Déroulement des TP LV336, Outils de la Biologie ... - Page d'accueil

Déroulement des TP LV336,
Outils de la Biologie Moléculaire
Ces travaux pratiques se déroulent sur 4 jours. Deux expériences seront réalisées en
parallèle :
- préparation d’une protéine : l’ADN polymérase Taq.
- clonage d’un fragment d’ADN (erf1) : construction du plasmide recombinant pETerf1.
L’analyse des constructions plasmidiques sera réalisée, sur les clones bactériens
transformés, par un test de PCR à l’aide de l’ADN Taq polymérase préparée en TP.
Préparation de la Taq polymérase et test d’activité PCR
1- Préparation de l’ADN polymérase Taq.
2- Détermination de l’activité enzymatique de la Taq polymérase par un test PCR sur un
ADN contrôle.
- Réalisation de la PCR.
- Analyse des produits PCR après dépôt et électrophorèse sur gel d’agarose.
Pour des raisons d’organisation, la préparation de l’ADN Taq Polymérase sera réalisée à partir
du 2 e jour des TP.
Préparation du vecteur
1- Minipréparation d’ADN plasmidique pET-21 à partir d’un culot bactérien congelé.
2- Hydrolyse enzymatique du vecteur plasmidique par Hind III et Xba I.
3- Contrôle de la nature et de la quantité de l’ADN plasmidique après dépôt et électrophorèse
sur gel d’agarose.
4- Déphosphorylation de l’ADN plasmidique digéré.
Ligation insert/vecteur
1- Préparation du mélange de ligation à partir du plasmide hydrolysé en TP et d’un fragment
d’ADN erf1.
2- Ligation en respectant un rapport molaire insert/vecteur de 3/1.
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Transformation
1- Transformation des bactéries compétentes DH5α par choc thermique.
2- Sélection des clones bactériens transformés sur boîte de culture LB Agar + ampicilline.
Analyse des colonies de bactéries transformées par un test PCR
1- Analyse des clones bactériens obtenus par un test PCR réalisé directement sur colonies
bactériennes
- Réalisation de la PCR.
- Analyse des produits PCR après dépôt et électrophorèse sur gel d’agarose.
2- Interprétation et discussion.
Vous consignerez le but de chaque expérience, les déviations
au protocole et les résultats obtenus ainsi que leur
interprétation dans un cahier qui
sera tenu à jour par l’étudiant.
- 2 - LV336

STRATEGIE DE CLONAGE ET
PURIFICATION D’UNE PROTEINE
Le clonage permet d’isoler et d’amplifier une séquence donnée d’ADN. Cette opération nécessite
l’insertion de la séquence à cloner dans un vecteur susceptible d’être répliqué (étapes de digestion
enzymatique et de ligation). Le vecteur recombinant est introduit dans une bactérie compétente
(étape de transformation) pour assurer sa réplication. Les bactéries transformées sont cultivées sur
un milieu sélectif où elles forment des clones correspondant à un type de vecteur recombinant
(étape d’amplification et de sélection).
Un vecteur est une molécule d’ADN capable de se répliquer de façon autonome dans une cellule
hôte. C’est le cas des plasmides, cosmides, bactériophages, virus, chromosomes artificiels de
bactéries et de levures. Ces vecteurs peuvent intégrer des fragments d’ADN exogènes, ce qui
permet de les amplifier. Le choix du vecteur dépend de la taille et de la nature des fragments que
l’on veut cloner :
- Les plasmides, dans lesquels on peut insérer des fragments d’ADN de 0 à 10-15 kpb ;
- Les phages acceptent des fragments de plus grande taille, jusqu’à 20 kpb ; ces particules
infectent les bactéries hôtes qui amplifient l’ADN du phage, se lysent et libèrent de
nouvelles particules phagiques
- Les cosmides permettent d’insérer des fragments dont la taille peut atteindre 47 kpb. Ils
utilisent certaines propriétés du phage (l’infection), mais ne peuvent donner naissance à
des particules infectieuses, ce qui les rapproche des plasmides.
