mélanges d'une quantité
constante d'une des souches et des quantités croissantes du produit à tester et à les étaler sur
des boîtes de Pétri contenant un milieu minimal. Ce milieu autorise la croissance des mutants
His + uniquement. Afin d'augmenter la sensibilité du test, une trace d'histidine est ajoutée qui
permet la croissance de 2 à 3 générations de His - et amplifie l'apparition des mutants. Après
incubation pendant 48h, le dénombrement des mutants His + est effectué. Ceux-ci apparaissent
sous la forme de colonies sur un tapis cellulaire translucide. Une courbe dose-réponse est
tracée en portant en ordonnées le nombre de His - /boîte en fonction des doses testées. Le
pouvoir mutagène est défini comme la pente de la région ascendante de la courbe (nombre de
His + /µg ou nmole).
24

eucaryote.
Données bibliographiques
C'est un test rapide et peu coûteux mais limité par son extrapolation à la cellule
Le test de numérisation des micronoyaux
Il est réalisé sur cellules eucaryotes. Lors d'une lésion majeure de l'ADN, une fraction
de chromosome ou un chromosome entier après la division cellulaire peut se détacher et
former un micronoyau visible après coloration au microscope. Sur culture de cellules, ce test
de micronoyaux permet de mesurer la génotoxicité des produits. Il a l’inconvénient d’être
lourd à mettre en œuvre. Les chercheurs lui préfèrent une nouvelle technique : les essais
comètes.
Les essais comètes
Il s'agit d'un test sur cellules eucaryotes qui consiste en l'étude du matériel nucléaire de
cellules individuelles. D'une façon schématique, I'ADN peut être représenté sous la forme
d'une bobine de fil et après cassures simples ou doubles brins induites par le composé
génotoxique, cette bobine se segmente. Positionnée dans un champ électrique, la bobine
s'étire et prend la forme d'une comète plus ou moins allongée proportionnellement au nombre
de lésions (voir schéma ci-après). Avec ce test, les chercheurs visualisent toutes les lésions
mais aussi celles provoquées par les mécanismes de réparation. C'est le gros avantage de cette
méthode comparée aux deux précédentes qui ne détectent que le stade final, c'est-à-dire les
lésions ayant entraîné une mutation.
• Dans la cellule, l'ADN est sous forme surenroulée et double-brins.
• Dans des conditions alcalines: relâchement de la structure surenroulée et libération des
fragments d'ADN.
ADN non fragmenté
Cellule
ADN
Cellule
lys
lyse
déroulement
de l'ADN
déroulement
de l'ADN
Electrophorèse
Electrophorèse
pas de migration
de l'ADN non
fragmenté
Migration des fragments d'ADN
25

- Etudes de carcinogénicité :
Données bibliographiques
Ce sont des études longues (24 mois chez le rat) et coûteuses réalisées le plus souvent
sur des rats et des souris. Ces études sont réalisées surtout pour des substances qui ont montré
des effets mutagènes (une telle caractéristique mène généralement à l’abandon d’une nouvelle
molécule). Les éléments d’évaluation de l’effet cancérigène comprennent la fréquence
d’apparition de tumeurs, la relation de cette fréquence avec la dose, le temps écoulé jusqu’à
l’apparition des premières tumeurs, la localisation et la multiplicité (éventuellement
métastases) des néoplasies (Giroud JP et coll., 1988).
Les études toxicologiques peuvent comporter aussi:
sur la descendance;
du mâle et de la femelle ;
- l’étude de la toxicité fœtale: des effets néfastes du produit sont recherchés
- l’examen de la fonction de reproduction: il consiste en l’étude de la fertilité
- l’étude des effets sur la péri et la post-natalité, de la tératogenèse à la
recherche d’apparition de malformations congénitales.
Pour le cas spécifique des implants ou des biomatériaux, avant d’être utilisés chez
l’homme, ils doivent passer plusieurs tests pour établir leur biocompatibilité (Tableau II).
26

Données bibliographiques
Tableau II: Tests de biomcompatibilité d'implant à libération contrôlée (Mallapragada SK et Narasimhan B,
1999)
Tests
Environnements biologiques de l’implant
Tissus mous et fluides Tissus osseux Sang
Cytotoxicité in vitro x x x
Implantation intramusculaire x x
Hémocompatibilité x
Hémolyse x
Carcinogénicité x x x
Implantation à long terme x x x
Toxicité aiguë (injection systémique) x x x
Injection intracutanée x x
Sensibilisation x x x
Mutagénicité x x x
Pyrogénicité x x x
I.20. L’expérimentation clinique
(AMM).
Il comporte trois phases et une étude après Autorisation de Mise sur le Marché
I.20.1. Phase I
Elle est réalisée chez des volontaires sains (à l’exception près du cas des médicaments
anticancéreux). Des doses croissantes du médicament sont administrées à des patients
successifs jusqu’à détermination d’un seuil d’intolérance. Elle comprend ensuite des études de
pharmacocinétique et si possible la mise en évidence d’effets pharmacologiques.
I.20.2. Phase II
Elle est réalisée chez des malades semblables à ceux chez qui on prévoit utiliser le
médicament. Son but est de tester l'efficacité du nouveau médicament, d'identifier sa dose
optimale (en relation avec son efficacité) et de contrôler les effets secondaires qu'il
occasionne.
27

I.20.3. Phase III
Données bibliographiques
Elle est réalisée chez des malades appartenant à la cible thérapeutique définie pour le
médicament, sur une période de temps suffisante pour permettre de juger des effets sur
l’évolution de la maladie. Son but est de tester l'efficacité du nouveau traitement par rapport à
celle du meilleur traitement connu, c'est-à-dire le traitement de référence. Ces études sont de
grande envergure car elles doivent être à même de détecter une éventuelle différence entre les
deux traitements qui peut être petite.
I.20.4. Etudes après AMM
Encore appelées études de Pharmacovigilance, elles sont destinées à affiner la
connaissance du médicament (situations physiologiques et pathologiques particulières,
mécanisme d’action) et à définir éventuellement de nouvelles indications, contre-indications,
ou effets indésirables après la mise sur le marché (Bourin M, 1993 ; Moulin M et Coquerel A,
2002).
BONNES PRATIQUES DE FABRICATION DES MEDICAMENTS STÉRILES
Les conditions de fabrication des médicaments stériles sont celles de Bonne pratique
de fabrication édictée par la Commission européenne (Commission européenne, 1999).
I.21. Généralités
La fabrication des médicaments stériles impose des exigences particulières en vue de
réduire les risques de contaminations microbienne, particulaire et de pyrogènes.
La fabrication des médicaments stériles doit s'effectuer dans des zones à atmosphère
contrôlée; l'entrée dans ces zones doit se faire par des sas réservés au personnel et/ou au
matériel et aux substances. Les zones à atmosphère contrôlée doivent être maintenues à un
niveau de propreté approprié et elles doivent être alimentées en air passé sur des filtres
d'efficacité correspondant au niveau de propreté requis.
Les différentes opérations de préparation du produit et de remplissage doivent être
effectuées dans la zone d'atmosphère contrôlée.
Aux fins de la fabrication de médicaments stériles, on distingue ordinairement quatre
classes de zones à atmosphère contrôlée:
28

Données bibliographiques
Classe: les points où sont réalisées des opérations à haut risque, tels que le point de
remplissage, les emplacements des bols vibrants de bouchons, les ampoules et flacons ouverts
ou les points de raccordements aseptiques. Les postes de travail sous flux d'air laminaire
satisfont normalement aux conditions requises pour ce type d'opérations. Les systèmes de flux
d'air laminaire doivent délivrer de l’air circulant à une vitesse homogène de 0,45m/s ± 20%
(valeur guide) au niveau du poste de travail.
Classe B: elle est destinée aux opérations de préparation et de remplissage aseptiques. A cette
classe devra appartenir l’environnement immédiat d’une zone de travail de classe A.
Classes C et D: ces zones à atmosphère contrôlée sont destinées aux étapes moins critiques
de la fabrication de médicaments stériles.
Le tableau ci-dessous classifie les différentes zones en fonction des caractéristiques
des particules présentes dans l'atmosphère :
Au repos (b) En activité
Classe Nombre maximal autorisé de particule par m 3 , de taille égale ou
supérieure à
0,5 µm 5 µm 0,5 µm 5 µm
A 3 500 0 3 500 0
B(a) 3 500 0 350 000 2 000
C(a) 350 000 2000 3 500 000 20 000
D(a) 3 500 000 20 000 Non défini (c) Non défini (c)
Notes :
(a) Pour atteindre les classes B, C et D, le nombre de renouvellements d'air doit être proportionnel à la taille de
la pièce ainsi qu'aux équipements et effectifs présents dans le local. Le système d'aération doit être muni de
filtres appropriés.
(b) Les indications données concernant le nombre maximum de particules "au repos" correspondent
approximativement au US Federal Standard 209 E et aux classifications de l'ISO comme suit : les classes A et B
correspondent à la classe 100, M 3.5, ISO 5; la classe C, à la classe 10 000, M 5.5, ISO 7 et la classe D, à la
classe 100 000, M 6.5, ISO 8.
(c) Pour cette zone, les conditions et les limites fixées dépendront de la nature des opérations réalisées.
29

Données bibliographiques
Les deux tableaux ci-après fournissent quelques exemples d'opérations qui seront
réalisées dans les différentes zones:
Classe Opérations sur des produits stérilisés dans leur récipient final
A Remplissage de produits, si l’opération présente des risques inhabituels
C Préparation de solutions, si l’opération présente des risques inhabituels. Remplissage
de produits.
D Préparation de solutions et d’accessoires aux fins de remplissage
Classe Opérations sur des préparations aseptiques
A Préparation et remplissage aseptique
C Préparation de solutions destinées à être filtrées
D Manipulation d’accessoires après nettoyage
I.22. Surveillance microbiologique des zones à atmosphère contrôlée
Les opérations aseptiques doivent être fréquemment surveillées par le biais de
méthodes utilisant des boîtes de Pétri, des échantillons volumétriques d'air et des contrôles de
surfaces (prélevés au moyen d'écouvillons et de géloses de contact). Les méthodes
d'échantillonnage utilisées ne doivent pas interférer avec la protection des zones. Les surfaces
et le personnel doivent être contrôlés après chaque opération critique. Une surveillance
microbiologique supplémentaire est également nécessaire en dehors des phases de production,
par exemple après des opérations de validation, de nettoyage ou de désinfection. La qualité
microbiologique des zones à atmosphère contrôlée obéit à des normes européennes
(Commission européenne, 1999) (Tableau III).
30

Données bibliographiques
Tableau III: Recommandations pour la surveillance microbiologique des zones à atmosphère contrôlée
durant la production.
Classe Echantillon d’air
Limites recommandées de contamination microbiologique (a)
UFC/m 3
Boîte de pétri
(diamètre : 55
mm)
UFC/plaque
Géloses de contact
(diamètre : 55 mm)
UFC/plaque
Empreintes
de gant (5
doigts)
UFC/gant
A

Données bibliographiques
La manipulation des matières premières et accessoires stériles qui ne seront pas
soumis ultérieurement à stérilisation ou à filtration à travers un filtre captant les
microorganismes doit être réalisée à un poste de travail de classe A dans un local de classe B.
La préparation de solutions qui doivent subir ultérieurement une filtration stérilisante
doit être effectuée dans un local de classe C; si ce n'est pas le cas, la préparation du matériel et
des produits doit se faire à un poste de travail de classe A, dans un local de classe B.
La manipulation et le remplissage des produits fabriqués aseptiquement doivent être
effectués à un poste de travail de classe A dans un local de classe B.
Le transfert, avant obturation, de récipients partiellement clos, tels que ceux qui sont
utilisés pour la lyophilisation, doit s'effectuer soit à un poste de travail de classe A dans un
local de classe B, soit sur des chariots de transfert scellés dans un local de classe B.
Pour les pommades, les crèmes, les suspensions et les émulsions, la préparation et le
remplissage doivent se faire à un poste de travail de classe A, dans un local de classe B, si au
cours de la préparation le produit est exposé et s'il n'est pas filtré ultérieurement.
ESSAIS DE STÉRILITÉ ET DES ENDOTOXINES BACTÉRIENNES DE MEDICAMENTS STÉRILES
I.25. Essais de stérilité
L’essai de stérilité s’applique aux substances, préparations et produits qui doivent être
stériles (World Health organization, 2006). Il doit être réalisé dans des conditions aseptiques.
Les techniques de filtration sur membrane ou d'ensemencement direct du milieu nutritif avec
le produit à examiner sont pratiquées.
La technique de filtration, qui utilise des membranes de porosité égale à 0,45 µm, est
recommandée à chaque fois que la nature du produit le permet. C'est le cas des préparations
aqueuses filtrables, des préparations alcooliques ou huileuses, et des préparations solubles
dans des solvants qui n'exercent pas d'effets antimicrobiens. Le filtre est découpé puis déposé
sur des milieux de cultures appropriés. Ces milieux sont ensuite incubés pendant une période
de deux semaines.
Un résultat favorable (absence de colonies microbiennes visibles) signifie qu'aucun
microorganisme n'a pu être décelé dans l'échantillon examiné, dans les conditions de l'essai
(Le Hir A, 2001). Pour garantir l’absence de microorganismes dans un échantillon, il faut en
principe que les milieux de culture utilisés pour l’essai permettent la croissance de toutes les
32

Données bibliographiques
espèces microbiennes: bactéries aérobies, anaérobies, et aérobies anaérobies facultatives,
champignons, levures.
En pratique, les milieux de culture incubés sont examinés au quotidien pendant les 14
jours pour déceler les signes macroscopiques d’une prolifération microbienne. S’il n’y a
aucune prolifération, le produit satisfait à l’essai de stérilité. En cas de prolifération
microbienne, des répétitions de l’essai sont souvent nécessaires pour écarter ou confirmer
l’hypothèse d’une contamination intrinsèque.
Dans la première répétition de l'essai, le nombre d’échantillons et les quantités à
examiner sont les mêmes que ceux indiqués pour le premier essai. Si aucune manifestation de
prolifération n'est décelée, le produit satisfait à l’essai de stérilité. Si la prolifération
microbienne est constatée dans un des milieux de culture, les contaminants sont identifiés et
comparés avec ceux du premier essai. Si les contaminants sont identiques, le produit est non
stérile.
Dans la situation ou les contaminants sont différents, une seconde répétition de l’essai
doit être effectuée, avec un nombre d’échantillons double de celui qui a été utilisé pour le
premier essai de stérilité. La quantité de produit à prélever dans chaque unité reste cependant
la même que celle indiquée pour le premier essai. Si aucune manifestation de prolifération
microbienne n’est décelée, le produit satisfait à l’essai. Si une croissance est décelée, le
produit ne satisfait pas aux exigences de l’essai de stérilité.
I.26. Essais des endotoxines bactériennes
I.26.1. Historique, nature et toxicité des endotoxines
Le terme endotoxine, désigne des lipopolysaccharides (LPS) issus de la paroi des
bactéries Gram négatif (Rudbach JA et coll., 1976).
La toxicité des endotoxines bactériennes, bien que rarement létale, se manifeste
généralement par de la fièvre, des frissons, des céphalées, des palpitations et de la cyanose.
Ces manifestations appelées aussi effets pyrogènes, sont uniquement observées après
administration parentérale des préparations pharmaceutiques contenant des substances
pyrogènes dont les endotoxines. Etant donné que l'activité pyrogène de ces dernières est
beaucoup plus élevée que celle des autres substances ayant une structure chimique différente,
il est souvent admis d’interpréter l’absence d’endotoxines bactériennes dans un produit
pharmaceutique comme équivalent à l’absence de pyrogènes (Fennrich S et coll., 1999; et
Hoffmann S et coll., 2005).
33

Données bibliographiques
I.26.2. Techniques de recherche et de quantification des endotoxines
bactériennes
La recherche des endotoxines dans les préparations pharmaceutiques administrées par
voie parentérale était habituellement effectuée sur des lapins. Cette technique consistait à
évaluer la réponse fébrile des lapins à l’administration du produit à tester. Un nouvel essai
offre plusieurs avantages par rapport à l'essai sur le lapin .Il est moins laborieux, moins cher et
plus sensible. Il s’agit du test LAL.
Le test LAL permet de rechercher et de quantifier in vitro des endotoxines produites
par les bactéries Gram négatif, au moyen d’un lysat d’amœbocytes de limule (LAL).
M, 1989):
Le test LAL peut être réalisé selon trois techniques différentes (Le Minor L et Véron
- la gélification qui induit la formation d’un gel en présence des endotoxines.
L’avantage de cette méthode est sa simplicité, la décision de déclarer le résultat de l’essai
positif ou négatif reposant sur la présence ou l’absence de gélification, visible à l’œil nu.
endogène ;
- la turbidimétrie qui entraîne le développement d’un trouble par clivage d’un substrat
- la colorimétrie qui entraîne le développement d’une coloration, suite au clivage d’un
complexe peptide chromogène synthétique.
Ces deux dernières techniques sont quantitatives. Elles nécessitent plus
d’instrumentations. Elles sont cependant plus faciles à automatiser pour le contrôle de routine
de grands nombres d’échantillons d’un même produit.
Etant donné que dans notre étude nous utiliserons la technique de gélification, les
conditions générales de réalisation de cette technique sont décrites ci- dessous.
I.26.3. Mise en œuvre d’un test LAL par la technique de gélification
a) La limite en endotoxines
La décision d’utiliser l’essai des endotoxines bactériennes sous forme d’essai limite
(gélification) implique de déterminer une teneur limite en endotoxines pour le produit à
examiner. L’objectif de l’essai est de vérifier si la teneur en endotoxines du produit est
inférieure ou supérieure à la limite définie.
Pour les produits à l’état solide, la teneur limite en endotoxines par unité de masse ou
par Unité Internationale (UI) de produit doit être convertie en concentration par millilitre de
solution à examiner, puisque l’essai ne peut être effectué qu’en milieu liquide.
L = K / M
34

L = Teneur limite en endotoxines
Données bibliographiques
K : Dose seuil d’endotoxines ayant un effet pyrogène, par kilogramme de masse corporelle et
par heure;
M : Dose maximale recommandée pour le produit, par kilogramme de masse corporelle et par
heure.
La limite en endotoxines, qui est fonction du produit et de sa voie d’administration, est
souvent indiquée dans les monographies. A titre d'exemples, des valeurs de K sont proposées
dans le Tableau IV.
Tableau IV : Dose seuil d’endotoxines (K) par kg de masse corporelle et par heure, en fonction de la voie
d’administration
Voie d’administration K (UI d’endotoxines par kilogramme de
masse corporelle et par heure)
Intraveineuse 5,0
Intraveineuse, produits radiopharmaceutiques 2,5
Intrarachidienne 0,2
b) La dilution maximale significative
Pour chaque produit à examiner, il faut aussi déterminer la dilution maximale du
produit à utiliser dans l’essai. Cela permet d'établir, avec un niveau d’assurance maximal,
qu’un résultat négatif signifie que la teneur en endotoxines du produit est inférieure à la limite
autorisée, et qu’un résultat positif signifie que le lysat a réagi à une concentration
d’endotoxines au moins égale à cette limite. Cette dilution, qui dépend à la fois de la limite en
endotoxines et de la sensibilité du lysat, est appelée Dilution Maximale Significative (DMS).
Elle peut être calculée d’après la formule :
DMS = L / λ
λ : Sensibilité déclarée du lysat (UI / mL) pour la technique de gélification.
La concentration du produit dans la solution à examiner est exprimée en:
- mg / mL si la limite en endotoxines est spécifiée par rapport à la masse (UI / mg)
35

Données bibliographiques
- Unités / mL si la limite en endotoxines est spécifiée par rapport à l’unité d’activité
biologique (UI / Unité),
- mL / mL si la limite en endotoxines est spécifiée par rapport au volume (UI / mL).
Une Unité Internationale (UI) d’endotoxine équivaut à une Unité d’Endotoxine (UE).
c) pH du mélange réactionnel
Dans l’essai des endotoxines bactériennes, la gélification est optimale lorsque le
mélange a un pH compris entre 6,0 et 8,0. Toutefois, l’addition du lysat à l’échantillon peut
conduire à une baisse du pH.
d) Confirmation et validation du lysat
L’application de ces différentes méthodes exige préalablement la confirmation de la
sensibilité déclarée du lysat et la recherche d’éventuels facteurs d’interférences (European
Pharmacopoeia, 2005). Il faut également s’assurer de l’absence d’endotoxines dans les
réactifs et le matériel utilisés pour la réalisation de l’essai.
e) Les Témoins
Un témoin positif (solution C1) composé d’eau pour essai des endotoxines
bactériennes (EEB) et de la préparation de référence d’endotoxines à concentration double de
la sensibilité déclarée du lysat, doit être parallèlement soumis à l'essai. Son rôle est de
permettre de vérifier l’activité du lysat dans les conditions de l’essai.
Un témoin négatif (solution D) constitué d'eau LAL, est aussi réalisé afin de vérifier
l’absence d’endotoxines à concentration détectable dans l’eau LAL.
Enfin, un autre témoin positif (solution B1) constitué du produit à examiner à la
concentration utilisée dans l’essai, et de la préparation de référence d’endotoxines, sert à
démontrer l’absence de facteurs d’inhibition dans les conditions de l’essai.
f) Incubation, lecture et interprétation des résultats de l'essai
Les tubes de réaction contenant les mélanges réactionnels sont mis en incubation
pendant 1 heure à 37 °C sans agitation. La lecture des résultats est visuelle et se fait après
avoir inversé le tube de réaction d’un angle de 180°, sans à coups. Si un gel s’est formé et
reste intact au fond du tube après renversement à 180°, le test est positif.
36

Données bibliographiques
L’essai n’est valable que si le résultat obtenu avec chacun des exemplaires des témoins
positifs (solution B1 et C1) est positif et si le résultat de chacun des exemplaires du témoin
négatif (solution D) est négatif.
La préparation à examiner satisfait à l’essai si tous les résultats obtenus avec la
solution à examiner sont négatifs.
Par contre, lorsque les résultats obtenus avec la solution à examiner sont positifs :
- l’essai doit être répété à une dilution plus élevée (mais ne dépassant pas la DMS) si
la dilution de la préparation à examiner est inférieure à la DMS.
- la préparation à examiner ne satisfait pas à l’essai, si elle a été diluée à la DMS.
- si un des résultats obtenus avec la solution à examiner est positif et les autres
négatifs, l’essai doit être répété. La préparation à examiner satisfait à l’essai si tous les
résultats obtenus avec la solution à examiner lors de la répétition sont négatifs.
37

DEUXIEME PARTIE : NOTRE ETUDE

CADRE DE L’ETUDE
Nous avons mené les différentes études dans les laboratoires de l’Institut de Pharmacie
de l’Université Libre de Bruxelles (Belgique), de l’Unité de Formation et de Recherche en
Sciences de la Santé de l’Université de Ouagadougou (Burkina Faso) et au Centre Hospitalier
Universitaire Yalgado OUEDRAOGO de Ouagadougou.
Les essais de formulation, les études de caractérisation physico-chimique des implants,
et les études de cinétique de libération du principe actif à partir des implants ont été réalisés
dans les Laboratoires suivants: le Laboratoire de Pharmacie Galénique et de Biopharmacie et
le Laboratoire de Pharmacognosie, Bromatologie et Nutrition humaine de l’Institut de
Pharmacie de l’Université Libre de Bruxelles (ULB).
Nous avons réalisé les études toxicologiques in vitro au Laboratoire de Chimie
Bioanalytique, de Toxicologie et de Chimie Physique Appliquée de l’Institut de Pharmacie
(ULB).
La fabrication des implants en zones à atmosphère contrôlée a été réalisée dans la
« Salle blanche » de l’Unité de Formation et de Recherche en Sciences de la Santé
(UFR/SDS) de l’Université de Ouagadougou. Les essais microbiologiques sur les implants, le
test de recherche d’endotoxines et certains tests de caractérisation physico-chimique des
implants ont été mis au point dans les Laboratoires de Pharmacie galénique et de Chimie
analytique de l’UFR/SDS.
Nous avons mené Les études toxicologiques des implants chez l’animal dans le
Laboratoire de Pharmacologie/ Toxicologie de l’UFR/SDS et dans les Laboratoires de
Biochimie, d’Anatomie et de Cytologie pathologiques du Centre Hospitalier Universitaire
Yalgado OUEDRAOGO (CHU-YO).
CHU-YO.
L’essai clinique de l’implant a été réalisé au Service de Traumatologie/orthopédie du
39

OBJECTIFS
1. Objectif général
Développer et évaluer un implant biodégradable à base de gentamicine et de
monoléine destiné au traitement des ostéomyélites chroniques.
2. Objectifs spécifiques
Mettre au point une procédure de fabrication d’implants biodégradables à base de
gentamicine et de monoléine.
Déterminer les caractéristiques physico-chimiques des implants fabriqués.
Déterminer in vitro la cinétique de libération de la gentamicine à partir des
implants.
Réaliser des essais microbiologiques et de recherche d’endotoxines sur les
implants fabriqués.
Evaluer in vitro la toxicité de l’implant.
Evaluer chez l’animal la toxicité de l’implant.
Evaluer cliniquement l’efficacité et l’innocuité de l’implant.
40

CHAPITRE I: FABRICATION D’IMPLANTS BIODEGRADABLES DESTINES AU
TRAITEMENT D’OSTEOMYELITES CHRONIQUES

Chapitre I
INTRODUCTION
La fabrication des produits pharmaceutiques utilisés sous forme d'insert ou d'implant
impose un certain nombre de règles visant à assurer la qualité et la sécurité sanitaire du
produit (World Health Organization, 2006). En effet, ces préparations, du fait de leur mode
d'administration qui est la voie parentérale, doivent être stériles et apyrogènes (World Health
Organization, 2006). L'utilisation de Zones à atmosphère contrôlée du point de vue de la
contamination particulaire et microbienne (ou Salle blanche) s'impose donc (Commission
européenne, 1999). Ces Zones à atmosphère contrôlée doivent répondre à des spécifications
définies en fonction des opérations pharmaceutiques à y mener (Le Hir A, 2001). Pour la
préparation de nos implants, une unité de fabrication de produits pharmaceutiques stériles
(appelée "salle blanche") installée à cet effet a servi de site de production. Nous avons
entrepris de réaliser des contrôles particulaire et microbiologique des différents
compartiments de la "Salle blanche" et des surfaces de travail en vue de s’assurer de leur
conformité avec les recommandations généralement prescrites.
I. MATÉRIEL ET MÉTHODES
La "Salle blanche" et les surfaces de travail ont fait l’objet de contrôles particulaires et
microbiologiques. Elle comporte plusieurs compartiments (Fig. 6):
- Le sas d'entrée:
Il est la zone d'accès à l’unité de préparation. Il s'ouvre sur l'extérieur par une porte
métallique surmontée d'une soufflerie verticale qui reflue l'air entrant. On y trouve une
étagère contenant le matériel de nettoyage et divers autres matériels (tabliers, chaussures
pour visiteurs, etc.)
- La zone technique (ZT):
Elle comporte deux compartiments:
Le premier compartiment contient une étuve et un autoclave qui servent à la
stérilisation du matériel, une soufflante notée V8 qui achemine l'air de la ZT vers la zone
stérile, un climatiseur qui maintient la température à 20 ± 2 °C, et le tableau électrique des
installations ;
Dans le second compartiment, on y trouve un générateur d'eau stérile désionisée, un
cryostat, une pompe à vide, un évier, deux climatiseurs, une soufflante notée V7, et une unité
de prise d'air extérieur. Il s'agit d'un groupe pulsant, équipé d'un régulateur de débit d'air qui
42

