Étude de la réalisation d'un thermocycleur assisté par onde ... - Cnfm

surface permettant l’intégration, sur une même puce, de
plusieurs processus [9-11]. Notons que lorsque l’on
chauffe ou que l’on actionne la goutte, on observe aussi
un mélange interne.
L’objectif de notre projet est de réaliser un laboratoire
sur puce avec, comme principale fonction, la duplication
de brins d’ADN par réaction de type PCR (Polymerase
Chain Reaction). La réaction PCR consiste à effectuer des
cycles de températures. Chaque cycle s’effectue en trois
étapes : la première est la dénaturation (séparation de la
double hélice en deux monobrins) à 95°C, la seconde est
l’hybridation (fixation de l’amorce sur les monobrins qui
sert de point de départ à la duplication) entre 50 et 60°C
et la troisième est l’élongation (ajout successif des
nucléotides à partir de l’amorce avec l’aide de la
polymérase) à 72°C. On passe donc d’un double brin
d’ADN à deux doubles brins. A chaque cycle, on
multiplie par deux la quantité initiale d’ADN. A l’aide
des ondes de Rayleigh, ces températures peuvent être
atteintes avec des liquides assez visqueux, de l’ordre de
100mPa.s et en modulant l’énergie de l’onde élastique.
1.3 Problématique
Des thermocycleurs industriels permettant de
dupliquer des brins d’ADN par PCR existent depuis les
années 80. Ces thermocycleurs présentent l’avantage de
paralléliser de nombreuses réactions. En revanche, le
chauffage étant résistif, l’inertie thermique est grande ce
qui provoque des durées de cycles assez longs. De plus, il
a été montré qu’il est difficile de dupliquer de l’ADN
avec des liquides visqueux. La Figure 3 nous présente
l’évolution du rendement de la duplication d’ADN en
fonction de la viscosité du milieu (pourcentage
volumique de glycérol dans un mélange eau/glycérol)
pour un thermocycleur industriel. On constate qu’au-delà
d’une certaine viscosité, le rendement chute jusqu'à
s’annuler. En effet, la probabilité de rencontre des
espèces dans le milieu diminue lorsque la viscosité
augmente.
L’avantage de l’utilisation des ondes élastiques de
surfaces est que plus la viscosité du liquide augmente,
plus on le chauffe tout en effectuant un mélange interne.
Par conséquent, on augmente la probabilité de rencontre
des espèces et on améliore le rendement de la réaction de
PCR. Il est donc possible d’imaginer la duplication
d’ADN par PCR en microgoutte à des viscosités
supérieurs de celles des milieux réactionnels des
thermocycleurs. De plus, l’inertie thermique de notre
microsystème est bien plus faible que son homologue.
Les constantes de temps sont de l’ordre de 3 à 4 secondes
ce qui permettrait d’obtenir des cycles de PCR bien plus
court et donc un gain de temps non négligeable pour des
expériences typiques de 30 cycles.
Avant de réaliser un tel système, nous avons voulu
vérifier si les ondes élastiques de surface ont un
comportement destructeur vis-à-vis des espèces
biologiques nécessaires à la réaction PCR. Nous avons
donc irradié toutes les espèces puis réalisé la duplication
d’ADN par thermocycleur industriel. Dans le cas ou la
duplication serait faible, nous ciblerions chaque espèce et
déterminerions laquelle ou lesquelles sont sensibles à
l’échauffement dû aux ondes élastiques de surface.
Rendement de la réaction
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Figure 3. Rendement de la réaction de PCR en
fonction de la viscosité (% volumique de glycérol dans
un mélange Eau/Glycérol) pour un thermocycleur
Pour effectuer ces manipulations, nous avons
collaboré avec l’équipe du Professeur Becuwe (Unité de
recherche : Signalisation, Génomique et Recherche
Translationnelle en Oncologie, SIGRETO, EA 4421 –
Cancéropôle Grand Est) qui nous a fournis de nombreux
échantillons contenant les espèces nécessaires à la
réaction de PCR.
2. Procédure expérimentale
Pour générer les ondes de Rayleigh, nous utilisons,
comme matériau piézoélectrique, le niobate de lithium
(LiNbO3) de coupe Y+128° qui présente un coefficient de
couplage élevé (K² ≈ 5%) pour la direction de
propagation X. La vitesse de propagation des ondes de
Rayleigh est de 3993m.s -1 pour cette même direction. Le
motif des IDT est transféré par photolithographie en
utilisant la résine positive S1813 en effectuant un lift-off.
Le métal des électrodes est de l’aluminium déposé par
pulvérisation cathodique avec un courant continu de
0,33A et une tension de 326V, un flux d’argon de 16sccm
et une pression de 0,0032mbar. La durée de dépôt est de
200s ce qui donne une épaisseur d’aluminium de 150nm.
La longueur d’onde λ des électrodes est de 100µm. La
fréquence d’excitation est f = v / λ = 39,937 MHz. Le
taux de métalisation des IDT est de 0,5 afin de limiter les
harmoniques impaires. Le dispositif est adapté à 50Ω
pour recevoir le maximum de puissance.
Les échantillons sont constitués de brins d’ADN
MCF7 obtenuent par transcription inverse d’ARN
messagés de cellules mammaires cancéreuses, de
l’enzyme polymérase Taq, de nucléotides ainsi que de
l’amorce β-actine spécifique aux brins d’ADN à
dupliquer.
Ensuite, nous avons irradié ces échantillons d’une part
avec différentes puissances pendant un temps fixé,
d’autre part avec différentes durées à puissance constante.
Nous avons par la suite retourné les échantillons au
laboratoire SIGRETO. Des cycles de PCR « classique »
avec un thermocycleur industriel puis la quantification
par électrophorèse dans un gel d’Agarose ont été réalisés.
3. Résultats
0% 10% 20% 30% 40% 50%
% volumique de glycérol dans un
mélange Eau/Glycérol
L’électrophorèse dans le gel d’Agarose est la
migration de séquences d’ADN soumis à un champ
électrique. On y trouve deux informations importantes : la