- Les chromosomes artificiels de bactérie ou de levure sont utilisés pour analyser de grands
fragments d’ADN génomique (200 à 500 kpb).
Quel que soit le vecteur choisi, le clonage requiert deux étapes : l’insertion du fragment à
amplifier dans le vecteur et l’identification du fragment recherché.
Le but de ces TP est de placer la séquence codante du gène erf1 (1398 pb) dans le vecteur de
clonage et d'expression pET-21d (5443 pb, voir figure page suivante).
En parallèle de ce clonage, vous allez préparer l’ADN polymérase Thermus aquaticus (Taq) à
partir d’une souche d’E.coli qui a été transformée par le plasmide pTaq qui contient le gène
Taq sous le contrôle d’un promoteur inductible. Ce plasmide permet l’expression de
l’enzyme Taq polymérase fonctionnelle. Le promoteur utilisé est extrêmement efficace et
permet un contrôle temporel de l’initiation de la transcription grâce à une induction par
l’IPTG. Ainsi, il est possible d’induire l’expression de la protéine Taq polymérase à un taux
maximum dans les conditions optimales de culture, c’est-à-dire quand la culture bactérienne
est en croissance exponentielle à densité élevée. Le respect de ces conditions de culture est
important pour avoir une induction optimale de la protéine. En travaillant sur des temps
relativement courts d’induction et donc de production de protéines, nous évitons son
accumulation. En effet, la présence massive de la protéine étrangère peut gêner, voire inhiber
la croissance des bactéries, et par conséquent, diminuer le rendement final. Avec une telle
stratégie, la quantité de la protéine Taq polymérase produite peut représenter jusqu’à 10 %
des protéines totales de l’extrait bactérien.
L’enzyme Taq polymérase préparée lors des travaux pratiques sera testée puis utilisée pour la
PCR de discrimination des clones obtenus après transformation par le vecteur recombinant
pET-erf1.
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Séquence partielle de la région comprenant le site multiple de clonage de pET21 :
Sites de restriction pour Hind III et Xba I :
Hind III :
5’ A/AGCTT 3’
Xba I :
5’ T/CTAGA 3’
Séquences des oligonucléotides utilisés pour la réaction de PCR :
- oligo-up (T7 promoter) : 5’ TAATACGACTCACTATAGGG 3’
- oligo-down (T7 terminator) : 5’ CTAGTTATTGCTCAGCGGT 3’
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Minipréparation d’un ADN plasmidique.
Ce protocole permet de purifier rapidement (environ 10 min) un ADN plasmidique à partir d’un
culot d’une culture bactérienne. Les temps d’incubation sont extrêmement importants et doivent
être strictement respectés. Préparer tous les produits et le matériel avant de commencer.
Vous disposez d’un culot d’Escherichia coli (DH5α) transformées par le plasmide pET-21
correspondant à 4 mL de culture bactérienne en phase stationnaire de croissance.
1. Resuspendre soigneusement le culot dans 50µL de tampon TE. Le culot doit être totalement
resuspendu avant de poursuivre, vous pouvez vortexer l’échantillon.
2. Ajouter 300µL de tampon TENS, vortexer 10 sec et incuber à température ambiante jusqu’à
observer un mélange visqueux. Cette étape est très importante ne dépassez pas les 5 min
d’incubation.
3. Ajouter 150µL d’Acétate de Sodium 3 M pH 5,2, vortexer immédiatement 2 à 5 sec pour bien
homogénéiser.
4. Centrifuger 2 min à 12 000 rpm.
5. Transférer le surnageant dans un tube eppendorf. Ajouter 2 volumes d’Ethanol 100%
prérefroidi à –20°C.
6. Laisser 15 min à -20°C.
7. Centrifuger 5 min à 12 000 rpm.
8. Eliminer le surnageant en le prélevant doucement à la micropipette sans toucher le culot.
9. Ajouter 1 mL d’Ethanol 70%. Rincer soigneusement la paroi du tube. Attention le culot peut
se décoller. Centrifuger 2 min à 12 000 rpm. Eliminer le surnageant.
