Déroulement des TP LV336, Outils de la Biologie ... - Page d'accueil

More documents

Recommendations

Info

Transformation par choc thermique Les produits de ligation sont introduits dans des bactéries rendues compétentes (DH5α). La transformation se fait par choc thermique. 1. Laisser décongeler lentement sur la glace les bactéries (20 µL/tube). Attention : les bactéries compétentes sont particulièrement fragiles ne pas agiter le tube pour les étapes 2 à 6. 2. Ajouter 1µL du mélange de ligation aux bactéries. Mélanger doucement avec l’extrémité du cône (ni vortex, ni pipetage). 3. Incuber les cellules sur la glace durant 10 min. 4. Pour le choc thermique : incuber exactement 30 sec à 42°C. 5. Placer le tube dans la glace 2 min. 6. Ajouter 100 µL de milieu SOC préchauffé à 37°C. 7. Incuber les cellules à 37°C dans un bain-marie, 30 min. 8. Déposer pour chaque transformation, les volumes indiqués ci-après sur des boîtes de culture LB Agar + ampicilline. Étaler à l’aide d’un râteau. Laisser sécher les boîtes avant de les retourner. 100 µL pour le témoin déphosphorylé sans insert 100 µL pour l’essai avec insert. 9. Identifier vos boîtes sur le côté et pas sur le couvercle. Incubez la boîte gélose vers le haut dans une étuve à 37°C pendant la nuit. Composition des milieux : Pour 10 mL de milieu SOC : LB : - 10 mL de milieu SOB : • Bactotryptone 20 g/L • Extrait de levure 5 g/L • NaCl 125 mM • KCl 2,5 mM - 50 µL MgCl 2 0,2 M - 0,2 mL glucose 1M - 1 % tryptone - 0,5 % d’extrait de levure - 1 % NaCl - (1,5 % de bacto-agar est ajouté si l’on veut faire du milieu LB-agar pour les boîtes de Pétri). - 8 - LV336
Préparation de la Taq polymérase La préparation de l’ADN polymérase Thermus aquaticus (Taq) est réalisée à partir d’une souche d’E.coli qui a été transformée par le plasmide pTaq qui contient le gène Taq sous contrôle d’un promoteur inductible (voir introduction). Avant ces travaux-pratiques, la souche bactérienne transformée par pTaq a été ensemencée à basse densité et mise en culture sous agitation à 37°C jusqu’à une DO=0,6. L’expression de la protéine Taq a alors été induite par addition d’IPTG (à une concentration de 0,1M). Après 14 h d’induction à 30°C, les bactéries ont été centrifugées et lavées dans le tampon A. Des culots correspondant à 100 mL de culture ont été préparés et congelés. 1. Resuspendre soigneusement le culot de bactéries dans 5 mL de tampon de prélyse (tampon A + 4mg/mL de lysozyme), incuber 15 min à température ambiante. 2. Ajouter le même volume de tampon de lyse. 3. Identifier votre tube et incuber le dans un bain marie à 90°C durant 30 min 4. Centrifuger à 10 000 rpm durant 20 min à 4°C. 5. Transférer le lysat clair dans une fiole à bouchon avec un barreau aimanté. Agiter en permanence la solution et ajouter très doucement à température ambiante la poudre de sulfate d’ammonium de façon à obtenir une concentration finale de 30% (poids/volume). 6. Centrifuger à 10 000 rpm durant 20 min à 4°C. 7. Repérer avec l’enseignant le culot, éliminer le surnageant et dissoudre le culot dans 2 mL de tampon A. Composition des tampons utilisés : - Tampon A : • 50 mM Tris HCl pH 7.9 • 50 mM Dextrose • 1 mM EDTA - Tampon de lyse : • 10 mM Tris HCl pH 7.9 • 50 mM KCl • 1 mM EDTA • 1mM Pefabloc (AEBSF) • 0,5% Tween 20 • 0,5% NP40 - Tampon de stockage : • 50 mM Tris HCl pH 7.9 • 50 mM KCl • 0,1 mM EDTA • 1mM DTT • 0,5 mM Pefabloc (AEBSF) • 50% glycérol - 9 - LV336
Page 1 and 2: Déroulement des TP LV336, Outils d
Page 3 and 4: STRATEGIE DE CLONAGE ET PURIFICATIO
Page 5 and 6: Minipréparation d’un ADN plasmid
Page 7: Déphosphorylation de l’ADN plasm
Page 11 and 12: Afin d’éviter de pipeter de trop
Page 13 and 14: 3. Pendant la réaction de PCR, pr
Page 15: Annexe 3 : Conditions pour avoir un

Déroulement des TP LV336, Outils de la Biologie ... - Page d'accueil

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?