Chapitre I
assure la surpression de l'ensemble du site par rapport à l'extérieur. Elle porte deux filtres
notés F10.1et F10.2.
- Le sas:
C’est une barrière physique entre la zone stérile et les zones environnantes. Il permet
notamment le lavage des mains, l’habillage du personnel ainsi que le transit du matériel et du
personnel. On y trouve une étagère sur laquelle sont rangés le matériel et les réactifs
nécessaires à l'entretien de la salle stérile, et à la fabrication des implants (antiseptiques,
alcool, compresses stériles, habits stériles emballés, etc.). Au fond de ce compartiment se
trouve un évier à commande fémorale, qui sert au lavage et à la désinfection des mains avant
l’habillage. Cet évier se situe sous une hotte à flux laminaire notée F8. A coté de cet évier se
trouve un réfrigérateur qui sert à la conservation des indicateurs physiques et biologiques, des
milieux de culture, des matières premières, et tout autre produit relatif à la production dont la
conservation se fait au frais.
- La zone stérile (ZS):
C'est la zone de production et de conditionnement des implants. Elle contient outre les
tables qui servent de paillasses de travail, les appareils nécessaires à la production (rotavapor,
balances, etc.). Elle est balayée par de l'air filtré par les flux laminaires F1, F2, F3, F4, F5, F6
et les filtres F7.1 et F7.2.
- Le "pass box":
C’est un caisson muni d'une fenêtre destinée au passage du matériel stérile vers la zone
de production (Zone stérile). Il est situé sous une hotte à flux laminaire notée F9.
43

Figure 6: Plan détaillé de la "Salle blanche"
F : filtres d’air
ZT : Zone technique
ZS : Zone stérile
Chapitre I
I.1. Détermination de la contamination particulaire de l'air des différents
compartiments de la "Salle blanche"
Nous avons utilisé un compteur de particules à grand débit (MET ONE 227 B, Pacific
Science Instrument, USA) pour déterminer le niveau de contamination de l’air par des
particules. Les mesures ont concerné les particules de taille supérieure ou égale à 0,5 µm et
celles de taille supérieure ou égale à 0,3 µm. Le prélèvement a été fait à un débit de 0,1 pied
cube par minute (soit 2,83 L/min.) pendant une minute.
Les sites de prélèvement sont décrits dans la Figure 7:
- la salle stérile: points 1 à 7;
- le sas d'entré: points 8.1 et 8.2;
- le pass box: point 9;
ZT 2
- la zone technique: point 10.
ZS
Sas
ZT 1
Sas
d’entrée
44

Chapitre I
Les contrôles ont été faits au repos et pendant les activités de production, dans les
conditions suivantes: ventilation en fonctionnement et climatiseurs en marche.
Pour le cas particulier du contrôle particulaire au repos, la prise d'air n'a été déclenchée
que cinq minutes après que le manipulateur ait quitté la salle.
Nous avons effectué les contrôles trois fois à des intervalles de 5 jours.
Les différents compartiments ont été enfin classés selon leur niveau
d’empoussièrement.
I.2. Contrôle de la biocontamination de l'air des différents compartiments de la "Salle
blanche"
Le contrôle microbiologique de l'air ambiant s'est fait selon la méthode d’impaction
sur boîtes de pétri montées sur biocollecteur (SAS SUPER 180 PBI International, Italie). Le
principe est basé sur la collision des microorganismes sur des milieux gélosés par aspiration
d'un volume connu d'air. Le volume d'air prélevé a été de 1 000 L. Les sites de prélèvement et
les conditions de prélèvement sont les mêmes que ceux du comptage particulaire.
Le biocollecteur a été placé sur la table de travail ou supporté par un trépied selon que
le prélèvement est fait sous le flux laminaire ou en dehors du flux. Le prélèvement a consisté
chronologiquement à :
- ouvrir le couvercle perforé ou tête de prélèvement de l'appareil;
- placer une boîte de pétri sur le support de boîte;
- retirer le couvercle de la boîte de pétri;
- repositionner la tête de prélèvement du biocollecteur;
- l'appareil étant préalablement programmé, déclencher la prise d'air;
- retirer la tête du biocollecteur puis la boîte de pétri après la prise d'air.
L'appareil a été désinfecté après chaque prélèvement à l'aide de Phagospray®
(antiseptique composé d’un ammonium quaternaire et de l’éthanol).
Les milieux de culture utilisés ont été du Sabouraud-Chloramphénicol (propice à la
culture des champignons et des moisissures) et la gélose trypto-caséine soja (TSA) propice à
la culture des bactéries aérobies. Comme témoins négatifs (blancs), nous avons incubé deux
boîtes de TSA et deux boîtes de sabouraud-chloramphénicol. Nous avons aussi ensemencé à
titre de témoins positifs, deux boîtes de TSA et deux boîtes de sabouraud-chloramphénicol
respectivement avec Staphylococcus aureus ATCC 653 et Candida albicans ATCC 10231.
L'incubation a été faite à 37 °C pour le TSA et à 25 °C pour le sabouraud-chloramphénicol
pendant cinq jours.
45

Chapitre I
Nous avons effectué les contrôles de la contamination microbiologique pendant les
activités de production et au repos à trois reprises à des intervalles de cinq jours.
Figure 7: Visualisation des sites de prélèvement pour les comptages particulaire et microbiologique de
l'air
46

Chapitre I
I.3. Contrôle de la biocontamination des surfaces de travail
Le contrôle de la contamination des surfaces de travail par des microorganismes a
concerné les paillasses de travail de la salle stérile, du sas, et du pass box (Figure 7, sites 1, 2,
3, 4, 5, 6, 8.1, et 9). Il a été réalisé dans des conditions identiques à celles précédant le
démarrage d’une production.
Nous avons utilisé la méthode de l'écouvillonnage pour réaliser les prélèvements. Les surfaces
à contrôler ont d'abord été découpées en zones virtuelles (10 cm x 10 cm), puis
écouvillonnées à l’aide d’un écouvillon stérile mouillé avec de l'eau physiologique stérile.
L'écouvillon ainsi chargé a servi à ensemencer une boîte de pétri de gélose trypto-caséine soja
(TSA) et une autre de Sabouraud-Chloramphénicol. Deux boîtes de pétri de TSA et deux
autres de sabouraud-chloramphénicol ensemencées respectivement avec Staphylococcus
aureus et Candida albicans ont servi de témoins positifs. Comme témoins négatifs, nous
avons ensemencé deux boîtes de pétri de TSA et deux autres de Sabouraud-Chloramphénicol
avec des écouvillons stériles mouillés avec de l’eau physiologique stérile.
L'incubation a été faite à 37 °C pendant 5 jours pour le T.S.A et à 25 °C pendant 5
jours pour le sabouraud-chloramphénicol.
Tout comme pendant le contrôle de la contamination microbiologique de l’air, le
contrôle de la biocontamination a été effectué à trois reprises à des intervalles de cinq jours.
I.4. Préparation des implants
Les opérations de fabrication proprement dites se sont déroulées dans la Zone stérile
(zone de classe A). Le matériel utilisé lors de ces opérations a été stérilisé dans la Zone
technique (zone de classe C en période de production). Les spatules, la verrerie, et les flacons
de conditionnement, après emballage dans du papier pour stérilisation, ont été stérilisés à
l’étuve à 150 °C pendant 3 heures. L’eau désionisée utilisée a été stérilisée à l’autoclave à
121°C pendant 20 minutes.
La quantité prescrite de sulfate de gentamicine (Id Indis, Belgium), a été dissoute dans
de l’eau désionisée stérile (solution A). La quantité prescrite de monoléine (Laboratoire
DANISCO PHARMA, Danemark) a été fondue à 50 °C puis mélangée à de l’éthanol/éther
(97,1/2,9) des Laboratoires STELLA, Belgique (solution B). Les solutions A et B ont été
stérilisées par filtration à travers des membranes de porosité 0,22 µm, puis introduites dans un
ballon d’évaporateur rotatif (Rotavapor Büchi R-205 LABORTECHNIK, Suisse). Celui-ci a
été ensuite mis en marche après avoir monté le ballon. Ce dernier a été porté à une
température de 50 °C.
47

Chapitre I
La dépression (créée par une pompe à vide Vacumbrand, Allemagne) et la vitesse de
rotation du ballon ont été réglées suivant la procédure ci-dessous :
• vide : - 0,70 bar, vitesse de rotation 150 tours/min. durée : 5 min.
• vide : - 0,80 bar, vitesse de rotation 200 tours/min. durée : 20 min.
• vide : - 0,82 bar, vitesse de rotation 220 tours/min. durée : 15 min.
• vide : - 0,84 bar, vitesse de rotation 230 tours/min. durée : 15 min.
• vide : - 0,86 bar, vitesse de rotation 235 tours/min. durée : 15 min.
• vide : - 0,88 bar, vitesse de rotation 235 tours/min. durée : 30 min.
• vide : - 0,90 bar, vitesse de rotation 235 tours/min. durée : 15 min.
• vide : - 0,92 bar, vitesse de rotation 235 tours/min. durée : jusqu’à l’obtention
du poids final souhaité.
Après 90 minutes de marche de l’évaporateur rotatif, nous avons pesé régulièrement le
ballon afin de déterminer le poids de l'implant qu’il contient. Lorsque ce poids est
sensiblement égal au poids attendu (200 g), la préparation est terminée. Le produit a été
ensuite conditionné dans les flacons bruns puis conservé au réfrigérateur (4-8°C).
Les quantités prescrites de matière premières sont décrites au tableau V.
Deux types d’implants blancs (implants ne contenant pas de sulfate de gentamicine) et
quatre types d’implants à différentes concentrations en sulfate de gentamicine et en eau ont
été préparés en vue d’obtenir des produits de caractéristiques physico-chimiques différentes
(Tableaux VI).
Tableau V: Composition du mélange contenu dans le ballon (début de la préparation)
Sulfate de Eau distillée (g) Monoléine (g) Ethanol
gentamicine (g)
dénaturé (mL)
Implant blanc 1 0 50 175 50
Implant blanc 2 0 50 170 50
Implant 1 10 50 165 50
Implant 2 10 50 160 50
Implant 3 20 50 155 50
Implant 4 20 50 150 50
48

Tableau VI: Composition des différents implants
Désignation Teneur en
sulfate de
gentamicine
(%)
Implant
blanc 1
Implant
blanc 2
Implant 1
Implant 2
Implant 3
Implant 4
Chapitre I
Teneur en
eau (%)
Formulation pour faire 200
g d’implant
0 12,5 - Eau: ---------------------------25 g
- Monoléine :------------------175 g
0 15 - Eau: --------------------------30 g
- Monoléine :------------------170 g
5 12,5 - Sulfate de gentamicine:-----10 g
- Eau: -------------------------- 25 g
-Monoléine: ----------------- 165 g
5 15 - Sulfate de gentamicine: ----10 g
- Eau: ---------------------------30 g
-Monoléine: ----------------- 160 g
10 12,5 - Sulfate de gentamicine: ----20 g
- Eau: ---------------------------25 g
-Monoléine: ----------------- 155 g
10 15 - Sulfate de gentamicine: ----20 g
- Eau: ---------------------------30 g
- Monoléine: -----------------150 g
49

RÉSULTATS ET DISCUSSIONS
Chapitre I
I.5. Détermination de la contamination particulaire et de la biocontamination l'air
des différents compartiments de la "Salle blanche"
En fonction du niveau de contamination particulaire et microbiologique, les différents
compartiments de la "salle blanche" peuvent être classés suivant les normes européennes
(Commission européenne, 1999).
Le Pass box et la Zone stérile appartiennent à la classe A; que ce soit en période de
repos ou de production. En effet, le nombre de particules (de taille supérieure ou égale à 0,5
µm)/ mètre cube d’air a été largement inférieur à la limite de 3500 en période de repos ou de
production (Tableau VII et VIII). En outre, le nombre d’unité formant colonie (UFC) par
mètre cube d’air a été inférieur à 1 (Tableau IX et X). Conformément aux recommandations
de bonne pratique de fabrication de la Commission européenne, les compartiments cités plus
hauts sont aptes à être utilisés pour la manipulation des matières premières et accessoires
stériles qui ne seront pas soumis ultérieurement à stérilisation ou à filtration à travers un filtre
captant les microorganismes. Ils s’y prêtent à la fabrication des implants que nous mettons
mis au point. En effet, les implants fabriqués ne sont pas stérilisés en fin de production. Leurs
caractéristiques physico-chimiques (gel instable à haute température) ne permettent pas leur
stérilisation par la chaleur, par filtration ou par toute autre forme de stérilisation. L’ensemble
des opérations de fabrication de ces implants nécessitent l’utilisation de ce type de locaux
(locaux de classe A).
En période de repos (hors production) le Sas est de classe A. Il passe à une classe B en
période de production avec une biocontamination de l’air située entre 1 et 10 UFC/m 3
(Tableaux IX et X). Ce changement de classe en période d’activité pourrait être dû à la
présence du manipulateur (n’ayant pas encore porté la combinaison stérile) dans le sas. Toute
fois, le sas répond aux normes de bonnes pratiques de fabrication européennes. Il n’est qu’une
zone de transit pour le manipulateur. Il pourrait même être utilisé pour la réalisation de
préparation aseptique à condition que le poste de travail soit de classe A.
En période de repos, la Zone technique est de classe B avec une biocontamination de
l’air située entre 1 et 10 UFC/m 3 . En période de production, elle passe à la classe C avec une
biocontamination de l’air située entre 10 et 100 UFC/m 3 (Tableaux IX et X). La préparation
de solutions qui doivent subir ultérieurement une filtration stérilisante peut être effectuée dans
un local de ce type (classe C).
50

Chapitre I
Pendant la production, on constate donc deux niveaux de propreté croissants lorsqu’on
accède à la zone stérile de classe A : la Zone technique (classe C) et le Sas (Classe B) ; ceci
est conforme aux bonnes pratiques de fabrication (Commission européenne, 1999).
Tableau VII: Nombre de particules par m 3 d’air en fonction du site de prélèvement (en période de repos)
Sites Contrôle 1
Zone stérile
Contrôle 2 Contrôle 3 Moyenne
Taille Taille Taille Taille Taille Taille Taille Taille
≥ 0,3 µm ≥ 0,5 µm ≥ 0,3 µm ≥ 0,5 µm ≥ 0,3 µm ≥ 0,5 µm ≥ 0,3 µm ≥ 0,5 µm
1 0 0 0 0 0 0 0
0
2 0 0 0 0 0 0 0
0
3 0 0 0 0 0 0 0
0
4 0 0 0 0 0 0 0
0
5 0 0 0 0 0 0 0
0
6 4 0 0 0 0 0 1
0
7 35 0 0 0
Sas
0 0 12 0
8.1 152 117 60 35 81 11 98
54
8.2 201 25 131 60 184 60 172 48
9 0 0 0
Pass box
0 0 0 0 0
Zone technique
10 3912 2251 873 399 2166 293 2317 981
Tableau VIII: Nombre de particules par mètre cube d’air en fonction du site de prélèvement (pendant la
production)
Sites Contrôle 1
Zone stérile
Contrôle 2 Contrôle 3 Moyenne
Taille Taille Taille Taille Taille Taille Taille Taille
≥ 0,3 µm ≥ 0,5 µm ≥ 0,3µm ≥ 0,5 µm ≥ 0,3 µm ≥ 0,5 µm ≥ 0,3 µm ≥ 0,5 µm
1 0 0 46 0 35 0 41 0
2 0 0 0
0 0 0 0 0
3 35 0 35 0 71 0 47 0
4 35 0 35 0 0 0 23 0
5 0 0 0
0 0 0 0 0
6 35 0 0
0 0 0 12 0
7 258 106 212 117
Sas
71 35 180 86
8.1 611 46 39 247 399 293 350 195
8.2 1438 1049 4654 3403
Pass box
3322 2049 3138 2167
9 35 0 0 0 35 0 35 0
Zone technique
10 7021 2534 873 399 13403 4004 7099 2312
51

Chapitre I
Tableau IX : Nombre de colonies isolées (UFC) pour 1 000 L d'air en fonction du type de contamination et
du site de prélèvement en période de repos
Site Contrôle 1
Zone stérile
Contrôle 2 Contrôle 3 Moyenne
UFC UFC UFC UFC UFC UFC UFC UFC
bactérien fongique bactérien fongique bactérien fongique bactérien fongique
1 0 0 0 0 0 0 0,0 0,0
2 0 0 0 0 0 0 0,0 0,0
3 0 0 0 0 0 0 0,0 0,0
4 0 0 0 0 0 0 0,0 0,0
5 0 0 0 0 0 0 0,0 0,0
6 0 0 0 0 1 0 0,3 0,0
7 0 0 0 0
Sas
0 0 0,0 0,0
8.1 1 0 0 0 1 0 0,7 0,0
8.2 2 0 0 0
Pass box
0 0 0,7 0,0
9 0 0 0 0 0 0 0,0 0,0
10 7 1 12
Zone technique
1 6 2 8,3 1,3
Tableau X : Nombre de colonies isolées (UFC) pour 1 000 L d'air en fonction du type de contamination et
du site de prélèvement en période de production
Site CONTROLE 1
Zone stérile
CONTROLE 2 CONTROLE 3 MOYENNE
UFC UFC UFC UFC UFC UFC UFC UFC
bactérien fongique bactérien fongique bactérien fongique bactérien fongique
1 0 0 0 0 0 0 0,0 0,0
2 0 0 0 0 0 0 0,0 0,0
3 1 0 0 0 0 0 0,3 0,0
4 0 0 0 0 0 0 0,0 0,0
5 0 0 0 0 0 0 0,0 0,0
6 0 0 0 0 1 0 0,3 0,0
7 0 0 2 0
Sas
0 0 0,7 0,0
8.1 0 0 2 0 1 0 1,0 0,0
8.2 7 1 9 0 3 1 6,3 0,7
9 0 0 0
Pass Box
0 0 0 0,0 0,0
Zone Technique
10 8 0 21 1 7 1 12 0,6
I.6. Contrôle de la biocontamination des surfaces de travail
Aucun des prélèvements des surfaces de travail n’a donné de colonie sur les milieux
de culture utilisés. Aussi, les prélèvements témoins négatifs (écouvillons imbibés d’eau
stérile) n'ont pas donné de colonies à la culture. Les prélèvements positifs à Staphylococcus
52

Chapitre I
aureus et à Candida albicans ont développé des colonies. Les surfaces de travail de la « Salle
blanche » sont donc aptes à être utilisées pour la fabrication de produits stériles.
I.7. Préparation
Les produits finaux obtenus se présentaient sous forme de gels de consistance variant
selon leur composition.
Nous avons choisi la monoléine comme matrice pour la préparation d’implants
contenant du sulfate de gentamicine pour les raisons suivantes :
La monoléine est pratiquement non toxique, biodégradable et biocompatible. En
présence d’excès d’eau, le mélange monoléine/eau forme une structure cubique qui est
adaptée pour assurer une libération prolongée de principes actifs hydrosolubles (Rowe RC et
coll., 2003) comme le sulfate de gentamicine.
L’ajout de l’éthanol dénaturé à la monoléine fondue avait trois objectifs: permettre la
stérilisation de la monoléine par filtration; favoriser le mélange de la phase aqueuse à la
monoléine; et enfin, maintenir la préparation stérile lors de la fabrication des implants.
Nous avons fixé les conditions de fabrication des implants en nous soumettant à deux
exigences : fabriquer des implants à basse température et en un temps optimal. Ceci pour
garantir l’homogénéité des implants, et leurs stabilités physique et chimique au cours de la
fabrication. C’est ainsi que tous les implants ont été préparés en un temps n’ayant pas excédé
140 min.
CONCLUSION
Les compartiments de la "salle blanche" ont répondu aux normes pour la réalisation
des différentes opérations de production d’implants dans des conditions aseptiques.
Dénuées de tout germe, les surfaces de travail peuvent être utilisées pour la production
des implants sans risque de contaminer le matériel ou les matières premières. Si des implants
à base de gentamicine et de monoléine ont été fabriqués, leurs propriétés physico-chimiques
restent cependant à caractériser.
53

CHAPITRE II: CARACTERISATION PHYSICO-CHIMIQUE DES IMPLANTS ET
CINETIQUE DE LIBERATION DE LA GENTAMICINE

INTRODUCTION
Chapitre II
Des études physico-chimiques et de cinétique de libération du principe actif des
implants préparés nous permettront de choisir l’implant ayant le meilleur profil pour le
traitement des ostéomyélites chroniques. Ces caractéristiques physico-chimiques et cinétiques
pourront servir de paramètres de qualité lors des contrôles de qualité du produit fini.
I. MATÉRIEL ET MÉTHODES
I.1. Caractérisation physico-chimique
I.1.1. Observation macroscopique
C’est une observation que nous avons faite à l’œil nu afin d’apprécier des
caractéristiques telles que la couleur, l’aspect et l’homogénéité des implants. L’adhésivité a
été appréciée grossièrement en triturant un échantillon d’implant entre pouce et index.
I.1.2. Microscopie sur platine chauffante (Hot Stage Microscopy ou HSM)
La microscopie sur platine chauffante est une technique d’observation au microscope
optique d’échantillons à des températures déterminées. A cet effet une platine chauffante
Linkam THMS 600 (UK) monté sur un microscope Olympus-BX 60 (Japon), équipé d’une
caméra JVC TK-C1381 (Japon) a été utilisé. Nous avons porté à 37 °C des échantillons de
monoléine et d'implants. Nous les avons ensuite observés au microscope sans polariseur de
lumière puis avec polariseur de lumière. Le but a été de vérifier l’absence ou la présence de
particules et/ou de structures cristallines.
I.1.3. Calorimétrie différentielle à balayage (Differential Scanning
Calorimetry ou DSC)
Nous avons utilisé le matériel suivant pour l’étude de la DSC:
- un appareil Perkin-Elmer DSC-7 (Perkin-Elmer Instruments USA), équipé de deux
fours (l’un pour l’échantillon, l’autre pour la référence);
- un contrôleur d’analyse thermique TAC-7 /DX (Perkin-Elmer Instruments USA);
- un appareil de refroidissement intercooler-2 (Perkin-Elmer Instruments USA);
- un programme Pyris de traitement des données;
- des cupules de 50 μl non perforées avec des couvercles perforés en aluminium
(Perkin-Elmer).
55

Chapitre II
Nous avons pesé directement avec précision, 5 à 10 mg de chaque échantillon dans
une cupule. Après avoir placé le couvercle sur la cupule, l’ensemble a été scellé et placé dans
le four pour échantillon. Parallèlement, nous avons placé dans le four de référence un
ensemble cupule vide/couvercle. Le refroidisseur a été ensuite mis en marche. A l’aide du
programme Pyris, nous avons soumis les deux fours au cycle de températures suivant:
- refroidir les fours à -10 °C et les maintenir à cette température pendant 5 min;
- chauffer de -10 °C à 45 °C à une vitesse de 2 °C/min;
- refroidir de 45 °C à - 10 °C à une vitesse de 40 °C/min;
- maintenir la température à - 10 °C pendant 5 min;
- et réchauffer de -10 °C à 45 °C à la vitesse de 2 °C/min.
Nous avons ensuite analysé les différents thermogrammes à l’aide du programme Pyris.
Pour analyser les résultats, nous avons considéré les pics des endothermes comme étant
les températures auxquelles il y a une transition de phase c’est à dire passage d’un état de
phase à un autre (Exemple : Phases solide - liquide - vapeur). Chaque échantillon a fait l’objet
de 3 essais.
I.1.4. Diffraction des rayons X (DRX)
L’appareillage utilisé est le Diffractomètre D 5000 Siemens (Allemagne) avec comme
source de radiation le Cu Kα.
Les conditions standard appliquées ont été : voltage = 40 Kv, intensité du courant = 40 mA.
Du sulfate de gentamicine poudre, de la monoléine, et les implants ont été soumis aux rayons
X. L’angle de balayage a été de 2-50°, à une vitesse de 0,02 °/min. Le but de cette technique a
été de vérifier la structure cristalline des implants.
I.1.5. La thermogravimétrie (TGA)
Elle a été réalisée dans le but de pouvoir déterminer la quantité d’eau totale contenue
dans les implants et d’étudier la cinétique de dégradation des implants.
Une balance analytique TGA SETARAM MTB 10-8 équipée de 2 fours SETARAM
FS 10-1000 et pilotée par un logiciel DASYLAB de traitement des données a été utilisée.
Des échantillons des implants 1, 2, 3 et 4 ont été soumis à la thermogravimétrie. Nous
avons introduit environ 10 mg de chaque échantillon dans un creuset en quartz qui a été
ensuite placé dans le four. La température du four a été augmentée de 20 à 350°C à une
vitesse de 2°C/min sous air sec. La perte de poids de l’implant a été calculée par le logiciel
DASYLAB.
56

I.1.6. Etude rhéologique
Chapitre II
Un viscosimètre digital Brookfield Model DV-V (Brookfield engineering Laboratory,
USA) et son spindle n° 3 (cylindre interne) ont été utilisés pour l’étude du comportement
rhéologique des implants. L’échantillon d’implant placé dans le cylindre externe a été
maintenu à 37 °C à l’aide d’un thermostat. Les valeurs des viscosités ont été enregistrées à
des vitesses de rotation allant de 1 à 12 tours/minute. Les viscosités et les vitesses de rotation
ont été respectivement converties en vitesse de cisaillement (s –1 ) et en tension de cisaillement
(mPa). L’étude a été répétée trois fois pour chaque échantillon.
I.1.7. Détermination de la teneur en eau
Pour la détermination de la teneur en eau des implants, nous avons utilisé la méthode
coulométrique de Karl Fischer. C’est une méthode basée sur l’oxydation du dioxyde de soufre
par l’iode en présence d’eau. A cet effet, le matériel et réactifs utilisés ont été le suivant :
- un coulomètre Metrohm modèle 756KF Metrohm (Suisse) ;
- de l’Hydranal® coulomat CG, (France) qui sert à remplir le compartiment cathodique ;
- de l’Hydranal® coulomat AG, Sigma-Alrich (France) qui sert à remplir le compartiment
anodique.
- du méthanol anhydre Sigma-Aldrich (France).
Nous avons, dans un premier temps, déterminé la teneur moyenne (sur deux essais) en eau
du méthanol anhydre. Dans un second temps, nous avons déterminé la quantité moyenne (sur
deux essais) d’eau contenue dans le blanc. Ce blanc a été constitué de méthanol et d’une
cupule destinée à recevoir l’échantillon. Cette détermination a été faite avant chaque mesure
de la quantité d’eau contenue dans un échantillon.
Les teneurs en eau de la monoléine et des implants ont été mesurées après dissolution
dans le méthanol anhydre. Sur chaque échantillon, trois essais ont été réalisés. La teneur
moyenne en eau de chaque implant a été ensuite calculée.
I.1.8. Détermination de la teneur en éthanol résiduel
La teneur en éthanol résiduel dans les implants a été déterminée par chromatographie
en phase gazeuse.
Pour déterminer la teneur d’éthanol résiduel dans les implants, nous avons établi dans un
premier temps une droite d’étalonnage en utilisant les solutions d’éthanol (dissous dans du
diméthylformamide) de concentration : 250 ppm, 500 ppm, 1250 ppm, 5000 ppm, et 10000
ppm.
57

