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Transformation 1- Transformation des bactéries compétentes DH5α par choc thermique. 2- Sélection des clones bactériens transformés sur boîte de culture LB Agar + ampicilline. Analyse des colonies de bactéries transformées par un test PCR 1- Analyse des clones bactériens obtenus par un test PCR réalisé directement sur colonies bactériennes - Réalisation de la PCR. - Analyse des produits PCR après dépôt et électrophorèse sur gel d’agarose. 2- Interprétation et discussion. Vous consignerez le but de chaque expérience, les déviations au protocole et les résultats obtenus ainsi que leur interprétation dans un cahier qui sera tenu à jour par l’étudiant. - 2 - LV336
STRATEGIE DE CLONAGE ET PURIFICATION D’UNE PROTEINE Le clonage permet d’isoler et d’amplifier une séquence donnée d’ADN. Cette opération nécessite l’insertion de la séquence à cloner dans un vecteur susceptible d’être répliqué (étapes de digestion enzymatique et de ligation). Le vecteur recombinant est introduit dans une bactérie compétente (étape de transformation) pour assurer sa réplication. Les bactéries transformées sont cultivées sur un milieu sélectif où elles forment des clones correspondant à un type de vecteur recombinant (étape d’amplification et de sélection). Un vecteur est une molécule d’ADN capable de se répliquer de façon autonome dans une cellule hôte. C’est le cas des plasmides, cosmides, bactériophages, virus, chromosomes artificiels de bactéries et de levures. Ces vecteurs peuvent intégrer des fragments d’ADN exogènes, ce qui permet de les amplifier. Le choix du vecteur dépend de la taille et de la nature des fragments que l’on veut cloner : - Les plasmides, dans lesquels on peut insérer des fragments d’ADN de 0 à 10-15 kpb ; - Les phages acceptent des fragments de plus grande taille, jusqu’à 20 kpb ; ces particules infectent les bactéries hôtes qui amplifient l’ADN du phage, se lysent et libèrent de nouvelles particules phagiques - Les cosmides permettent d’insérer des fragments dont la taille peut atteindre 47 kpb. Ils utilisent certaines propriétés du phage (l’infection), mais ne peuvent donner naissance à des particules infectieuses, ce qui les rapproche des plasmides. - Les chromosomes artificiels de bactérie ou de levure sont utilisés pour analyser de grands fragments d’ADN génomique (200 à 500 kpb). Quel que soit le vecteur choisi, le clonage requiert deux étapes : l’insertion du fragment à amplifier dans le vecteur et l’identification du fragment recherché. Le but de ces TP est de placer la séquence codante du gène erf1 (1398 pb) dans le vecteur de clonage et d'expression pET-21d (5443 pb, voir figure page suivante). En parallèle de ce clonage, vous allez préparer l’ADN polymérase Thermus aquaticus (Taq) à partir d’une souche d’E.coli qui a été transformée par le plasmide pTaq qui contient le gène Taq sous le contrôle d’un promoteur inductible. Ce plasmide permet l’expression de l’enzyme Taq polymérase fonctionnelle. Le promoteur utilisé est extrêmement efficace et permet un contrôle temporel de l’initiation de la transcription grâce à une induction par l’IPTG. Ainsi, il est possible d’induire l’expression de la protéine Taq polymérase à un taux maximum dans les conditions optimales de culture, c’est-à-dire quand la culture bactérienne est en croissance exponentielle à densité élevée. Le respect de ces conditions de culture est important pour avoir une induction optimale de la protéine. En travaillant sur des temps relativement courts d’induction et donc de production de protéines, nous évitons son accumulation. En effet, la présence massive de la protéine étrangère peut gêner, voire inhiber la croissance des bactéries, et par conséquent, diminuer le rendement final. Avec une telle stratégie, la quantité de la protéine Taq polymérase produite peut représenter jusqu’à 10 % des protéines totales de l’extrait bactérien. L’enzyme Taq polymérase préparée lors des travaux pratiques sera testée puis utilisée pour la PCR de discrimination des clones obtenus après transformation par le vecteur recombinant pET-erf1. - 3 - LV336
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