10. Laisser évaporer totalement l’excès d’Ethanol, tube ouvert.
11. Resuspendre le culot dans 20 µL d’H 2O.
12. Prélever et conserver au froid deux échantillons de 1 µL de cet ADN plasmidique.
Un échantillon sera utilisé pour estimer sur gel d’agarose la quantité d’ADN plasmidique de
votre préparation, l’autre échantillon servira pour le test de PCR.
Pendant l’évaporation de l’Ethanol (étape 10) préparer un gel à 0.8% d’agarose (voir annexe 1).
Composition des tampons utilisés pour la minipréparation d’ADN plasmidique:
TE : Tris HCl pH8 10mM
EDTA 1 mM
TENS : Tampon TE
NaOH 0,1N
SDS 0,5%
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Digestion de l’ADN plasmidique.
L’ADN plasmidique doit être « ouvert » avant l’étape de ligation avec l’insert. L’ADN pET-21 est
hydrolysé par les deux enzymes de restriction Hind III et Xba I.
1. L’ADN plasmidique est digéré à 37°C par les enzymes Hind III et Xba I. Le protocole
d’hydrolyse sera discuté en séance de TP. (voir annexe 3).
Pendant la digestion enzymatique, préparer un gel à 1% d’agarose (voir annexe 1).
2. Quand la digestion a été contrôlée par visualisation sur gel (voir protocole suivant), les
enzymes de restriction sont dénaturées en incubant le mélange de digestion 20 min à 65°C.
Analyse qualitative et quantification sur gel d’agarose des
échantillons d’ADN.
1. 1 µL d’ADN plasmidique contrôle non-digéré et 1 µL d’ADN plasmidique hydrolysé par
Hind III et Xba I sont dilués chacun dans un volume final de 12 µL de tampon de dépôt 1X.
2. Déposer sur le gel 0.8% d’agarose (voir annexe 1) les échantillons d’ADN et 12µL du
marqueur de taille « High DNA Mass-ladder » *. Effectuer la migration et l’analyse des ADN
sur gel 0.8% d’agarose selon le protocole décrit en annexe 2.
3. Vérifier si la digestion de l’ADN plasmidique est totale.
4. Estimer la quantité d’ADN plasmidique analysé sur gel et la concentration de votre solution
d’ADN plasmidique.
* High DNA Mass-ladder : mélange équimolaire de 6 fragments d’ADN linéaires de 10, 6, 4, 3, 2
et 1 kpb. L’électrophorèse de 12 µL donnera des bandes contenant respectivement 200, 120, 80,
60, 40 et 20 ng d’ADN.
Composition du tampon de dépôt 6X :
• 50% glycérol
• 100mM EDTA
• 0,02% Bleu de Bromophénol
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Déphosphorylation de l’ADN plasmidique digéré.
L’ADN plasmidique digéré est déphosphorylé par une phosphatase (Shrimp alkaline
Phosphatase) avant la ligation avec la séquence erf1.
1. Prélever 3 µL d’ADN digéré avant la déphosphorylation, cet échantillon servira de contrôle
non déphosphorylé.
2. Préparer 50 µL de mélange réactionnel de déphosphorylation contenant :
l’ADN plasmidique digéré,
la phosphatase à raison d’1 unité de phosphatase par picomole d’extrémité d’ADN
(solution à 1u/µL)
Ajuster à 1X la concentration du tampon* de déphosphorylation.
3. Incuber la réaction 30 min à 37°C
4. Désactiver l’enzyme en incubant la réaction 15 min à 65°C.
L’ADN plasmidique « ouvert » et déphosphorylé est prêt pour la ligation, conserver le tube dans
la glace.
* Ce point sera discuté en TP, en tenant compte du volume d’ADN (+ tampon de digestion) utilisé
pour cette réaction.
