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Séquence partielle de la région comprenant le site multiple de clonage de pET21 : Sites de restriction pour Hind III et Xba I : Hind III : 5’ A/AGCTT 3’ Xba I : 5’ T/CTAGA 3’ Séquences des oligonucléotides utilisés pour la réaction de PCR : - oligo-up (T7 promoter) : 5’ TAATACGACTCACTATAGGG 3’ - oligo-down (T7 terminator) : 5’ CTAGTTATTGCTCAGCGGT 3’ - 4 - LV336
Minipréparation d’un ADN plasmidique. Ce protocole permet de purifier rapidement (environ 10 min) un ADN plasmidique à partir d’un culot d’une culture bactérienne. Les temps d’incubation sont extrêmement importants et doivent être strictement respectés. Préparer tous les produits et le matériel avant de commencer. Vous disposez d’un culot d’Escherichia coli (DH5α) transformées par le plasmide pET-21 correspondant à 4 mL de culture bactérienne en phase stationnaire de croissance. 1. Resuspendre soigneusement le culot dans 50µL de tampon TE. Le culot doit être totalement resuspendu avant de poursuivre, vous pouvez vortexer l’échantillon. 2. Ajouter 300µL de tampon TENS, vortexer 10 sec et incuber à température ambiante jusqu’à observer un mélange visqueux. Cette étape est très importante ne dépassez pas les 5 min d’incubation. 3. Ajouter 150µL d’Acétate de Sodium 3 M pH 5,2, vortexer immédiatement 2 à 5 sec pour bien homogénéiser. 4. Centrifuger 2 min à 12 000 rpm. 5. Transférer le surnageant dans un tube eppendorf. Ajouter 2 volumes d’Ethanol 100% prérefroidi à –20°C. 6. Laisser 15 min à -20°C. 7. Centrifuger 5 min à 12 000 rpm. 8. Eliminer le surnageant en le prélevant doucement à la micropipette sans toucher le culot. 9. Ajouter 1 mL d’Ethanol 70%. Rincer soigneusement la paroi du tube. Attention le culot peut se décoller. Centrifuger 2 min à 12 000 rpm. Eliminer le surnageant. 10. Laisser évaporer totalement l’excès d’Ethanol, tube ouvert. 11. Resuspendre le culot dans 20 µL d’H 2O. 12. Prélever et conserver au froid deux échantillons de 1 µL de cet ADN plasmidique. Un échantillon sera utilisé pour estimer sur gel d’agarose la quantité d’ADN plasmidique de votre préparation, l’autre échantillon servira pour le test de PCR. Pendant l’évaporation de l’Ethanol (étape 10) préparer un gel à 0.8% d’agarose (voir annexe 1). Composition des tampons utilisés pour la minipréparation d’ADN plasmidique: TE : Tris HCl pH8 10mM EDTA 1 mM TENS : Tampon TE NaOH 0,1N SDS 0,5% - 5 - LV336
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