Description de l'exocytose - Laboratoire Matière et Systèmes ...
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PHYSIQUE CELLULAIRE<br />
FUSION MEMBRANAIRE<br />
Rappel <strong>de</strong>s cours précé<strong>de</strong>nts<br />
<strong>Description</strong> <strong>de</strong> l’exocytose (5)<br />
Jean-Pierre HENRY<br />
5 Février 2009
Place <strong>de</strong> la fusion membranaire en<br />
biologie cellulaire<br />
• Le trafic membranaire <strong>et</strong> l’exocytose<br />
• La fusion virale<br />
• Fusion <strong>et</strong> développement
Trafic membranaire <strong>et</strong> exocytose
La fusion virale
La fusion cellule-cellule
ASPECTS PHYSIQUES<br />
DE LA FUSION MEMBRANAIRE
Le modèle du pédoncule
LA FUSION VIRALE<br />
Un modèle « simple » <strong>de</strong> fusion <strong>de</strong><br />
membranes biologiques
Mécanisme <strong>de</strong> la fusion induite par le<br />
virus <strong>de</strong> la grippe
PHYSIQUE CELLULAIRE<br />
Jean-Pierre HENRY<br />
5 Février 2009<br />
FUSION MEMBRANAIRE<br />
EXOCYTOSE
Exocytose régulée/constitutive<br />
• Exocytose constitutive:<br />
– Non régulée par Ca 2+<br />
– Renouvellement <strong>de</strong> la<br />
membrane cellulaire<br />
• Exocytose régulée<br />
(schéma)<br />
– Déclenchée par une<br />
montée <strong>de</strong> Ca 2+ cellulaire<br />
– Libération <strong>de</strong> médiateur<br />
pour la communication<br />
cellulaire<br />
L’exocytose régulée est impliquée dans le fonctionnement<br />
<strong>de</strong> la synapse <strong>et</strong> dans la libération <strong>de</strong>s hormones hydrosolubles
L’exocytose régulée est complexe<br />
L’exocytose (sécrétion) comporte <strong>de</strong>s étapes multiples<br />
précédant la fusion membranaire, qui ren<strong>de</strong>nt l’analyse<br />
biochimique (moléculaire) difficile<br />
remplissage<br />
migration<br />
?<br />
?<br />
membrane membrane<br />
bourgeonnement<br />
fusion<br />
arrimage maturation exocytose endocytose<br />
extérieur extérieur<br />
<strong>de</strong> <strong>de</strong> la la cellule cellule<br />
?<br />
Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ endosome endosome<br />
? ? ?<br />
?<br />
?<br />
migration<br />
vésicule vésicule<br />
catécholamine<br />
catécholamine<br />
(adrénaline)<br />
(adrénaline)<br />
Mais, l’étu<strong>de</strong> est facilitée car la fusion est détectable <strong>de</strong>puis<br />
l’extérieur <strong>de</strong> la cellule (pore <strong>de</strong> fusion, libération <strong>de</strong><br />
matériel)
<strong>Systèmes</strong> d’étu<strong>de</strong>: la cellule chromaffine<br />
bovine<br />
La cellule chromaffine est le prototype<br />
<strong>de</strong> la sécrétion neuroendocrine<br />
• Les cellules chromaffines<br />
bovines peuvent être<br />
cultivées<br />
• La sécrétion est induite par<br />
l’Ach ou les ions K +<br />
• Les vésicules (granules<br />
chromaffines) sont gros (200<br />
à 300 nm)<br />
• Les produits <strong>de</strong> sécrétion<br />
sont l’adrénaline <strong>et</strong> la<br />
noradrénaline, l’ATP <strong>et</strong> <strong>de</strong>s<br />
pepti<strong>de</strong>s/protéines
<strong>Description</strong> phénoménologique <strong>de</strong><br />
l’exocytose<br />
-1-<br />
Ce que les métho<strong>de</strong>s électriques ont amené
Patch-clamp: circuit équivalent<br />
