MT21255 - Pierron

LA REACTION DE HILLMT21255DVD scientifique et pédagogique de 13 minutesCe film a été conçu pour s’intégrer dans la partie de programme de première scientifique suivante:“Flux d’énergie et cycle de la matière a l’échelle des écosystèmes et de la biosphère” -“L’énergie du rayonnement solaire, source initiale d’énergie pour la majorité des êtres vivantsd’un écosystème.” - “Conversion de l’énergie radiative en énergie chimique chez les organismeschlorophylliens.”Dans ce DVD, il s’agit de montrer comment une expérience qui s’intègre dans les programmespeut être réalisée dans un grand laboratoire de recherche. La réaction de Hill est une expériencequi permet d’aborder certains aspects de la photosynthèse. Elle met en évidence l’existence derelation entre structure et fonction au niveau des chloroplastes. C’est ainsi que l’on peut suivresa préparation, sa réalisation et ses résultats. C’est une bonne introduction pour que les élèvespuissent la réaliser en Ex.A.O. ainsi qu’un moyen de voir s’ils ont compris ce type d’expérience.Ce document n’est pas conçu pour remplacer une réelle expérimentation par les élèves avec dumatériel de type lycée, c’est un complément qui peut être utilisé avant ou après l’expérimentation.Nous tenons à remercier le directeur de l’Ecole Normale Supérieure qui nous a autorisé à travaillerdans son établissement.Les principales séquences du vidéogramme (la durée de chaque séquence est indiquée enitalique à la fin de chaque paragraphe)MT21255PIERRON Education - Parc Industriel Sud - Z.I. Gutenberg - 2, rue Gutenberg- B.P. 80609- 57206 SARREGUEMINES CEDEXTél. : 03 87 95 14 77 Fax : 03 87 98 45 91- E-mail : education-france@pierron.fr http://www.pierron.com1

Séquence 1 : introduction.Il s’agit de poser le problème par un zoom de la forêt à l’intérieur de la feuille où se dessine leschloroplastes. Les végétaux chlorophylliens sont capables de réaliser leurs synthèses organiques àpartir d’éléments minéraux et d’énergie lumineuse. Ils utilisent en particulier le dioxyde de carboneatmosphérique comme source de carbone: ils sont dits autotrophes pour le carbone. Une desconséquences de cette photosynthèse est l’émission de dioxygène à partir de l’eau. La feuille estl’organe qui réalise cette production de dioxygène, en utilisant l’énergie solaire grâce aux pigmentschlorophylliens contenus dans un organite cellulaire appelé chloroplaste. La réaction de Hill permetd’illustrer quelques aspects de la chimie de la photosynthèse, en particulier la liaison entrestructures et fonction dans le chloroplaste.Durée: 50 secondesSéquence 2 : préparation d’une suspension de chloroplastes.Les feuilles sont d’abord soigneusement lavées à l’eau courante. Elles sont ensuite découpées enfines lanières. Une solution tampon, de pH constant et iso-osmotique aux chloroplastes, refroidie à4 degrés Celsius, est ajoutée dans un mortier. Un broyage énergique permet de casser les celluleset de libérer les chloroplastes. Du tampon est ajouté pour diluer le broyat et faciliter la filtration quiva éliminer les débris de feuilles et les cellules entières. Dès cet instant, l’échantillon biologiquesera toujours au froid pour assurer sa conservation. Deux tubes contenant le filtrat sont soigneusementéquilibrés en masse avant la centrifugation. Les deux tubes sont placés l’un en face de l’autredans le rotor d’une centrifugeuse préalablement refroidi. La première centrifugation réalisée à 4degrés Celsius dure 5 minutes à 600 tours par minute, soit une accélération de 100 g. Le surnageantest récupéré. Le tube contenant le surnageant est toujours placé dans la glace. Les débris lesplus denses, principalement les parois des cellules et les noyaux, sont dans le culot qui est éliminé.Après rééquilibration des deux nouveaux tubes, une deuxième centrifugation va permettre deconcentrer les chloroplastes. Toujours à 4 degrés Celsius, elle se fait à 2000 tours par minute, soit1000 g, pendant 10 minutes. Cette fois, le surnageant est éliminé. Le culot est enrichi en chloroplastes.Un peu de solution tampon est ajoutée pour remettre les chloroplastes en suspension, àl’aide d’un pinceau. L’observation de cette suspension au microscope photonique à divers grossissementspermet de voir les chloroplastes.Durée: 4 minutes 15 secondesSéquence 3 : réaction de HiIl à partir de la suspension de chloroplastes.La cuve à réaction est remplie avec i millilitre de solution tampon. Elle comprend une électrode àdioxygène. Une source lumineuse est couplée à la cuve à réaction. Un bain thermostatique règle latempérature à 18 degrés Celsius. 100 microlitres de la suspension de chloroplastes sont ajoutésdans la cuve. Le début de l’expérience se passe à l’obscurité. L’ordinateur trace la courbe de laconcentration en dioxygène dans la cuve, en fonction du temps. La deuxième étape consiste àéclairer la cuve. La troisième étape de l’expérience est une injection de ferricyanure de potassium,en conservant la lumière. Pour la quatrième et dernière étape de l’expérience, la lumière est éteinte.La courbe obtenue permet de mettre en évidence à la lumière, une forte émission de dioxygènelorsque le ferricyanure est ajouté. A l’obscurité, la respiration observée est due à la présence demitochondries en plus des chloroplastes.La courbe obtenue est présentée dans le document A.MT21255Durée : 45 secondesPIERRON Education - Parc Industriel Sud - Z.I. Gutenberg - 2, rue Gutenberg- B.P. 80609- 57206 SARREGUEMINES CEDEXTél. : 03 87 95 14 77 Fax : 03 87 98 45 91- E-mail : education-france@pierron.fr http://www.pierron.com2

