des cibles aux criblages - Biogenouest

Criblage phénotypique : sélectionner des petites moléculescapables de provoquer des phénotypes spécifiques au niveaucellulaire = blocage du fuseau mitotique pour la recherche d’agentsboquant la division cellulaire.WTmsb3 msb4Bach S., Bouchat O., Portetelle D. & Vandenbol M. Yeast 2000; 16: 1015±1023.USR3151 -CNRS

CriblageLeadIdentification0 2 4 6 8 10 12 14 16Years1/5000 molecules testées rentre sur le marchéUSR3151 -CNRS

RechercheFondamentaleTargetIdentificationLeadIdentificationCandidateIdentificationPre-Clinical Phase I/IIa Phase IIb Phase IIIRegulatoryReviewSales,Phase IVstudies0 2 4 6 8 10 12 14 16YearsCriblageUSR3151 -CNRS

Main steps of Pharmaceutical R&DResearch (2-10 years)Preclinical testing (3-4 years)Laboratory and animal testingPhase I (1 year)20-80 Healthy volunteers used todetermine safety and dosageDrug development cost : $802 MPhase II (2 years)100-800 Patient volunteers used to look forefficacy and side effectsPhase III (3 years)1000-8000 Patient volunteers used tomonitor adverse reactions to long-term useAgencies Review/Approval0 2 4 6 8 10 12 14 16YearsUSR3151 -CNRS

Criblage moléculaireUne cible thérapeutiqueUn essai à automatiser et à validerUne collection de molécules à analyser / cribler(produits de synthèse, métabolites secondaires naturels…)Effets cellulaires à vérifier (efficacité) :Crible secondaire de confirmationUSR3151 -CNRS

Criblage moléculaireUne cible thérapeutiqueKISSf: les cibles enzymatiques liées à despathologies humainesUn essai à automatiser et à validerUne collection de molécules à analyser / cribler(produits de synthèse, métabolites secondaires naturels…)Effets cellulaires à vérifier (efficacité) :Crible secondaire de confirmationUSR3151 -CNRS

Problématique scientifiqueFDA approval of Iressa(gefitinib) tablets as a singleagent treatment for patientswith advanced non-small celllung cancer (NSCLC)2003Src (pronounced "sarc" as itis short for sarcoma= TyrKinase)Philip Cohen (2002, Nat. Rev. Drug Discov. 1, 309-315)Ian Collins & Paul Workman (2006, Nat Chem Biol. 2, 689-700)

Le kinome humain: 518 cibles potentiellesManning et al. 2002.Science, 298:1912-34.

(R)-roscovitine(CYC202, Seliciclib)Human cyclin-dependent kinase 2 in complex with roscovitine(2A4L , De Azevedo et al. 1997)

Criblage moléculaireUne cible thérapeutiqueUn essai à automatiser et à validerUne collection de molécules à analyser / cribler(produits de synthèse, métabolites secondaires naturels…)Effets cellulaires à vérifier (efficacité) :Crible secondaire de confirmationExemple de campagne de criblage : Recherche demolécules inhibitrices d’interactions protéine-protéineS. Bach - USR3151 -CNRS

Criblage moléculaireLake Cowal mineCriblage manuel – semi-automatisé – automatiséDébit d’analyseQuelques composés / jours -------------------------------- 100,000 composés/jours(HTS-High-throughput Screening)>100,000/jour = ultra HTS(puce utilisant la microfluidique… 200,000 essais/seconde…10 -7 x moins de volume/essaiSchonbrun et al. 2010. Lab on a Chip 10 (7): 852–856.S. Bach - USR3151 -CNRS

Criblage moléculaireautomatiséwww.agilent.com/lifesciences/automationS. Bach - USR3151 -CNRS

...3456

Les différentes techniques de dosage d’activité kinase= différentes méthodes de détectionRadioactivité(Conditions hétérogènes)Colorimétrie(Essais en conditions hétérogènes)Luminescence(Essais en conditions homogènes)Fluorescence(Essais en conditions homogènes)S. Bach - USR3151 -CNRS

RadioactivitéProtein Kinases (+518)ATP [ 33 P] ADPSubstrate(S, T, Y)Phospho-Substrate(S-P*, T-P*, Y-P*)L. Meijer

USR3151Moyens actuels dédiés aux tests kinasesDébit : 2500 composés évalués sur une cibleenzymatique / jourCOMPTAGE etINTERPRETATIONdes résultatsPREPARATION des plaquesde dosage - Incubation etréactionFIXATION du substratmarqué sur filtre dephosphocelluloseIC 50Multiprobe IIHTMultiprobe IIFiltermateTop count NXTO. Lozach

