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Analyse des clones bactériens transformés
Pour analyser l’ADN plasmidique des clones bactériens transformés, une réaction de
polymérisation en chaîne (PCR) est réalisée. Un couple d’amorces, encadrant la région
d’insertion, permet de tester la présence de l’insert. Après migration électrophorétique des
produits de PCR, on évaluera la taille du fragment amplifié qui révélera la présence ou non de
l’insert.
La réaction de PCR est réalisée directement sur les bactéries transformées.
1. Préparation des échantillons :
Récupérer les boîtes sur lesquelles ont poussé les clones des bactéries transformées. À l’aide d’un
embout de pipetteman jaune, prélever délicatement sur la boîte un clone isolé et le plonger dans
un tube eppendorf contenant 50µL d’H 2O stérile. Répéter l’opération sur 4 autres colonies de la
même boite avec un embout propre à chaque fois.
Attention, un excès d’extrait bactérien peut inhiber les réactions d’amplification.
2. Réaction de PCR :
La réaction de PCR est effectuée sur les 5 colonies et un témoin H 2O. Seule l’origine de l’ADN
diffère d’un test à un autre.
Afin d’éviter de pipeter de trop petits volumes et dans un souci d’homogénéité, préparer un
prémélange dans un tube de 1,5 mL contenant tous les réactifs communs aux différents tests.
Compléter le tableau ci-dessous.
Tableau à
compléter
Concentration
initiale
Concentration
finale
Tampon PCR 10X 10X 1X
H 2O distillée - -
Mélange dNTPs 10 mM 200 µM
oligo-up 50 ng/µL 2 ng/µL
oligo-down 50 ng/µL 2 ng/µL
Volume pour
1 réaction (en
µL)
(volume final de
25µL)
Volume pour
(x+1) réactions
(en µL)
Taq polymérase 1u/microL 1 U/ microL 1 U -
Solution de bactéries ou eau - - 5 -
• Effectuer le mélange réactionnel dans les tubes PCR numérotés en respectant l’ordre
suivant :
le mélange réactionnel avec l’enzyme Taq polymérase
les bactéries en solution (source d’ADN) ou l’eau (témoin négatif)
• Centrifuger brièvement les tubes avant de les mettre en place dans l’appareil PCR.
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