• En patch-clamp, whole-cell, le<br />
scellement entre la pip<strong>et</strong>te <strong>et</strong><br />
la membrane cellulaire est fort<br />
(résistance > 1 Gohm)<br />
• La membrane à l’extrémité <strong>de</strong><br />
la pip<strong>et</strong>te est enlevée: on voit<br />
les propriétés <strong>de</strong> l’ensemble<br />
<strong>de</strong> la membrane plasmique<br />
• On impose un potentiel<br />
sinusoïdal (800Hz)<br />
• On mesure l’admittance du<br />
circuit équivalent
Circuit équivalent (5)<br />
• L’équation <strong>de</strong> l’admittance se<br />
décompose en une partie<br />
réelle <strong>et</strong> une partie imaginaire<br />
• Il est possible d’avoir accès à<br />
ces 2 parties (ampli lock-in)<br />
• Aux temps brefs, la chute <strong>de</strong><br />
potentiel est surtout ohmique<br />
• Aux temps longs, g est infini<br />
(Breckenbridge and Almers (1987), Nature 328, 814
I m<br />
Re<br />
Caractérisation du pore <strong>de</strong> fusion (1)<br />
• (Haut) Evolution <strong>de</strong> la partie<br />
imaginaire I m <strong>et</strong> <strong>de</strong> la partie<br />
réelle R e <strong>de</strong> l’admittance<br />
• (Bas) conductance du pore<br />
<strong>de</strong> fusion en nS (à gauche)<br />
<strong>et</strong> en nm (à droite)<br />
• Le pore apparaît<br />
brutalement avec une<br />
conductance initiale <strong>de</strong> 230<br />
pS<br />
• Avec <strong>de</strong>s hypothèses<br />
raisonnables, le pore aurait<br />
un diamètre <strong>de</strong> ~ 1 nm
Résultats obtenus par patch-clamp<br />
• L’événement <strong>de</strong> fusion unique est visible (dans<br />
certaines conditions): augmentation <strong>de</strong> capacité<br />
(vésicules <strong>de</strong> 200 nm ~ qqes fF)<br />
• Le pore <strong>de</strong> fusion est visible: <strong>de</strong> 100 à 1000 pS (qqes<br />
nm) ; il s’ouvre très rapi<strong>de</strong>ment; il peut être stable<br />
pendant une fraction <strong>de</strong> s; il peut fluctuer<br />
(ferm<strong>et</strong>ure/ouverture)<br />
• Un pore purement lipidique a <strong>de</strong>s caractéristiques<br />
semblables (mais, il y l’hypothèse d’un pore<br />
protéique est aussi défendue )
Principe <strong>de</strong> l’ampérométrie<br />
• Certaines cellules<br />
neuroendocrines sécrètent <strong>de</strong>s<br />
molécules oxydables: cellules<br />
chromaffines <strong>et</strong> adrénaline<br />
• On utilise une microélectro<strong>de</strong><br />
<strong>de</strong> carbone à un potentiel<br />
oxydant (800 mV), placée près<br />
<strong>de</strong> la cellule<br />
• La libération <strong>de</strong> l’adrénaline<br />
donne un pic <strong>de</strong> courant<br />
• Pas <strong>de</strong> filtrage diffusionnel : le<br />
pic donne la cinétique <strong>de</strong><br />
sécrétion
Réalisation d’une expérience<br />
d’ampérométrie<br />
• Une cellule chromaffine (diamètre 20 µm) est stimulée<br />
parune micropip<strong>et</strong>te (à gauche) libérant du KCl (55mM)<br />
• La microélectro<strong>de</strong> (fibre <strong>de</strong> carbone, à droite) est à 800 mV<br />
• Sur l’enregistrement du courant, un pic correspond à la<br />
libération d’une vésicule
Apports <strong>de</strong>s métho<strong>de</strong>s électriques<br />
• Mise en évi<strong>de</strong>nce du pore <strong>de</strong> fusion<br />
