TP 12 - modification..

1 ère S, SVT, 05-06 1/2
1. situation dans le cours et but du TP
TP 12
Les conditions de l’activité enzymatique
Une enzyme permet de réaliser une catalyse biologique, c'est-à-dire d’accélérer une réaction :
Enzyme
Substrats
Produits
L’étude de l’amylase pancréatique (TP 11) a permis de mettre en évidence cette propriété de catalyseur d’une enzyme. De
plus, on a pu noter dans ce cas une influence de la température : la réaction a été catalysée à 35°C, mais pas à 0°C.
On peut donc se demander quelles conditions peuvent influer sur l’activité d’une enzyme.
2. enzyme et principes du TP
On se propose d’étudier par ExAO (Expérimentation Assistée par Ordinateur) l’activité de la peroxydase du raifort :
- cette enzyme est présente en grande quantité dans le raifort, ou radis noir ; on utilise donc un extrait de radis noir
dilué ;
- cette enzyme agit à température ambiante ;
- elle catalyse la réaction suivante, permettant d’éliminer le peroxyde d’hydrogène (« eau oxygénée »), composé
potentiellement dangereux pour les composés cellulaires :
H 2 O 2 H 2 O + ½ 0 2
Pour mesurer l’activité de la peroxydase, on utilise une réaction colorimétrique : la présence de dioxygène induit la
formation d’un composé coloré, en présence de gaïacol :
0 2 + gaïacol (incolore) gaïacoquinone (rouge)
Grâce à un colorimètre, on mesure le passage d’un faisceau lumineux à travers la solution :
- en présence de gaïacol, incolore, 100% du faisceau lumineux traverse la solution ;
- en présence de gïacoquinone, rouge, 0% du faisceau lumineux traverse la solution.
Le colorimètre est relié à une interface ExAO, qui permet de tracer la courbe obtenue en fonction du temps sur l’ordinateur.
Principales fonctions du logiciel :
réglage des paramètres de l’expérience
vumètre : affichage des valeurs mesurées
début de la mesure
arrêt des mesures (à faire obligatoirement à la fin de chaque mesure, une fois le temps écoulé)
Par défaut, les courbes d’expérience successives sont superposées. On peut effacer les courbes de l’écran en cliquant avec
le bouton droit de la souris, et en choisissant « effacer les données ».
3. matériel disponible
Interface Orphy GTS II, module colorimétrique et PC
9 tubes à essai
6 pipettes de 2 mL, 1 pipette de 5 mL et propipettes
8 cuve colorimétriques
au bureau :
H2O2 à 1%
H2O2 à 3%
Peroxydase 1X
Peroxydase en milieu acide 1X
Peroxydase en milieu basique 1X
Gaïacol 1‰
4. préparation du matériel informatique
Allumer l’interface ExAO (Orphy GTS II)
Ouvrir le logiciel « Visuel Orphy »
Choisir « mesures directes »
Choisir comme capteur : « colorimètre 100% »
Brancher le module colorimétrique suivant les indications fournies par le logiciel ; positionner le bouton sur
« bleu »
Choisir « temporel », puis cliquer sur poursuivre jusqu’à arriver sur le graphe vide.
Dans les paramètres, indiquer un temps de mesure de 120 secondes, avec environ 1 mesure toutes les 1,2 secondes.
TP 11

1 ère S, SVT, 05-06 2/2
5. protocole des mesures (commun à toutes les expériences)
- dans une cuve colorimétrique, déposer 1,5 mL de gaïacol et 1,5 mL de solution de peroxydase
- placer la cuve dans le colorimètre, et préparer une seringue avec 1 mL de substrat
- lancer la mesure (qui dure 2 minutes)
- après 20 à 30 secondes, injecter le substrat à travers l’adhésif (il ne faut surtout pas ouvrir l’enceinte, ni faire de
bulles : injecter doucement !)
- une fois l’expérience terminée (120 secondes), arrêter les mesures.
Rincer tout de suite les cuves de colorimétrie, et les placer dans la bassine prévue à cet effet.
6. expériences communes à réaliser
Expérience « conditions témoins » :
Réaliser une expérience avec la solution de peroxydase 1X et l’eau oxygénée à 1%.
Enregistrer le graphe dans le répertoire élève, sous le nom : 3BINOME1.grf (avec « BINOME » = initiales des membres du
binôme)
Ne pas effacer les données avant l’expérience suivante !
Expériences « pH » :
Réaliser deux expériences, avec l’eau oxygénée à 1% et :
- la solution de peroxydase en milieu acide (pH = ……)
- la solution de peroxydase en milieu basique (pH = ……)
Enregistrer le graphe dans le répertoire élève, sous le nom : 3BINOME2.grf
Effacer les données de l’écran : clic droit avec la souris, et « effacer les données ».
7. expériences par demi-groupe
Selon les instructions du professeur, réaliser l’expérience A ou l’expérience B.
Expérience A :
Préparer trois dilutions de l’enzyme : 2 fois (0,5 X), 10 fois (0,1 X) et 100 fois (0,01 X). (prévoir 5 à 10 mL de solution
diluée, pour pouvoir effectuer plusieurs fois les mesures si nécessaire)
Réaliser quatre expériences, avec l’eau oxygénée à 1% et les quatre solutions de peroxydase (1 X ; 0,5 X ; 0,1 X ; 0,01 X).
Enregistrer le graphe dans le répertoire élève, sous le nom : 3BINOMEA.grf
Expérience B :
Préparer 3 dilutions de l’eau oxygénée à partir de la solution à 1% : diluée 200 fois, diluée 500 fois et diluée 1000 fois.
Réaliser quatre expériences, avec la peroxydase 1X et les quatre solutions d’eau oxygénée (1, 1/200, 1/500, 1/1000).
Enregistrer le graphe dans le répertoire élève, sous le nom : 3BINOMEB.grf
Si vous avez assez de temps (à voir selon l’avancement de votre compte-rendu), réaliser l’expérience (A ou B) non
réalisée.
8. Bilan et compte-rendu
Quelles conditions expérimentales semblent influer sur l’activité enzymatique de la peroxydase
Rédiger un compte-rendu, intégrant :
- Une introduction, rappelant en particulier le problème à résoudre
- Les différentes conditions expérimentales réalisées
- Les résultats obtenus
- L’interprétation des résultats obtenus
- Une conclusion, réalisant une synthèse de ces interprétations, et la réponse à la question posée
Avant de partir : ramener les tubes et pipettes sales dans le seau prévu à cet effet, ramener les cuves colorimétriques dans
le seau prévu à cet effet, fermer Visuel Orphy et éteindre l’interface, débrancher le module colorimétrique. Vérifier que
vous laisser une paillasse propre pour le groupe suivant ou la classe suivante !
TP 11