Composition du tampon de déphosphorylation 10X :
• 100 mM Tris HCl pH 7,5 à 37°C
• 100 mM MgCl 2
• 1mg/mL BSA
Ligation
La réaction de ligation est effectuée avec l’ADN plasmidique que vous venez de préparer et
l’insert erf1 digéré par Hind III et Xba I. En parallèle, plusieurs contrôles seront effectués :
- vecteur digéré déphosphorylé ou non
- avec ou sans insert
En plus de l’ADN du vecteur pET21d que vous avez préparé et digéré par Hind III et Xba I, vous
disposez des produits suivants :
T4 DNA ligase à 1 u/µL
Insert erf1 20 ng/µL
Tampon de ligation 2X
1. La ligation est réalisée dans un volume final de 20 µL, en présence de 1 unité de ligase.
Calculer les volumes nécessaires de chaque type d’ADN (plasmidique et insert) pour avoir un
rapport molaire insert/vecteur de 3/1 avec 50 ng de vecteur, sachant que les tailles respectives
de l’insert et du vecteur sont d’environ 1400 pb et 5440 pb.
2. Le mélange réactionnel est réalisé dans la glace dans un tube eppendorf. Ajouter en respectant
l’ordre : le mélange d’ADN plasmidique et insert, l’eau, le tampon de ligation (1X final) puis
l’enzyme T4 DNA ligase (1 unité).
3. Incuber la réaction 1 heure à température ambiante.
Composition du tampon de ligation 10X :
• 300 mM Tris-HCl pH 7.5
• 100 mM MgCl2
• 100 mM DTT
• 10 mM ATP
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Transformation par choc thermique
Les produits de ligation sont introduits dans des bactéries rendues compétentes (DH5α). La
transformation se fait par choc thermique.
1. Laisser décongeler lentement sur la glace les bactéries (20 µL/tube).
Attention : les bactéries compétentes sont particulièrement fragiles ne pas agiter le tube pour les
étapes 2 à 6.
2. Ajouter 1µL du mélange de ligation aux bactéries. Mélanger doucement avec l’extrémité du
cône (ni vortex, ni pipetage).
3. Incuber les cellules sur la glace durant 10 min.
4. Pour le choc thermique : incuber exactement 30 sec à 42°C.
5. Placer le tube dans la glace 2 min.
6. Ajouter 100 µL de milieu SOC préchauffé à 37°C.
7. Incuber les cellules à 37°C dans un bain-marie, 30 min.
8. Déposer pour chaque transformation, les volumes indiqués ci-après sur des boîtes de culture
LB Agar + ampicilline. Étaler à l’aide d’un râteau. Laisser sécher les boîtes avant de les
retourner.
100 µL pour le témoin déphosphorylé sans insert
100 µL pour l’essai avec insert.
9. Identifier vos boîtes sur le côté et pas sur le couvercle. Incubez la boîte gélose vers le haut dans
une étuve à 37°C pendant la nuit.
Composition des milieux :
Pour 10 mL de milieu SOC :
LB :
- 10 mL de milieu SOB :
• Bactotryptone 20 g/L
• Extrait de levure 5 g/L
• NaCl 125 mM
• KCl 2,5 mM
- 50 µL MgCl 2 0,2 M
- 0,2 mL glucose 1M
- 1 % tryptone
- 0,5 % d’extrait de levure
- 1 % NaCl
- (1,5 % de bacto-agar est ajouté si l’on veut faire du milieu LB-agar pour les boîtes de
Pétri).
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Préparation de la Taq polymérase
La préparation de l’ADN polymérase Thermus aquaticus (Taq) est réalisée à partir d’une souche
d’E.coli qui a été transformée par le plasmide pTaq qui contient le gène Taq sous contrôle d’un
promoteur inductible (voir introduction).
Avant ces travaux-pratiques, la souche bactérienne transformée par pTaq a été ensemencée à
basse densité et mise en culture sous agitation à 37°C jusqu’à une DO=0,6. L’expression de la
protéine Taq a alors été induite par addition d’IPTG (à une concentration de 0,1M). Après 14 h
d’induction à 30°C, les bactéries ont été centrifugées et lavées dans le tampon A. Des culots
correspondant à 100 mL de culture ont été préparés et congelés.