– Ouverture très rapi<strong>de</strong><br />
– Taille généralement inférieure au nS (gros canal)<br />
– Susceptible <strong>de</strong> ferm<strong>et</strong>ure <strong>et</strong> <strong>de</strong> fluctuations<br />
• L’expansion du pore serait gouvernée par le<br />
gonflement <strong>de</strong> la matrice<br />
• Les vésicules synaptiques (diamètre 40 nm) ne<br />
semblent pas gonfler, mais la diffusion à travers le<br />
pore les vi<strong>de</strong> en quelques ms<br />
• Pas d’indication sur l’hémifusion
<strong>Description</strong> phénoménologique <strong>de</strong><br />
l’exocytose<br />
-2-<br />
Ce que les métho<strong>de</strong>s optiques ont amené
Les techniques développées récemment<br />
• Microscopie électronique:<br />
– Métho<strong>de</strong>s sans coloration<br />
– Métho<strong>de</strong>s <strong>de</strong> tomographie<br />
• Métho<strong>de</strong>s optiques in vivo<br />
– Interference reflection microscopy<br />
– Microscopie biphotonique<br />
– Microscopie <strong>de</strong> fluorescence à excitation évanescente (TIRFM)<br />
– Microscopie STED (stimulated emission <strong>de</strong>pl<strong>et</strong>ion)
Electron tomographie conique:<br />
Hémifusion <strong>de</strong>s vésicules synaptiques<br />
« dockées »<br />
(Zampighi <strong>et</strong> al (2006) Biophys J, 91, 2910))<br />
• Une coupe <strong>de</strong> cortex<br />
frontal a été fixée <strong>et</strong><br />
examinée en tomographie,<br />
avec reconstitution d’image<br />
• Les images du centre <strong>et</strong> à<br />
droite suggèrent une<br />
hémifusion<br />
• En projection sur un plan,<br />
c<strong>et</strong>te résolution disparaît
STED<br />
Résolution du mouvement <strong>de</strong>s vésicules<br />
synaptique<br />
(Westphal <strong>et</strong> al (2008) Science,320, 246)<br />
• Neurones en culture, avec<br />
un marquage par<br />
fluorescence<br />
• Même champ observé en<br />
confocal <strong>et</strong> STED<br />
• C<strong>et</strong>te métho<strong>de</strong> <strong>de</strong> champ<br />
large perm<strong>et</strong> <strong>de</strong>s séquences<br />
rapi<strong>de</strong>s (30 Hz) <strong>et</strong> elle est<br />
utilisable pour le suivi <strong>de</strong>s<br />
vésicules synaptiques à la<br />
synapse.
Exocytose vue par Interference Reflection<br />
microscopy (IRM)<br />
• Cellules chromaffines<br />
observées in vivo<br />
• En A, empreinte <strong>de</strong> la cellule<br />
au repos, B, stimulation par<br />
dépolarisation, C, exocytose,<br />
D, récupération<br />
(Llob<strong>et</strong> <strong>et</strong> al(2003) Neuron,40, 1075)
Sécrétion d’une cellule chromaffine<br />
• Empreinte <strong>de</strong> la face<br />
basale; calibration 5µ<br />
• Les cellules sont stimulées<br />
par dépolarisation<br />
électrique (point blanc)
Suivi <strong>de</strong>s cellules BON par microscopie TIRF<br />
vésicules<br />
marquées<br />
faisceau<br />
laser<br />
eau<br />
verre<br />
épifluorescence<br />
i<br />
cellule<br />
i > i critique<br />
(i critique ˜ 64°)<br />
z<br />
on<strong>de</strong><br />
évanescente<br />
I<br />
épifluorescence<br />
évanescence<br />
Les cellules sont marquées par transfection par une construction<br />
NPY-GFP. NPY est un pepti<strong>de</strong> exprimé dans les vésicules
<strong>Description</strong> du montage utilisé au<br />
