ELISA Test Procedure

Information technique
Mode opératoire du test ELISA
Sauf exception, nos réactifs ELISA sont optimisés pour être utilisés dans un test en double sandwich (DAS-ELISA)
sur des microplaques de titration Nunc certifiées avec un volume utile de 200 µl par puit. Lorsque une autre
procédure est utilisée, celle-ci est clairement spécifiée à la fiche de données du réactif.
Le principe des tests ELISA de BIOREBA correspond au protocole généralement utilisé dans les laboratoires de
certification réalisant de nombreuses analyses en routine. C’est une procédure «robuste» qui a largement fait ses
preuves et qui optimise la fiabilité des résultats. Ainsi les clients utilisent un protocole identique et fiable pour
toutes les combinaisons plantes/pathogènes.
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Version: 3 - 08.12.2011
www.bioreba.com
1. Coating: Sensibilisation des microplaques avec un anticorps spécifique
Diluer au 1/1000 les anticorps de coating (IgG) dans le tampon de coating ; i.e. 20 µl IgG dans 20 ml
de tampon. Ajouter 200 µl de la solution obtenue dans chaque puit de la microplaque.
Couvrir les plaques et placer les dans une étuve humide.
Incuber 4 h à 30°C ou une nuit à + 4°C.
1a. Lavage : Vider les plaques et laver les au moins 3 fois avec le tampon de lavage. Eliminer
tout le liquide en tapant les plaques sur du papier absorbant. Le laveur de microplaque
BIOREBA «EASY WASH 2000» permet un lavage optimum.
2. Echantillon: Incubation de l’extrait de plante (antigène)
Diluer l’extrait végétal au 1/20 dans le tampon d’extraction (la nature du tampon d’extraction
ainsi que le taux de dilution peut varier selon les échantillons; se reporter à la fiche
«information produit» du réactif).
Ajouter 200 µl par puit.
Couvrir les plaques et placer les dans une étuve humide.
Incuber une nuit à + 4°C.
2a. Laver comme en 1a.
3. Conjugué: Incubation avec les anticorps conjugués à l’enzyme (conjugate)
Diluer au 1/1000 les anticorps conjugués dans le tampon de conjugué.
Ajouter 200 µl de la solution obtenue par puit.
Couvrir les plaques et placer les dans une étuve humide.
Incuber 5 h à 30°C.
3a. Laver comme en 1a.
4. Substrat: Une réaction colorée indique la présence d’un échantillon infecté
Diluer les pastilles de substrat pNPP à 1 mg/ml dans le tampon de substrat.
Ajouter 200 µl de la solution obtenue par puit.
Incuber à température ambiante (18 - 25°C) à l’obscurité.
Observez la réaction et notez le développement de la coloration entre 30 et 120 min,
soit visuellement soit avec un photomètre à 405 nm. Les photomètres à double lecture
405/492 nm permettent de réduire les effets de bruits de fond.
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