Séquence 4 : réaction de Hill après choc osmotique.L’expérience est ensuite recommencée en présence d’une solution tampon de très faible pressionosmotique, car sans saccharose. Les quatre étapes de l’expérience précédente sont rigoureusementrépétées. L’interprétation de la courbe est identique à la précédente.La courbe obtenue est présentée dans le document B.Durée : 3 minutes 20 secondesSéquence 5 : comparaison des résultats et conclusion.La comparaison des deux courbes montre une augmentation de l’effet du ferricyanure lorsque leschloroplastes sont placés dans la solution à faible pression osmotique.Une observation en microscopie électronique montre les différences des chloroplastes dans lesdeux solutions tampon. L’enveloppe des chloroplastes a été déchirée par l’absorption d’eau due àla différence de pression osmotique entre le stroma et la solution tampon. La pénétration du ferricyanurequi stimule la photosynthèse est empêchée par l’enveloppe. Le degré d’action du ferricyanureest fonction de la proportion de plastes cassés dans chaque échantillon.Durée : 45 secondesDOCUMENT A: réaction de Hill pour les chloroplastes témoinsMT21255PIERRON Education - Parc Industriel Sud - Z.I. Gutenberg - 2, rue Gutenberg- B.P. 80609- 57206 SARREGUEMINES CEDEXTél. : 03 87 95 14 77 Fax : 03 87 98 45 91- E-mail : education-france@pierron.fr http://www.pierron.com3

DOCUMENT B: réaction de Hill après choc osmotiqueApplication numériqueSoit pour la suspension de départ: Ne le nombre de chloroplastes entiers et Ne le nombre de chloroplastescassés (sans enveloppe).Soit Oe le dioxygène émis par un chloroplaste entier (insensible à la présence de ferricyanure) etOe le dioxygène émis par un chloroplaste cassé en présence de ferricyanure.La photosynthèse nette observée dans la première expérience en présence de ferricyanure est égaleà la photosynthèse brute (PB1) diminuée de la respiration mesurée à la fin de l’expérience (car leferricyanure peut stimuler la respiration). De même, on peut appeler PB2 la photosynthèse brute enprésence de ferricyanure pour la seconde expérience.On a: PB1=Oe x Ne + Oc x NcPB2 = Oc x(Ne + Nc) puisque tous les plastes ont été cassés par le choc osmotique.D’où: PB1/PB2=(Oe x Ne + Oc x Nc)/Oc x (Ne+Nc)Dans la première expérience, on voit que l’émission de dioxygène due aux chloroplastes entiers(Oe x Ne) est très faible (illumination avant ajout de ferricyanure) : on la néglige.On a donc:PB 1/PB2 = Oc x Ne/Oc x(Ne + Ne)Donc finalement:PB1/PB2 = Nc/(Ne + Nc)MT21255C’est-à-dire que la proportion de plastes cassés dans la suspension de départ est égale au rapportdes photosynthèses brutes des deux expériences. Cette proportion est assez forte. On pense quel’amidon contenu dans les chloroplastes brise les eveloppes de ceux-ci au cours de la seconde centrifugation.D’ailleurs dans la séquence montrant leculot après cette centrifugation, on remarqueune zone blanche qui correspond àl’accumulation d’amidon.PIERRON Education - Parc Industriel Sud - Z.I. Gutenberg - 2, rue Gutenberg- B.P. 80609- 57206 SARREGUEMINES CEDEXTél. : 03 87 95 14 77 Fax : 03 87 98 45 91- E-mail : education-france@pierron.fr http://www.pierron.com4

