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Test PCR de l’activité de la Taq polymérase.
L’activité de la Taq polymérase, que vous venez de préparer, est testée par une réaction PCR avec
une série de dilutions de l’enzyme. Le couple d’amorces (oligo-up et oligo-down) utilisé pour
cette PCR, encadre la région du site multiple de clonage de l’ADN plasmidique que vous avez
préparé le 1 e jour (voir figure et séquences dans l’introduction).
Deux contrôles avec une Taq polymérase du commerce sont réalisés sur de l’ADN plasmidique
(contrôle positif) et sur de l’H 2O (contrôle négatif).
1. L’ADN plasmidique préparé le 1 e jour est dilué au 1/100 e dans de l’eau, 5µL de cette dilution
serviront pour chaque test.
2. Prélever une fraction aliquote de votre préparation de Taq polymérase et effectuer les
dilutions suivantes dans le tampon de stockage : 1/5 ; 1/10 ; 1/20 ; 1/40.
3. En vous aidant du tableau de la page suivante, calculer les volumes des différents réactifs
pour préparer le prémélange.
4. Effectuer le prémélange en omettant l’enzyme et l’ADN (voir tableau ci-après). Conserver le
tube dans la glace.
5. Effectuer le mélange réactionnel dans les micro-tubes PCR numérotés (respecter l’ordre) :
le prémélange,
soit l’ADN plasmidique dilué au 1/100 soit l’eau
l’enzyme diluée
6. Centrifuger brièvement les tubes avant de les mettre en place dans l’appareil.
Important : il est impératif de disposer vos tubes dans l’appareil en respectant les indications des
enseignants. Numéroter les micro-tubes PCR sur le côté, (pas sur le bouchon qui sera
directement en contact avec le couvercle de l’appareil).
7. Pendant la réaction PCR, préparer un gel d’agarose à 1% d’agarose pour l’électrophorèse
(selon le protocole de l’annexe 1).
8. Le volume réactionnel des échantillons PCR est de 25 µL, Calculer le volume de tampon de
dépôt 6X à ajouter à chaque tube pour avoir une concentration finale à 1X.
9. Déposer 15 µL de vos échantillons sur gel et 5µL du marqueur de taille Smart Ladder (100,
200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 1000 pb).
10. Effectuer l’électrophorèse et la coloration du gel selon le protocole de l’annexe 2.
11. Comparer avec le témoin positif (1 unité de Taq polymérase du commerce) les intensités des
bandes d’ADN amplifié dans les différentes conditions testées. Voir avec l’enseignant la
dilution à utiliser pour les expériences de PCR suivantes.
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