Chapitre II
Un échantillon de 1000 mg de chaque implant a été introduit dans une fiole de 10 mL;
Il a été ensuite dissous dans du diméthylformamide. L’acétate d’éthyle a été utilisé comme
étalon interne ; pour cela, 30 μL d’acétate d’éthyle ont été ajoutés à chaque 10 mL de solution
d’échantillon. Les conditions expérimentales ont été les suivantes :
- appareil Carlos Erba Instrument « Auto/HRG/MS » MFC 500;
- colonne capillaire CP-Sil 5CB de dimensions 25 m x 0,32 mm (Chromopack,
Belgium);
- gaz vecteur: He;
- pression : 50 KPa;
- température de l’injecteur : 200 °C;
- température du détecteur : 240 °C;
- température de la colonne : 40 °C pendant 10 min ; puis augmentation de la
température jusqu’à 200 °C à une vitesse de 30 °C/min. Maintien de la température
à 200 °C pendant 15 min;
- temps d’acquisition: 25 min;
- volume injecté: 1 μL.
Le logiciel AZUR version 2.0.4.0 a été utilisé pour le traitement des données.
Chaque échantillon a été dosé trois fois.
I.1.9. Identification et dosage des acides gras libres
La technique de chromatographie en phase gazeuse a été utilisée pour identifier et
déterminer la concentration des implants en acides gras libres.
Les acides gras libres contenus dans les implants ont été extraits avec de l’hexane puis
estérifié. Un mélange méthanol/ acide chlorhydrique 0,5 N (Supelco, USA) a été utilisé dans
la réaction d’estérification. Des acides gras estérifiés (stéarate de méthyle, palmitate de
méthyle, linoléate de méthyle, oléate de méthyle) fourni par Sigma-Alrich (Allemangne) ont
été utilisés comme standards externe. L’heptadécanoate cis-10- Méthyle (Sigma-Alrich,
Germany) a été utilisé comme standard interne. Les conditions expérimentales ont été les
suivantes :
(Belgium)
- Colonne: WCOT fused silica 25 m x 0,32 mm ID coating FFAP CB Chrompack
- Température de l’injecteur: 250 °C
- Température du détecteur: 250 °C
- Four:
58

Chapitre II
Température initiale: 80 °C durant 1 min;
Programmation de 80 °C à 230 °C, à raison de 8 °C/min;
Température finale: 230 °C pendant 6 min.
- Gaz vecteur : Hélium (débit: 2,1 mL/min; pression: 59 kPa)
- Volume injecté: 1 μL.
Les solutions à injecter ont été préparées comme suit:
Solution de standard interne :
Dans un ballon jaugé de 10 mL, introduire exactement, environ 20 mg
d’heptadécanoate cis-10- Méthyle; les dissoudre dans du n-hexane et porter au trait à l’aide du
même solvant.
Solutions des témoins
Dans un ballon jaugé de 25 mL, peser exactement, environ 20 mg de stéarate de
méthyle. Dissoudre le stéarate de méthyle dans du n-hexane et porter au trait à l’aide du même
solvant.
Dans un ballon jaugé de 25 mL, peser exactement, environ 10 mg de palmitate de
méthyle, 8 mg de linoléate de méthyle et 40 mg d’oléate de méthyle. Introduire ensuite dans
le même ballon jaugé 2,5 mL de la solution de stéarate de méthyle. Dissoudre l’ensemble de
ces produits dans le n-hexane et porter au trait à l’aide du même solvant (solution 1).
Dans un flacon muni d’un bouchon à septum, introduire 2,5 mL de la «solution 1», 2,5
mL de la solution de standard interne, et 5,0 mL de n-hexane. Après fermeture du récipient,
l’homogénéiser soigneusement durant 1 minute à l’aide d’un vibrateur (vortex ® ).
Echantillons à doser
Dans un ballon jaugé de 25 mL, introduire environ 1000 mg, exactement pesés
d’implant. Les dissoudre dans du n-hexane et porter au trait à l’aide du même solvant.
Dans un petit flacon muni d’un bouchon à septum, introduire 2,5 mL de cette solution,
y ajouter 2,5 mL de la solution de standard interne et évaporer le n-hexane sous un courant
d’azote. Après dessiccation, en exsiccateur, sous vide poussé, durant 15 minutes, reprendre le
résidu par 2,5 mL d’un mélange méthanol/ acide chlorhydrique 0,5 N. Fermer
hermétiquement le flaconnage, le soumettre durant 1 minute à l’action d’un bain à ultrasons et
le maintenir durant 30 minutes à 80 °C.
59

Chapitre II
Après refroidissement, introduire successivement dans le récipient, 2,5 mL d’une
solution d’hydroxyde de sodium 0,5 N ainsi que 10,0 mL de n-hexane. Agiter au vortex ®
pendant 10 minutes. Introduire 500 mg de chlorure de sodium et agiter, à nouveau au vortex ® ,
durant 10 minutes.
Après séparation des deux phases, prélever la phase supérieure organique et la
dessécher, durant 5 minutes sur sulfate de sodium anhydre avant de l’utiliser pour l’analyse
par chromatographie en phase gazeuse.
Pour chaque échantillon d’implant, réaliser trois extractions distinctes. Préparer trois
solutions de témoins d’acides gras méthylés. Injecter alternativement et à trois reprises,
chacune des solutions des standards acides gras méthylés et chacune des solutions à examiner.
Les valeurs d’intégration ont été corrigées en les rapportant à une valeur d’intégration
identique pour le témoin interne (heptadécanoate cis-10- Méthyle).
A partir des valeurs corrigées ainsi obtenues, la teneur en chacun des esters
méthyliques de chacun des échantillons a été calculée, par règle de trois. Cette teneur a été
ensuite convertie en teneur en acides gras libres correspondants.
I.2. Cinétique de libération du sulfate de gentamicine
Les réactifs et matériel suivants ont été utilisés pour étudier la cinétique de libération
de la gentamicine à partir des implants:
- un dispositif de dissolution à palettes tournantes conforme à la description de la
Pharmacopée européenne (3 ème édition, 1997);
- des cellules de dissolution pour formes topiques conformes à la description de la
Pharmacopée européenne (3 ème édition, 1997);
- un bain-marie;
- un pHmètre PHM 61 de marque Radiometer Copenhagen (Danemark);
- un spectrophotomètre UV-160A (U.V-Visible recording spectrophotometer)
SHIMADZU (Japon);
- 1,2 –phthalic dicarboxaldéhyde (orthophtalaldéhyde ou OPA) p.a (Laboratoire
Acros organics, Belgique);
Belgique);
- acide mercaptoacétique (acide thioglycolique) 98% (Laboratoire Acros organics,
- acide borique R. (Laboratoire Merck, Allemagne);
60

Chapitre II
- méthanol pour spectroscopie (Laboratoire Merck, Allemagne);
- hydroxyde de potassium (Laboratoire Merck, Allemagne);
- hydroxyde de sodium tech. (past.) (Laboratoire Federa, Belgique);
- hydrogéno-phospate dipotassique anhydre très pur (Laboratoire Merck, Allemagne);
- acide acétique glacial 100% p.a (Merck, Allemagne);
- tween 20 (Laboratoire Federa, Belgique);
- acide oléique (Laboratoire Fluka, Suisse);
- des filtres membranes de nitrocellulose Millipore (diamètre des pores = 0,45 μm) de
2,5 cm de diamètre;
- seringues en verre de 10 mL.
Le milieu de dissolution a été du tampon phosphate pH 7,0. Il a été préparé comme
suit: nous avons dissous 8,7 g d’hydrogéno phospate dipotassique dans de l’eau distillée; 3 g
d'acide acétique et 0.5 g de Tween 20 y ont été ajoutés ; le tout a été porté à un litre avec de
l’eau distillée ; le pH a été ensuite ajusté à 7,0 avec une solution 8 N d’hydroxyde de sodium.
La solution de sulfate de gentamicine n’absorbe pratiquement pas dans l’ultraviolet.
Afin de doser le sulfate de gentamicine par spectrophotométrie dans l’ultraviolet, une
dérivatisation de la gentamicine est recommandée par la Pharmacopée européenne (3 ème
édition, 1997). Pour ce faire, le mode opératoire suivant a été utilisé pour préparer le réactif de
dérivatisation :
Préparer un Tampon borate de potassium qui sera utilisé dans la
préparation du réactif de dérivatisation. Pour cela, dissoudre 2,47 g d'acide
borique dans 75 mL d'eau filtrée sur une membrane millipore. Ajuster le
pH à 10,4 avec une solution aqueuse d'hydroxyde de potassium à 45%
(m/v).
Pour la préparation du réactif final (réactif de dérivatisation), dissoudre 400
mg d'orthophtalaldéhyde dans 2 mL de méthanol. Ajouter 38 mL de
tampon borate et 0,8 mL d'acide thioglycolique. Ajuster le pH à 10,4 avec
la solution d'hydroxyde de potassium à 45% (m/v).
En ce qui concerne le test de libération du sulfate de gentamicine à partir des implants,
les opérations suivantes ont été réalisées :
Nous avons introduit 500 mL de tampon phosphate dans chaque ballon de dissolution.
Le milieu de dissolution a été porté à 37 °C. La vitesse de rotation des palettes a été réglée à
60 tours/min. La tige d'agitation a été placée de telle sorte que la partie inférieure de la palette
61

Chapitre II
soit située à une distance de 2,5 cm des cellules de dissolution ou du fond intérieur des
récipients (pour ceux ne contenant pas de cellule).
Pour chaque implant, des échantillons, de quantité connue (environ 1,5 g), ont été
placés dans trois cellules de dissolution. Celles-ci ont été ensuite introduites au fond des
ballons contenant le tampon phosphate.
Dans quatre autres ballons de dissolution, nous avons introduit respectivement environ
80 mg de sulfate de gentamicine exactement pesé (témoin 1), environ 80 mg de sulfate de
gentamicine et environ 1,5 g d'Implant blanc 1 (témoin 2), environ 160 mg de sulfate de
gentamicine et environ 1,5 g d'Implant blanc 2 (témoin 3); et une quantité (environ 80 mg) de
sulfate de gentamicine plus 10μl d’acide oléique (témoin 4).
Nous avons effectué des prélèvements de 15 mL de la solution de dissolution aux
temps suivants: 3, 6, 24, 48, 96, 168, 240, 336, et 480 heures. A chaque prélèvement, nous
avons remplacé le volume prélevé par 15 mL de solution de dissolution (tampon phosphate).
Les solutions prélevées ont été filtrées à l’aide des filtres de porosité 0,45 μm et leur
concentration en sulfate de gentamicine déterminée. Cette détermination a été effectuée
suivant le protocole ci-dessous:
Prélever 10,0 mL de la solution filtrée à l’aide d’une pipette, puis l’introduire dans une
fiole jaugée de 25,0 mL. Y ajouter 800 µL de réactif de dérivatisation. Porter le tout au trait
de jauge avec du méthanol. Agiter la fiole au vortex ® puis la chauffer au bain-marie à 60 °C
pendant 15 min. Laisser refroidir la solution à la température ambiante pendant 25 min.
Mesurer l’absorbance de chaque solution au spectrophotomètre, à la longueur d’onde de 325
nm.
Pour déterminer les concentrations des solutions, nous avons établi une droite
d’étalonnage du sulfate de gentamicine, en déterminant les absorbances des solutions de
sulfate de gentamicine dosées à 10 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 75 μg/mL et 100 μg/mL.
Nous avons corrigé les pourcentages de libération de la gentamicine obtenus pour
chaque type d’implant et à chaque temps. Le facteur de correction est le rapport Pourcentage
de libération attendu du témoin (témoin 2 pour les implants 1 et 2, témoin 3 pour les implants
3 et 4) / Pourcentage de libération mesuré dans le même ballon.
I.3. Etude de stabilité
Elle a consisté à évaluer la stabilité des implants en fonction de la température de
conservation. Pour cela nous avons conservé des échantillons d’implants à 30 °C, 40 °C
62

Chapitre II
pendant une semaine et au réfrigérateur (2- 6 °C) pendant 10 mois. Ensuite, ces implants ont
été soumis à une observation macroscopique. Seuls, les implants conservés au réfrigérateur
pendant 10 mois ont été soumis aux études physico-chimiques suivantes: calorimétrie
différentielle à balayage (DSC), diffraction des rayons X (DRX). Sur ces implants, les tests de
dissolution et de stabilité chimique du principe actif (sulfate de gentamicine) ont été aussi
réalisés. La stabilité chimique de la matrice (la monoléine) a été étudiée à travers le dosage de
ses produits de dégradation (acide oléique, acide linoléique, acide palmitique, acide
stéarique).L’étude de la stabilité chimique du sulfate de gentamicine dans les implants a été
réalisée comme suit :
Le sulfate de gentamicine dans les implants a été dosé immédiatement après leur
préparation. Il a été également dosé dans les mêmes implants conservés pendant 10 mois au
réfrigérateur (2-6 °C). Pour le dosage, nous avons appliqué le mode opératoire suivant :
Peser 500 mg d’implant dans une fiole jaugée de 100 mL. Y Ajouter 20 mL de
méthanol et agiter manuellement pour le dissoudre. Compléter la solution avec de l’eau
distillée jusqu’au trait de jauge. Ensuite, introduire une puce magnétique dans le ballon.
Soumettre le tout à une agitation magnétique à une vitesse de 450 tours/min pendant 1 heure
puis à 550 tours/min pendant 1 heure. Filtrer 2 fois sur une membrane de porosité 0,45 μm (de
diamètre) ; laisser décanter puis filtrer une 3 ème fois. Prélever 5 mL et doser suivant le
protocole de dosage du sulfate de gentamicine (Cf. cinétique de libération du sulfate de
gentamicine ci-dessous).
Réaliser le dosage sur 5 prélèvements d’un même conditionnement.
Utiliser un échantillon blanc (implant sans sulfate de gentamicine) dont l’extrait
servira de blanc pour le dosage.
RÉSULTATS ET DISCUSSIONS
I.4. Caractérisation physico-chimique
I.4.1. Observation macroscopique
Tous les implants préparés se sont présentés sous forme de gel. Ils avaient un aspect
homogène (Fig. 8). Ils étaient capables d'adhérer aux tissus biologiques (pouce et index). Les
implants 3 et 4 ont eu une consistance et une adhésivité nettement plus grandes que les
implants 1 et 2.
63

Chapitre II
Mis au contact avec de l’eau distillée, tous les implants (initialement semi-liquides) se
prenaient en masse.
Figure 8 : Photo d’échantillon d’un implant
La prise en masse des gels (implants) en présence d’eau a été déjà constatée avec
d’autres préparations à base de monoléine (Norling T et coll., 1992). Cette propriété pourrait
être intéressante pendant leur utilisation in vivo. En effet, leur état semi-liquide initial
facilitera leur application sur tout le foyer infectieux de l’os. Au contact du sang, les gels se
pendront en masse. Cette masse pourrait combler la cavité osseuse, empêchant du même coup
la formation d’hématome. L’hématome entretient le plus souvent les infections après les
interventions chirurgicales. La consistance et l’adhésivité des implants ont augmenté avec
l’augmentation de leur teneur en eau. Ceci pourrait témoigner d’un réarrangement de la
structure du gel vers une structure plus ordonnée quand la teneur en eau des gels augmente.
I.4.2. Observation microscopique
Au microscope sans lumière polarisée, tous les implants et la monoléine ont présenté
un aspect homogène (Fig. 9). A la lumière polarisée nous n’avons pas constaté de particules
biréfringentes sur le fond noir; ce qui nous permet d’affirmer que le principe actif (sulfate de
gentamicine) s’est complètement dissous dans les implants. L’absence de particules
biréfringentes à la lumière polarisée pourrait aussi suggérer que les implants à base de
monoléine et d’eau avaient une structure cubique (Schmidt C et coll., 1995; Nielsen LS et
coll., 1998; Kim JC et coll., 2004), donc apte à assurer une libération prolongée des principes
actifs hydrosolubles comme le sulfate de gentamicine (Rowe RC et coll., 2003). Les
particules cristallines au niveau de ces structures cubiques sont extrêmement petites (de
l’ordre du nanomètre). Ceci explique aussi pourquoi les simples techniques de microscopie
64

Chapitre II
optique ne permettent pas de mettre en évidence ces structures cristallines en lumière
polarisée.
Monoléine Implant
Figure 9: HSM (lumière non polarisée, 37 °C) de monoléine et d'implant (grossissement x 500)
I.4.3. Calorimétrie différentielle à balayage (Differential Scanning
Calorimetry ou DSC)
La DSC est une technique d’analyse thermique qui permet de mesurer des différences
d’échange de chaleur entre un échantillon et une référence, tous deux soumis à la même
programmation de température. Elle permet de détecter les phénomènes de transition de phase
d’un échantillon lorsque celui-ci est soumis à une variation régulière de température.
Le thermogramme de chaque implant a présenté deux pics endothermiques tandis que
celui de la monoléine n’a présenté qu’un seul pic endothermique (Fig. 10). Les premiers pics
endothermiques des implants sont apparus entre 13 °C et 21°C, et les seconds entre 30 °C et
34 °C. Les différents implants changeraient de structure en fonction de la température, et/ou
se présenteraient sous forme de deux structures différentes qui coexistent. Dans le cas de la
deuxième hypothèse, les seconds pics endothermiques (apparaissant à des températures
voisines au pic endothermique de la monoléine) pourraient être ceux d’une fraction de
monoléine non liée à l’eau et les premiers pics endothermiques ceux de monoléine liée à l’eau
et contenant la gentamicine. En effet, la molécule de monooléate de glycéryle (monoléine),
du fait de sa nature amphiphile (Fig. 3) pourrait se lier au groupement hydroxyle de l’eau
(Geraghty PB et coll., 1996) et former des structures gélifiées.
En outre, la température de fusion de la monoléine que nous avons utilisée a été de 33
°C au lieu de 35 °C comme indiquée dans la littérature. La composition de la monoléine
65

Chapitre II
variant d’un fabricant à l’autre, les propriétés physiques peuvent aussi varier (Rowe RC et
coll., 2003). Le point de fusion pourrait donc être un élément de contrôle de qualité de la
monoléine que nous utilisons.
Les thermogrammes des secondes chauffes se sont confondus à ceux des premières
chauffes. Les cycles de chauffage et de refroidissement appliqués n’ont donc pas eu d'effet sur
le comportement thermique des implants. Que peut-on tirer comme conséquence ?
L’échantillon a gardé son homogénéité, sa structure initiale et donc qu’il n’y a pas eu de
séparation de phase/destruction de la structure cristalline après le traitement thermique.
Figure 10: Thermogrammes (enregistrés lors de la 1 ère chauffe) de la monoléine et des implants 1, 2, 3, 4
superposables.
Les thermogrammes de la première et de la seconde chauffe des implants ont été
66

Chapitre II
I.4.4. Diffraction des rayons X (DRX)
Les rayons x sont des radiations électromagnétiques situées entre l’ultraviolet et les
radiations gamma. L’étude de la diffraction de ces rayons permet d’identifier la structure
cristalline ou amorphe d’une substance.
Le spectre de diffraction d’une substance cristalline (composants organisés dans un
ordre précis) présente des pics alors que celui d’une substance amorphe (substances dont les
composants sont disposés de façon anarchique) est caractérisé par l’absence de pics nets.
Le spectre de diffraction des rayons X du sulfate de gentamicine n’a présenté aucun pic (Fig.
11). Cette absence de pic confirme la structure amorphe du sulfate de gentamicine (Evrard J.,
1993). Cependant, la monoléine, les implants blancs 1 et 2, et les implants 1, 2, 3 et 4 ont
donné un spectre avec des pics nets apparaissant aux angles de balayage situés entre 5 et 20°.
L’apparition de ces pics témoigne que les composants des échantillons sont organisés dans un
ordre précis (c'est à dire sous forme de cristaux). En outre, Les pics de diffraction de la
monoléine apparaissent mais avec une plus faible intensité au niveau des implants. Ceci
prouve (comme nous l’avons dit pour la DSC) qu’il y a une partie de la monoléine qui reste à
l’état non lié à l’eau.
Les différentes propriétés physico-chimiques des implants suggèrent que les implants
obtenus sont sous forme de cristaux liquides. En effet, ils combinent les propriétés des états
liquides et solides. Ils sont sous forme de fluide et présentent les propriétés physiques des
cristaux comme l’attestent leurs diffractogrammes (Fig. 11). Cette structure cristalline de la
monoléine en présence d’eau corrobore les données de la littérature (Nielsen LS, 1998; Rowe
RC et coll., 2003). Cette structure cristalline serait de nature cubique du fait qu’aucune
particule biréfringente n’a été observée lors de la microscopie optique sous lumière polarisée
(Schmidt C et coll., 1995; Nielsen LS et coll., 1998; Kim JC et coll., 2004). La structure
cristalline des implants pourrait leur conférer la propriété de libérer de manière prolongée les
principes actifs hydrosolubles qu’ils contiennent (Shah JC et coll., 2001).
67

Chapitre II
( h )
( g )
( f )
( e )
( d )
( c )
( b )
( a )
5 15 25 35 45
2- theta- scale (degree)
Figure 11: Spectre de diffraction des rayons X de sulfate de gentamicine (a), de monoléine (b), d’implant
blanc 1 (c), d’implant blanc 2 (d), d’implants 1 (e), 2 (f), 3 (g), 4 (h) et d’implant 2 conservé pendant 10
mois au réfrigérateur (2-6°C) (f’).
I.4.5. La thermogravimétrie (TGA)
La thermogravimétrie est une technique qui permet de mesurer la perte de poids d’une
substance lorsque celle-ci est soumise à une augmentation programmée de température. La
TGA pourrait contribuer à la mise au point d’un protocole de contrôle de qualité des implants.
Ce protocole serait basé sur la mesure de la perte de poids des implants placés dans une étuve.
On pourrait par exemple déterminer le pourcentage de perte de la substance chauffée à l’étuve
à une température donnée et pendant un temps déterminé.
(f')
68

Chapitre II
Les thermogrammes des implants obtenus par thermogravimétrie ont présenté trois
paliers de perte de poids (Fig. 12-13). Le premier palier observé entre 20 °C et 110 °C,
correspondrait à l’évaporation de l’eau libre contenu dans les implants. Le second palier (de
110 °C à 210 °C), où la perte de poids est moins importante, pourrait correspondre à
l’évaporation de l’eau qui serait liée à la monoléine. Le troisième palier caractérisé par une
perte brutale de poids à partir de 210 °C pourrait correspondre à la décomposition des
composés organiques que sont la gentamicine et la monoléine. Les pertes de poids des
implants, calculées aux points d’inflexion des thermogrammes (210 °C à 220 °C) ont été
presque identiques à leur teneur théorique en eau (soit 12, 5% pour les implants 1 et 3, et 15%
pour les implants 2 et 4). Les allures des courbes de perte de poids des 4 formulations
évaluées ont été comparables.
La TGA n’est pas suffisamment sensible pour déterminer les teneurs en éthanol
résiduel dans les implants. En effet, les teneurs en éthanol résiduel sont très faibles et les
pertes en éthanol résiduel peuvent être masquées par la perte en eau.
Weight loss (%)
60
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
(a)
20 70 120 170 220 270 320 370
Temperature (°C)
69

Weight loss (%)
Weight loss ( % )
65
60
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
(b)
Chapitre II
20 70 120 170 220 270 320 370
Temperature ( °C )
Figure 12 : Perte de poids des échantillons d’implants 1 (a) et 2 (b) en fonction de la température
60
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
(c)
20 70 120 170 220 270 320 370
Temperature ( °C )
70

Weight loss ( % )
60
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
(d)
Chapitre II
20 70 120 170 220 270 320 370
Temperature ( °C )
Figure 13: Perte de poids des échantillons d’implants 1 (c) et 2 (d) en fonction de la température
I.4.6. Etude rhéologique
Les contraintes de cisaillement des implants ont augmenté avec les vitesses de
cisaillement (Tableau XI, Fig. 14). L’allure des courbes obtenue est caractéristique de celle de
fluide non-newtonien pseudoplastique (Fig. 15). La viscosité des implants a augmenté avec
leur teneur en eau. Cette propriété est imputable à la monoléine, qui est réputée devenir plus
visqueuse au fur et à mesure que sa teneur en eau augmente (Engström S, 1990). En passant
de 5 à 10% de sulfate de gentamicine on observe une chute très importante de la viscosité
(Tableau XI). Le sulfate de gentamicine aurait donc un effet fluidifiant à plus forte
concentration.
71

Chapitre II
Tableau XI: Contrainte de cisaillement (mPa) des implants (moyenne ± écart-type, n = 3) en fonction de la
vitesse de cisaillement
Vitesse
RPM
Contrainte de cisaillement (mPa)
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
Vitesse de
cisaillement
(s -1 )
0 0,5 1 1,5
Vitesse de cisaillement (s-1)
Figure 14 : Rhéogrammes des implants 1, 2, 3 et 4
implant 1 Implant 2 Implant 3 Implant 4
0,0 0,00 0 0 0 0
1,0 0,11 54 ± 3 271 ± 4 15 ± 8 78 ± 3
1,5 0,16 75 ± 8 380 ± 6 27 ± 6 91± 3
2,0 0,21 86 ± 7 480 ± 8 24 ± 9 103 ± 3
2,5 0,26 92 ± 4 586, ± 14 10 ± 9 113 ± 3
3,0 0,31 92 ± 16 645 ± 19 9 ± 7 122 ± 4
4,0 0,42 102 ± 3 726 ± 22 13 ± 1 136 ± 4
5,0 0,52 118 ± 2 795 ± 23 13 ± 1 146 ± 4
6,0 0,63 123 ± 2 813 ± 25 14 ± 0 151 ± 4
10,0 1,05 142 ± 2 851 ± 28 23 ± 14 174 ± 5
12,0 1,26 144 ± 3 867 ± 31 28 ± 1 172 ± 5
Implant 1
Implant 2
Implant 3
Implant 4
72

Contrainte de
cisaillement
Chapitre II
Figure 15: Les principaux comportements rhéologiques des fluides
I.4.7. Détermination de la teneur en eau
Bien que la méthode thermogravimétrique ou de dessiccation à l’étuve puisse être
utilisée pour la détermination de la teneur en eau des implants, nous avons utilisée aussi une
méthode plus sensible et sélective qu’est la méthode de Karl Fischer. Les teneurs en eau
obtenues sont inférieures de celles que l’on peut déduire par TGA au point d’inflexion
(Tableau XII). Cette différence s’expliquerait par le fait que la méthode de Karl Fischer
permet seulement une quantification de l’eau libre alors que la méthode TGA permet de
quantifier l’eau totale (eau libre et eau liée) contenue dans un échantillon (Vyas S et coll.,
2004). De cette hypothèse, on peut déduire que les teneurs des implants en eau liée est
d’environ de 2% ; ceci en faisant la différence entre les teneurs en eau obtenues par TGA et
celles obtenues par la méthode de Karl Fischer.
Plastique
Pseudo-plastique
Newtonien
Dilatant
Vitesse de cisaillement
73