1. Resuspendre soigneusement le culot de bactéries dans 5 mL de tampon de prélyse (tampon A +
4mg/mL de lysozyme), incuber 15 min à température ambiante.
2. Ajouter le même volume de tampon de lyse.
3. Identifier votre tube et incuber le dans un bain marie à 90°C durant 30 min
4. Centrifuger à 10 000 rpm durant 20 min à 4°C.
5. Transférer le lysat clair dans une fiole à bouchon avec un barreau aimanté. Agiter en
permanence la solution et ajouter très doucement à température ambiante la poudre de sulfate
d’ammonium de façon à obtenir une concentration finale de 30% (poids/volume).
6. Centrifuger à 10 000 rpm durant 20 min à 4°C.
7. Repérer avec l’enseignant le culot, éliminer le surnageant et dissoudre le culot dans 2 mL de
tampon A.
Composition des tampons utilisés :
- Tampon A :
• 50 mM Tris HCl pH 7.9
• 50 mM Dextrose
• 1 mM EDTA
- Tampon de lyse :
• 10 mM Tris HCl pH 7.9
• 50 mM KCl
• 1 mM EDTA
• 1mM Pefabloc (AEBSF)
• 0,5% Tween 20
• 0,5% NP40
- Tampon de stockage :
• 50 mM Tris HCl pH 7.9
• 50 mM KCl
• 0,1 mM EDTA
• 1mM DTT
• 0,5 mM Pefabloc (AEBSF)
• 50% glycérol
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Test PCR de l’activité de la Taq polymérase.
L’activité de la Taq polymérase, que vous venez de préparer, est testée par une réaction PCR avec
une série de dilutions de l’enzyme. Le couple d’amorces (oligo-up et oligo-down) utilisé pour
cette PCR, encadre la région du site multiple de clonage de l’ADN plasmidique que vous avez
préparé le 1 e jour (voir figure et séquences dans l’introduction).
Deux contrôles avec une Taq polymérase du commerce sont réalisés sur de l’ADN plasmidique
(contrôle positif) et sur de l’H 2O (contrôle négatif).
1. L’ADN plasmidique préparé le 1 e jour est dilué au 1/100 e dans de l’eau, 5µL de cette dilution
serviront pour chaque test.
2. Prélever une fraction aliquote de votre préparation de Taq polymérase et effectuer les
dilutions suivantes dans le tampon de stockage : 1/5 ; 1/10 ; 1/20 ; 1/40.
3. En vous aidant du tableau de la page suivante, calculer les volumes des différents réactifs
pour préparer le prémélange.
4. Effectuer le prémélange en omettant l’enzyme et l’ADN (voir tableau ci-après). Conserver le
tube dans la glace.
5. Effectuer le mélange réactionnel dans les micro-tubes PCR numérotés (respecter l’ordre) :
le prémélange,
soit l’ADN plasmidique dilué au 1/100 soit l’eau
l’enzyme diluée
6. Centrifuger brièvement les tubes avant de les mettre en place dans l’appareil.
Important : il est impératif de disposer vos tubes dans l’appareil en respectant les indications des
enseignants. Numéroter les micro-tubes PCR sur le côté, (pas sur le bouchon qui sera
directement en contact avec le couvercle de l’appareil).
7. Pendant la réaction PCR, préparer un gel d’agarose à 1% d’agarose pour l’électrophorèse
(selon le protocole de l’annexe 1).
8. Le volume réactionnel des échantillons PCR est de 25 µL, Calculer le volume de tampon de
dépôt 6X à ajouter à chaque tube pour avoir une concentration finale à 1X.
9. Déposer 15 µL de vos échantillons sur gel et 5µL du marqueur de taille Smart Ladder (100,
200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 1000 pb).
10. Effectuer l’électrophorèse et la coloration du gel selon le protocole de l’annexe 2.
11. Comparer avec le témoin positif (1 unité de Taq polymérase du commerce) les intensités des
bandes d’ADN amplifié dans les différentes conditions testées. Voir avec l’enseignant la
dilution à utiliser pour les expériences de PCR suivantes.
