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Ecrit 1 e partie LV203
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Durée de l’épreuve 1h
Lire attentivement le sujet ; toute réponse doit être justifiée.
L’utilisation de téléphone portable et calculatrice est interdite
Un fragment d’ADN X de taille 500 pb doit être cloné dans un vecteur plasmidique pL2.
La séquence des extrémités d’un des brins du fragment X est représentée ci-dessous :
5’-CTTAAGTCTAGAGTTCT…………………//…………………..AGTCGACAAGCATGCTGA-3’
Le vecteur pL2 de 3000 paires de bases est schématisé ci-dessous avec le nom et la position de quelques sites de
restriction uniques ainsi que le gène de résistance à l’ampicilline (Ampi R ).
Ori
Q1 : Calculez la masse molaire du fragment d’ADN X double brin. (Données : pour faciliter les calculs, vous
prendrez comme masse molaire moyenne d’un désoxyribonucléotide au sein d’un polymère d’ADN la valeur de
300 g/mol).
PM= 500 x 2 x 300 = 3 10 5 g/mole
Q2 : Combien de picomoles du fragment X avez-vous dans 600ng. Combien de molécules de ce fragment
possédez-vous ?
On a (Q1) 1 mole qui fait 3 10 5 g
pL2
(3000pb)
EcoRI (310)
XbaI (318)
SphI (335)
Ampi R
Sal I (1035)
Dans 600 ng (600 10 -9 g) on a : 600 10 -9 /3 10 5 = 2 10 -12 moles = 2 picomoles
Nombre de molecules = 2 x N = 2 10 -12 x 6,02 10 23 = 12 10 11 molécules

Q3 : Schématisez le fragment X sous forme double brin en précisant l’orientation des brins. Identifiez sur le
fragment X les sites de restriction présents en les encadrant. Les séquences des sites de restriction à rechercher
sont les suivants :
EcoR I, 5’-G/AATTC-3’ ; Xba I, 5’-T/CTAGA-3’ ; Sph I, 5’-GCATG/C-3’ ; Sal I, 5’-G/TCGAC-3’
Fragment X :
5’ CTTAAGTCTAGAGTTCT…………………//………………………………AGTCGACAAGCATGCTGA 3’
3’ GAATTCAGATCTCAAGA…………………//………………………………TCAGCTGTTCGTACGACT 5’
Xba I Sal I Sph I
Q4 : Dessinez une représentation détaillée de l’enchaînement des deux premiers nucléotides « du site de
restriction Sal I » au sein d’une molécule d’ADN. Un seul des deux brins sera représenté et les bases seront
détaillées. Indiquez (à l’aide d’une flèche) à quel niveau la liaison est rompue sous l’action de l’enzyme Sal I,
nommez cette liaison.
Liaison
ester phosphate
Liaison
ester phosphate
O -
----o
O P
O -
O
CH2
H
H
O
O P
O -
CH
O
H
H
N
N
O
H
Liaison
ester phosphate
C
C
CH3
CH2
H
HC
H
O
OH ----o
O
C
G
N
H
H
O
C
T
N
H
NH
C
C NH
C
NH2
O
Q5 : On considère que la séquence intérieure du fragment X, schématisée en pointillé dans l’énoncé, n’apporte
aucun site supplémentaire pour les enzymes de restriction listées dans la question 3.
Précisez les enzymes de restriction à utiliser pour cloner le fragment X dans le plasmide pL2 ? Combien de
possibilités d’insertion y a-t-il pour ce clonage ? Justifiez vos réponses.
Reponse : Xba I et Sph I ; pas d’utilisation de Sal I car il y a un site au niveau du gène ampi. L’insertion au
niveau de ce gène inactive ce dernier il n’y a plus de resistance à l’ampicilline
Réponse :1 possibilite d’insertion, clonage oriente car 2 enzymes différentes

