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Étude de la réalisation d’un thermocycleur assisté par onde élastique de surface
Thibaut ROUX-MARCHAND
Université Henri Poincaré
Institut Jean Lamour (I.J.L) – UMR 7198 CNRS
Boulevard des Aiguillettes B.P. 70239
54506 Vandoeuvre-lès-Nancy Cedex
Denis BEYSSEN, I.J.L
Frédéric SARRY, I.J.L
Stéphanie GRANDEMANGE, S.I.G.R.E.T.O
9 avenue de la Forêt de Haye B.P. 184
54505 Vandoeuvre-lès-Nancy Cedex
Email : Thibaut.Roux-Marchand@ijl.nancy-universite.fr
Résumé
Les dispositifs à ondes élastiques de surface ont démontré
un certain potentiel pour la réalisation de laboratoire sur
puce. Un des principaux effets est l’échauffement d’un liquide
placé sur la trajectoire de l’onde. L’objectif de nos travaux est
de concevoir un laboratoire sur puce avec, comme principale
fonction, la duplication de brins d’ADN par cycle de
température (Polymérase Chain Reaction, PCR). Avant de
réaliser ce système, nous avons montré que les ondes
élastiques de surface ont un comportement non destructeur
vis-à-vis des espèces biologiques nécessaires à la PCR.
Nous commençons par rappeler le principe de la
génération des ondes élastiques de surface ainsi que les
différentes interactions qu’il existe avec une goutte déposée
sur la trajectoire de l’onde. Nous exposons les résultats du
comportement des ondes sur les espèces, puis nous concluons
et présentons les perspectives de nos recherches.
1. Introduction
L’utilisation des dispositifs à onde élastique de surface
a explosé grâce au domaine de la télécommunication. Ils
se sont révélés très efficaces pour la réalisation de filtres
passe bande ainsi que pour le traitement de signaux [1-2].
Plus récemment, ce sont au niveau des capteurs qu’ils ont
apporté leurs avantages. En effet, on peut les utiliser
comme capteur de pression, de température ou encore de
gaz avec la possibilité de les interroger à distance,
l’énergie d’alimentation étant contenue dans le signal
d’interrogation fourni par une source extérieure, à
distance du capteur [3].
Dernièrement, pour la conception de laboratoire sur
puce, il est possible d’utiliser des ondes élastiques de
surface. La première publication concernant l’utilisation
de ces ondes en tant que moyen d’actionner des gouttes
est parue à la fin des années 1980 [4]. Depuis, de
nombreux travaux ont été effectués à travers le monde
permettant d’affirmer la capacité des dispositifs à ondes
élastiques de surface à s’intégrer comme outils de travail
sur des biopuces ou laboratoires sur puce [5-8].
1.1 Les ondes élastiques de surface
Le principe de génération des ondes élastiques de
surface s’appuie sur les propriétés piézoélectriques du
matériau. On réalise des transducteurs inter-digités (Inter-
IDT
Substrat
piézoélectrique
Figure 1. Exemple de dispositif à onde élastique de
surface
Digit Transducteur, IDT) en métal de périodicité λ
comme le montre la Figure 1. Connaissant la vitesse v de
l’onde élastique de surface dans le matériau
piézoélectrique, on excite l’IDT avec un signal électrique
de fréquence f = v/λ pour générer cette onde élastique.
1.2 Interaction onde/liquide
λ Onde élastique de
surface
Il existe différents types d’ondes élastiques de surface.
Nous utilisons l’onde de Rayleigh qui permet d’interagir
avec des liquides. Elle est constituée de deux
composantes : une longitudinale et une transversale. C’est
cette dernière qui permet l’interaction avec le liquide.
L’onde de Rayleigh est fortement atténuée à l’interface
liquide/solide. En s’atténuant, elle cède son énergie au
liquide sous forme d’ondes de compression dans le
liquide suivant un angle θR appelé angle de Rayleigh
(Figure 2).