Chapitre II
Tableau XII: Pourcentage (m/m) en eau (moyenne ± écart-type, n = 3) des implants 1, 2, 3 et 4 déterminé
par la méthode Karl Fischer (KF) et par TGA
Implant 1 Implant 2 Implant 3 Implant 4
KF 10,3 ± 0,4 13,0 ± 0,1 10,97 ± 0,06 12,7 ± 0,2
TGA 12,5 15 12,5 15
I.4.8. Détermination de la teneur en éthanol résiduel
La teneur en éthanol résiduel des implants (Tableau XIII, Fig. 16) indique que la
technique de fabrication a permis d’éliminer la quasi-totalité de l’éthanol utilisé. Cette teneur
a été largement inférieure à la limite prescrite par la Pharmacopée américaine (USP XXIII
edition) pour les préparations pharmaceutiques (5000 ppm) pouvant contenir des solvants de
classe 3 comme l’éthanol.
Tableau XIII: Teneur (ppm) des implants en éthanol (moyenne ± écart-type, n = 3)
Implant 1 Implant 2 Implant 3 Implant 4
13,69 ± 1,40 12,38 ± 0,07 14,05 ± 1,07 23,18 ± 0,69
Ethanol
Ethyle acétate
Diméthylformamide
Figure 16: Chromatogramme typique des implants obtenu par chromatographie en phase gazeuse.
74

Chapitre II
I.4.9. Identification et dosage des acides gras libres
Les acides linoléique, oléique, palmitique et stéarique ont été les principaux acides
gras libres retrouvés dans les implants (Fig. 17). L’acide gras libre majoritaire dans tous les
implants a été l’acide oléique, avec des teneurs inférieures à 5% (Tableau XIV). Ceci n’est
pas étonnant quand on sait que le composé majeur de la monoléine est le monooléate de
glycéryle (Rowe RC et coll., 2003). Outre le monooléate de glycéryle comme composant
majoritaire, la monoléine utilisée contiendrait des esters d’acides linoléique, palmitique et
stéarique.
Tableau XIV: Concentrations des implants (% m/m) en acides gras libres (moyenne ± écart-type, n = 3)
Implant 1 Implant 2 Implant 3 Implant 4 Implant 2,
après 10
mois
Acide stéarique 0,27 ± 0,14 0,56 ± 0,01 0,40 ± 0,09 0,32 ± 0,11 0,49 ± 0,04
Acide palmitique 0,13 ± 0,01 0,18 ± 0,00 0,16 ± 0,01 0,11 ± 0,03 0,18 ± 0,02
Acide linoléique 0,33 ± 0,01 0,52 ± 0,00 0,46 ± 0,01 0,32 ± 0,08 0,46 ± 0,36
Acide oléique 2,56 ± 0,07 3,89 ± 0,07 3,51 ± 0,10 2,42 ± 0,62 4,80 ± 0,29
75

Chapitre II
Figure 17 : Chromatogramme typique d’acides gras estérifiés dans les implants
(a): Palmitate de méthyle;
(b): Cis-10-heptadecenoate de méthyle;
(c): Stéarate de méthyle;
(d): Oléate de méthyle;
(e): Linoléate de méthyle.
I.5. Cinétique de libération du sulfate de gentamicine
Les tests de libération (ou de dissolution) ont eu pour but de mesurer l’aptitude des
implants à libérer dans un milieu biologique le sulfate de gentamicine. Ces tests jouent un rôle
important dans le domaine pharmaceutique. En effet, les tests de libération in vitro sont une
approche de l’étude de la biodisponibilité d’un médicament. Ils vont nous permettre de
sélectionner la formulation d’implant susceptible de libérer sur plusieurs jours la quasi-totalité
du principe actif, donc adaptée au traitement des ostéomyélites chroniques. Les cinétiques de
libération obtenues à l’issue des tests de libération peuvent aussi servir de paramètres de
contrôle de qualité des implants.
Au bout de 20 jours de test de libération, seul l’implant 2 a libéré la totalité de son
contenu en principe actif. Les pourcentages de libération du sulfate de gentamicine à partir
des implants 1, 3, et 4 ont été respectivement de 90, 80, et 75% au bout des 20 jours.
L’implant 2 a libéré 50% de son contenu en 65 heures environ, 75% environ en 7 jours, et
76

Chapitre II
environ 100% en 20 jours de test de dissolution tandis que les autres n’ont libéré 50% du
principe actif qu’au bout de 96 heures au minimum (Fig. 18).
Le profil de libération du sulfate de gentamicine à partir de l’implant 2 correspondrait
mieux au traitement de l’ostéomyélite chronique. En effet, l’implant 2 pourrait assurer une
antibiothérapie locale forte dans les 72 heures, puis une libération lente jusqu’au 20 ème jour de
l’implantation.
Pour des implants de même teneur en eau, le pourcentage de libération diminue avec
leur concentration en sulfate de gentamicine (Fig. 18); ceci pourrait s’expliquer par le
phénomène suivant: la faible quantité d’eau qui pénètre dans l’implant n’arriverait pas à éluer
complètement la forte dose de sulfate de gentamicine. Des résultats similaires ont été
constatés avec des implants d’amylose imprégnés de ciprofloxacine (Désévaux C et coll.,
2002).
Le profil de libération du sulfate de gentamicine à partir de l’implant 2 a un avantage
par rapport à celui d’autres implants biodégradables imprégnés du même principe actif. En
effet, des hydrogels formés de poly(acide acrylique) et de gélatine ont libéré 90% de la dose
de sulfate de gentamicine après seulement 7 jours de test (Changez M et coll., 2003). Des
copolymères biodégradables (d’acide érucique et d’acide sébacique) n’ont libéré que 25% de
leur sulfate de gentamicine en 30 jours de test (Stephens D et coll., 2000).
Le pourcentage de sulfate de gentamicine libéré est une fonction linéaire de la racine
carrée du temps de dissolution (Fig. 19). Ce profil de libération nous permet d’affirmer que le
mécanisme de libération du principe actif à partir des implants fabriqués est une diffusion
contrôlée (Geraghty PB et coll., 1996; Chang C et Bodmeier, 1997). Les implants se
comporteraient comme une matrice homogène non délitable que le milieu de dissolution
pénètre et dissout progressivement le principe actif. Celui-ci diffuse alors vers l’extérieur soit
par le réseau poreux, soit par les espaces intermoléculaires. La cinétique de libération n’est
donc pas d’ordre zéro. Elle est caractéristique d’un mécanisme de dissolution-diffusion où la
vitesse de libération diminue avec le temps (Langer R et Peppas NA, 1981; Dash AK et
Cudworth II GC, 1998).
Ce mécanisme de libération de principe actif à partir de la monoléine a déjà été
rapporté par Chang C et Bodmeier R (1997). Ces derniers ont démontré que le chlorhydrate
de pseudoéphédrine est libéré de la monoléine par diffusion contrôlée (Lew DP et
Waldvoimplant FA, 1997). Le bromure de propanthéline est également libéré du mélange
monoléine/eau suivant le même mécanisme (Geraghty PB et coll., 1996).
77

Chapitre II
Des facteurs de correction ont été apportés au pourcentage de libération de la
gentamicine des implants en raison de l’observation suivante:
Des tests de dissolution préliminaires ont montré que les concentrations en sulfate de
gentamicine dans les milieux de dissolution des implants 1 et 4 diminuaient anormalement au
14 ème jour. Deux hypothèses ont été formulées.
La première est que le sulfate de gentamicine en milieu aqueux s’est dégradé. Cette
hypothèse est infirmée du fait qu’une solution de sulfate gentamicine placée dans les même
conditions du test n’a pas connu de diminution anormale de sa concentration (Fig. 18).
La seconde hypothèse est que l’acide oléique ou d’autres acides gras ont pu être
libérés dans le milieu soit, du fait d’une hydrolyse précoce de la monoléine, soit de la
libération d’acides gras libres contenus dans les implants. Une réaction acido-basique entre
les groupements amines de la gentamicine et le groupement carboxylique de l’acide gras a
probablement abouti à la formation d’oléate de gentamicine peu hydrosoluble. Cette
hypothèse semble être la plus plausible car un implant blanc additionné à une solution de
sulfate de gentamicine (placée dans les même conditions du test) a induit une diminution
sensible de la concentration de la solution en gentamicine; ceci à partir du 14 ème jour pour
l’implant blanc1 et du 20 ème jour pour l’implant blanc 2. C’est ainsi que nous avons pu
corriger le pourcentage de libération du principe actif. Cela a été possible à cause de la
similitude qu’il y a entre les implants 1, 2 et l’implant blanc 1(excepté le fait que ce dernier ne
contient pas de principe actif). Il en est de même pour les implants 3, 4 et l’implant blanc 2.
La chute de la concentration de sulfate de gentamicine dans le milieu n’est donc pas
due à une dégradation du principe actif. Elle est probablement due à la formation de
complexes peu hydrosolubles entre la gentamicine et les acides gras libres dans le milieu de
dissolution. Ces sels faiblement hydrosolubles ne peuvent pas être quantifiés par la méthode
de dosage que nous avons utilisée. Chang C et Bodmeier R (1997) ont rapporté que l’acide
oléique ou d’autres acides gras pouvaient réagir (à pH 7,4) avec certains principes actifs pour
former des complexes insolubles. Ainsi, l’ajout d’acide oléique à la monoléine renfermant du
propranolol chlorhydrate a contribué à diminuer le pourcentage de libération du principe actif
en milieu tamponné pH 7,4 (Chang C et Bodmeier R, 1997). C’est ainsi que nous avons mis
au point une méthode permettant de séparer et de doser la gentamicine dans un milieu de
dissolution contenant l’oléate de gentamicine: 10 mL du milieu a été acidifié par l’ajout de
125 µL d’acide sulfurique concentré. La solution a été ensuite passée au bain ultrasonique
pendant 1 heure. Les acides gras libérés ont été extraits 3 fois avec 5 mL de chloroforme. La
phase aqueuse a été enfin alcalinisée avec une solution d’hydroxyde de potassium (45% m/v).
78

Chapitre II
Cette solution alcaline a été diluée de manière appropriée et le dosage de la gentamicine
effectué suivant le protocole décrit précédemment (cf. I.2).
Les concentrations en sulfate de gentamicine ont été similaires à celles calculées en
utilisant les facteurs de correction.
% libération
125
100
75
50
25
0
0 96 192 288 384 480
Temps (heures)
Figure 18: Cinétique de libération du sulfate de gentamicine à partir des implants
% libération
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
y = 4,5932x + 10,1
R 2 = 0,9614
0 5 10 15 20 25
Racine carrée du temps (heure 1/2 )
implant 1
implant 2
implant 3
implant 4
gentamicin sulfate
gentamicin sulfate + implant
blanc 1
gentamicin sulfate + implant
blanc 2
Figure 19: Pourcentage de libération du sulfate de gentamicine à partir de l’implant 2 en fonction de la
racine carrée du temps
79

I.6. Etude de stabilité
Chapitre II
Les implants conservés à 30 °C et 40 °C ont présenté un aspect hétérogène au bout
d’une semaine de conservation tandis que ceux conservés au réfrigérateur sont restés
homogènes. Etant rapidement dégradés à des températures de 30 °C et 40 °C, les implants ne
peuvent pas être conservés à des températures ambiantes ou dans des conditions de
conservation où la température n’est pas contrôlée même pour des courtes périodes (par
exemple, le transport de l’implant du lieu de production au lieu d’administration).
Les Thermogrammes obtenus par DSC ont présenté toujours deux pics
endothermiques même après 10 mois de conservation (Fig. 20). Le spectre de diffraction des
rayons X de l’implant 2 conservé pendant 10 mois a montré une diminution du nombre et de
l’intensité des pics (Fig 11), témoignant ainsi d’une modification de la structure physique du
gel.
Figure 20: Thermogrammes DSC de la monoléine (glyceryl monooleate) et des implants 1, 2
immédiatement après préparation ( ____ ) et après 10 mois de conservation (------)
Les profiles de libération du sulfate de gentamicine de l’implant 2 fraîchement préparé
et celui de l’implant 2 conservé au réfrigérateur (2- 6 °C) pendant 10 mois sont représentées à
la figure 21.
80

Chapitre II
Il n’existe pas de différence significative entre la teneur en sulfate gentamicine de
l’implant 2 conservé et celle de l’implant 2 fraîchement préparé (Tableau XV; Test de χ 2 , p>
0,05). Le sulfate de gentamicine serait donc chimiquement stable dans le produit fini
(l’implant).
Tableau XV: Teneurs (% m/m) en sulfate de gentamicine (moyenne ± écart-type, n = 5) de l’implant 2
fraîchement préparé et de celui conservé pendant 10 mois
Implant fraîchement préparé Implant conservé pendant 10 mois
5,22 ± 0,02 4,98 ± 0,15
La concentration d’acide oléique dans l’implant 2 conservé pendant 10 mois (4,80 ±
0,29% m/m) est légèrement supérieure à celle de l’implant 2 fraîchement préparé (3,89 ±
0,07% m/m) (Tableau XIV). Cette légère augmentation (non statistiquement significative) de
la concentration d’acide oléique pourrait être le reflet d’une dégradation d’une mineure partie
du monooléate de glycéryle (monoléine) en ses deux composants (acide oléique et glycérol).
Cependant, les concentrations d’acides linoléique, palmitique et stéarique n’ont pas changé de
manière significative.
La modification de la DRX de l’implant conservé à 2-6 °C n’a pas influencé sa
capacité à assurer une libération prolongée du sulfate de gentamicine. Les profiles de
libération à partir d’implants fraîchement et conservés ont été pratiquement identiques (Fig.
21).
% Libération
Figure 21 : Cinétique de libération du sulfate de gentamicine à partir d’implants fraîchement préparé et
conservé
100
75
50
25
0
0 96 192 288 384 480
Temps (heures)
implant 2 fraîchement
préparé
implant 2 conservé
81

CONCLUSION
Chapitre II
Une technique de préparation d’implants biodégradables à base de monoléine, d’eau et
de sulfate de gentamicine a été mise au point.
Les implants obtenus se présentent sous forme de gels, d’apparence homogènes et
bioadhésifs. La consistance et l’adhésivité des implants augmentent avec leur teneur en eau.
Mis aussi au contact de l’eau distillée, les gels, initialement semi-liquides à la température
ambiante (25-35 °C), se prennent en masse. Ces gels se comportent comme des fluides non-
newtoniens pseudoplastiques. Les études physico-chimiques ont montré que les implants
préparés sont en réalité sous forme de cristaux liquides, de phase cubique, donc aptes à
assurer une libération prolongée des principes actifs. Par ailleurs, ils sont instables à 30 °C
mais stables (durant 10 mois) lorsqu’ils sont conservés au réfrigérateur (2-6 °C). Outre la
monoléine, l’eau et le sulfate de gentamicine, les implants contiennent des acides gras libres
(acides linoléique, oléique, palmitique et stéarique) à de faibles concentrations. De l’éthanol
persiste dans la préparation finale à l’état de traces.
Tous les implants libèrent au moins 75% de leur contenu en sulfate de gentamicine sur
20 jours de test. L’implant contenant 15% d’eau et 5% de sulfate de gentamicine (implant 2)
présente la meilleure cinétique de libération adaptée au traitement d’ostéomyélites chroniques.
Des études toxicologiques de cet implant s’avèrent nécessaires avant leur éventuelle
utilisation pour des essais d’études cliniques.
82

CHAPITRE III: CONTROLE MICROBIOLOGIQUE DES MATIERES PREMIERES
ET DU PRODUIT FINI

INTRODUCTION
Chapitre III
Les préparations pharmaceutiques à usage parentéral doivent être stériles et
apyrogènes (World health Organization, 2006). Les implants destinés à être placés au niveau
du site infectieux de l’os doivent donc être soumis à des essais de stérilité et d’apyrogénicité.
Les matières premières utilisées pour la fabrication des implants sont aussi soumises au
contrôle microbiologique; ceci est d’autant indispensable que le produit final n’est pas
stérilisable, ni par filtration, ni par la chaleur humide. Les méthodes classiques d’essais de
stérilité et d’apyrogénicité ne sont pas applicables aux implants mis au point. En effet,
l’implant fabriqué contient un antibiotique (la gentamicine) et se prend en masse au contact
des liquides aqueux. L’application de la technique d’ensemencement direct n’est pas
envisageable du fait de la difficulté d’avoir un inhibiteur spécifique de la gentamicine.
L’application de la technique classique de filtration sur membrane se bute, elle, à
l’impossibilité de diluer l’antibiotique après filtration. Et pour cause, la membrane, imprégnée
de la solution de l’implant se colmate au contact du diluant aqueux du fait de la réaction
implant- liquide aqueux. Une alternative à la technique classique de filtration sur membrane a
donc été développée.
I. MATÉRIEL ET MÉTHODES
I.1. Essai de stérilité
Pour les différents essais de stérilité, nous avons d'abord procédé au choix et à la
validation des milieux à utiliser. Les essais ont été réalisés en utilisant la technique de
filtration sur membrane (World health Organization, 2006) légèrement modifiée. Les
manipulations ont eu lieu sous une hotte à flux laminaire dont l’efficacité a été vérifiée. Les
essais de stérilité ont été effectués sur les matières premières utilisées pour la fabrication de
l’implant (l’eau désionisée, la monoléine, et le sulfate de gentamicine), sur le produit fini
(l’implant) et sur les produits utilisés lors de la réalisation des essais (myristate d’isopropyle,
et eau peptonée additionnée de polysorbate 80 (Tween 80 ® ) à 1%).
I.1.1. Choix des milieux de culture
Pour garantir l’absence de microorganismes dans un échantillon, il faut en principe
que les milieux de culture utilisés pour l’essai permettent la croissance de toutes les espèces
84

Chapitre III
microbiennes: bactéries aérobies, anaérobies, et aérobies/anaérobies facultatives,
champignons. Pour ce faire, nous avons utilisé les milieux suivants:
• Milieux liquides:
- Bouillon au thioglycolate + résazurine (Laboratoire Biomerieux, France) pour la
culture des bactéries anaérobies et aérobies ;
- Bouillon trypto-caséine soja ou TSB (Laboratoire Biomerieux, France) pour la
culture des bactéries aérobies, des champignons et des moisissures.
• Milieux solides:
- Gélose sabouraud-chloramphénicol (Laboratoire Biomerieux, France) pour la culture
des champignons et des moisissures;
- La gélose trypto-caséine soja ou TSA (Laboratoire Biomerieux, France) pour la
culture des bactéries aérobies.
Tous ces milieux ont été préparés à partir de formulations déshydratées, et
conditionnés dans des flacons, puis stérilisés à l’autoclave. Ensuite, ils ont été coulés dans des
tubes inclinés ou dans des boîtes de pétri en fonction des besoins. Pour cette opération, nous
avons travaillé sous une hotte à flux laminaire. Nous avons ensuite étudié les propriétés
nutritives et la stérilité de ces milieux avant leur utilisation. Les propriétés nutritives des
milieux ont été vérifiées en utilisant un nombre limité de microorganismes considérés comme
représentatifs des principaux groupes recherchés.
I.1.2. Etude des propriétés nutritives des milieux de culture
- Etude des propriétés nutritives des milieux de culture vis-à-vis des bactéries:
Nous avons ensemencé trois lots de quatre tubes du bouillon au thioglycolate avec
respectivement 0,1 mL d’une suspension (environ 1000 microorganismes viables/mL) de
Staphylococcus aureus ATCC 6538P, de Bacillus subtilis ATCC 6633 et de Clostridium
perfringens ATCC 13124, deux lots de quatre tubes de gélose de trypto-caséine soja avec 0,1
mL d’une suspension (environ 1000 microorganismes viables/mL) de Staphylococcus aureus
ATCC 6538P et de Bacillus subtilis ATCC 6633 et un lot de quatre tubes du bouillon au
trypto-caséine soja avec 0,1 mL d'une suspension (environ 1000 microorganismes
viables/mL) de Staphylococcus aureus ATCC 6538P. Les milieux de culture ainsi ensemencés
ont été incubés à 35 °C pendant trois jours.
- Etude des propriétés nutritives des milieux de culture vis-à-vis des champignons et
des moisissures :
85

Chapitre III
Pour ce test, nous avons ensemencé quatre tubes du bouillon au trypto-caséine soja et
quatre tubes de la gélose sabouraud-chloramphénicol avec 0,1 mL d’une suspension (environ
1000 microorganismes viables/mL) de Candida albicans ATCC 10231. Les milieux ont été
ensuite incubés à 25 °C pendant cinq jours. Les milieux de culture sont utilisables lorsqu’ils
permettent une croissance clairement visible des microorganismes inoculés.
Pour tous les essais, nous avons effectué des témoins négatifs en ensemençant à
chaque fois, un lot de quatre tubes pour chacun des milieux utilisés, 0,1 mL d'eau distillée
stérile puis incubé à 25 °C ou 35 °C pendant le délai d'incubation pour l'essai.
I.1.3. Etude de la stérilité des milieux de culture
Pour ce test, quatre tubes du bouillon au thioglycolate, quatre tubes du bouillon au
trypto-caséine soja et quatre tubes de la gélose trypto-caséine soja ont été incubés à 35 °C
pendant 14 jours.
Quatre tubes du bouillon au trypto-caséine soja et quatre tubes de la gélose sabouraud-
chloramphénicol ont été incubés à 25 °C pendant 14 jours. Pour être utilisable, aucun de ces
milieux ne doit présenter un développement microbien.
I.1.4. Etude de la fertilité des milieux en présence des échantillons à tester
Cette étude a eu pour but de vérifier que les échantillons soumis aux essais de stérilité
ou que les conditions des essais n’empêchent pas une croissance de germes. Une inhibition
microbienne lors des essais de stérilité conduirait à des résultats faussement négatifs en cas de
contamination.
L’étude de la fertilité des milieux en présence d’implant ou de monoléine a été réalisée
comme suit: nous avons fondu à 40°C au bain-marie un échantillon de 100 mg d’implant ou
de monoléine. Cet échantillon fondu a été ensuite dissous dans 9,9 g de myristate
d'isopropyle. La solution ainsi obtenue a été filtrée sous vide sur membrane filtrante en nitrate
de cellulose dont le diamètre des pores est de 0,45 µm. Ensuite, nous avons rincé à trois
reprises la membrane de filtration. Un rinçage a consisté à filtrer 100 mL d'une solution stérile
d'eau peptonée additionnée de polysorbate 80 à 1% et d’inoculum de 100 microorganismes
viables par type. Les microorganismes utilisés ont été: Staphylococcus aureus, Bacillus
subtilis, Clostridium perfringens et Candida albicans.
Pour l’étude de la fertilité des milieux lors de l’essai de stérilité du sulfate de
gentamicine, nous avons dissous 1 g de ce produit dans 50 mL d’eau stérile. La solution ainsi
obtenue a été filtrée sous vide sur membrane filtrante en nitrate de cellulose dont le diamètre
86

Chapitre III
des pores est de 0,45 µm. Ensuite, nous avons rincé à trois reprises la membrane de filtration
comme précédemment.
L'étude de la fertilité des milieux de culture en présence d’eau utilisée pour la
production de l'implant a été réalisée suivant le protocole précédent; mais en utilisant un
échantillon de 10 mL d’eau désionisée millipore.
Après rinçage, chaque membrane a été découpée en quatre parties égales qui ont été
respectivement placés dans les milieux de culture suivants:
subtilis;
- gélose trypto-caséine soja pour l’isolement de Staphylococcus aureus et Bacilus
- bouillon au thioglycolate + résazurine pour l’isolement de Clostridium perfringens;
- bouillon trypto-caséine soja pour l’isolement de Candida albicans et de
Staphylococcus aureus;
- gélose Sabouraud-chloramphénicol pour l’isolement de Candida albicans.
Parallèlement à ces tests, nous avons effectué un test de croissance des germes sans
l'échantillon testé.
L’incubation a été faite à 35 °C pendant trois jours pour Bacillus subtilis, Staphylococcus
aureus et Clostridium perfringens et à 25°C pendant cinq jours pour Candida albicans.
Si au cours de l’incubation, la croissance microbienne est semblable en présence et en
l’absence de l'échantillon testé, ce dernier n’a pas d’activité antimicrobienne dans les
conditions de l’essai; et l’essai de stérilité peut donc s’effectuer sans aucune modification.
Si les milieux de culture contenant l'échantillon présentent une croissance plus faible,
retardée ou totalement inhibée par rapport aux milieux ne le contenant pas, l'échantillon a une
activité antimicrobienne dans les conditions de l’essai. Dans ce cas, cette activité doit être
éliminée avant l’essai.
I.1.5. Essais de stérilité du myristate d'isopropyle et de l'eau peptonée
additionnée de polysorbate 80 (Tween 80 ® ) à 1%
Ces contrôles ont eu pour but de vérifier la stérilité des différents produits à utiliser
dans l’essai de stérilité des échantillons. Pour ce faire, chacun des deux produits a été filtré
sous vide sur membrane filtrante en nitrate de cellulose dont le diamètre des pores est de 0,45
µm. Celle-ci a ensuite été découpée en quatre. Les fragments de membrane ainsi obtenus ont
été placés dans les milieux de culture suivants : bouillon trypto-caséine soja, gélose trypto-
caséine soja, bouillon au thioglycolate, et gélose sabouraud-chloramphénicol. L'incubation a
été faite à 37 °C pendant 14 jours pour le bouillon au thioglycolate, le bouillon trypto-caséine
87

Chapitre III
soja, la gélose trypto-caséine soja, et à 25°C pendant 14 jours pour le trypto-caséine soja et le
sabouraud-chloramphénicol.
Aucun développement microbien ne doit être observé si le produit est stérile.
I.1.6. Essai de stérilité de l’eau utilisée pour la préparation de l’implant
Pour cet essai, nous avons prélevé 10 mL d’eau de production que nous avons filtrée
sur membrane filtrante en nitrate de cellulose dont le diamètre des pores est de 0,45 µm. Nous
avons ensuite rincé chaque membrane à trois reprises avec de l’eau peptonée stérile. Le
rinçage a consisté à filtrer à chaque fois 100 mL d’une solution stérile d’eau peptonée. Pour
l’ensemencement, la membrane de filtration a été découpée aseptiquement en quatre parties
égales. Le quart de chaque membrane a été placé dans les milieux de culture suivants : gélose
trypto-caséine soja (TSA), bouillon trypto-caséine soja (TSB), bouillon au thioglycolate et
gélose sabouraud-chloramphénicol.
I.1.7. Essai de stérilité de la monoléine
La monoléine utilisée dans la fabrication de l'implant a été d'abord solubilisée dans de
l'éthanol dénaturé puis stérilisée par filtration à travers un filtre de porosité égale à 0,2 µm de
diamètre.
Ainsi, nous avons prélevé 1 g de monoléine, qui a été fondu à 40 °C au bain-marie,
puis dissous dans 50 mL de myristate d’isopropyle et filtré à travers une membrane en nitrate
de cellulose de porosité 0,2 µm (de diamètre). Le filtrat ainsi obtenu a été encore filtré sous
vide sur une membrane en nitrate de cellulose. Ensuite, nous avons rincé à trois reprises la
membrane de filtration, en filtrant à chaque fois 100 mL d’une solution stérile d’eau peptonée
additionnée de 1% de polysorbate 80. La membrane de filtration a été ensuite découpée
aseptiquement en quatre parties égales et le quart de chaque membrane a été placé dans les
milieux de culture suivants : TSA, TSB, bouillon au thioglycolate et sabouraud-
chloramphénicol.
I.1.8. Essai de stérilité du sulfate de gentamicine
Nous avons utilisé 1 g de sulfate de gentamicine. Ce dernier a été dissous dans 50 mL
d’eau peptonée. Nous avons agité le mélange pendant 5 minutes avant de le stériliser par
filtration à travers le filtre de porosité égale à 0,2 µm. Le filtrat a été soumis à l'essai de
stérilité par filtration sur une membrane en nitrate de cellulose de 0,45 µm de porosité. Nous
avons rincé à trois reprises la membrane de filtration, en filtrant à chaque fois 100 mL d’une
88