Q6 : Dessinez le fragment X d’une part et le vecteur pL2 d’autre part après digestion totale par ces enzymes en
précisant la séquence des extrémités générées, le type d’extrémités et l’orientation des brins.
Fragment X :
5’ CTAGAGTTCT…………………//………………………………AGTCGACAAGCATG 3’
3’ TCAAGA…………………//………………………………TCAGCTGTTC 5’
extrémité cohésive extrémité cohésive
5’ sortante (ou 3’ rentrante) 3’ sortante (ou 5’ rentrante)
Plasmide pL2 :
5’ C…………………//………………………………T 3’
3’ GTACG…………………//………………………………AGATC 5’
Le vecteur pL2 digéré (voir question 6) est déphosphorylé (on considère que cette étape de déphosphorylation
est efficace à 100%). Il est ensuite mélangé au fragment X digéré (voir question 6), puis incubé en présence
d’ADN ligase et d’ATP. Après cette ligation, le mélange est utilisé pour transformer des bactéries compétentes
qui sont alors cultivées sur milieu nutritif gélosé en présence d’ampicilline à 37°C pendant une nuit.
Q7 : Pourquoi le vecteur pL2 est-il déphosphorylé avant l’étape de ligation ?
La déphosphorylation du vecteur pL2 empêche celui-ci de se recirculariser sur lui-même sans insérer un
fragment X.
L’ADN plasmidique issus d’un clone bactérien (test A) est hydrolysé par l’enzyme de restriction EcoR I.
D’autre part deux tests sont réalisés avec le vecteur pL2 sous forme native (test B) ou hydrolysé par EcoR I (test
C). Les produits de digestion sont soumis à une électrophorèse sur gel d’agarose.
Q8 : Comment visualise-t-on les produits de digestion ? Précisez le principe mis en jeu.
Le Bromure d’Ethidium, (BEt) permet de visualiser l’ADN dans le gel d’agarose. Le BEt est un intercalant qui
s’insère entre les plateaux de bases de l’ADN. Quand le gel est irradié aux UV le BEt est excité et émet des
photons (lumière fluorescente)

Q9 : Dessinez le profil électrophorétique des produits de digestions obtenus, en ajoutant les contrôles qui vous
paraissent nécessaires à l’étude de ces ADN, en indiquant leurs tailles en paires de bases et en légendant lisiblement
les pistes du gel.
Piste A : plasmide recombinant de 3500pb linéarisé
par l’hydrolyse par EcoRI
Piste B : plasmide natif non hydrolysé (circulaire double brin, superenroulé)
Piste C : plasmide natif de 3000pb linéarisé par l’hydrolyse par EcoRI
Piste MM : Marqueur de taille : mélange de fragment d’ADN
double brin linéaire de taille connu pour permettre d’estimer
la taille des fragment d’ADN étudiés.
Q10 : Que donnerait la digestion de ces mêmes ADN par Sal I ? Dessinez le profil électrophorétique des produits
de digestion par Sal I, en indiquant leurs tailles approximatives en paires de bases et en légendant lisiblement les
pistes du gel.
Bonus
ATTENTION il y a une ambiguité sur la question.
Certains étudiants ont compris que les ADN étaient déjà digérés par EcoR I, alors que nous voulions une
digestion par Sal I seulement.
Tailles attendues pour digestion par SalI.
Piste A (plasmide recombinant) 2 bandes = 2800pb+700pb
Piste B (plamisde natif non digéré) 1 bande ADN double brin circulaire superenroulée
Piste C (plasmide natif) 1 bande = 3000 pb plasmide linéarisé
Tailles attendues pour digestion par EcoRI + SalI.
Piste A (plasmide recombinant) 3 bandes = 525 pb + 2275pb+700pb
Piste B (plamisde natif non digéré) 1 bande ADN double brin circulaire superenroulée
Piste C (plasmide natif) 2 bandes = 2275 pb + 725 pb
_
+
A B C MM
3500 pb
3000 pb