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Afin d’éviter de pipeter de trop petits volumes et dans un souci d’homogénéité, préparer un
prémélange contenant tous les réactifs communs aux différents tests (étape 4 du protocole).
Compléter et utiliser le tableau ci-dessous. Seuls les volumes pour la Taq polymérase et pour
l’ADN sont fixés.
Tableau à
compléter
Concentration
initiale
Concentration
finale
Tampon PCR 10X 10X 1X
H 2O distillée
Mélange dNTPs 10 mM 200 µM
oligo-up 50 ng/µL 2 ng/µL
oligo-down 50 ng/µL 2 ng/µL
ADN dilué au 1/100 e
ou eau
Taq polymérase
diluée
Volume pour
1 réaction
(en µL)
(volume final
de 25µL)
Volume pour (x+1)
réactions (en µL)
- - 5 -
- - 1 -
Séquences des oligonucléotides utilisés pour la réaction de PCR :
- oligo-up (T7 promoter) : 5’ TAATACGACTCACTATAGGG 3’
- oligo-down (T7 terminator) : 5’ CTAGTTATTGCTCAGCGGT 3’
Composition du tampon PCR 10X :
- 100 mM Tris HCl pH 8,8
- 500 mM KCl
- 15 mM MgCl 2
Programme PCR :
- 95°C, 5 min 1 fois
- 95°C, 30 sec
- 48°C 30 sec
- 72°C 1 min }
25 fois
- 72°C 5 min 1 fois
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Analyse des clones bactériens transformés
Pour analyser l’ADN plasmidique des clones bactériens transformés, une réaction de
polymérisation en chaîne (PCR) est réalisée. Un couple d’amorces, encadrant la région
d’insertion, permet de tester la présence de l’insert. Après migration électrophorétique des
produits de PCR, on évaluera la taille du fragment amplifié qui révélera la présence ou non de
l’insert.
La réaction de PCR est réalisée directement sur les bactéries transformées.
1. Préparation des échantillons :
Récupérer les boîtes sur lesquelles ont poussé les clones des bactéries transformées. À l’aide d’un
embout de pipetteman jaune, prélever délicatement sur la boîte un clone isolé et le plonger dans
un tube eppendorf contenant 50µL d’H 2O stérile. Répéter l’opération sur 4 autres colonies de la
même boite avec un embout propre à chaque fois.
Attention, un excès d’extrait bactérien peut inhiber les réactions d’amplification.
2. Réaction de PCR :
La réaction de PCR est effectuée sur les 5 colonies et un témoin H 2O. Seule l’origine de l’ADN
diffère d’un test à un autre.
Afin d’éviter de pipeter de trop petits volumes et dans un souci d’homogénéité, préparer un
prémélange dans un tube de 1,5 mL contenant tous les réactifs communs aux différents tests.
Compléter le tableau ci-dessous.
Tableau à
compléter
Concentration
initiale
Concentration
finale
Tampon PCR 10X 10X 1X
H 2O distillée - -
Mélange dNTPs 10 mM 200 µM
oligo-up 50 ng/µL 2 ng/µL
oligo-down 50 ng/µL 2 ng/µL
Volume pour
1 réaction (en
µL)
(volume final de
25µL)
Volume pour
(x+1) réactions
(en µL)
Taq polymérase 1u/microL 1 U/ microL 1 U -
Solution de bactéries ou eau - - 5 -
• Effectuer le mélange réactionnel dans les tubes PCR numérotés en respectant l’ordre
suivant :
le mélange réactionnel avec l’enzyme Taq polymérase
les bactéries en solution (source d’ADN) ou l’eau (témoin négatif)
• Centrifuger brièvement les tubes avant de les mettre en place dans l’appareil PCR.
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3. Pendant la réaction de PCR, préparer un gel à 1% d’agarose pour l’électrophorèse.
4. Le volume réactionnel des échantillons de PCR est 25 µL, ajouter à chaque tube le volume de
tampon de dépôt pour avoir une concentration finale1X.
5. Déposer 15 µL de vos échantillons sur gel et 5µL de Smart Ladder (marqueur de taille : 1000,
800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 et 100 pb).