Chapitre III
solution stérile d’eau peptonée. La membrane de filtration a été ensuite découpée
aseptiquement en quatre parties. Le quart de chaque membrane a été placé dans les milieux de
culture suivants : TSA, TSB, bouillon au thioglycolate et sabouraud-chloramphénicol.
I.1.9. Essai de stérilité de l’implant
Chaque lot de production compte dix flacons de 55 g d’implant. Un flacon a été
prélevé par lot et soumis à l’essai. Dans ce flacon trois prélèvements de 100 mg ont été
effectués. Chaque prélèvement a d'abord été fondu à 40°C au bain-marie puis dissous dans 9,9
g de myristate d’isopropyle. La solution ainsi obtenue a été filtrée sous vide sur une
membrane en nitrate de cellulose de 0,45 µm de porosité. Ensuite, nous avons rincé à trois
reprises, la membrane de filtration. Le rinçage a consisté à filtrer à chaque fois 100 mL d'une
solution stérile d'eau peptonée additionnée de 1% de polysorbate 80. Pour l'ensemencement,
la membrane de filtration a été découpée aseptiquement en quatre parties égales. Le quart de
chaque membrane a été placé dans les milieux de culture suivants : TSA, TSB, bouillon au
thioglycolate, et sabouraud-chloramphénicol.
Pour tous les essais de stérilité, Le TSA, le TSB et le bouillon au thioglycolate ont été
incubés à 35 °C pendant 14 jours. Le sabouraud-chloramphénicol et le TSB ont été incubés à
25°C pendant la même durée. Les milieux de culture ont été ensuite examinés au quotidien
pendant les 14 jours afin de déceler les signes macroscopiques d’une prolifération
microbienne. S'il n'y a aucune prolifération, l’échantillon satisfait à l'essai de stérilité. En cas
de prolifération microbienne, des répétitions de l'essai sont nécessaires pour écarter ou
confirmer l'hypothèse d'une contamination intrinsèque:
- Première répétition de l'essai :
Le nombre d'échantillons et les quantités à examiner sont les même que ceux indiqués
pour le premier essai. Si aucune manifestation de prolifération ne peut être décelée,
l’échantillon satisfait à l'essai de stérilité. Si la prolifération microbienne est constatée dans un
des milieux de culture de la première répétition de l'essai, identifier le ou les contaminants et
comparer les avec ceux du premier essai. Si les contaminants sont identiques, l’échantillon est
non stérile. Si les contaminants sont différents, une seconde répétition de l'essai est effectuée.
- Deuxième répétition de l'essai :
Un nombre d'échantillons double de celui qui a été utilisé pour le premier essai de
stérilité est prélevé. La quantité à prélever pour chaque unité étant la même que celle indiquée
pour le premier essai. Si aucune manifestation de prolifération microbienne n'est décelée, le
89

Chapitre III
gel (implant) satisfait à l'essai. Si une croissance est décelée dans la seconde répétition de
l'essai, l’échantillon ne satisfait pas aux exigences de l'essai de stérilité.
I.2. Recherche et dosage des endotoxines bactériennes in vitro
Le Test LAL (Lysat d’amoebocyte de Limule), plus précisément la méthode de
gélification (décrite par la Pharmacopée Européenne, 5 ème édition) a été utilisée pour la
recherche et le dosage des endotoxines bactériennes dans les implants. A cet effet, le matériel
et réactifs suivants ont été utilisés: un bloc chauffant capable de maintenir une température de
37±1 °C, des portoirs, des pipettes stériles et apyrogènes, des tubes à essai apyrogènes, un
réactif LAL (0,015 EU/mL), un standard d’endotoxines (flacon de 100 EU), de l’eau LAL, et
du myristate d’isopropyle, des solutions apyrogènes d’hydroxyde de sodium (0,1 N) et
d’acide chlorhydrique (0,1 N), et l’implant 2. Les étapes suivantes ont été suivies pour la
réalisation du test LAL.
I.2.1. Vérification de la sensibilité déclarée du lysat
Les différents réactifs ont été répartis dans les tubes à essai contenant 0,1 mL de
réactif LAL (Tableau XVI).
Tableau XVI: Composition des tubes pour la vérification de la sensibilité du lysat
0,1 mL de solution d’endotoxines de
concentration
0,1 mL du réactif LAL
2 λ (= 0,030 EU/mL) λ (= 0,015 EU/mL)
λ (= 0,015 EU/mL) λ (= 0,015 EU/mL)
½ λ (= 0,0075 EU/mL) λ (= 0,015 EU/mL)
¼ λ (= 0,0037 EU/mL) λ (= 0,015 EU/mL)
0 λ (= Eau LAL) λ (= 0,015 EU/mL)
Pour chaque mélange, l’essai a été réalisé dans 4 tubes différents.
Les tubes de réaction ont été délicatement homogénéisés puis placés dans un
incubateur à 37±1 °C pendant 60 minutes. L'incubateur a été déposé sur une surface plane, à
90

Chapitre III
l'abri de toute vibration. Si un gel s’est formé et reste intact au fond du tube après
renversement à 180 °, le test est positif.
La concentration extrême de chaque série de 4 donnant un résultat positif est convertie
en logarithme. L'antilogarithme de la moyenne des valeurs logarithmiques constitue la
sensibilité du lysat. La sensibilité déclarée du lysat est confirmée si la sensibilité calculée est
située entre 0.5 λ et 2 λ.
I.2.2. Détermination de la Concentration Limite en Endotoxines
bactériennes (CLE) de l'implant, et de la Dilution Maximale
Significative (DMS)
La concentration limite en endotoxines (CLE) est donnée par la relation :
CLE = K x C / M
K: Dose seuil d’endotoxines ayant un effet pyrogène, par kilogramme de masse
corporelle et par heure. La valeur de K la plus exigeante est celle réservée aux produits
administrés par voie intrarachidienne (K= 0,2 EU/ kg/h) selon les normes de la Pharmacopée
européenne (2005). Nous avons opté de prendre cette valeur pour calculer la CLE de l’implant
en développement.
M : Dose maximale recommandée pour le produit, par kilogramme de masse
corporelle et par heure. La dose maximale d’implant prévue pour l’adulte est de 120 g. Nous
avons considéré 70 kg comme le poids de l'adulte et 24 h comme délai de libération de
l'ensemble des endotoxines contenues dans la dose maximale.
C : Concentration du produit dans la solution à examiner. Nous avons dissous 100 mg
d’implant dans 6 mL de myristate d’isopropyle. L'extraction d’éventuelles endotoxines à
partir de cette solution a été faite avec 5 mL d'eau LAL; C = 100 mg/5 mL, soit 20 mg/mL.
La dilution maximale significative a été calculée selon la relation : DMS = CLE / λ
λ = sensibilité du réactif LAL.
I.2.3. Extraction, recherche et dosage in vitro à proprement dits des
endotoxines bactériennes dans les implants
Afin d’extraire d’éventuelles endotoxines dans les implants, 100 mg d'implant ont été
introduits dans un tube, puis fondus à 40 °C au bain-marie. 6 mL de myristate d’isopropyle y
ont été ajoutés. Après avoir agité énergiquement pour solubiliser l'implant, 5 mL d’eau LAL
ont été ajoutés au mélange. Ce mélange a été aussi agité au vortex pendant 10 minutes et
91

Chapitre III
laisser au repos pendant 20 minutes. La phase lipophile (le surnageant) a été ensuite éliminée,
et la phase aqueuse a servi de solution pour le test LAL.
En vue de vérifier d’éventuelle interférence de l’implant sur le test LAL, la sensibilité
du lysat a été aussi calculée à partir d’implants auxquels des quantités déterminées
d’endotoxines ont été ajoutées. Ce sont les extraits issus de ces implants "contaminés" qui ont
été utilisés pour vérifier l’absence d’interférence. Il n’y a pas d’interférence si la sensibilité du
lysat en présence de l’extrait est comprise entre 0,5 λ et 2 λ.
Comme témoin négatif, de l’eau LAL a été utilisée comme solution pour le test LAL.
Pour la mise en œuvre du test, 0,1 mL de la solution à examiner a été délicatement
mélangé à 0,1 mL du réactif LAL dans quatre tubes à essai apyrogènes. Ces tubes ont été
ensuite placés dans un incubateur à 37±1 °C pendant 60 minutes. Le test est positif si un gel
s’est formé et reste intact au fond du tube après renversement à 180 °.
RÉSULTATS ET DISCUSSIONS
I.3. Essais de stérilité
I.3.1. Etude de la fertilité et de la stérilité des milieux de culture
Tous les milieux de culture (gélose de trypto-caséine soja, bouillon de trypto-caséine
soja, bouillon au thioglycolate, gélose sabouraud-chloramphénicol) ont permis le
développement des germes qui y ont été inoculés (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis,
Clostridium perfringens, Candida albicans).
Au bout des quatorze jours d’observations quotidiennes, les milieux de culture non
ensemencés n’ont révélé aucun signe de développement microbien.
Les milieux de culture utilisés ont été donc stériles et propices au développement
d’éventuels contaminants (bactéries anaérobies, aérobies, champignons et moisissures) des
échantillons testés.
I.3.2. Etude de la fertilité des milieux en présence des échantillons à tester
Les essais de fertilité des milieux de culture en absence d’échantillon et en présence
d’échantillon contaminé ont donné des résultats similaires. En effet, aucune différence n'a pu
être décelée visuellement entre le développement microbien en présence d’échantillon
contaminé et le développement microbien en absence de ce dernier. Les essais de stérilité des
92

Chapitre III
échantillons ont donc pu se faire sans modification puisque ces derniers n’inhibent pas la
croissance microbienne dans les conditions de l'essai.
Cette série de tests valide la méthode d’essai de stérilité que nous avons utilisée. Cette
méthode permet de réaliser un essai de stérilité d’un produit renfermant un antibiotique sans
avoir recours à un inhibiteur d’antibiotique; qui, d’ailleurs n’existe pas toujours pour tous les
antibiotiques.
L’addition du polysorbate 80 à l’eau peptonée (utilisée comme solution de rinçage
pour éliminer l’antibiotique) lors de l’essai de stérilité de l’implant ou de la monoléine a été
nécessaire pour la raison suivante: l’eau peptonée seule provoque un colmatage des
membranes de filtration par réaction de l’implant ou de la monoléine résiduelle avec l’eau
peptonée. L’addition d’un tensio-actif (le polysorbate 80) à l’eau peptonée a permis d’éviter le
colmatage. Cette addition n’a pas entamé la validité de la méthode d’essai de stérilité utilisée.
I.3.3. Essais de stérilité du myristate d'isopropyle et de l'eau peptonée
additionnée de polysorbate 80 (Tween 80 ® ) à 1%
Aucun développement microbien n’a été constaté sur les milieux de culture
ensemencés par les membranes ayant filtré le myristate d’isopropyle ou l’eau peptonée
additionnée de polysorbate 80. Ces produits ont été donc stériles et peuvent être utilisés lors
des essais de stérilité.
I.3.4. Essais de stérilité des matières premières
Au bout des 14 jours d’incubation, aucun signe de développement microbien n’a été
observé sur les milieux de culture ensemencés par les membranes filtrantes utilisées pour
l’essai de stérilité des matières premières. Elles ont été donc stériles et ne se sont pas
susceptibles de produire des endotoxines bactériennes; lesquelles peuvent créer des
dommages à l’organisme lorsqu’elles se trouvent en grande quantité dans le produit final
(World health Organization, 2006).
I.3.5. Essai de stérilité de l’implant
Les milieux de culture ensemencés par les membranes filtrantes utilisées pour l’essai
de stérilité de l’implant n’ont pas présenté de signe de développement microbien. Ces
résultats ont été vérifiés pour tous les lots d’implant fabriqués L’implant a été donc exempt
de tout microorganisme vivant. Cette stérilité se justifie par le fait que les matières premières
93

Chapitre III
ont été stériles et la fabrication de l’implant s’est faite en atmosphère stérile, avec du matériel
stérilisé.
I.4. Recherche et dosage des endotoxines bactériennes in vitro
I.4.1. Vérification de la sensibilité déclarée du lysat
Tableau XVII: Résultats du test de vérification de la sensibilité déclarée du lysat
Solutions d’endotoxines
Numéro d’essai
1 2 3 4
2 λ (= 0,030 EU/mL) + + + +
λ (= 0,015 EU/mL) + + + +
½ λ (= 0,0075 EU/mL) - - + -
¼ λ (= 0,0037 EU/mL) - - - -
0 λ (= Eau LAL) - - - -
+ : réaction positive (gélification)
- : réaction négative (absence de gélification)
La sensibilité du lysat (λ )= antilog [(3ln 0.015 + ln 0.0075) / 4] = 0,0126 EU/mL.
I.4.2. Détermination de la Concentration Limite en Endotoxines
bactériennes (CLE) de l'implant, et de la Dilution Maximale
Significative (DMS)
Dose maximale recommandée pour le produit, par kilogramme de masse corporelle et
par heure (M) = (120 g/70 kg)/24 h
M = 71,43 mg/kg/h
La concentration limite en endotoxines (CLE) = est donnée par la relation :
CLE = K x C / M
= (0,2 EU/ kg/h x 20 mg / mL)/ 71,43 mg/kg/h
= 0,056 EU/mL soit (0,056 EU/mL x 5 mL) /100 mg
= 0,0028 EU/mg
La dilution maximale significative (DMS) = CLE / λ
= (0,056 EU/mL)/ (0,015 EU/mL)
DMS = 3,73
94

Chapitre III
I.4.3. Recherche et dosage in vitro à proprement dits des endotoxines
bactériennes dans les implants
Tableau XVIII: Résultats de recherche et de dosage des endotoxines dans les implants
solutions
Numéro d’essai
1 2 3 4
A - - - -
B1 (0,030 EU / mL) + + + +
B2 (0,015 EU/ mL) + + + +
B3 (0,0075 EU / mL) - - - -
B4 (0,0037 EU/ mL) - - - -
C - - - -
A: Solution d’implant à tester
B: Solutions extraites d’implant mis en contact avec des endotoxines
C: Eau LAL
+: réaction positive (gélification)
-: réaction négative (absence de gélification stable)
La sensibilité du lysat en présence de la solution d’implant à examiner (λ) =
antilog[(4ln0,015)/4] = 0,015 EU /mL
La concentration en endotoxines de l’implant a été inférieure à la limite définie qui est de
0,056 EU/mL soit 0,0028 EU/mg.
L'essai de la confirmation de la sensibilité déclarée du lysat a donné une sensibilité de
0,0126 UI / mL (Tableau XVII). Ce résultat confirme la sensibilité déclarée du lysat selon la
Pharmacopée européenne, puisqu'elle est bien comprise entre 0,5 λ (0,0075 UI / mL) et 2 λ
(0,030 UI / mL); mieux, elle est très proche de λ (0,015 UI / mL). Ce résultat nous autorise à
effectuer nos essais avec ce réactif.
L’extrait de l’implant peut être dilué à la DMS (1/3) avant de le faire réagir avec le
réactif LAL. Seule une réaction positive obtenue par réaction de l’extrait de l’implant dilué
au 1/3 avec le réactif LAL permettra de conclure que l’implant est «apyrogène».
L’implant a eu une concentration en endotoxines largement inférieure à la
concentration limite. Elle a été au moins inférieure au 1/3 de cette concentration limite soit
0,0009 EU/mg. Les résultats de la recherche des facteurs d'interférences dans l'extrait de ce
produit ainsi que ceux des témoins négatifs et de la sensibilité déclarée du lysat valident le
résultat de l'essai et la méthode d’extraction des endotoxines à partir de l’implant (Tableau
95

Chapitre III
XVIII). La DMS du produit étant de 3, la dose maximale définie pour être administrée (120g)
peut être multipliée par 3, sans risque de survenue d'un effet pyrogène. L’implant fabriqué
peut donc être utilisé par voie parentérale dans le traitement de l'ostéomyélite chronique sans
risque de survenue d'un effet pyrogène.
L’absence ou la très faible concentration en endotoxines de l’implant pourrait
s’expliquer par l’absence de germes au niveau de l’implant ou de ses matières premières (déjà
démontrée lors de nos études antérieures). Cette absence élimine toute source de production
d’endotoxines bactériennes.
CONCLUSION
Une méthode de filtration sur membrane pour le contrôle microbiologique d’un
implant majoritairement composé de monoléine a été mise au point et validée. Cette méthode
pourrait s’appliquer au contrôle microbiologique d’autres préparations pharmaceutiques
renfermant de la monoléine, lipide polaire, gonflant en présence d’eau. Les essais de stérilité
et d’apyrogénicité réalisés sur l’implant et ses matières premières ont révélé qu’ils répondent
tous aux exigences de qualité microbiologique.
96

CHAPITRE IV : ETUDES TOXICOLOGIQUES IN VITRO

INTRODUCTION
Chapitre IV
L’emploi de substrats de quelque nature que ce soit, sous forme s’inserts (implants)
pose la question essentielle de leur compatibilité avec les tissus de contact (Bury P et coll.,
1985; Aiache JM et coll., 1995) dont le sang. Les études de cytotoxicité in vitro sont les
premiers tests toxicologiques à réaliser quand on veut évaluer la biocompatibilité d’un
implant ((Mallapragada SK et Narasimhan B, 1999). Des prérequis sur le potentiel
génotoxique de l’implant sont aussi exigés avant d’envisager l’utilisation des implants chez
des malades.
Des tests d’hémolyse, de cytotoxicité, et de génotoxicité in vitro des implants mis au
point ont alors été réalisés à cet effet.
I. MATÉRIEL ET MÉTHODES
I.1. Test d’hémolyse in vitro
Une solution de chlorure de sodium à 0,9% m/v (eau physiologique), de l’eau distillée,
l’implant 2 (5% de gentamicine sulfate, 80% de monoléine, et 15% d’eau), des tubes en verre
de 5 mL contenant 0,5 mL de solution de citrate de sodium 0,129 M (Beliver Industrial
Estate, Plymouth, UK), et un spectrophotomètre UV-Visible (S1000 SECONAM Esaco
International, France) ont été utilisés. Le sang veineux (5 mL) a été obtenu chez 10
volontaires sains d’hémoglobine AA, et chez 10 autres d’hémoglobine SS. 4,5 mL du sang
prélevé a été immédiatement transvasé dans les tubes contenant le citrate de sodium.
Le pouvoir hémolytique in vitro de l’implant (implant 2) a été testé selon la méthode
de Roy Chowdhury SK et coll.(2004).
Le sang citraté a été dilué au 1/10 ème dans de l’eau physiologique. A 0,2 mL du sang
dilué, 10 mL d’eau distillée ont été ajoutés. Comme l’eau distillée est réputée comme solvant
causant une lyse des hématies, ce mélange a été considéré comme témoin positif de
l’hémolyse. Comme témoin négatif un mélange contenant 0,2 mL du sang dilué et 10 mL de
la solution de chlorure de sodium a été utilisé. Parallèlement, 200, 300, 400 et 500 mg
d’implant ont été ajoutés à des solutions contenant 0,2 mL de sang dilué et 10 mL d’eau
physiologique.
Tous les mélanges (Tableau XIX) ont été ensuite incubés au Bain-marie à 37 °C
pendant 60 minutes. La densité optique (DO ou l’absorbance) des solutions incubées a été
98

Chapitre IV
mesurée au spectrophotomètre à 545 nm. Le pouvoir hémolytique (%) de l’implant aux
différentes doses a été déterminé selon l’équation suivante :
Pouvoir hémolytique = (DO Test – DO Témoin négatif / DO Témoin positif - DO Témoin négatif) ×100
Pour chaque échantillon de sang des 20 sujets, l’expérience a été répétée trois fois.
Tableau XIX : Composition des tubes ayant servi au test d’hémolyse in vitro
Témoin négatif Témoin positif Test
Sang dilué au 1/10 ème + + +
Eau physiologique + - +
Eau distillée - + -
Implant - - +
(+) : Présence ; (-) : Absence
I.2. Test de cytotoxicité in vitro
La cytotoxicité a été évaluée par la méthode de contact direct utilisant le test MTT. Le
principe de ce test est basé sur la capacité des enzymes déshydrogénases mitochondriales
présentes dans les cellules vivantes à transformer le substrat MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-
yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) en formazan. Des fibroblastes V79-4 d’hamster chinois
(Cricetulus griseus) et des macrophages P388D1 de souris (Mus musculus) provenant de la
banque de cellules ATCC (American Type Culture Collection) ont utilisés pour réaliser le
test.
Le milieu Dulbecco’s Mod Eagle Medium additionné de serum fœtal de bovin, de
streptomycine, de pénicilline et de glutamine (GIBCO, in vitrogen Co, UK) a servi de milieu
de culture des fibroblastes; celui des macrophages a été le milieu RPMI additionné de
pénicilline, de streptomycine et de glutamine, de tampon Hepes et de sérum fœtal de bovin
(GIBCO, in vitrogen Co, UK).
Les cellules, introduites dans des flacons de culture de 50 mL, ont été incubées à 37 °C
dans une atmosphère humide à 5% de gaz carbonique. Afin de récupérer le culot cellulaire
tapissé au fond des flacons de culture, le milieu de culture a été délicatement éliminé dans un
premier temps. Ensuite, environ 1 mL de solution de Trypsine-EDTA (trypsine 0,05 M,
EDTA 0,02 M dans une solution saline de tampon phosphate, pH 7,4) a été introduit dans le
flacon pour détacher les cellules du fond (des flacons). Enfin, 5 mL de milieu de culture ont
été introduits dans le flacon et une numération des cellules vivantes était faite au microscope
optique; ceci après coloration de l’échantillon prélevé au bleu trypan. La suspension cellulaire
a été convenablement diluée à 125000 cellules/mL.
99

Chapitre IV
Cette suspension cellulaire (200 µL) a été placée dans chaque puit d’une microplaque
(96 puits). La microplaque a été ensuite incubée à 37 °C pendant 24 heures dans une
atmosphère humide à 5% de gaz carbonique. Après cette période, l’implant dissous dans du
méthanol dilué a été distribué dans les puits à des concentrations allant de 0,009 µg/mL à 37,5
µg/mL. Afin d’évaluer la part de cytotoxicité du solvant de l’implant, une distribution
similaire du méthanol dilué (ayant servi à dissoudre l’implant) a été faite dans des puits
d’autres microplaques. La dilution du méthanol a été faite avec les milieux de culture
respectifs de chaque type de cellules. Comme contrôle négatif, le milieu de culture seul a été
mis en contact avec les cellules. Pour vérifier l’absence d’une éventuelle interférence entre
l’implant et les réactifs, des solutions d’implants ont été aussi introduites dans des puits sans
cellules.
Toutes ces microplaques ont été ensuite incubées pendant 48 heures à 37 °C dans une
atmosphère humide à 5% de gaz carbonique. Après cette période d’incubation, le milieu de
culture est aspiré des puits et remplacé par 200 µL de solution de MTT dans chaque puit. Les
microplaques ont été une fois de plus incubées pendant 2 heures dans les mêmes conditions
que précédemment. Au bout des 2 heures, le surnageant a été remplacé par 200 µL de
diméthyle sulfoxide (DMSO), dans le but de dissoudre le formazan qui se serait formé. Les
microplaques ont été agitées pendant 30 minutes pour uniformiser la coloration pourpre qui
serait apparue. La densité optique de chaque solution contenue dans les puits a été ensuite lue
au spectrophotomètre pour microplaques (Labsystems, Finlande) à 540 nm. Le pourcentage
de cellules vivantes a été calculé en faisant le rapport entre la densité optique des puits tests et
celle des puits témoins négatifs.
Ce test de cytotoxicité a été répété 3 fois et la moyenne de pourcentages de cellules
vivantes calculée. L’implant 2 contenant 80% de monoléine, 15% d’eau, 5% de sulfate de
gentamicine et l’implant 4 contenant 75% de monoléine, 15% d’eau, 10% de sulfate de
gentamicine ont été testés.
I.3. Test de génotoxicité in vitro
L’étude du potentiel génotoxique des implants a été réalisée en utilisant la technique
des essais comètes selon la procédure de Singh NP et coll. (1988) schématisée par la figure
22. Les suspensions de fibroblastes et de macrophages ont été respectivement mises en
contact avec des solutions d’implants à 37,5 µg/mL. La dissolution de ces implants a été faite
dans du méthanol 1% (V/V). L’ensemble a été ensuite incubé à 37 °C (dans une atmosphère
humide à 5% de gaz carbonique) pendant 48 heures. Dans le but d’étudier une éventuelle
100

Chapitre IV
influence du solvant des implants (méthanol dilué) sur le test, les fibroblastes et macrophages
ont été aussi mis en contact avec le méthanol dilué, et placés dans les mêmes conditions que
précédemment.
Au bout des 48 heures de mise en contact, le surnageant a été éliminé. Le culot
cellulaire a été récupéré en utilisant une solution Trypsine-EDTA (trypsine 0,05 M, EDTA
0,02 M dans une solution saline de tampon phosphate, pH 7,4). Ce culot a été ensuite mis en
suspension dans un milieu de culture. Cette suspension a été centrifugée à 2000 tours/min
pendant 2 minutes. Le surnageant a été éliminé et le culot repris par une solution saline de
tampon phosphate (pH 7,4) de manière à avoir une densité cellulaire comprise entre 1750000
et 3500000 cellules/mL. A 300 µL d’agarose liquéfié, 15 µL de la suspension cellulaire ont
été ajoutés. Ce mélange a été déposé entre lame et lamelles, et gardé à 4 °C pendant 20
minutes. Au bout de ces 20 minutes, les lamelles ont été délicatement retirées, et les lames
immergées dans une solution de lyse renfermant 89 mL de "solution stock" (2.5 M NaCl, 100
mM EDTA; 10 mM Tris; ~8 g NaOH pour obtenir un pH de 10; 890 mL d’eau désionisée; 1%
sodium lauryl sarcosinate), 1 mL Triton X-100 (Merck) et 10 mL de DMSO. Cette immersion
a été faite pendant 60 minutes à 4 °C. Au bout ce temps, les lames ont été retirées de la
solution de lyse et placées dans une cuve à électrophorèse contenant un tampon alcalin de
dénaturation (pH >13) (5 mL d’EDTA à 200 mM, 30 mL de NaOH à 10N et 965 mL d’eau
désionisée à 4 °C) pendant 40 minutes. Les lames ont été ensuite soumises à une
électrophorèse (25 V et 300 mA) pendant 20 minutes. Les lames ont été par la suite couvertes
de solution de neutralisation (0.4 M Tris-HCl, pH 7.5) pendant 15 min à 22 °C, puis
immergées dans une solution d’éthanol absolu pendant 10 minutes à 22 °C.
Toutes ces opérations ont menées dans l’obscurité sous lampe inactinique afin d’éviter
des dommages à l’ADN provoqués par la lumière.
Enfin, les lames ont été colorées avec une solution de bromure d’éthidium (20 µg/mL),
puis examinées au microscope à fluorescence connecté à un système d’analyse des images
comètes.
Le dommage causé à ADN a été exprimé par le pourcentage d’ADN dans la queue de
la comète (Tail DNA%) où:
Tail DNA% = Tail DNA / (Head DNA+ Tail DNA) x 100.
Tail DNA: ADN dans la queue de la comète.
Head DNA: ADN dans la tête de la comète
La moyenne de ce pourcentage d’ADN a été calculée pour chaque échantillon.
101