L’interaction induit, selon l’amplitude de l’onde de
Rayleigh, un écoulement interne à la goutte, un
échauffement, l’actionnement, voir l’atomisation pour de
très forte puissance de l’onde incidente. On remarque
donc la polyvalence des dispositifs à ondes élastiques de
IDT
θR
Liquide
Substrat
piézoélectrique
Figure 2 : Interaction entre l'onde de Rayleigh et un
liquide

surface permettant l’intégration, sur une même puce, de
plusieurs processus [9-11]. Notons que lorsque l’on
chauffe ou que l’on actionne la goutte, on observe aussi
un mélange interne.
L’objectif de notre projet est de réaliser un laboratoire
sur puce avec, comme principale fonction, la duplication
de brins d’ADN par réaction de type PCR (Polymerase
Chain Reaction). La réaction PCR consiste à effectuer des
cycles de températures. Chaque cycle s’effectue en trois
étapes : la première est la dénaturation (séparation de la
double hélice en deux monobrins) à 95°C, la seconde est
l’hybridation (fixation de l’amorce sur les monobrins qui
sert de point de départ à la duplication) entre 50 et 60°C
et la troisième est l’élongation (ajout successif des
nucléotides à partir de l’amorce avec l’aide de la
polymérase) à 72°C. On passe donc d’un double brin
d’ADN à deux doubles brins. A chaque cycle, on
multiplie par deux la quantité initiale d’ADN. A l’aide
des ondes de Rayleigh, ces températures peuvent être
atteintes avec des liquides assez visqueux, de l’ordre de
100mPa.s et en modulant l’énergie de l’onde élastique.
1.3 Problématique
Des thermocycleurs industriels permettant de
dupliquer des brins d’ADN par PCR existent depuis les
années 80. Ces thermocycleurs présentent l’avantage de
paralléliser de nombreuses réactions. En revanche, le
chauffage étant résistif, l’inertie thermique est grande ce
qui provoque des durées de cycles assez longs. De plus, il
a été montré qu’il est difficile de dupliquer de l’ADN
avec des liquides visqueux. La Figure 3 nous présente
l’évolution du rendement de la duplication d’ADN en
fonction de la viscosité du milieu (pourcentage
volumique de glycérol dans un mélange eau/glycérol)
pour un thermocycleur industriel. On constate qu’au-delà
d’une certaine viscosité, le rendement chute jusqu'à
s’annuler. En effet, la probabilité de rencontre des
espèces dans le milieu diminue lorsque la viscosité
augmente.
L’avantage de l’utilisation des ondes élastiques de
surfaces est que plus la viscosité du liquide augmente,
plus on le chauffe tout en effectuant un mélange interne.
Par conséquent, on augmente la probabilité de rencontre
des espèces et on améliore le rendement de la réaction de
PCR. Il est donc possible d’imaginer la duplication
d’ADN par PCR en microgoutte à des viscosités
supérieurs de celles des milieux réactionnels des
thermocycleurs. De plus, l’inertie thermique de notre
microsystème est bien plus faible que son homologue.
Les constantes de temps sont de l’ordre de 3 à 4 secondes
ce qui permettrait d’obtenir des cycles de PCR bien plus
court et donc un gain de temps non négligeable pour des
expériences typiques de 30 cycles.
Avant de réaliser un tel système, nous avons voulu
vérifier si les ondes élastiques de surface ont un
comportement destructeur vis-à-vis des espèces
biologiques nécessaires à la réaction PCR. Nous avons
donc irradié toutes les espèces puis réalisé la duplication
d’ADN par thermocycleur industriel. Dans le cas ou la
duplication serait faible, nous ciblerions chaque espèce et
déterminerions laquelle ou lesquelles sont sensibles à
l’échauffement dû aux ondes élastiques de surface.
Rendement de la réaction
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Figure 3. Rendement de la réaction de PCR en
fonction de la viscosité (% volumique de glycérol dans
un mélange Eau/Glycérol) pour un thermocycleur
Pour effectuer ces manipulations, nous avons
collaboré avec l’équipe du Professeur Becuwe (Unité de
recherche : Signalisation, Génomique et Recherche
Translationnelle en Oncologie, SIGRETO, EA 4421 –
Cancéropôle Grand Est) qui nous a fournis de nombreux
échantillons contenant les espèces nécessaires à la
réaction de PCR.