On peut augmenter la proportion de chloroplastes entiers en plaçant les plantes pendant 24h ou 48hàl’obscurité avant l’extraction.Valeurs déduites des courbes:Expérience 1 : respiration = -7,5 nmol O 2 .min -1 , photosynthèse nette = 7 nmol O 2 .min -1 , d’où PB1= 14,5 nmol O 2 .min -1 ’.Expérience 2: respiration = -6,5 nmol O 2 .min -1 , photosynthèse nette = 13,5 nmol O 2 .min -1 , d’oùPB2 = 20 nmol O 2 .min -1 .Soit PB1/PB2 = 72 %. La suspension de départ contenait donc seulement 28 % de plastes entiers.Conseils et commentairesC’est en 1937 que Hill a mis en évidence la possibilité de rétablir un dégagement de dioxygène pardes chloroplastes isolés et éclairés si on leur fournissait un accepteur d’électrons approprié(“oxydant de Hill”). Un accepteur d’électrons est nécessaire car la liaison entre les accepteurs finauxdu photosystème I et le thylacoïde est fragile et, de plus, le cycle de Calvin n’est généralementpas fonctionnel dans des plastes isolés.Le ferricyanure de potassium est un des plus utilisés, car il est peu coloré (et ne perturbe donc pasl’absorption de lumière). Au cours de la réaction, le fer ferrique (Fe 3+ ), acceptant un électron, estréduit en fer ferreux (Fe 2+ ) . En outre, le ferricyanure ne pénètre pas à travers l’enveloppe du chloroplaste,ce qui permet une évaluation de la proportion de chloroplastes entiers, comme le montrele vidéogramme.Préparation des chloroplastes.Solution tampon : la nature de la solution tampon utilisée n’est pas critique. On peut employer dutampon phosphate ou du Tris-HC1. L’essentiel est que le pH soit compris entre 7 et 7,5. Pour équilibrerla pression osmotique avec le stroma, la solution doit contenir 0,4 mol de saccharose mais ilfaut préparer également du tampon sans saccharose pour la seconde expérience. Il faut éviter d’ajouterdes ions divalents (qui pourtant stimuleraient la photosynthèse), car ils précipitent généralementavec le ferricyanure.Extraction des chloroplastes : comme le montre le vidéogramme, il faut maintenir au froid la suspensionde chloroplastes (mais sans la geler !) pour éviter une détérioration trop rapide de l’activité.L’abondance d’amidon dans les chloroplastes augmente la proportion de plastes cassés car l’amidonperfore les membranes au cours des centrifugations. Si on peut partir de plantes en pot, ilest souvent préférable de les maintenir une ou deux journées à l’obscurité avant de prélever lesfeuilles. Il est utile de laver les feuilles pour enlever d’éventuels conservateurs ou insecticides.Après broyage et filtration, une première centrifugation à environ 100 g élimine les débris cellulaires.La seconde, autour de 1000 à 2000 g, donne un culot de chloroplastes (et de mitochondries,d’amidon...). Ce culot doit alors être resuspendu avec précaution (pinceau) dans 2 à 5 mL de solutiontampon avec saccharose et conservé au froid.MT21255PIERRON Education - Parc Industriel Sud - Z.I. Gutenberg - 2, rue Gutenberg- B.P. 80609- 57206 SARREGUEMINES CEDEXTél. : 03 87 95 14 77 Fax : 03 87 98 45 91- E-mail : education-france@pierron.fr http://www.pierron.com5