Figure 22: Etapes de réalisation des essais comètes
I.4. Analyse statistique
Chapitre IV
L’analyse statistique a été réalisée en utilisant le logiciel GraphPad PRISM version
2.01 (GraphPad Software Inc., USA). Une différence a été jugée significative lorsque p< 0,05.
Après vérification de la distribution normale des données, le test t de Student (pour des
échantillons non appariés) a été utilisé pour comparer à chaque dose d’implant les hémolyses
en fonction du type d’hématie.
Le test de Kruskal-Wallis a été utilisé pour comparer les niveaux de dommages de
l’ADN lorsque des cellules n’ont pas été exposées à un produit ou lorsqu’elles ont été mises
en contact avec du méthanol dilué, ou avec les implants 2 et 4. Il a été suivi du post-test de
comparaison multiple de Dunn lorsque p< 0,05.
102

RÉSULTATS ET DISCUSSIONS
I.5. Test d’hémolyse in vitro
Chapitre IV
Des substances toxiques sont susceptibles d’endommager la membrane ou perturber le
métabolisme cellulaire. Les principales conséquences de ces actions toxiques sont la lyse ou
la mort cellulaire. Comme les hématies font partie des cellules qui seront en contact avec
l’implant in vivo, le pouvoir hémolytique de ce dernier a été évalué. L’étude du pouvoir
hémolytique de l’implant a porté non seulement sur des hématies à hémoglobine AA mais
aussi sur des hématies à hémoglobine SS. En effet, l’ostéomyélite chronique (pathologie dont
le traitement pourrait nécessiter l’utilisation de l’implant qui est en cours de développement)
est relativement fréquente chez les drépanocytaires (Habibou A et coll., 1999).
Le pouvoir hémolytique de l’implant a été linéairement fonction de la dose d’implant
(Fig.23). A la dose de 200 mg/10 mL de sang dilué, il n’y a pratiquement pas eu de lyse
significative des deux types d’hématies. En effet, à cette dose la moyenne des pourcentages de
lyse n’est pas statistiquement différente de la valeur nulle. Aux doses supérieures, la lyse a été
plus importante pour les hématies à hémoglobine AA que pour les hématies à hémoglobine
SS (Tableau XX).
La gentamicine libérée dans le milieu réactionnel pourrait être impliquée dans la
survenue de l’hémolyse. En effet, la quantité de gentamicine libérée est aussi fonction de la
dose d’implant dans le milieu. Aussi, la toxicité de la gentamicine sur des cellules telles que
les cellules ciliées de la cochlée est également connue (Medicines Complete Browser, 2004).
Les doses très hémocompatibles (lorsque le pourcentage d’hémolyse est inférieur à 5
(Roy Chowdhury SK et coll., 2003) de l’implant ont été d’environ 351 mg et 277 mg par 10
mL de sang dilué, respectivement pour les hématies à hémoglobine AA et celles à
hémoglobine SS. Les hématies à hémoglobine SS ont été donc plus susceptibles à une lyse par
l’implant que les hématies à hémoglobine AA. Cette plus grande sensibilité des hématies à
hémoglobine SS pourrait s’expliquer par leur tare.
Toutefois, l’implant a été très compatible avec les 2 types d’hématies. En effet, une
étude a rapporté que le polysorbate 80 ® , un surfactant non-ionique utilisé en administration
intraveineuse, a un pouvoir hémolytique de 82,8%; ceci à une concentration de 100 mg/mL
(Lee SC et coll., 2003); tandis que, l’implant n’a induit aucune lyse significative à la
concentration de 200 mg/10mL (quel que soit le type d’hématie).
103

Chapitre IV
Tableau XX : Pourcentage d’hémolyse (moyenne ± SEM, n = 10) provoqué par l’implant 2 en fonction de
la dose et du type d’hématie (hématies provenant de sujets homozygotes AA et de d’homozygotes SS)
Hématies à
hémoglobine AA
Hématies à
hémoglobine SS
Doses d’implant (mg/10 mL de sang dilué)
200 300 400 500
0,11 ± 0,06
0,93 ± 0,55
Test t de student (échantillons non appariés) :
2,99 ± 0,57
6,13 ± 1,25*
6,12 ± 0,49
11,73 ± 0,69*
10,61 ± 0,65
16,06 ± 0,87*
* Pourcentage de lyse des hématies à hémoglobine AA versus pourcentage de lyse des hématies à hémoglobine
Pourcentage d'hémolyse
20
15
10
5
y = 0,051x - 9,134
R 2 = 0,9975
y = 0,0346x - 7,1592
R 2 = 0,9883
0
100 200 300 400 500 600
Dose d'implant (mg/10 ml)
Erythrocytes d'hémoglobine AA
Erythrocytes d'hémoglobine SS
SS (p< 0,05)
Figure 23: Pourcentage de lyse des hématies de sujets homozygotes AA (n = 10) et SS (n = 10) en fonction
de la dose d’implant
I.6. Test de cytotoxicité in vitro
Le test de cytotoxicité in vitro fait partie des tests préliminaires de biocompatibilité
des implants. En plus des fibroblastes qui sont largement utilisés dans les tests de
biocompatibilité in vitro (Ignatius A et Claes E, 1996; Vale FM et coll., 1997; Cory D et
Moran J, 1998; Tiozzo R et coll., 2003), nous avons utilisé des macrophages dans notre étude.
En effet, les macrophages font partie des principales cellules qui pourraient entrer en contact
avec les implants.
Le test de cytotoxicité peut aussi être utilisé pour évaluer le pouvoir irritant des
formulations pharmaceutiques à usage topique (Thornback-Lecoq S, 1997).
104

Chapitre IV
Les courbes de tendance de la viabilité des fibroblastes et des macrophages en
présence des implants 1 et 2 ont avoisiné la valeur de 100% de viabilité (Fig. 24-25). Il en est
de même pour le méthanol 1% (v/v) utilisé comme solvant de l’implant (Fig. 26).
Les implants 2 et 4 n’ont donc pas montré de signe de cytotoxicité vis-à-vis des fibroblastes et
des macrophages même à la plus forte concentration (37,5 µg/mL).
Les implants 1 et 2 n’auraient donc pas de pouvoir irritant lorsqu’ils seront utilisés
localement in vivo. Cette non-cytotoxicité des implants pourrait s’expliquer par la grande
biocompatibilité de la monoléine (composé majeur des implants) rapportée par certains
auteurs (Ganem-Quintanar A et coll., 2000).
Il n’y a pas eu d’interférence entre les implants et les réactifs utilisés car la densité
optique des puits contenant la solution d’implant sans cellules a été sensiblement égale à zéro.
De plus, le méthanol n’a pas influencé la viabilité des cellules aux concentrations utilisées
pour dissoudre les implants (Fig. 26). Ainsi, le méthanol de concentration faible (1% v/v)
pourrait être utilisé pour dissoudre les échantillons liposolubles lors des tests de cytotoxicité.
Viabilité cellulaire
150
100
50
0
0,000001 0,0001 0,01 1
Concentration d'implant (mg/ml)
implant 2
implant 4
courbe de tendance
(implant 2)
courbe de tendance
(implant 4)
Figure 24: Viabilité des fibroblastes V79-4 ATCC en fonction des concentrations d’implants : implant 2
(gentamicine 5%, eau 15%, monoléine 80%), implant 4 (gentamicine 10%, eau 15%, monoléine 75%).
Chaque point représente la moyenne de viabilité cellulaire dans 4 puits (Données obtenues de 3
expériences séparées).
105

Viabilité cellulaire
150
100
50
0
Chapitre IV
0,000001 0,00001 0,0001 0,001 0,01 0,1 1
Implant concentration (mg/ml)
implant 2
implant 4
courbe de tendance
(implant 2)
courbe de tendance
(implant 4)
Figure 25: Viabilité des macrophages P388D1 ATCC en fonction des concentrations d’implants. Chaque
point représente la moyenne de viabilité cellulaire dans 4 puits (Données obtenues de 3 expériences
séparées).
Viabilité cellulaire
140
120
100
80
60
40
20
0
0,000001% 0,000100% 0,010000% 1,000000%
Methanol concentration (v/v)
fibroblastes
macrophages
courbe de
tendance
Figure 26: Viabilité des fibroblastes V79-4 ATCC et des macrophages P388D1 ATCC en fonction des
concentrations de méthanol.
I.7. Test de génotoxicité in vitro
La génotoxicité des implants a été étudiée dans des conditions non cytotoxiques. Les
implants ont été utilisés aux plus fortes concentrations, qui par ailleurs sont non cytotoxiques.
106

Chapitre IV
En effet, les nucléases activées pendant la mort des cellules peut interférer avec l’action des
substances génotoxiques su l’ADN (Henderson L et coll., 1998).
Comme la distribution du pourcentage d’ADN dans la queue des comètes a été
hétérogène, des «Box Plot» ont été utilisés pour présenter les résultats. Ces «Box Plot»,
encore appelés «boîte à moustaches», représentent mieux les éventuels dommages subis par
l’ADN, plutôt que des valeurs uniques telles que la moyenne ou la médiane. Ils fournissent
des informations plus détaillées sur les dommages de l’ADN de l’ensemble des cellules
soumises au test.
La distribution des cellules selon le pourcentage d’ADN dans la queue constitue la
manière la plus basique pour visionner les données des essais comètes. Le pourcentage
d’ADN dans la queue augmente avec l’intensité de l’atteinte d’ADN.
La distribution du pourcentage d’ADN dans la queue (Tail DNA %) des cellules
exposées au méthanol et aux implants comparée à celle des cellules non exposées a été
représentée par les figures 27 et 28.
Statistiquement, il n’y a pas de différence entre les pourcentages d’ADN dans la queue
des comètes des fibroblastes traités et non traités (Tableau XXI). On pourrait dire que l’ADN
des fibroblastes non traités a été similaire à celui des fibroblastes mis en contact avec des
agents chimiques (Méthanol dilué, implant 2 et 4). Les implants testés n’ont donc pas été
génotoxiques et ne sont pas susceptibles de provoquer la formation de tumeur lorsqu’ils
seront au contact des tissus in vivo (Viala A et Botta A, 2005). 90% des comètes des
fibroblastes traités et non traités ont eu un pourcentage d’ADN dans la queue inférieur à 40.
La moyenne du pourcentage d’ADN dans la queue a été d’environ 10% pour les
macrophages traités et d’environ 15% pour les macrophages non traités. (p< 0,05 ; Tableau
XXI). En outre, l’atteinte de l’ADN des macrophages traités au méthanol dilué (solvant des
implants) est statistiquement similaire à celle des macrophages traités aux implants 1 et 2. Ces
résultats confirment la non génotoxicité des implants.
Quid du méthanol dilué (1% m/v) ? Aurait-il donc un effet protecteur du patrimoine
génétique des macrophages vu que sa moyenne du pourcentage d’ADN dans la queue est
inférieure au contrôle? Des études plus approfondies pourront nous en éclairer davantage.
107

Chapitre IV
Tableau XXI: Pourcentages d’ADN dans la queue des comètes (moyenne ± SEM) en fonction de la cellule
et du produit
Fibroblastes
V79-4
Macrophages
P388D1
Contrôle Méthanol dilué Implant 2 Implant 4
négatif (1% v/v)
14,50 ± 1,17 18,57 ± 3,040 13,44 ± 1,30 15,98 ± 1,43
15,78 ± 1,08*
Test de Kruskal-Wallis suivi du post-test de Dunn :
10,27 ± 0,77 9,191 ± 0,97 9,93 ± 0,76
* Comparaison des pourcentages d’ADN dans la queue des comètes de macrophages contrôles, de macrophages
mis en contact avec du méthanol dilué (1%), les implants 2 et 4 (P< 0,001).
Tail DNA %
80
60
40
20
0
Negative control (n=187)
Diluted methanol (n=24)
Implant 2 (n=139)
Implant 4 (n=101)
Figure 27: Box Plot des pourcentages d’ADN dans la queue des comètes (Tail DNA%) des fibroblastes
V79-4 témoins et des fibroblastes V79-4 traités avec du méthanol dilué ou avec des implants (n= nombre
de comètes analysées).
----: Moyenne des pourcentages d’ADN dans la queue des comètes (Tail DNA %).
108

Tail DNA %
70
60
50
40
30
20
10
0
Chapitre IV
Negative control (n=202)
Diluted methanol (n=181)
Implant 2 (n=130)
Implant 4 (n=189)
Figure 28: Box Plot des pourcentages d’ADN dans la queue des comètes (Tail DNA%) des macrophages
P388D1 témoins et des macrophages P388D1 traités avec du méthanol dilué ou avec des implants (n=
nombre de comètes analysées).
----: Moyenne des pourcentages d’ADN dans la queue des comètes (Tail DNA %).
CONCLUSION
Les études de biocompatibilité in vitro ont montré que les implants à base de
monoléine, d’eau et de gentamicine pourraient être sans dommages pour les cellules avec
lesquelles ils pourraient être en contact. Ces implants sont aussi très hémocompatibles;
cependant avec une plus forte sensibilité des hématies à hémoglobine AA que celles à
hémoglobine SS. Ils ne sont pas cytotoxiques et n’altèrent pas la structure de l’ADN.
Les tests in vitro ne sont pas suffisants pour éviter l’expérimentation sur l’animal
entier avant l’administration à l’homme. Après cette étape d’étude de biocompatibilité in
vitro, une étude toxicologique chez l’animal pourrait être la prochaine étape vers des essais
chez l’Homme.
109

CHAPITRE V: ETUDES TOXICOLOGIQUES PRECLINIQUES CHEZ L’ANIMAL

INTRODUCTION
Chapitre V
Les études toxicologiques précliniques des médicaments en développement offrent des
garanties de sécurité d’utilisation lors des essais chez l’homme. Elles sont même une étape
obligatoire à la réalisation des essais cliniques (Bourin M, 1993). Les études toxicologiques
réalisées chez l’animal peuvent permettre une prédiction des effets toxiques chez l’Homme
(Woodward SC, 1999).
Les études toxicologiques chez l’animal de l’implant mis au point ont porté sur les
études de toxicité générale subaiguë et de réaction tissulaire locale à l’implant. En effet, avant
d’utiliser un nouveau biomatériau comme l’implant chez l’homme, il est obligatoire d’étudier
la réaction inflammatoire que son implantation provoque chez des animaux (Woodward SC,
1999). Il est reconnu que la réaction inflammatoire peut varier selon le tissu ou l’organe
concerné (Anderson JM, 1994a). Cependant l’évaluation de l’inflammation suite à une
implantation par voie sous-cutané ou intramusculaire, permet d’anticiper la réponse qu’il
induira dans les organes parenchymateux ou autres sites spécialisés (Woodward SC, 1999).
Cette étude de la réaction du tissu hôte à l’implant a été suivie d’études de l’impact de
l’implant sur l’histologie et le fonctionnement d’organes vitaux tels que le foie et les reins.
L’impact de l’implant sur le métabolisme des triglycérides a été aussi étudié.
L’ensemble de ces études toxicologiques permet de mieux investiguer la
biocompatibilité de l’implant.
I. MATÉRIEL ET MÉTHODES
I.1. Animaux d’expérience
Quarante souris mâles de souche NMRI, pesant entre 35 et 39 g au moment de
l’implantation, ont été utilisées dans cette étude. Elles avaient entre 12 et 13 semaines de vie.
Les quarante souris ont été randomisées en 4 lots de 10. Elles ont été gardées dans une salle
dont la température variait entre 20 et 25 °C, avec une humidité relative de 50±10%. Cette
salle a été éclairée artificiellement pendant 12 heures par jour. Elles ont eu librement accès à
des granulés de blé et à l’eau de boisson. Les souris ont été stabulées dans ces conditions
pendant 10 jours avant l’expérience.
111

I.2. Procédure d’implantation
Chapitre V
Avant l’implantation, les souris ont été préalablement privées d’eau et d’aliments
pendant 12 heures. De l’eau physiologique (solution de chlorure de sodium à 0,9% m/v), de la
carraghénine à 1% m/v (Sigma chemical co, USA) comme phlogogène, de la monoléine pure,
et de l’implant 2 ont été respectivement administrés aux lots 1, 2, 3 et 4 des souris. L’implant
2 et la monoléine ont été préalablement fondus au bain-marie à 37 °C. Les produits à
administrer ont été prélevés à l’aide d’une seringue stérile puis injectés sous l’aponévrose
plantaire de l’arrière patte droite de la souris. Avant l’administration, la patte de la souris a été
désinfectée avec de l’éthanol 70%.
I.3. Monitoring clinique des souris
Les souris ont été surveillées cliniquement, et le site d’implantation quotidiennement
observé à la recherche de signes de réaction inflammatoire locale (oedème, rougeur, chaleur,
et douleur). Ces observations se sont poursuivies jusqu’à la sacrification des animaux (52
jours après l’implantation).
I.4. Evaluation de la réaction tissulaire locale
I.4.1. Evaluation de l’œdème
L’œdème susceptible d’être provoqué par l’administration sous l’aponévrose plantaire
des produits a été évalué selon le principe de la méthode de Winter et coll.(1962). Le volume
de la patte arrière droite de la souris a été mesurée avant administration sous plantaire des
produits puis à 3 heures, 6 heures, 24 heures, 48 heures, 72 heures, 6 jours, 12 jours, 19 jours,
26 jours, 35 jours et 52 jours après l’administration. Cette patte a été immergée dans une
solution de chlorure de sodium à 0,45% m/v jusqu’au niveau de la malléole et son volume
déterminée à l’aide d’un pléthysmomètre (Pléthysmomètre 7150 UGO Basile, Italy).
I.4.2. Examen histologique
Au bout de 52 jours suivant l’administration sous plantaire des produits, les souris ont
été sacrifiées. Les deux pattes arrières des souris ont été ensuite prélevées puis fixées dans une
solution de formaldéhyde à 10% m/v (Cooper, France) pendant 72 heures; la patte arrière
gauche servant de contrôle. Ces pattes ont été ensuite déshydratées dans une série de solutions
d’éthanol de concentration croissante jusqu’à l’absolu. Cette déshydratation a été faite à l’aide
d’une histokynette Leica TP1010 (Leica, Germany). Elle a été suivie d’une inclusion des
112

Chapitre V
pattes dans de la paraffine. Les blocs obtenus ont été découpés (dans un plan parallèle à la
longueur des pattes à l’aide d’un microtome Leica RM 2135 (Leica, Germany). Les coupes,
d’épaisseur de 4 µm, ont été placées sur des lames, puis colorées à l’hématéine-phloxine-
safran (HPS). Les lames ont été examinées par deux investigateurs seniors indépendants à
l’aide d’un microscope optique.
La présence de cellules inflammatoires et d’une capsule fibreuse a été recherchée. La
présence de cellules inflammatoires a été graduée comme suit: 0, absence de cellules
inflammatoires; 1, présence minimale de cellules inflammatoires; 2, présence moyenne de
cellules inflammatoires; 3, présence massive de cellules inflammatoires.
En outre, une dissection post-mortem des pattes arrières chez trois souris de chaque lot
a permis de réaliser une observation macroscopique du site d’implantation, de l’implant ou de
ce qui en reste.
I.5. Evaluation des effets rénaux et hépatiques
I.5.1. Examen macroscopique
Après sacrification des animaux au bout des 52 jours d’expérience, le foie et les reins
ont été prélevés puis fixés dans une solution de formol 10% m/v (Cooper, France). Une coupe
sagitale de ces organes a été effectuée et une observation macroscopique réalisée à la
recherche d’éventuelles lésions macroscopiques.
I.5.2. Examen histologique
Les organes ont été déshydratés, inclus dans de la paraffine, coupés puis colorés à
l’hématéine-phloxine-safran. Les lames ont été également lues par deux investigateurs seniors
indépendants. Des lésions histologiques ont été recherchées pendant cette lecture.
I.5.3. Exploration fonctionnelle
Pour explorer le fonctionnement du foie et des reins des souris après l’administration
des produits, des dosages sériques des bilirubines (bilirubine libre, bilirubine totale) et de la
créatinine ont été respectivement réalisés. Un automate de biochimie Mira Plus (ABX
Diagnostics, Suisse) a été utilisé pour ces dosages. Le sang a été recueilli sur tube sec; ceci
après exsanguination des souris au bout des 52 jours suivant l’administration des produits.
113

I.6. Effet sur le métabolisme des triglycérides
Chapitre V
Le glycérol et les acides gras étant les produits de dégradation de la monoléine
(composant majeur de l’implant fabriqué), le dosage des triglycérides sériques permettra de
vérifier leur impact sur le métabolisme des triglycérides. Le sang recueilli pour le dosage des
transaminases et de la créatinine a été aussi utilisé pour le dosage des triglycérides sériques.
L’automate de biochimie Mira Plus (ABX Diagnostics, Suisse) a été utilisé pour ce dosage.
I.7. Analyse statistique
L’analyse statistique a été réalisée en utilisant le logiciel GraphPad PRISM version
2.01 (GraphPad Software Inc., USA). Une différence a été jugée significative lorsque p< 0,05.
Après vérification de la distribution normale des données, le test de ANOVA 1 a été utilisé
pour comparer dans chaque lot les volumes des pattes des souris avant administration des
produits et après l’administration à différents temps (post-administration). Ce test a été suivi
du post-test de comparaison multiple de Dunnett (lorsque p< 0,05) pour comparer les volumes
de pattes à un temps post-administration donné versus volume des pattes avant administration.
Le même test ANOVA 1 a été aussi utilisé pour comparer les taux sériques de la créatinine,
de la bilirubine directe, de la bilirubine totale, et des triglycérides entre les lots.
RÉSULTATS ET DISCUSSIONS
I.8. Monitoring clinique des souris
Cliniquement, aucun effet adverse général n’a été observé pendant la période post-
implantation chez les souris ayant reçu l’eau physiologique, la monoléine ou l’implant.
Cependant, dans le lot de dix souris ayant reçu de la carraghénine, des morts été ont
constatées aux temps suivants: 1 mort à 6 jours, 3 morts à 12 jours, 3 morts à 19 jours et 1
mort au 52 ème jour. Il n’est donc resté que 2 souris au bout des 52 jours d’expérience dans ce
lot. La forte mortalité constatée dans le lot ayant reçu la carraghénine pourrait être due à une
infection ou à une réaction inflammatoire généralisée L’observation du site d’implantation a
révélé une augmentation du volume des pattes des souris dans les 3 heures suivant
l’administration. Cette augmentation n’a duré que 24 heures dans le lot de souris ayant reçu
l’eau physiologique. De plus, elle a été légère par rapport à celle des lots 2, 3 et 4. Pour ces
derniers, l’augmentation du volume des pattes a diminué progressivement à partir de 24
heures pour disparaître au 52 ème jour.
114

Chapitre V
La relative forte augmentation du volume des pattes dans les 24 heures suivant
l’administration de la monoléine et de l’implant serait due à une réaction inflammatoire des
tissus hôtes. Cette réaction inflammatoire a été transitoire et légère. En effet, l’œdème a
diminué progressivement après 24 heures suivant l’implantation et elle a été caractérisée par
la non perceptibilité de certains signes associés à l’inflammation (douleur, rougeur) (Cotran
RS et coll., 1994; Tizard IR, 1996).
Les souris ayant reçu de la carraghénine retiraient la patte implantée lorsqu’on exerçait
une pression mécanique croissante sur cette dernière. Les souris des lots 1, 3 et 4 n’ont
manifesté aucun signe de souffrance à la pression mécanique des pattes implantées; ceci
pendant toute la durée de l’expérience. Le non retrait des pattes implantées par la monoléine
ou l’implant pourrait témoigner de l’absence de douleur, sinon d’une douleur modérée au
niveau des sites d’implantation. Aucune rougeur particulière de la plante des pattes n’a été
observée.
Par ailleurs, aucun signe d’infection ou de nécrose n’a été observé au niveau du site
d’implantation dans tous les lots; ceci pourrait dénoter d’une bonne tolérance des tissus
vivants à la monoléine ou à l’implant.
L’étude de la toxicité d’un implant à base de monoléine chez la souris est la première
du genre. Elle a été faite chez la souris pour faciliter l’évaluation de la réaction locale. Aussi,
pour l’étude de la réaction tissulaire locale face à un implant, les souris sont mieux indiquées.
En effet, elles sont plus sensibles à une implantation que d’autres animaux (les rats) (Van
Tienhoven EA et coll., 2006).
La monoléine, reconnue comme substance non toxique et biocompatible (Rowe RC et
coll., 2003; Ganem-Quintanar A et coll., 2000), a été utilisée dans l’étude comme témoin de
substance biocompatible. La carraghénine a été utilisée comme substance phlogogène de
référence (Arya S et Kumar VL, 2005, Roach JT, Sufka KJ. Roach JT et Sufka KJ, 2003). La
dose de 0,05 mL d’implant par souris est compatible avec le volume d’implant susceptible
d’être utilisé chez l’Homme (160 mL).
I.9. Evaluation de la réaction tissulaire locale
I.9.1. Evaluation de l’œdème
Le délai d’apparition significative de l’œdème a été de 6 heures chez le lot de souris
ayant reçu de l’eau physiologique. C’est aussi, seulement à ce temps post-administration que
l’œdème a été constaté dans ce lot. Il pourrait être dû au traumatisme causé par l’aiguille lors
115