2. Procédure expérimentale
Pour générer les ondes de Rayleigh, nous utilisons,
comme matériau piézoélectrique, le niobate de lithium
(LiNbO3) de coupe Y+128° qui présente un coefficient de
couplage élevé (K² ≈ 5%) pour la direction de
propagation X. La vitesse de propagation des ondes de
Rayleigh est de 3993m.s -1 pour cette même direction. Le
motif des IDT est transféré par photolithographie en
utilisant la résine positive S1813 en effectuant un lift-off.
Le métal des électrodes est de l’aluminium déposé par
pulvérisation cathodique avec un courant continu de
0,33A et une tension de 326V, un flux d’argon de 16sccm
et une pression de 0,0032mbar. La durée de dépôt est de
200s ce qui donne une épaisseur d’aluminium de 150nm.
La longueur d’onde λ des électrodes est de 100µm. La
fréquence d’excitation est f = v / λ = 39,937 MHz. Le
taux de métalisation des IDT est de 0,5 afin de limiter les
harmoniques impaires. Le dispositif est adapté à 50Ω
pour recevoir le maximum de puissance.
Les échantillons sont constitués de brins d’ADN
MCF7 obtenuent par transcription inverse d’ARN
messagés de cellules mammaires cancéreuses, de
l’enzyme polymérase Taq, de nucléotides ainsi que de
l’amorce β-actine spécifique aux brins d’ADN à
dupliquer.
Ensuite, nous avons irradié ces échantillons d’une part
avec différentes puissances pendant un temps fixé,
d’autre part avec différentes durées à puissance constante.
Nous avons par la suite retourné les échantillons au
laboratoire SIGRETO. Des cycles de PCR « classique »
avec un thermocycleur industriel puis la quantification
par électrophorèse dans un gel d’Agarose ont été réalisés.
3. Résultats
0% 10% 20% 30% 40% 50%
% volumique de glycérol dans un
mélange Eau/Glycérol
L’électrophorèse dans le gel d’Agarose est la
migration de séquences d’ADN soumis à un champ
électrique. On y trouve deux informations importantes : la

distance de migration révèle la longueur des séquences
d’ADN dupliquées et l’intensité des empruntes nous
informe de la quantité de séquences d’ADN dupliquées.
Un exemple est présenté Figure 4. Les nombres impairs
sont les échantillons de références (mêmes conditions
expérimentales mais non-irradiées) tandis que les pairs
sont les échantillons irradiés. A gauche de la figure, on
observe une référence de taille. On remarque que toutes
les traces sont au même niveau, ce qui signifie que
l’ADN dupliquée a bien la même taille. Par ailleurs, on
constate que les empruntes sont plus ou moins intenses.
Cela révèle que la quantité d’ADN dupliqué n’est pas
forcement la même entre la référence et l’échantillon
irradié.
La Figure 5 présente les mesures de densité de brins
d’ADN pour plusieurs puissances d’irradiations avec les
échantillons de références et ceux irradiés. La durée des
expériences est de deux minutes et le volume des
microgouttes est de 20µL. On constate une certaine
différence entre les échantillons irradiés et ceux de
références : A partir de 25dBm, la densité de brins
dupliqués se stabilise. En appliquant ces puissances, nous
réalisons un certain échauffement, de l’ordre d’une
quinzaine de degré à 31dBm, ce qui provoque
l’évaporation d’un certain volume de la microgoutte. Par
ailleurs, le mélange interne doit favoriser l’adsorption des
brins d’ADN à l’interface solide/liquide. Ces deux
phénomènes contribuent à l’écart entre les échantillons
irradiés et ceux de références.
La Figure 6 présente les mesures de densité de brins
d’ADN pour différentes durées d’irradiation avec les
échantillons de références et ceux irradiés. La puissance a
été fixée à 25dBm (315mW) et le volume des
microgouttes est de 20µL. L’échauffement de la
Densité (brins/mm²)
1
Figure 4. Photographie de la migration de l'ADN dans
le gel d'agarose
12
10
8
6
4
2
0
x 10 4
2
3
4
20 25 28 31
Puissance d'irradiation (dB m)
Ref
Figure 5. Densité de brins d'ADN en fonction de la
puissance d'irradiation avec en bleu, les échantillons
de références et en rouge, ceux irradiés pour une
durée d’irradiation de deux minutes
5
6 8
7
9
Irr
10
Densité (brins/mm²)
6
5
4
3
2
1
0
x 10 4
1' 2' 3' 5' 7'
Temps d'irradiation (mn)
Figure 6. Densité de brins d'ADN en fonction du temps
d'irradiation avec en bleu, les échantillons de
références et en rouge, ceux irradiés pour une
puissance de 25dBm
microgoutte est de l’ordre de 5°C. Tout d’abord, on
constate que pour les échantillons de référence, la densité
diminue avec l’augmentation de la durée d’irradiation.