COMPTAGE et INTERPRETATION des résultatsGSK3 IC50 = 0,25 M CDK1 IC50 = 0,025 MKinase activity(% of average maximal activity)1401301201101009080706050403020100IC 500,001 0,01 0,1 1Concentration (M)

Validation de l’essai pour laréalisation de criblages à grandeéchelle (le facteur Z’)Zhang JH, Chung TDY, Oldenburg KR (1999). "A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of highthroughput screening assays". Journal of Biomolecular Screening 4: 67–73.Le facteur Z se définit en tenant compte de 4 paramètres : les moyennes etdéviations standard des contrôles positifs (p) et négatifs (n=inhibition ou noninduction) ( p , p and n , n ). Ainsi il se calcule en utilisant cette formule:Z=1 : Idéal. (Z ne peut excéder 1)0,5 – Z – 1 : Un excellent essai.0 – Z – 0.5 : Un essai marginal.Z=0 : Il y a trop de recouvrement entre les valeurs positives et négativespour que les résultats de cet essai soient exploitables

Validation de l’essai pour laréalisation de criblages à grandeéchelle (le facteur Z’)IsopeptidasesRLUs for signal maximum (3% DMSO vehicle, ) and signal minimum (no enzyme, )were determined from (14) independent 384-well plates. Overall S/B was determined tobe 24-fold, with a Z-factor of 0.67, demonstrating the robust nature of this assay formatfor screening isopeptidases.Orcutt et al. BBA. Vol1823, Issue 11, November 2012, Pages 2079–2086

Criblage moléculaireUne cible thérapeutiqueUn essai à automatiser et à validerUne collection de molécules à analyser / cribler(produits de synthèse, métabolites secondaires naturels…)Effets cellulaires à vérifier (efficacité) :Crible secondaire de confirmationExemple de campagne de criblage : Recherche demolécules inhibitrices d’interactions protéine-protéineS. Bach - USR3151 -CNRS

Une collection de molécules à analyser / cribler(produits de synthèse, métabolites secondaires naturels…)Les molécules sont en grande majorité solubilisées en DMSO et sontorganisées en chimiothèques / Compound Collections :435,000 for the ChemBridge TM CollectionStockées à -20°C (ou -80°C) dans des microplaques (96-, 384-, 1536 puits)S. Bach - USR3151 -CNRS

5. Chemicalcollection of theInstitut de chimie dessubstances naturellesICSN, Gif sur Yvette.2960 cpdsHitsselection1. Chemical collections ofUSR3151:ReCC – Roscoff essentialChemical Collection1040 cpds4. Prestwick chemicalcollection –FDA approved drugs1200 cpds3. Chemical collection of ClaudeBernard University – Lyon 12720 cpds2. MaRC3 – MarineRoscoff ChemicalCollection20 cpds (Feb 2013)

An important tool in Medicinal Chemistry :Lipinski’s Rules or Rule of 5 :The rule was formulated by Christopher A. Lipinski in 1997, based on the observationthat most medication drugs are relatively small and lipophilic molecules.Lipinski's rule states that, in general, an orally active drug has no more than oneviolation of the following criteria1 - A molecular weight < 500 daltons or g/mol2 - Hydrogen bond donor groups < 5 (nitrogen or oxygen atomswith one or more hydrogen atoms)3 - Hydrogen bond acceptor groups < 10 (nitrogen or oxygen atoms)4 - logP < 5 (octanol-water partition coefficient)Good absorption or permeability of the drugThis rule of 5 is associated with 90% of orally activedrugs that have achieved Phase II clinical status.

Une touche/hit est toujours à confirmer parun retour dans la collection d’origine :Cherry pickingStockage 100,000 composésUSR3151 -CNRS

RésultatsUSR3151L. Meijer

RésultatsUSR3151chromenoindoles 1 (I- : DYRK1A)Neagoie et al. 2012initially isolated from a marinemollusk, Lamellaria sp.

Criblage moléculaireUne cible thérapeutiqueUn essai à automatiser et à validerUne collection de molécules à analyser / cribler(produits de synthèse, métabolites secondaires naturels…)Effets cellulaires à vérifier (efficacité) :Crible secondaire de confirmationExemple de campagne de criblage : Recherche demolécules inhibitrices d’interactions protéine-protéineS. Bach - USR3151 -CNRS

Effets cellulaires à vérifier (efficacité) :Crible secondaire de confirmationDe débit plus faible que le criblage primaire.Il va permettre d’observer un paramètre différent etainsi de croiser les informations de bio-activité.Pour un inhibiteur de kinase => inhibition de lacroissance de lignées cellulaires tumorales oudéclenchement de l’apoptoseEssai MTT: viabilité cellulaire

USR3151 – CNRS - KISSf(1 CR CNRS, 2IR CNRS, 2IE CNRS, 2IECDD)