Chapitre V
de l’administration. Le délai d’apparition de l’œdème chez les lots de souris ayant reçu de la
carraghénine, de la monoléine ou l’implant a été plus précoce (3 heures). L’œdème a été
maximal à la 24 ème heure post-implantation chez les lots de souris ayant été implantées par la
monoléine ou par l’implant. L’œdème maximal a été atteint à la 3 ème heure post-
administration lorsqu’il a été provoqué par de la carraghénine (Tableau XXII, Fig. 29-32).
L’œdème provoqué par la carraghénine a disparu à la 48 ème heure post-administration.
A partir de la 24 ème heure post-implantation, l’œdème provoqué par la monoléine ou
l’implant a diminué significativement. La réaction tissulaire n’a donc duré que pendant 24
heures. L’œdème a disparu au 19 ème jour pour les souris implantées par la monoléine ou par
l’implant (Fig. 31-32). En effet, il n’y a pas eu de différence significative entre les volumes
des pattes à partir du 19 ème jour post-implantation et les volumes de pattes avant implantation.
On pourrait alors dire que l’un des signes de l’inflammation (l’œdème) provoqué par
la monoléine ou l’implant a été aigu. La réaction tissulaire observée avec les deux produits
ont correspondu avec l’une des phases principales de réaction inflammatoire à corps étranger
qui se développe à la suite de l’implantation d’un dispositif biocompatible (Anderson, 1994a
et 1994b; Cotran RS et coll., 1994; Woodward SC, 1999):
- La phase aiguë se caractérise par un exsudat tissulaire et une accumulation de
polynucléaires. Cette phase se déroule essentiellement au cours de la première
semaine après l’implantation.
- La phase subaiguë se caractérise par une accumulation progressive de
macrophages et une prolifération de fibroblastes et de cellules endothéliales.
Cette phase se déroule principalement au cours de la deuxième semaine qui suit
l’implantation.
- La phase chronique se caractérise généralement par une dégradation de l’implant
avec la présence de macrophages et/ou de cellules géantes multinucléées.
De résultats similaires ont été rapportés par d’autres travaux sur des implants
biodégradables. Le polymère poly (acide sébacique-co-acide ricinoléique) en administration
sous-cutané a provoqué une inflammation mineure chez la souris une semaine après
l’administration. Cette inflammation a disparu au bout de trois semaines après
l’administration (Shikanov A et coll., 2004).
Bien que l’œdème provoqué par la monoléine ou l’implant ait disparu au 19 ème jour
post-implantation, les volumes des pattes aux 26 ème et 35 ème jour post-implantation
(respectivement pour l’implant et la monoléine) sont restés globalement supérieurs aux
volumes pré-implantation. Cette légère augmentation serait due au volume occupé par la
116

Chapitre V
monoléine ou l’implant non encore dégradé. La valeur de la différence de volume (0,04-0,05
mL, soit l volume de produit injecté) a été en faveur de cette hypothèse (Tableau XXII). La
dégradation de la monoléine ou de l’implant a été donc presque totale au 52 ème jour post-
implantation sous l’aponévrose plantaire des souris.
Tableau XXII: Volume des pattes (mL) des souris avant et après administration de 0,05 mL de produits
sous l’aponévrose plantaire.
Temps post-administration
* n = 9
Avant
implantation
3 heures
6 heures 0,19 ± 0,02 (a)
24 heures
Volume des pattes (moyenne ± SD, n = 10) des souris ayant
reçu :
Eau
physiologique
Carraghénine Monoléine Implant
0,16 ± 0,01 0,15 ± 0,02 0,16 ± 0,02 0,17 ± 0,02
0,17 ± 0,01 0,22 ± 0,03 (b)
0,25 ± 0,06 (a)
0,23 ± 0,03 (a)
0,22 ± 0,03 (b) 0,30 ± 0,08 (b) 0,29 ± 0,04 (b)
0,16 ± 0,01 0,20 ± 0,02 (a) 0,35 ± 0.1 (b) 0,35 ± 0,06 (b)
48 heures 0,16 ± 0,01 0,18 ± 0,04 0,31 ± 0,08 (b) 0,33 ± 0,06 (b)
72 heures
6 jours 0,16 ± 0,01
0,16 ± 0,02 0,19 ± 0,03 0,30 ± 0,08 (b) 0,31 ± 0,06 (b)
0,16 ± 0,03 * 0,33 ± 0,06 (b) 0,31 ± 0,07 (b)
12 jours 0,17 ± 0,02 - 0,32 ± 0,07 (b) 0,30 ± 0,08 (b)
19 jours
26 jours
35 jours 0,16 ± 0,02
52 jours 0,16 ± 0,02
0,17 ± 0,02 - 0,25 ± 0,06 0,22 ± 0,05
0,18 ± 0,03 - 0,24 ± 0,03 0,22 ± 0,03
Test de ANOVA 1 suivi du test de comparaison multiple de Dunnett :
- 0,20 ± 0,01 0,18 ± 0,02
- 0,18 ± 0,01 0,17 ± 0,02
(a) : Volume des pattes après administration du produit versus volume des pattes avant administration (p<
0,05).
(b) : Volume des pattes après administration du produit versus volume des pattes avant administration (p<
0,01).
117

Volume de la patte (mL)
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
Avant adm.
3 H
6 H
(a)
24 H
48 H
72 H
6 J
12 J
Temps écoulé après admnistration (sous l'aponévrose plantaire)
d'eau physiologique
19 J
26 J
35 J
52 J
Chapitre V
Figure 29: Box Plot de l’évolution du volume des pattes de souris ayant reçu 0,05 mL d’eau physiologique
en fonction du temps (n = 10)
Avant adm.: Avant administration
ANOVA 1 suivi du test de comparaison multiple de Dunnett :
(a): Volume des pattes après administration d’eau physiologique versus volume des pattes avant administration (p< 0,05).
Volume de la patte (mL)
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
Moyenne du volume des pattes
Avant adm.
3 H
(b) (b)
6 H
24 H
(a)
Temps écoulé après administration (sous l'apnévrose plantaire)
de carraghénine
48 H
72 H
6 J
Figure 30: Box Plot de l’évolution du volume des pattes de souris ayant reçu 0,05 mL de carraghénine en
fonction du temps (n = 10)
Moyenne du volume des pattes
Test ANOVA 1 suivi du test de comparaison multiple de Dunnett:
(a) : Volume des pattes après administration de carraghénine versus volume des pattes avant administration (p< 0,05).
(b) : Volume des pattes après administration de carraghénine versus volume des pattes avant administration (p< 0,01).
12 J
118

Volume de la patte (mL)
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
Avant adm.
3 H
(a)
(b)
6 H
24 H
(b)
48 H
(b) (b)
(b) (b)
72 H
6 J
12 J
Chapitre V
Temps écoulé après administration (sous l'aponévrose plantaire)
de monoléine
19 J
26 J
35 J
52 J
Figure 31: Box Plot de l’évolution du volume des pattes de souris ayant reçu 0,05 mL de monoléine en
fonction du temps (n = 10)
Test ANOVA 1 suivi du test de comparaison multiple de Dunnett :
Volume de la patte (mL)
(a): Volume des pattes après administration de la monoléine versus volume des pattes avant administration (p< 0,05).
(b): p< 0,01
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
Moyenne du volume des pattes
Avant adm.
3 H
(a)
(b)
6 H
24 H
(b)
48 H
(b)
72 H
(b) (b)
(b)
6 J
12 J
Temps écoulé après admnistration (sous l'aponévrose plantaire)
d'implant
19 J
26 J
35 J
Figure 32: Box Plot de l’évolution du volume des pattes de souris ayant reçu 0,05 mL d’implant en
fonction du temps (n = 10)
Test ANOVA 1 suivi du test de comparaison multiple de Dunnett :
(a): Volume des pattes après administration de la monoléine versus volume des pattes avant administration (p< 0,05).
(b): p

I.9.2. Examen histologique
Chapitre V
Après dissection des sites d’implantation de l’implant 2 ou de la monoléine au
bout des 52 jours d’expérience, l’implant ou la monoléine sous forme semi-solide n’a pas été
retrouvé. Cependant, les tissus avoisinants le site d’implantation ont été enduits d’un liquide
visqueux. Ce dernier n’a pas été observé au niveau des sites ayant reçu de l’eau physiologique
ou de la carraghénine.
Aucune capsule fibreuse n’a été observée au niveau du site d’implantation.
Histologiquement, les réponses tissulaires à la monoléine, à l’implant et à l’eau
physiologique ont été identiques. Les tissus ayant été en contact avec les produits n’ont pas
été infiltrés par des cellules de réaction tissulaire telles que les polynucléaires, les
macrophages, les cellules géantes multinucléées, les lymphocytes. L’architecture des tissus
avoisinants est normale et aucune capsule fibreuse ne s’est formée au niveau des sites
d’implantation (Fig. 33).
(A)
(B)
(C)
a
a
a
Figure 33. (A): microscopie optique d’aponévrose plantaire de souris ayant reçu de l’eau physiologique
(a), de la monoléine (b), et de l’implant (c) sous l’aponévrose plantaire.
(B): microscopie optique de rein de souris ayant reçu de l’eau physiologique (a), de la
monoléine (b), et de l’implant (c) sous l’aponévrose plantaire.
(C): microscopie optique de foie de souris ayant reçu de l’eau physiologique (a), de la monoléine
(b), et de l’implant (c) sous l’aponévrose plantaire.
Coloration à l’hématéine-phloxine-safran; Grossissement x100.
b c
b c
b c
120

Chapitre V
L’étude histologique des sites d’implantation a confirmé qu’une éventuelle réaction
inflammatoire face à la monoléine ou à l’implant ne serait que transitoire. En effet, à 52 jours
post-implantation, les coupes histologiques n’ont pas révélé de signes d’inflammation
chronique tels que la présence de macrophages, de lymphocytes, de plasmocytes, ou de
capsule fibreuse (Anderson JM, 1994a).
I.10. Evaluation des effets rénaux et hépatiques
La morphologie normale des reins a été préservée. L’architecture histologique des
reins des souris ayant reçu de l’eau physiologique était similaire à celle des lots de souris
ayant reçu de la monoléine ou l’implant. Les coupes histologiques ont révélé que les
glomérules, les bordures en brosse des tubes étaient normales. En outre, les tubes n’étaient
pas dilatés et aucun matériel n’y était perceptible. L’épithélium était non nécrosé. Les tissus
du rein n’étaient pas infiltrés par des cellules de l’inflammation (Fig.33).
La morphologie et l’architecture du foie des souris étaient identiques et pour le lot
témoin et pour les lots ayant reçu de la monoléine ou l’implant. La morphologie des
hépatocytes était normale et aucun signe de nécrose n’était perceptible. Les foies n’étaient pas
infiltrés par des cellules de l’inflammation (Fig. 33).
Tableau XXIII:Concentrations sériques (moyenne ± S.D, n = 10) en substances endogènes pour les lots de
souris ayant reçu de l’eau physiologique, de la monoléine et l’implant 2 en administration sous-plantaire
(52 jours après administration).
Lots de souris ayant reçu en administration sous-plantaire:
Eau physiologique monoléine Implant 2
Créatinine (µmole/L) 37,20 ± 1,28 39,60 ±1,17 39,00 ± 1,00
Bilirubine directe
(µmole/L)
Bilirubine totale
(µmole/L)
Triglycérides
(mmole/L)
Test de ANOVA 1 pour chaque substance : p> 0,05.
4,14 ± 0,31 3,96 ± 0,24 3,98 ± 0,46
21,30 ± 0,94 22,20 ± 0,92 22,50 ± 0,81
2,36 ± 0,06 2,32 ± 0,11 2,43 ± 0,06
121

C o n c e n t r a t i o n s é r i q u e
( µ m o l e / L )
50
40
30
20
10
0
Créatinine Bilirubine directe Bilirubine totale
Substance dosée
Chapitre V
Lot de souris ayant reçu de l'eau physiologique
Lot de souris ayant reçu de la monoléine
Lot de souris ayant reçu l'implant 2
Figure 34: Diagrammes des concentrations sériques (moyenne ± S.D, n = 10) en créatinine, en bilirubine
directe et en bilirubine totale chez les lots de souris ayant reçu respectivement 0,5 mL d’eau
physiologique, de monoléine et d’implant 2.
Test de ANOVA 1: p> 0,05 pour chaque substance endogène.
La gentamicine, l’antibiotique contenu dans l’implant, est connue comme substance à
potentiel néphrotoxique (Adam A et coll., 2003). La néphrotoxicité induite par la gentamicine
est caractérisée une nécrose du tube contourné proximal et une perte des bordures en brosse
des tubes rénaux (Whiting PH et Bown PA, 1996; Fashola TO et coll., 2000). L’absence de
ces signes (Fig. 33-34) suite à l’administration de la monoléine et de l’implant suggère que
ces derniers n’ont pas été néphrotoxiques aux doses utilisées.
Les taux sériques de créatinine chez les souris ayant reçu la monoléine ou l’implant
ont été statistiquement identiques à ceux mesurés chez les souris ayant reçu de l’eau
physiologique (Tableau XXIII, Fig. 34). La monoléine et l’implant n’ont donc pas provoqué
d’atteintes rénales aux doses utilisées, confirmant ainsi les résultats obtenus lors de l’étude
histologique des reins. La gentamicine, néphrotoxique à forte dose ou en utilisation prolongée
a probablement été libérée localement; Elle se trouverait donc dans le plasma à des
concentrations non toxiques.
Le taux sérique de la bilirubine totale augmente en cas d’atteintes hépatocellulaires
(hépatites infectieuses, hépatites toxiques ou alcooliques, néoplasie), d’obstruction des voies
biliaires intra et extra-hépatiques, et d’hémolyses intra et extravasculaires. L’augmentation de
122

Chapitre V
la bilirubine libre est manifeste en cas d’hémolyse. Des médicaments comme la
carbamazépine, la pénicilline, les contraceptifs oraux sont susceptibles de provoquer une
cholestase. D’autres substances sont connues pour provoquer des dommages hépatocellulaires
(paracétamol, allopurinol, isoniazide, éthanol…).
Les taux sériques de bilirubine libre et de bilirubine totale chez les souris ayant reçu la
monoléine ou l’implant en administration sous l’aponévrose plantaire sont similaires à ceux
des souris ayant reçu de l’eau physiologique (Tableau XXIII et Fig. 34). Aux doses utilisées,
on pourrait dire que la monoléine et l’implant à base de gentamicine et de monoléine n’a
entraîné ni hémolyses, ni cholestase, ni atteintes hépatocellulaires chez les souris; ceci après
52 jours d’implantation. L’étude histologique du foie des souris a confirmé l’absence de
dommages hépatiques consécutifs à l’administration de la monoléine ou de l’implant.
La dégradation de la monoléine ou de l’implant, et la libération de la gentamicine au
bout des 52 jours d’implantation n’ont pas perturbé le fonctionnement des reins et du foie. La
monoléine et l’implant pourraient être donc considérés comme substances non néphrotoxiques
et non hépatotoxiques aux doses susceptibles d’être utilisées chez l’Homme.
I.11. Effet sur le métabolisme des triglycérides
Dans le milieu biologique, la monoléine (ou mono-oléate de glycéryle) peut
s’hydrolyser en glycérol et en acide oléique sous l’action d’estérases (Ganem-Quintanar A et
coll., 2000). Cette hydrolyse pourrait constituer un apport supplémentaire en glycérol et en
acide oléique (ou autres acides gras) à l’organisme. Ces métabolites pourraient influencer le
métabolisme des triglycérides dans l’organisme. En effet, les triglycérides résultent de
l'estérification des fonctions alcool du glycérol par des molécules d'acides gras. Les
hypertriglycéridémies sévères, rares, présentent un risque de pancréatite aiguë et nécessitent
une intervention rapide. De nombreuses enquêtes épidémiologiques ont montré qu'elles sont
associées à des pathologies cardiovasculaires (Castelli WP, 1986; Cambien F et coll., 1986;
Parra HJ et Coll., 1992). Elles s'accompagnent également de perturbations de paramètres de
l'hémostase (hyperagrégabilité plaquettaire, augmentation du facteur VII, et de l'inhibiteur de
l'activateur du plasminogène de type I) favorisant la survenue de thromboses (Hamsten A,
1990). Il a été donc nécessaire d’étudier l’impact de l’implant (dont le composant majeur est
la monoléine) sur le taux de triglycérides sériques.
La monoléine et l’implant n’ont pas modifié le métabolisme des triglycérides. La
triglycéridémie chez les souris ayant reçu la monoléine ou l’implant a été statistiquement
identique à celle ayant reçu de l’eau physiologique (tableau XXIII et Fig. 35).
123

Chapitre V
Aussi, le taux de glycérol total dans le plasma n’a pas été modifié par l’implantation
de la monoléine ou de l’implant chez la souris. En effet, la méthode de dosage des
triglycérides a été basée sur le dosage du glycérol libéré par hydrolyse des triglycérides.
Ainsi, c’est le glycérol total incluant le glycérol libre qui a été dosé.
Concentration sérique
(mmole/L)
3
2
1
0
Triglycérides
Lot de souris ayant reçu de l'eau physiologique
Lot de souris ayant reçu de la monoléine
Lotde souris ayant reçu l'implant 2
Figure 35 : Diagrammes des concentrations sériques (moyenne ± SD, n = 10) en triglycérides chez les lots
de souris ayant reçu respectivement 0,5 mL d’eau physiologique, de monoléine et d’implant 2.
CONCLUSION
Test de ANOVA 1 : p> 0,05.
Pour la première fois, la monoléine et un implant à base de monoléine et de
gentamicine ont fait l’objet d’études toxicologiques après implantation in vivo chez l’animal.
Des résultats issus de cette étude, nous pouvons conclure que la monoléine et l’implant ont été
bien tolérés par la souris lorsqu’ils ont été implantés sous l’aponévrose plantaire. Ils se sont
révélés aussi dégradables in vivo.
L’implantation n’a provoqué aucune mortalité ou changement de comportement chez
les souris. L’inflammation consécutive à l’implantation a été localisée, modérée et aiguë.
L’histologie et le fonctionnement d’organes vitaux comme le foie et les reins n’ont pas été
affectés par l’implantation de la monoléine ou de l’implant. Bien que les métabolites de la
monoléine soient susceptibles d’être utilisés pour la synthèse de triglycérides, le taux sérique
de ces dernières n’a pas été modifié.
124

Chapitre V
Cette étude chez l’animal offre plus de garantie d’innocuité pour envisager une étude
de tolérance et d’efficacité cliniques de l’implant dans le traitement des ostéomyélites
chroniques.
125

CHAPITRE VI: ETUDE D’EFFICACITE ET DE TOLERANCE CLINIQUES

INTRODUCTION
Chapitre VI
Un essai clinique est une expérimentation dont l’objectif principal est d’estimer l’effet
d’un traitement de façon précise et valide chez des êtres humains. Chronologiquement, il se
déroule après les études pharmacologiques et toxicologiques expérimentales chez l’animal.
L’essai clinique comprend quatre phases:
La phase I, qui correspond au premier essai du nouveau médicament chez l’homme
sain. Elle vise à déterminer la dose maximale tolérée et à réaliser des études
pharmacocinétiques.
La phase II, qui consiste à étudier la tolérance et l'efficacité d’un nouveau médicament
chez des malades semblables à ceux chez qui le médicament serait destiné. Le nombre de
patients soumis à cette phase de l’essai clinique est restreint.
La phase III, correspond à une étude qui vise à tester l'efficacité du nouveau traitement
par rapport à celle du meilleur traitement connu, c'est-à-dire le traitement de référence.
Enfin, la phase IV ou Post- Autorisation de Mise sur le Marché (Post-AMM) vise à
affiner la connaissance du médicament et à définir éventuellement de nouvelles indications
(Bouvenot G et Vray M., 1999).
Pour des raisons éthiques, nous avons commencé les essais cliniques par une étude de
tolérance et d’efficacité de l’implant à base de monoléine chez un nombre restreint de patients
souffrant d’ostéomyélites chroniques. Chez l’être humain, il n’est pas question de mettre
largement à disposition un nouveau médicament sans connaître suffisamment les avantages et
les inconvénients de son administration.
I. PROTOCOLE EXPERIMENTAL
L’essai clinique a été mené au Service de Traumatologie/Orthopédie du Centre
Hospitalier Universitaire Yalgado OUEDRAOGO de Ouagadougou (Burkina Faso). Il s’est
déroulé sur 12 mois (juillet 2006 à juillet 2007). Des critères ont été fixés pour le recrutement
des patients devant être soumis à l’essai clinique. Au total, 19 patients ont été inclus dans
l’étude.
127

I.1. Critères d’inclusion des patients
Chapitre VI
Ont été inclus dans l’essai clinique, des sujets des deux sexes âgés de 5 à 50 ans
atteints d’ostéomyélites chroniques dont le(s) germe(s) responsable(s) identifiés à partir d'un
prélèvement au(x) sites de l'infection est (sont) sensible (s) à la gentamicine. Les
ostéomyélites chroniques ont été diagnostiquées à la suite d’examens cliniques et
radiologiques. Les patients atteints du VIH (Virus d’Immuno-déficience Humaine), de
diabète, ou de toute autre pathologie susceptible d'induire des difficultés d’interprétation des
résultats ont été exclus de l’essai clinique. Sont également exclus, les patients répondant aux
critères suivants: ostéomyélites dont un curetage entraînerait une fracture, grossesse ou
allaitement, présence d'antécédents pathologiques rénaux, existence d'antécédents cochléaires
ou vestibulaires, existence d'antécédents allergiques aux aminosides, refus ou impossibilité de
respecter le protocole, arrêt du traitement au cours de l’étude. Toute antibiothérapie en cours a
été arrêtée pendant au moins 7 jours avant le début du traitement à instaurer.
Tous les patients présentant une ostéomyélite des os longs ont été classés selon la
classification de Cierny-Mader (Cierny G et Mader JT, 1984; Cierny G et coll., 1985). Cette
classification est basée sur le type anatomique de l’ostéomyélite et sur la classe physiologique
de l’hôte. Les types anatomiques sont: type1, médullaire; type 2, superficiel; type 3, localisé;
et type 4, diffus. Les classes physiologiques de l’hôte on été définies en classes A, Bs, BL, et
en C. La classe A regroupe les patients ayant leurs capacités physiologiques, métaboliques et
immnologiques; la classe Bs regroupe les patients présentant des facteurs systémiques
compromettants; la classe BL regroupe les patients présentant des facteurs locaux
compromettants; la classe C regroupe les patients chez qui, un traitement serait plus morbide
que la maladie elle-même. Les facteurs systémiques des ostéomyélites chroniques sont entre
autres la malnutrition, les âges extrêmes, l’immuno-déficience, l’insuffisance respiratoire, le
diabète. Les lymphoedèmes, les stases veineuses, les artérites sont des facteurs locaux
pouvant compromettre le traitement des ostéomyélites.
En utilisant le système de classification de Cierny-Mader, l’état clinique des patients
pourraient être déterminé en combinant les types anatomiques et les classes physiologiques de
l’hôte.
Un bilan pré-thérapeutique a été réalisé chez chaque patient inclus dans l’essai.
128

I.2. Bilan pré-thérapeutique
I.2.1. Bilan clinique
Chapitre VI
Ce bilan comporte les informations suivantes:
- le siège de l’infection ;
- l’ostéomyélite fermée avec douleur, ou avec cicatrices de traitement antérieur;
- présence de fistule;
- fistule avec ou sans écoulement;
- mise à nu d'un segment osseux;
- fracture pathologique associée;
- mobilité des articulations avoisinantes (limitée, normale, ankylosée);
- état général.
I.2.2. Bilan radiologique
Des radiographies face et profile du siège de l’ostéomyélite ont été réalisées chez
chaque patient inclus. De ces radiographies, la présence ou l’absence d’images radiologiques
suivantes a été décrite: lacune, séquestre, perte de substance osseuse, déminéralisation
segmentaire plus ou moins étendue, autres images.
I.2.3. Bilan biologique
Les examens biologiques suivants ont été réalisés chez les patients à jeun:
- une Numération Formule Sanguine (NFS);
- une Vitesse de Sédimentation (VS);
- l’électrophorèse de l’hémoglobine;
- le taux d’alanine-aminotransférase (ALAT) sérique;
- le taux d’aspartate amino-transférase (ASAT) sérique;
- la bilirubinémie directe (glycuroconjuguée);
- la bilirubinémie totale;
- la triglycéridémie.
En outre, en cas de présence de fistule, un prélèvement au niveau de la plaie a été
effectué en vue de réaliser une étude cytobactériologique associée à un antibiogramme.
129

I.3. Traitement reçu
Chapitre VI
Les patients inclus dans l’étude ont été soumis au protocole thérapeutique suivant:
Une anesthésie générale des patients à l’halothane a été réalisée au cours de
l’intervention chirurgicale.
Après incision des parties molles du site infecté, l’os infecté a été mis à nu. Le pus
localisé au niveau de cet os a été prélevé pour une étude cyto-bactériologique associée à un
antibiogramme. Les tissus nécrosés ont été excisés et l’os trépané. Les séquestres osseux mis
à nu ont été réséqués et la cavité médullaire curetée. Cette cavité a été ensuite lavée au sérum
salé injectable (Solution de chlorure de sodium 0,9%). Elle a enfin été comblée par l’implant
2 composé de monoléine 80%, d’eau 15%, et de sulfate de gentamicine 5%. Un drain a été
placé et la plaie d’incision a été fermée plan par plan (Fig. 36). Un pansement compressif à la
BETADINE ® dermique (Solution de Polyvidone iodée 10%).
Les patients ont été soumis à une antibiothérapie par voie intraveineuse pendant 3
jours selon la posologie suivante:
Adulte: gentamicine 160 mg en administration unique; LINCOCINE ® (ampoule de
lincomycine injectable 600 mg) en perfusion à la dose de 600 mg toutes les 12 heures. Aussi,
pendant ces 3 jours, ils ont reçu du PERFALGAN ® (Paracétamol 1 g) en perfusion à la dose
de 1 g toutes les 8 heures.
Enfants : gentamicine 80 mg en administration unique; LINCOCINE ® (ampoule de
lincomycine injectable 600 mg) en perfusion à la dose de 300 mg toutes les 12 heures.
Concomitamment, ils ont reçu du PERFALGAN ® (en perfusion à la dose de 15 mg/kg toutes
les 8 heures pendant 3 jours).
Un pansement compressif à la BETADINE ® dermique a été effectué tous les 3 jours
jusqu’à la cicatrisation de la plaie. Le drain placé au cours de l’intervention a été retiré dès
tarissement de la perte de sang.
130

(a)
Chapitre VI
Figure 36: Séquestrectomie (a), curetage (b), comblement de la cavité osseuse par un implant (c), et suture
de la plaie chirurgicale (d).
I.4. Suivi des patients traités
Des clichés radiographiques face et profile de la zone traitée ont été réalisés
immédiatement après l’intervention chirurgicale, au 45 ème jour, à 3, 6 et à 12 mois suivant
l’intervention.
Pendant les 3 semaines suivant l’intervention chirurgicale, un examen clinique
quotidien général et local a été réalisé en vue de rechercher d’éventuels signes de guérison ou
de complications précoces. L’examen clinique a été poursuivi au 45 ème jour, à 3, 6 et 12 mois
suivant l’intervention chirurgicale. Les examens biologiques suivants ont été réalisés chez les
patients aux 5 ème et 45 ème jour, et à 3 mois, 6 mois et 12 mois après l’intervention: Numération
Formule Sanguine (NFS), une Vitesse de Sédimentation (VS), le taux d’alanine-
(b)
(c) (d)
Séquestre osseux
Implant (sous forme de gel)
131