laboratoire<br />
Montage réalisé au laboratoire<br />
faisceau laser<br />
(Argon à 488 nm)<br />
déplacement du miroir<br />
eau<br />
Système<br />
<strong>de</strong> lentilles<br />
objectif<br />
cellule sur la lamelle<br />
<strong>de</strong> verre<br />
boite <strong>de</strong> culture<br />
prisme<br />
(verre)<br />
Ce montage perm<strong>et</strong> l'observation successive d'une même cellule à<br />
différentes épaisseurs d'évanescence (comprises entre 80 <strong>et</strong> 300 nm)
Cellules BON stimulées<br />
• Lignée cellulaire dérivée<br />
d’une tumeur carcinoï<strong>de</strong><br />
humaine<br />
• Cellules <strong>de</strong> type<br />
entérochromaffines<br />
(intestin) sécrétant <strong>de</strong> la<br />
sérotonine<br />
• Stimulation par les ions Ba 2+<br />
• Profon<strong>de</strong>ur d’évanescence:<br />
150nm<br />
• Ca<strong>de</strong>nce 25 Hz, accéléré 3<br />
fois
Cellules BON stimulées par le Ca cagé<br />
• Un composé photosensible complexant Ca 2+ incorporé dans la cellule<br />
• Un flash UV est utilisé pour libérer très rapi<strong>de</strong>ment le Ca 2+
Observation d’un événement unique:<br />
Le « flash »<br />
Integrated Intensity<br />
33Hz, Ralenti 3x Intensité intégrée<br />
Cellule BON transfectée NPY-GFP,<br />
stimulation digitonine/Ca 2+<br />
1900<br />
1700<br />
1500<br />
1300<br />
1100<br />
900<br />
700<br />
2,5 3,5 4,5<br />
Temps Time (s) (sec)<br />
τ flash ~ 100 ms
Origine du flash<br />
• Le produit <strong>de</strong> sécrétion est le NPY-GFP<br />
• La fluorescence <strong>de</strong> la GFP dépend du pH:<br />
I F(pH5)
Observation après marquage <strong>de</strong> la<br />
membrane vésiculaire<br />
(Taraska <strong>et</strong> al (2004) PNAS, 101, 8780)<br />
• Cellules PC-12 (tumeur<br />
<strong>de</strong> la médullo-surrénale<br />
<strong>de</strong> rat)<br />
• Marquage par NPY-GFP<br />
(protéine soluble, verte)<br />
• Marquage par un colorant<br />
<strong>de</strong> type styrène FM-64,<br />
rouge <strong>et</strong> soluble dans les<br />
membranes<br />
• Le colorant se dilue dans<br />
la membrane cellulaire<br />
pendant la sécrétion
Des protéines <strong>de</strong> la membrane vésiculaire<br />
diffusent dans la membrane plasmique, …<br />
• Cellules chromaffines bovines transfectées par VAMP-<br />
GFP<br />
• La VAMP est une protéine abondante <strong>de</strong> la membrane<br />
<strong>de</strong>s granules chromaffines (M~30 kDa)<br />
• Après la fusion, elle diffuse dans la membrane<br />
plasmique<br />
(Allersma <strong>et</strong> al (2004)MolBiolCel, 15, 4658) Vidéo
… mais d’autres ne diffusent pas!<br />
• Cellules PC-12<br />
transfectées par NPY-<br />
GFP (soluble, vert) <strong>et</strong><br />
Phogrine-dsRED<br />
(membranaire, 60kDa,<br />
rouge)<br />
• Après exocytose, la<br />
Phogrine diffuse très<br />
peu<br />
(Taraska <strong>et</strong> al<br />
(2003)PNAS,100, 2070)
Conclusions<br />
Au moment <strong>de</strong> l’exocytose, il y a:<br />
• Fusion <strong>de</strong>s bicouches: diffusion d’un colorant <strong>et</strong> <strong>de</strong> la<br />
VAMP<br />
• La membrane vésiculaire gar<strong>de</strong> une certaine i<strong>de</strong>ntité<br />
dans la membrane cellulaire<br />
En fait, la membrane vésiculaire peut, dans certains<br />
cas, conserver sa courbure