On peut attribuer ce phénomène à l’évaporation d’un
certain volume de la microgoutte ce qui concentre les
brins d’ADN et doit favoriser donc l’adsorption à
l’interface liquide/solide. Par ailleurs, l’écart entre les
échantillons de références et ceux irradiés est lié aux
mêmes effets que l’expérience précédente : le mélange
interne et l’échauffement de la microgoutte amplifient
l’adsorption.
On peut dire qu’à ces puissances, les ondes élastiques
ne semblent pas être destructrices vis-à-vis du milieu
réactionnel. Bien sur, une étude plus approfondie du
phénomène d’adsorption et d’évaporation doit être
réalisée.
4. Conclusion et perspectives
Ref
Irr
Nous avons mis en évidence que les ondes élastiques
de surface de type Rayleigh ne sont pas destructrices visà-vis
des composés biologiques nécessaires à la PCR,
pour des puissances de 20 à 31dBm et des temps
d’irradiation variant de 1 à 7 minutes. Nous pouvons
donc chauffer des microgouttes avec des ondes de
Rayleigh et réaliser à court terme une réaction de type
PCR assistée par ondes élastiques. Il faudra, bien
évidemment, remédier au problème d’adsorption et
d’évaporation. Guttenberg et al. [12] ont proposé un
microsystème à base d’onde élastique de surface capable
de dupliquer des brins d’ADN par PCR. La goutte
contenant le milieu réactionnel est stabilisée dans de
l’huile ce qui limite l’évaporation et l’adsorption des
brins d’ADN. Un mélange est réalisé par les ondes
élastiques de surface ce qui permet de réduire la durée
d’un cycle à 20 secondes. Seulement 10 minutes sont
nécessaires pour réaliser 30 cycles de PCR. L’élévation
en température, elle, est réalisée par une résistance
chauffante en platine qui pourrait être remplacé par les
ondes élastiques de surface.
Nous travaillons actuellement sur un microsystème
multicouche permettant de chauffer suffisamment, par
onde élastique de surface, les microgouttes pour réaliser
une réaction de PCR. Le système, présenté Figure 7, est
constitué d’un substrat de niobate de lithium de coupe
Y+128° ainsi que d’une couche isolante électriquement et

K² (%)
Figure 7. Micro-Système en cour de développement
6,5
6
5,5
5
4,5
4
3,5
Figure 8. Simulation du coefficient de couplage en
fonction de l'épaisseur normalisée de la couche de
nitrure d'aluminium avec un substrat de niobate de
lithium de coupe Y+128° et de direction de
propagation X, h est l’épaisseur d’AlN et k=2.π/λ.
conductrice thermiquement qui nous permet de placer
directement notre microgoutte sur les électrodes.
Nous avons choisi le nitrure d’aluminium (AlN) pour
ces propriétés thermique et isolante adéquates. La
microgoutte capte donc toute l’énergie de l’onde de
Rayleigh. Des simulations nous ont montré qu’une faible
épaisseur d’AlN ne dégrade pas notre onde mais améliore
le coefficient de couplage (Figure 8), ce qui correspond
aux simulations de Ro et al. [13]. Pour une epaisseur
d’AlN normalisée de 0,06, le coefficient de couplage
atteind 6,1%. En utilisant des IDT dont la periodicité λ est
23µm, il nous faut déposer une épaisseur d’AlN
0,06 0,06.
220
2.
qui recouvre les électrodes d’épaisseur 150nm et les
protège de la microgoutte et de tout court-circuit. Ainsi, il
devrait être possible de chauffer et de mélanger nos
microgouttes afin de réaliser des cycles de PCR.
Références
IDT
Substrat piézoélectrique
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14
hk
Couche isolante d’AlN
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