Mesure de la photosynthèse.Utiliser des tampons à la température de la pièce pour éviter une dérive thermique de l’électrode. Ilne faut ajouter que très peu de la suspension de chloroplastes pour obtenir une suspension vertclair” (par exemple 0,5 mL de suspension dans 5 mL de tampon). En effet, certains problèmes résultentde l’emploi d’une suspension trop concentrée de chloroplastes:- effet d’écran la lumière est interceptée et ne parvient pas à l’ensemble de la suspension;- conséquence d’une trop forte absorption de l’énergie lumineuse, une élévation de températurepeut se produire dans l’enceinte lorsqu’on allume la lumière, provoquant une baisse de la concentrationen dioxygène (simulant une photorespiration);- par contre, la dilution de la suspension de chloroplastes dans du nouveau tampon dilue égalementles protéases, chlorophyllases, acides gras libresPour la première expérience, on utilise le tampon contenant du saccharose. Après addition deschloroplastes, attendre que la respiration soit stable à l’obscurité, avant d’allumer. Ajouter ensuitedu ferricyanure un faible volume 20 pi, pour que la dilution de la suspension qui en résulte soit négligeable.La concentration finale doit être d’environ de 1 à 5 mMol. Après la mesure de la photosynthèsenette, éteindre la lumière pour mesurer la respiration, qui peut être plus forte à la suited’un effet du ferricyanure sur les mitochondries.Pour la seconde expérience, refaire les mêmes opérations mais en utilisant du tampon sans saccharose,provoquant ainsi un “choc osmotique”.Préparation du tampon phosphate mono/di-sodique:Solution stock (à conserver au réfrigérateur car des bactéries ou champignons peuvent s’y développer):- A: 3,62 g de NaPO 4 H 2 O, 2H 2 O dans 100 mL d’eau (soit 0,2 mol)- B: 7,2 g de Na 2 PO 4 H, 12H 2 O dans 100 mL d’eau (Soit 0,2 mol)Pour pH 7,4:19 mL de A + 81 mL de B + 100 mL d’eau distillée.Préparation du tampon Tris-HCI:Solution stock (à conserver au réfrigérateur): (soit 0,2 mol)- A : 2,4 g de TRIS (hydroxyméthyl) aminométhane dans 100 mL d’eau- B: HCl à 0,2molPour pH 7,4: 50 mL de A + 41,4 mL de B + 108 mL d’eau distillée.MT21255PIERRON Education - Parc Industriel Sud - Z.I. Gutenberg - 2, rue Gutenberg- B.P. 80609- 57206 SARREGUEMINES CEDEXTél. : 03 87 95 14 77 Fax : 03 87 98 45 91- E-mail : education-france@pierron.fr http://www.pierron.com6

L’utilisation d’un ‘vidéogramme pédagogique:L’enseignement, en particulier de la biologie-géologie, utilise depuis de nombreuses années desimages comme substitut du réel. C’est un moyen de réaliser des observations impossibles en sallede classe par manque de moyens, par manque de temps, par manque de place... On peut égalementutiliser différemment le temps.Les techniques de la vidéo apportent des images qui peuvent être beaucoup plus travaillées. Maiselles permettent aussi un confort d’utilisation lié aux magnétoscopes modernes.NE PAS OUBLIER que l’on peut à partir de la télécommande du magnétoscope:* faire des arrêts sur image permettant l’exploitation de celles-ci par annotation, schéma, voiredessin;* revenir en arrière en utilisant un compteur afin de revisionner une séquence à exploiter oupour une correction après observation;* sauter une séquence qui apparaît comme inutile avec un groupe d’élèves donnés;* effectuer des ralentis ou des accélérés pour mieux observer une séquence.NE PAS OUBLIER que l’on peut, à partir de la télécommande du téléviseur, choisir de conserverle son ou de le couper pour faire son propre commentaire.Chaque vidéogramme est conçu comme un outil. La notice propose un exemple d’utilisation pédagogique,mais c’est au professeur de choisir comment, et avec qui, il utilisera les images que nouslui proposons...N’hésitez pas à nous faire part de vos remarques et de vos suggestions sur ce document.MT21255PIERRON Education - Parc Industriel Sud - Z.I. Gutenberg - 2, rue Gutenberg- B.P. 80609- 57206 SARREGUEMINES CEDEXTél. : 03 87 95 14 77 Fax : 03 87 98 45 91- E-mail : education-france@pierron.fr http://www.pierron.com7

NotesMT21255PIERRON Education - Parc Industriel Sud - Z.I. Gutenberg - 2, rue Gutenberg- B.P. 80609- 57206 SARREGUEMINES CEDEXTél. : 03 87 95 14 77 Fax : 03 87 98 45 91- E-mail : education-france@pierron.fr http://www.pierron.com8