La concavité, vue par IRM, survit après la<br />
sécrétion, vue par TIRFM <strong>de</strong> FM4-64<br />
• La face basale d’une<br />
cellule chromaffine est<br />
observée par IRM<br />
(interference reflection<br />
microscopy)<br />
• La sécrétion est suivie<br />
par TIRFM (marquage<br />
membranaire)<br />
• La concavité persiste<br />
après l’exocytose<br />
(Llob<strong>et</strong> <strong>et</strong> al (2003) Neuron, 40, 1075)
La concavité, vue par IRM, survit après la<br />
sécrétion, vue par TIRFM <strong>de</strong> FM4-64 (1)<br />
• Les « concavités »<br />
sont dans le canal<br />
vert<br />
• Le FM4-64 est vu<br />
dans le canal rouge
Conservation <strong>de</strong> la concavité (2):<br />
expérience TIRFM<br />
• Cellule chromaffine marquée<br />
sur la membrane vésiculaire<br />
par VAM-GFP<br />
• Dans 10% <strong>de</strong>s cas, la<br />
fluorescence apparaît<br />
comme un anneau<br />
• C<strong>et</strong>te figure est interprétée<br />
comme la projection d’une<br />
concavité<br />
(Allersma <strong>et</strong> al (2004) MolBiolCell,15, 4658)
Conservation <strong>de</strong> la concavité (3): observation en<br />
2 photons d’un marqueur extracellulaire<br />
• On utilise <strong>de</strong>s « agrégats » <strong>de</strong> cellules chromaffines<br />
• Un marqueur fluorescent imperméant marque l’espace intercellulaire<br />
(sulforhodamine)<br />
• Une exocytose apparaît comme une croissance <strong>de</strong> l’espace externe<br />
• En C, exocytose avec fusion totale; en E, persistance <strong>de</strong> la concavité<br />
(Kishimoto <strong>et</strong> al (2006) EMBO J, 25, 673)
Implications mécanistiques<br />
• La conservation <strong>de</strong> la cavité est<br />
inattendue: après les travaux<br />
ampérométriques, on attendait une<br />
fusion totale<br />
• Il faut que la forme soit maintenue <strong>de</strong><br />
l’intérieur (protéines non sécrétées <strong>de</strong><br />
la matrice) ou <strong>de</strong> l’extérieur (rôle <strong>de</strong><br />
l’actine, voir schéma)<br />
• La conservation n’est pas toujours<br />
observée<br />
(Sukac and Bement (2006) MolBiolCell, 17, 1495)
Il n’y a pas <strong>de</strong> cavité persistante dans les<br />
neurones<br />
(Lob<strong>et</strong> <strong>et</strong> al (2003) Neuron,40, 1075)<br />
• Observation d’une<br />
terminaison nerveuse<br />
géante par IRM<br />
• Pas <strong>de</strong> cavités visibles<br />
• Augmentation <strong>de</strong> la<br />
surface <strong>de</strong> l’empreinte<br />
• Les systèmes sont<br />
différents (taille,<br />
matrice, cytosquel<strong>et</strong>te)
Exocytose séquentielle: une vésicule peut<br />
fusionner sur une concavité<br />
(Tran <strong>et</strong> al (2007) Eur Biophys J, 37, 55)<br />
Expérience sur cellule<br />
BON, en TIRFM<br />
I0 1 I<br />
! t<br />
! z<br />
• La fluorescence disparaît<br />
en <strong>de</strong>ux temps<br />
• La <strong>de</strong>uxième vésicule<br />
étant plus loin, elle a une<br />
intensité plus faible
Exocytose séquentielle (2): imagerie en 2<br />
photons <strong>de</strong> l’espace extracellulaire<br />
• L’espace extracellulaire est marqué par la sulfoRhodamine B<br />
• Après stimulation, la fluorescence ne diminue pas, mais<br />
augmente par exocytose <strong>de</strong> nouvelles vésicules<br />