Chapitre VI
aminotransférase (ALAT) sérique, taux d’aspartate amino-transférase (ASAT) sérique, la
bilirubinémie directe (glycuroconjuguée), la bilirubinémie totale, la triglycéridémie.
Un prélèvement pour étude cyto-bactériologique associée à un antibiogramme a été
toujours réalisé en cas de présence d’exsudat au niveau de la plaie d’incision.
I.5. Critères d’efficacité et de tolérance du traitement
radiologiques.
Les critères d’efficacité du traitement instauré ont été cliniques, biologiques, et
Les critères cliniques d’efficacité ont été: l’absence d’épisodes septicémiques
(température élevée, pouls accéléré), d’écoulement nécessitant un antibiogramme, et
d’oedème douloureux en regard de la zone traitée.
Une guérison a été caractérisée biologiquement par une normalisation de la
leucocytose et de la vitesse de sédimentation.
La présence de signes de reconstruction osseuse et l’absence d’atteintes osseuses
secondaires à la radiographie ont constitué des signes radiologiques en faveur d’une évolution
favorable de l’ostéomyélite chronique.
La confrontation de ces différents éléments a permis de définir:
- les échecs: persistance de l'écoulement, des signes infectieux (épisodes
septicémiques), présence d'une hyperleucocytose et de signes d'atteintes osseuses.
- les bons résultats: absence de signes cliniques d'infection mais douleurs
épisodiques, leucocytose dans les limites de la normale, VS modérément accélérée.
- les excellents résultats: disparition totale des signes cliniques, biologiques et
radiologiques de l'ostéomyélite chronique.
Les signes d’intolérance au traitement à rechercher ont été:
- les signes cliniques d'insuffisance rénale: oligurie ou anurie ;
- les signes d'atteintes cochléo-vestibulaires: baisse de l'acuité auditive, vertiges;
- les réactions allergiques: urticaires, rush cutané;
- des irritations au niveau du siège de l’intervention chirurgicale;
- des valeurs anormalement basses ou élevées de la créatininémie, de la
bilirubinémie, des taux de triglycérides, d’ALAT, et d’ASAT.
Toute autre réaction d’intolérance a été notifiée.
132

I.6. Considérations éthiques
Chapitre VI
L’étude a été mise en route après un avis favorable du Comité d’Ethique pour la
Recherche en Santé (CERS) du Burkina Faso (2006/016/CERS/BF du 26/05/2006).Un
formulaire de consentement libre et éclairé (cf. annexes) a été signé par le patient ou par son
représentant légal (s’il est mineur) avant toute participation à l’essai.
RÉSULTATS
I.7. Efficacité du traitement
Une description préalable du profil des patients traités est nécessaire pour juger de
l’efficacité du traitement.
Au total, 19 patients (dont l’ostéomyélite chronique a été objectivée par les images
radiologiques et les signes cliniques) ont été inclus dans l’étude. Seize de ces patients étaient
de sexe masculin. L’âge des patients se situait entre 6 et 50 ans, avec une médiane de 24 ans
(Tableau XXIV). Ils étaient tous apyrétiques. Dix patients appartenaient au type 3 classe A, et
les 3 autres au type 3 classe Bs selon la classification de Cierny-Mader. Deux de ces trois
patients avaient une hémoglobinose AC, et le troisième une hémoglobinose SC. Une
fistulisation du foyer infectieux accompagnée d’écoulement de pus a été constatée chez 12
patients. Le segment osseux était à nu chez un des patients. Avant leur inclusion dans l’étude,
tous les patients avaient bénéficié sans succès d’une antibiothérapie par voie parentérale ou
orale, et de pansement. Trois patients avaient associé à ce traitement, une utilisation topique
d’extraits de plantes médicinales traditionnelles du Burkina Faso. Tous les patients ne
présentaient aucune autre pathologie. L’histoire de l’ostéomyélite chronique chez les patients
remonterait entre 2 et 11 ans (avec une médiane de 5 ans).
Tous les germes isolés étaient sensibles in vitro à la gentamicine. La leucocytose sanguine
était normale chez tous les patients sauf chez un patient où elle était de 12000/mm 3 . Les taux
d’hémoglobine variaient de 9,5 à 13,5 g/dL avec une moyenne de 11,7 g/dL. Par ailleurs, les
taux sériques de bilirubines (bilirubine directe et bilirubine totale), de triglycérides, de
transaminases (ASAT et ALAT), de cholestérol, et de créatinine étaient normaux chez tous
les patients. Les vitesses de sédimentation des globules à la première et à la deuxième heure
étaient respectivement supérieures à 7 mm (15 à 52 mm) et 13 mm (20 à 90 mm). Les clichés
radiographiques montraient la présence de séquestres osseux chez tous les patients (Fig. 38).
133

Chapitre VI
Les doses d’implant (quantité d’implant nécessaire pour combler les cavités osseuses
curetées) chez les patients adultes (plus de 14 ans) ont varié de 30 à 110 g (avec une moyenne
50 g) tandis que celles des enfants ont été de 30 et 70 g.
Après l’instauration du traitement, l'état local est redevenu non inflammatoire dans un
délai de 8 jours. Les drains ont été supprimés au 3 ème jour du fait du tarissement de la perte de
sang. Au demeurant, la perte de sang post-opératoire n’a jamais excédé 15 cL. Les patients
sont restés tous apyrétiques sauf une patiente de 22 ans où une fièvre de 39 °C a été
enregistrée au 4 ème jour de l’intervention. Cette fièvre a cédé à l’administration de
médicament antipaludéen (Quinine sulfate 500 mg comprimé à la posologie d’un comprimé
par prise, 3 fois par jour). Entre le 6 ème et le 12 ème jour suivant l’intervention, un léger
écoulement, non purulent au niveau de la plaie opératoire des patients a été observé. Des
études cyto-bactériologiques de cet écoulement ont montré que ce dernier était stérile. Les
plaies opératoires se sont cicatrisées entre 30 jours et 70 jours (avec une médiane de 42
jours)(Fig. 37), exception faite de la plaie du patient dont le segment osseux était à nu.
Les vitesses de sédimentation chez tous les patients se sont normalisées lors du suivi
biologique au 45 ème jour de l’intervention.
Les images radiographiques post-intervention ont montré que la séquestrectomie a été
complète chez tous les patients (Fig. 38).
134

Chapitre VI
Tableau XXIV: Résultats du traitement de 19 patients soufrant d’ostéomyélite chronique par un implant
biodégradable à base de gentamicine et de monoléine.
Age des
patients
(ans)
Site (s) de
l’infection
Germe(s) isolé(s) Durée
de la
maladie
Durée
du
suivi
Résultats
(échec, Bon,
Excellent)
(ans) (mois)
22 Ulna Escherichia coli 3 12 Excellent
31 Ulna Escherichia coli 11 12 Excellent
24 Tibia Salmonella sp 5 11 Excellent
18 Ulna Proteus mirabilis 4 11 Excellent
6 Fibula Staphylococcus aureus 3 11 Excellent
23 Tibia Proteus mirabilis 3 10 Excellent
5 Radius Staphylococcus aureus 2 10 Excellent
Tibia Staphylococcus aureus 2 10 Excellent
27 Humérus Staphylococcus aureus 2 10 Excellent
50 Tibia Staphylococcus aureus 7 10 Bon
23 Tibia Escherichia coli 5 9 Excellent
26 Fémur Staphylococcus aureus 3 9 Excellent
31 Fémur Staphylococcus aureus 6 9 Excellent
17 Fémur Staphylococcus aureus 3 8 Excellent
26 Tibia Salmonella sp. 5 4 Excellent
18 Humérus Proteus mirabilis 4 4 Excellent
22 Fémur Pseudomonas
aeruginosa
6 3 Excellent
30 Tibia Proteus mirabilis 8 3 Excellent
20 Tibia Escherichia coli 7 2 Excellent
46 Crâne Staphylococcus aureus 6 2 Excellent
Médiane 24 5 10
(a) (b)
Figure 37: Ostéomyélite chronique de l'avant bras avant traitement (a) et 35 jours après le début du
traitement.
135

I.8. Tolérance au traitement
Chapitre VI
Au niveau du siège de l’intervention, aucune irritation n’a été signalée par les patients
au bout d’un suivi de 2 à 12 mois. De plus aucune réaction inflammatoire notoire n’a été
observée. Les patients n’ont pas développé de signes de réactions allergiques. Aucun signe
d’atteintes cochléo-vestibulaires (vertiges, baisse d’acuité auditive, voire surdité) n’a été
signalé par les patients. La diurèse est restée normale. Aucune complication n’a été observée.
Les taux sériques de créatinine, de bilirubine totale, de bilirubine glycuroconjuguée, de
triglycérides et de transaminases sont restés normaux. Les taux sanguins d’hémoglobine ont
légèrement chuté (de 9,5-13,5 g/dL à 8,5-12,2 g/dL) lors des examens biologiques au 5 ème jour
de l’intervention. Cette chute n’a pas nécessité de transfusion sanguine. Les taux
d’hémoglobine aux 45 ème et 90 ème jour de l’intervention ont été de 11,5 à 13,7 g/dL. Au 6 ème
mois, ils ont été de 12 à 13,5 g/dL.
Par ailleurs, aucun signe de lésions osseuses n’a été objectivé par la radiographie.
Figure 38: Radiographie d’une fibula avant (a) et après intervention chirurgicale.
DISCUSSIONS
Séquestre
I.9. Efficacité du traitement
(a) (b)
La double antibiothérapie (par voie parentérale) pendant 72 heures suivant
l’intervention a eu pour but de prévenir toute septicémie qui pourrait partir du foyer infectieux
136

Chapitre VI
dès les premières heures de l’intervention. Le relais pourrait ensuite être assuré par la
gentamicine libérée par l’implant. Une antibiothérapie par voie parentérale de courte durée (5
à 7 jours) a aussi été réalisée par d’autres auteurs lors du traitement des ostéomyélites
chroniques avec des systèmes à libération locale et prolongée d’antibiotiques (Méani E et
Romano C, 1994).
Le comblement de la cavité osseuse (laissée par le curetage) par l’implant a empêché
non seulement une hémorragie post-opératoire mais aussi la formation d’hématome au niveau
du site d’intervention. Ceci est l’un des avantages de l’implant étudié. En effet, la probabilité
d’une réinfestation de l’os est d’autant plus grande que la cavité laissée par une
séquestrectomie n’est pas comblée (Rowling DE, 1959; Hall BB et coll., 1983; Fitzgerald RH
et coll., 1984). Une transfusion sanguine post-opératoire n’est donc pas nécessaire avec cet
implant. Le mécanisme de l’effet hémostatique de l’implant pourrait être une compression
mécanique des vaisseaux lésés lors de l’intervention chirurgicale.
Le léger écoulement non purulent et stérile, apparaissant entre le 6 ème et le 12 ème
suivant l’intervention serait le résultat d’une dégradation de l’implant. La nature
biodégradable de l’implant a d’ailleurs été constatée lors de son utilisation chez la souris.
Les signes cliniques, radiologiques et biologiques obtenus après le traitement ont été
en faveur d’une guérison des ostéomyélites chroniques chez presque la totalité des patients
traités (Tableau XXIV).L’os traité du seul cas où nous n’avons pas obtenu un excellent
résultat était à nu même après l’intervention chirurgicale; ceci pourrait retarder la cicatrisation
de la plaie. La plaie n’étant plus infectée, une greffe de peau est envisagée chez le patient afin
d’obtenir au plus vite une cicatrisation.
L’implant à base de monoléine et de gentamicine constitue donc une alternative pour
le traitement des ostéomyélites chroniques chez des patients ayant ou non une hémoglobinose,
enfants ou adultes; ceci quel que soit le siège de l’infection.
Le traitement classique de l'ostéomyélite chronique qui associe une excision
chirurgicale soigneuse et une antibiothérapie par voie parentérale prolongée (6 semaines) est
relativement moins efficace (25 à 30 % d'échecs) (Blaha JD et coll., 1993 ; Nelson CL et coll.,
1993 ; Habibou A et coll., 1999). Les résultats de ce traitement classique sont obtenus au prix
d'inconvénients majeurs à type de toxicité systémique si l'on veut obtenir des concentrations
bactéricides au niveau du foyer infectieux. En effet, le taux osseux des antibiotiques ne
dépasse pas 15 à 20 % du taux sérique, Wiggins CE et coll., 1978 ; Mader JT et coll., 1993;
137

Chapitre VI
Haydon RC et coll., 1993). En plus de l’éventuelle toxicité systémique que causerait le
traitement classique, les patients supportent mal le mode d'administration et la longue durée
d'hospitalisation (6 semaines) qui est très coûteuse.
Une autre étude d’efficacité de l’association d’une excision chirurgicale avec une
administration prolongée de fluoroquinolones (lomefloxacine, levofloxacine, et
ciprofloxacine) dans le traitement des ostéomyélites chroniques a donné respectivement des
taux de guérison de 71, 60 et 40 %. La durée moyenne de l’administration de l’antibiotique
dans cette étude (réalisée chez 27 patients) a été de 2 mois. Le délai d’apparition des récidives
(quand elles existaient) a été de 5 mois (Greenberg RN et coll., 2000). Dans notre étude,
aucune récidive n’a été constatée pendant la durée du suivi des patients (2 à 12 mois avec une
médiane de 10 mois).
Par ailleurs, une étude réalisée dans le même Service ayant servi de cadre de notre
étude (Service de Traumatologie/Orthopédie du Centre Hospitalier Universitaire Yalgado
OUEDRAOGO de Ouagadougou /Burkina Faso) a révélé que sur 65 patients ayant bénéficié
d’un traitement médico-chirurgical sans implant, une guérison a été obtenue chez 33 patients
(50,77 %) d’entre eux (Korsaga AS, 2004).
Une autre forme à libération prolongée, l’implant de polyméthylmétacrylate (PMMA)
renfermant de la gentamicine a fait l'objet de multiples études in vitro et in vivo (Bucholz HV
et coll., 1981; Langlais F et coll., 1988; Klemm KW, 1993; Langlais F et coll., 1995; Miclau
T et coll., 1993). Son efficacité dans le cadre du traitement des ostéomyélites chroniques n'est
plus à démontrer; elle permet d'obtenir sans une antibiothérapie par voie générale de longue
durée des taux d'échecs de l'ordre de 10 à 15% (Klemm KW, 1993 ; Garvin K et coll., 1994).
Cette méthode nécessite l'ablation du PMMA car ce dernier est non biodégradable. Cette
seconde intervention grève non seulement le coût du traitement, mais aussi présente un risque
infectieux.
I.10. Tolérance au traitement
La marge thérapeutique de l’implant n’est pas très étroite. En effet des doses d’implant
allant de 30 à 110 g n’ont provoqué aucun effet adverse chez les patients. Les résultats des
analyses biologiques ont confirmé l’absence d’atteintes hépatiques, rénales ou d’hémolyses
lors de l’utilisation de l’implant. Il n’y aurait pas eu de libération brusque et massive de
gentamicine dans le sang; en atteste l’absence de signes d’atteintes cochléo-vestibulaires
(vertiges, hypoacousie voire surdité) liés à une intoxication à la gentamicine (Medicines
Complete Browser, 2004).
138

Chapitre VI
L’absence de nécrose de l’os et des tissus avoisinants a révélé que l’implant a été
compatible avec la biologie de ces derniers.
traitement.
La bonne tolérance de l’implant a permis une bonne compliance des patients au
La durée de suivi de 12 mois semble relativement courte. Cependant, Waldogel FA et
coll. (1970) concluait que 95 % des récidives interviennent dans les 12 mois suivant
l’intervention chirurgicale.
CONCLUSION
Pour la première fois un implant à base de monoléine et de gentamicine a été utilisé
chez l’Homme pour traiter une infection chronique. Malgré le faible recul de notre étude, les
résultats préliminaires sont très encourageants. Ils nous ont permis de valider l’efficacité et
l'innocuité de cet implant dans le traitement des ostéomyélites chroniques. Fort des résultats
de la phase II de l’étude, un essai clinique phase III, multicentrique avec un nombre plus élevé
de patients pourrait être envisagé.
Le traitement des ostéomyélites par l’utilisation d’implants biodégradables à base de
gentamicine et de monoléine semble être donc une alternative au traitement par voie générale.
Du fait de l’innocuité (prouvée) de la monoléine, cette dernière pourrait faire l’objet
d’autres études en vue de l’utiliser comme véhicule de principes actifs dans le traitement
d’autres affections chroniques.
139

Conclusion générale
CONCLUSION GENERALE
140

Conclusion générale
Nous avons mis au point une technique de préparation d’implants à base de
gentamicine et de monoléine. Nous les avons préparés dans une ″salle blanche″. Les contrôles
du niveau de contamination particulaire et microbiologique des différents compartiments (de
cette salle) et des surfaces de travail nous ont permis de la juger conforme aux normes
requises pour la fabrication de formes pharmaceutiques stériles.
Les implants préparés se présentent sous forme de gel et se prennent en masse en
présence de liquide aqueux. L’implant contenant 5% de sulfate de gentamicine, 15% d’eau et
80% de monoléine libère progressivement la quasi-totalité de la gentamicine en 20 jours. Il a
donc été sélectionné pour les études ultérieures. Les préparations sont stables lorsqu’elles sont
conservées à des températures de 2-6 °C. Nonobstant ces résultats, une évaluation de
l’homogénéité par quantification de la gentamicine à différents niveaux dans les implants, et
des essais de stabilité sur une période plus longue pourraient être envisagés.
Les conditions de préparation ont permis d’obtenir des implants stériles et apyrogènes.
Pour chaque lot fabriqué, nous disposons maintenant de paramètres physico-chimiques
permettant de réaliser des contrôles de qualité. In vitro, ils sont biocompatibles avec les
globules rouges, les fibroblastes ou avec les macrophages. En outre, ils ne sont pas
potentiellement génotoxiques.
Chez la souris, les implants préparés ne provoquent pas de lésions particulières au
niveau du site d’implantation. Ils sont totalement biodégradés à 52 jours après leurs
implantations sous l’aponévrose plantaire. La libération de l’antibiotique et/ou la dégradation
des implants ne provoquent pas d’effets systémiques délétères chez la souris. Le
fonctionnement et l’histologie des organes nobles tels que le foie et les reins ne sont pas
perturbés par l’administration des implants. Les produits testés ne seraient donc pas
susceptibles de créer des dommages à l’Homme lorsqu’ils seront utilisés localement pour
traiter les ostéomyélites chroniques.
Chez l’Homme, les implants préparés se sont révélés efficaces dans le traitement de
l’ostéomyélite chronique. Avec un recul allant de 2 à 12 mois, aucune récidive n’a été
constatée chez les patients traités. La marge thérapeutique des implants n’est très pas étroite.
Aucun trouble cochléo-vestibulaire ou autres signes cliniques d’intolérance aux implants
n’ont été révélés. Au niveau du site d’implantation, il n’a pas été constaté de signes
d’incompatibilité à type de nécrose ou de lyse osseuse. La libération de la gentamicine et la
biodégradation des implants n’ont ni affecté le fonctionnement du foie et des reins, ni les
constantes hématologiques.
141

Conclusion générale
Le traitement des ostéomyélites chroniques par les implants biodégradables à base de
gentamicine et de monoléine sont, selon nos résultats préliminaires, un complément voire une
alternative aux traitements jusque-là expérimentés. Les résultats obtenus nous permettent
d’envisager avec sérénité des essais cliniques comparatifs randomisés avec un nombre plus
étendu de patients.
142

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156

ANNEXES
i

NOTE D’INFORMATION AU PATIENT
Titre de l’étude: Essai clinique d’un implant biodégradable de gentamicine
destiné au traitement de l’ostéomyélite chronique.
Nous menons une étude d’évaluation de l’efficacité clinique et de la
tolérance d’un médicament appelé «implant». Fait à base de matières premières
connues comme substances ne créant pas de dommages à l’organisme lors de
son utilisation, l’implant pourrait participer de façon significative à un meilleur
traitement de l’ostéomyélite chronique.
Des études préliminaires réalisées au laboratoire ont révélé que l’implant
mis au point libère lentement et complètement l’antibiotique pendant 20 jours.
Des contrôles de qualité ont montré que l’implant utilisé répond aux normes de
qualités pharmaceutiques exigées. Des études au laboratoire ont également
montré que le médicament qui sera utilisé ne crée pas de réactions nocives au
contact des tissus de l’organisme.
Au cours de la présente étude, nous voudrions évaluer l’efficacité clinique
et la tolérance de l’«implant» chez la personne atteinte d’ostéomyélite
chronique. Il s’agit d’un passage obligé vers la connaissance parfaite de
l’«implant» et sa mise à la disposition des cliniciens pour traiter l’ostéomyélite
chronique.
Procédure à suivre :
1. Si vous consentez volontairement à participer à cette étude, nous vous ferons
subir un examen physique, des examens radiologiques et biologiques pour
déterminer si vous remplissez les conditions requises pour être inclus(e) dans
l’étude.
ii

2. Si vous remplissez les conditions requises pour être inclus dans cette étude,
vous serez soumis au traitement suivant:
Vous subirez une intervention chirurgicale au cours de laquelle les tissus
mous et l’os nécrosé sont réséqués, et la cavité osseuse curetée est comblée avec
l’implant. La plaie chirurgicale est ensuite refermée par suture.
Adulte: gentamicine 160 mg en administration unique; LINCOCINE ®
(ampoule de lincomycine injectable 600 mg) en perfusion à la dose de 600 mg
toutes les 12 heures pendant 3 jours. Aussi, pendant ces 3 jours, vous recevrez
du PERFALGAN ® (Paracétamol 1 g) en perfusion à la dose de 1 g toutes les 8
heures.
Enfant: gentamicine 80 mg en administration unique; LINCOCINE ®
(ampoule de lincomycine injectable 600 mg) en perfusion à la dose de 300 mg
toutes les 12 heures pendant 3 jours. Concomitamment, il recevra du
PERFALGAN ® (en perfusion à la dose de 15 mg/kg toutes les 8 heures pendant
3 jours).
Un pansement compressif à la BETADINE ® dermique sera effectué tous
les 3 jours jusqu’à la cicatrisation de la plaie.
3. Nous vous prélèverons de petites quantités de sang pour détecter d’éventuels
signes d’intolérance au traitement. Ces prélèvements se dérouleront aux 5 ème
et 45 ème jour, et à 3, 6, 12 mois suivant l’intervention chirurgicale. Ces
prélèvements sont sans danger pour votre organisme. Vous subirez également
des examens cliniques et radiologiques aux périodes indiquées
précédemment.
4. Nous arrêterons le traitement dans le cas où le traitement cause plus de
dommage à votre corps que de bien. Sur votre demande nous pourrons
également arrêter le traitement.
iii

5. Nous croyons que les informations ci-dessus indiquées ont dissipé toutes les
craintes ou tous les doutes que vous pourriez avoir. Toutefois, pendant la
période entière de l’étude, n’hésitez pas à nous poser toutes les questions
d’éclaircissement nécessaires.
6. Pour toutes informations complémentaires relatives à cette étude, vous
pourriez contacter une des personnes suivantes:
- Dr Moustapha OUEDRAOGO, UFR/SDS Université de Ouagadougou
Tél. : 70 23 83 91
- Pr. Innocent Pierre GUISSOU, Chef du Département de la Pharmacie et
des Laboratoires du Centre Hospitalier Universitaire Yalgado
OUEDRAOGO, 03 BP 7021 Ouagadougou 03
- Dr Christophe DA, Chirurgien, Centre Hospitalier Universitaire Yalgado
OUEDRAOGO
- Dr Innocent NACOULMA, Chirurgien, Centre Hospitalier Universitaire
Yalgado OUEDRAOGO
iv

FORMULAIRE DE CONSENTEMENT
Titre de l’étude : Essai clinique d’un implant biodégradable de gentamicine
destiné au traitement de l’ostéomyélite chronique.
Je soussigné, M/Mme/MLle _________________________________________,
né(e) le ________________ à __________________________, donne par la
présente mon consentement et ma permission à l’équipe d’investigation dirigée
par le Professeur Innocent Pierre GUISSOU pour m’inclure dans le protocole de
recherche tel qu’il m’a été expliqué et que j’ai compris.
Je comprends les risques et les avantages immédiats du traitement. J’accepte les
examens et/ou le traitement à subir et les risques possibles y afférents.
Je comprends que j’ai le droit de me retirer à n’importe quel moment de la
recherche, pour n’importe quelle raison, sans sanction ou préjudice. Si je me
retire, je comprends que les médecins s'occuperont de moi comme tout autre
malade.
Toutes les conditions ci-dessus m’ont été expliquées en langue
__________________ que je comprends bien. Les données/échantillons
biologiques seront codés et resteront confidentiels (nom non divulgué). J'ai
dûment obtenu une copie de la présente fiche de consentement éclairé.
Signature précédée de la mention « lu et approuvé »
Date :
v

CAHIER D’OBSERVATION
vi

PUBLICATIONS
Articles acceptés tirés de la thèse :
1) Moustapha Ouédraogo, Rasmané Semdé, Issa Toudoridomou Somé, Rasmata
Traoré/Ouédraogo, Innocent Pierre Guissou, Viviane Henschel, Brigitte Evrard,
Jacques Dubois, Karim Amighi. Monoolein-water liquid crystalline gels of
gentamicin as bioresorbable implants for the local treatment of chronic
osteomyelitis: in vitro characterization. Accepté par la revue: Drug
Development and Industrial Pharmacy.
2) Moustapha Ouédraogo, Mélanie Sanou, Norbert Ramdé, Olga Goumbri, Issa T. Somé,
Rasmané Semdé, Rasmata Ouédraogo, Innocent P. Guissou, Viviane Henschel,
Brigitte Evrard, Karim Amighi, Jacques Dubois. In vivo biocompatibility and
toxicity assessment of a gentamicin-loaded monoolein gel intended to treat
chronic osteomyelitis. Accepté par la revue: Journal of Pharmacology and
Toxicology.
Articles soumis tirés de la thèse :
1) Moustapha Ouédraogo, Christophe S. Da, Innocent S. Nacoulma, Hamado Kafando,
Rasmané Semdé, Issa T. Somé, Rasmata Ouédraogo, Innocent P. Guissou, Brigitte
Evrard, Viviane Henschel, Karim Amighi, Jacques Dubois. Preliminary clinical
assessment of a gentamicin-loaded monoolein gel intended to treat chronic
osteomyelitis. Soumis à la revue: Current Therapeutic Research.
2) Moustapha Ouedraogo, Eric Camille Nacoulma, Issa Touridomon Somé, Rasmané
Semdé, Innocent Pierre Guissou, Viviane Henschel, Brigitte Evrard, Karim
Amighi, Jacques Dubois. In vitro biocompatibility and genotoxicity assessment
of a gentamicin-loaded monoolein gel as implant for the treatment of chronic
osteomyelitis. Soumis à la revue: Toxicology in vitro.
Autres articles publiés :
1) I. SANOU, G. BIRINGANINE, M. OUEDRAOGO, I.P. GUISSOU, O.G. NACOULMA-
OUEDRAOGO., 2002. Activité anti-inflammatoire des proanthocyanes de
Entada africana. Science et technique, Sciences de la santé ; 25 (1) : 105-112.
vii

2) OUEDRAOGO M., OUEDRAOGO S., LOMPO M., SOME N., GUISSOU I.P., 2003.
Etudes pharmacologiques des écorces de racines de Calotropis procera Ait.
(Asclepiadaceae) utilisées en phytothérapie de la maladie drépanocytaire au
Burkina Faso. Science et technique, Sciences de la santé ; 26 (1) : 65-74.
3) Issa T. Somé, Rasmane Semde, Ouedraogo Moustapha, Karim Amighi, Pierre I. Guissou,
Pierre Duez, Jacques Dubois. Validation of gentamicin congeners using HPLC
with electrochemical detection: comparison with fluorimetric detection. C. R.
Chimie 7 (2004) 1087–1093.
viii