6. Effectuer l’électrophorèse et la coloration du gel.
7. Calculer la taille attendue du fragment amplifié, comparer avec vos résultats, qu’en concluezvous
?
Séquences des oligonucléotides utilisés pour la réaction de PCR :
- oligo-up (T7 promoter) : 5’ TAATACGACTCACTATAGGG 3’
- oligo-down (T7 terminator) : 5’ CTAGTTATTGCTCAGCGGT 3’
Composition du tampon PCR 10X :
- 100 mM Tris HCl pH 8,8
- 500mM KCl
- 15mM MgCl 2
Programme PCR :
- 95°C, 5 min 1 fois
- 95°C, 30 sec
- 48°C 30 sec
- 72°C 1 min }
25 fois
- 72°C 5 min 1 fois
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Annexes
Annexe 1 : Préparation d’un gel d’agarose.
Préparer dans une éprouvette 500 mL de tampon TBE 0,5X. Dans une fiole Erlenmeyer mettre la
quantité nécessaire en agarose et le tampon TBE 0.5X (par exemple un gel d’agarose de 0,8%
signifie : 0,8 g d’agarose pour 100 mL de tampon TBE 0,5X). Les volumes à préparer sont de
40mL (petit gel) ou 80 mL (grand gel). Faire fondre l’agarose en portant à ébullition le mélange
au four micro-ondes puis laisser refroidir le gel obtenu jusqu’à environ 55°C. Couler le gel dans le
support, mettre le peigne. La prise est obtenue après environ 20 à 30 min.
La préparation de gel d’agarose à des pourcentages différents est réalisée en ajustant la quantité
d’agarose.
Composition du tampon TBE 10X (Tris Borate EDTA) :
• 89 mM Tris HCl pH8
• 89 mM Acide Borique
• 2,5 mM EDTA
Annexe 2 : Migration électrophorétique et coloration d’un
gel d’agarose.
1. Faire migrer l’électrophorèse pendant 30 min ou 1 heure à 130 Volts.
2. La coloration du gel est réalisée par l’enseignant : après électrophorèse, le gel est incubé
10 min dans un bain de tampon TBE 0,5X contenant 20 µg/mL de Bromure d’Ethidium, puis
rincé à l’eau distillée.
3. La photo du gel est réalisée sur table UV en présence de l’enseignant.
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Annexe 3 :
Conditions pour avoir une activité enzymatique optimum
Hind III :
Tampon
recommandé
Température
d’incubation
Pour une
incubation
sur la nuit
U/µg ADN
Inactivation
thermique
Activité enzymatique, %
B G O R Tango TM
1X 1X 1X 1X 1X 2X
Tampon R 37°C 0.1 20 mn à 65°C 0-20 20-50 0-20 100 50-100 50-100
Xba I :
Tampon
recommandé
Température
d’incubation
Pour une
incubation
sur la nuit
U/µg ADN
Inactivation
thermique
Activité enzymatique, %
B G O R Tango TM
1X 1X 1X 1X 1X 2X
Tampon Tango 37°C 0.1 20 mn à 65°C 50-100 50-100 20-50 0-20 100 50-100
Composition des tampons de digestion :
Tampon 10X B
(Blue)
Tampon 10X G
(green)
Tampon 10X O
(orange)
Tampon 10X R
(red)
Tampon 10X Tango TM
(Yellow)
10mM Tris-HCl (pH7.5 à 37°C)
10mM MgCl 2
0.1 mg/mL BSA
10mM Tris-HCl (pH7.5 à 37°C)
10mM MgCl 2
50mM NaCl
0.1 mg/mL BSA
50mM Tris-HCl (pH7.5 à 37°C)
10mM MgCl 2
100mM NaCl
0.1 mg/mL BSA
10mM Tris-HCl (pH8.5 à 37°C)
10mM MgCl 2
100mM KCl
0.1 mg/mL BSA
33mM Tris acetate (pH7.9 à 37°C)
10mM Magneium acetate
66mM potassium acetate
0.1 mg/mL BSA
- 15 - LV336