(Kishimoto <strong>et</strong> al (2006) EMBO J, 25, 673)
Utilisation <strong>de</strong> l’imagerie par 2 photons<br />
avec un marqueur polaire extracellulaire<br />
• Agrégats <strong>de</strong> cellules chromaffines, marqueur sulfoRhodamine<br />
• Stimulation par KCl, images à 0,5 Hz
Si la concavité est conservée, la vésicule<br />
peut-elle se refermer?<br />
• Pour certains, l’exocytose pourrait être modulable:<br />
libération partielle du contenu <strong>et</strong> fusion membranaire<br />
incomplète<br />
• C’est l’hypothèse du « kiss-and-run », très<br />
développée pour les vésicules synaptiques<br />
• C<strong>et</strong>te hypothèse a aussi été proposée pour les gros<br />
granules <strong>de</strong>s cellules neuroendocrines<br />
• Toutefois, comment peut on arrêter le gonflement <strong>de</strong><br />
la matrice?<br />
• La « cavicapture »: les vésicules <strong>de</strong> sécrétion<br />
peuvent se refermer après libération <strong>de</strong> leur contenu
Argument en faveur <strong>de</strong> la « cavicapture »<br />
(Taraska <strong>et</strong> al (2003) PNAS, 100, 2070)<br />
• Cellules PC-12: marquage <strong>de</strong> la phogrine (protéine<br />
transmembranaire)<br />
• A gauche, marquage <strong>de</strong> l’extrémité N-terminale (cytosol)<br />
• A droite, marquage du C-terminal par l’GFP (sensible au pH)
Argument en faveur <strong>de</strong> la « cavicapture » (2)<br />
• L’EGFP est un indicateur <strong>de</strong> pH:<br />
– L’augmentation <strong>de</strong> I F correspond à<br />
l’ouverture <strong>de</strong> la vésicule (pH7)<br />
– La décroissance à l’acidification après<br />
referm<strong>et</strong>ure<br />
• Si on alcalinise par un pulse <strong>de</strong><br />
NH 4+ (F) pendant la <strong>de</strong>scente, la<br />
fluorescence remonte (F,G)<br />
• Si on alcalinise une vésicule au<br />
repos, même variation <strong>de</strong> I F<br />
• Il y a exocytose, puis<br />
referm<strong>et</strong>ure(cavicapture) <strong>et</strong><br />
acidification<br />
(Taraska <strong>et</strong> al (2003) PNAS, 100, 2070)
Mécanisme hypothétique <strong>de</strong> la cavicapture<br />
(Tsuboi <strong>et</strong> al (2004) J Biol Chem,279, 47115)<br />
• L’exocytose (2) perm<strong>et</strong> la<br />
libération du contenu<br />
• On peut alors avoir<br />
persistance <strong>de</strong> forme (3)<br />
• Puis, un mécanisme <strong>de</strong> type<br />
endocytose (4,5) referme la<br />
vésicule<br />
• La pression <strong>de</strong> gonflement a<br />
été évacuée en cours<br />
d’exocytose
Conclusions sur les métho<strong>de</strong>s optiques<br />
• Les métho<strong>de</strong>s optiques perm<strong>et</strong>tent l’observation in<br />
vivo <strong>de</strong> l’événement unique<br />
• Elles ont permis d’observer le phénomène <strong>de</strong><br />
persistance <strong>de</strong> forme, encore incompris<br />
• L’exocytose séquentielle (différente <strong>de</strong> l’exocytose<br />
composée) a été mise en évi<strong>de</strong>nce<br />
• La « cavicapture » est une réalité, le « kiss-andrun<br />
», perm<strong>et</strong>tant <strong>de</strong> contrôler l’exocytose est<br />
douteux dans les vesicules neuroendocrines<br />
• Comme toujours en biologie, il y a <strong>de</strong>s variations au<br />
moins quantitatives entre les différents systèmes