Régulation des populations de Nématodes gastro-intestinaux ...

N° d’ordre : 2346
THESE
présentée
pour obtenir
LE TITRE DE DOCTEUR DE L’INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE TOULOUSE
ÉCOLE DOCTORALE : SCIENCES ECOLOGIQUES, VETERINAIRES, AGRONOMIQUES ET BIOINGENIERIES
Spécialité : Qualité et Sécurité des Aliments
Par Mlle Caroline LACROUX
Titre de la thèse Régulation des populations de Nématodes gastro-intestinaux
(Haemonchus contortus et Trichostrongylus colubriformis) dans
deux races ovines, INRA 401 et Barbados Black Belly
Soutenue le 15 Juin 2006 devant le jury composé de :
M. Alain MILON Président
MM. Philippe DORCHIES Directeur de thèse
Jacques CABARET Rapporteur
Christophe CHARTIER Rapporteur
Jimmy DUNCAN Membre
Philippe JACQUIET Membre
1

REMERCIEMENTS
Et bien voilà, ce manuscrit est (quasiment) bouclé et c’est, comme toujours, au dernier
moment et dans l’urgence, qu’il faut peauffiner les dernières bricoles et en particulier
les remerciements. Au final, c’est toujours la partie la plus baclée. Mais bon, on va
essayer d’oublier personne…
A Philippe, pour ces quelques années de parasitologie, d’immunologie, de statistiques…
Ouf, on y est arrivés… Merci de mettre des points au milieu de mes phrases trop longues
et d’enlever tous les adverbes superflus. Néanmoins, toutefois et donc, enfin, merci
pour tout… La bouteille de champagne du Vet Research est encore au frigo, c’est quand
tu veux…
A Mr Dorchies, pour son enthousiasme constant et sans faille vis à vis de ce travail,
pour ses conseils judicieux, ses corrections entre la France et le Maroc…
A tout le laboratoire de parasitologie de l’ENVT : Françoise, Christelle, Jean-Paul …
Merci pour votre disponibilité, votre bonne humeur et votre aide au cours de ces
quelques années.
A Getachew, heureusement que tu sais quand il faut mettre « the » ou non avant les
mots, et merci pour ton aide dans les manips. Bon courage pour la tienne de thèse, mais
je ne me fais pas trop de souci…
A tous les membres du domaine expérimental de Bourges-La Sapinière : Jean Claude
Brunel, Yves Bourdillon, Hervé Morin, Thierry Fassier, Didier Marcon, Serge Py,
Eric Thévenot, Alain Burtin, Jérôme Bernard, Bruno Bouquet,Stéphane Gressin…
A l’équipe de parasitologie de Tours : Jacques Corté, Christine Sauvé et surtout Lucas
Gruner, pour votre aide lors de notre première grosse manip…
A Dominique François, pour une logistique parfaite d’expédition de moutons vers
Toulouse.
A Jacques Bouix, pour ses conseils avisés en matière de génétique lors des CSU de
Bourges.
A Sèv, Cécile, Pierrette et Cindy, merci de vous occuper de tout ce que je n’ai pas le
temps de faire en général, merci pour votre soutien durant cette difficile (et longue)
période de rédaction, pour les excursions vers la boulangerie entre midi et deux (plutôt
deux d’ailleurs), pour les extases devant les estampes japonnaises de caillettes colorées
au Giemsa (j’en veux un de tatouage…), pour l’écriture des cassettes (oui, je sais,
dorénavant on ne prendra que celles où ça écrit bien…). Bref, heureusement que vous
êtes là… Toutefois, je me demande encore s’il vaut mieux trois ou quatre roues !!!
2

A mon très cher et respecté « collègue de bureau », qui subit ma mauvaise humeur
fréquente et mes coups de gueule. En (maigre) contre-partie je réponds au téléphone (!),
c’est déjà ça. Trève de plaisanteries, sans vous je ne serais pas là. Merci pour tout et à
nos futurs vaches, chèvres et moutons…
A Paul Cabanié, professeur classé « X » comme il dit…, pour m’avoir délesté de matinées
d’autopsie quand j’étais trop à la bourre. Il n’y a que vous que je peux appeler à 9h45
pour me remplacer au pied levé à 10h00… Promis, l’année prochaine je rendrai tous mes
jours : bonne chasse…
Merci aux Poupou’s (Poupou I, Poupou II La Peste, le petit Blackou, la Crevette… mais
quand va t-on s’arrêter ?) et à vos biberons du soir qui clôturaient souvent mes journées
d’ordinateur…
A toute ma (grande) famille, mes parents et mon frère (Monsieur « Table des
matières »), qui y ont toujours cru et m’ont toujours soutenue. Merci de m’avoir toujours
laissé faire tout ce qui me passait par la tête. Avec tout mon amour…
Enfin et surtout, à Olivier, ma « pleine lune à moi »…Sans toi je ne serais jamais arrivée
au bout. Heureusement que tu as des solutions à tout (faire marcher des PCR bourrées
d’inhibiteurs, des anticorps sans bruit de fond…)… Grumpfff…
3

SOMMAIRE
CHAPITRE I : PREAMBULE ............................................................................................8
CHAPITRE II : CONTEXTE BIBLIOGRAPHIQUE .....................................................10
1. GENERALITES SUR LES STRONGLES GASTRO-INTESTINAUX DES OVINS.........................11
1.1. Classification et critères d’identification des Trichostrongles gastro-intestinaux des
ovins.............................................................................................................................11
1.2. Le cycle biologique des Trichostrongles gastro-intestinaux....................................13
1.3. Les deux espèces de Trichostrongles utilisées comme modèles dans nos travaux
expérimentaux : Haemonchus contortus et Trichostrongylus colubriformis...................15
1.3.1. Haemonchus contortus et l’haemonchose ovine...............................................15
1.3.2. Trichostrongylus colubriformis et la trichostrongylose ovine...........................17
2. MOYENS DE LUTTE CONTRE LES STRONGLES GASTRO-INTESTINAUX ...........................20
2.1. Les anthelminthiques et leur mode d’action............................................................20
2.2. Les limites d’utilisation des anthelminthiques ........................................................22
2.3. La résistance aux anthelminthiques : définition et mécanismes...............................22
2.4. Prévalence de la résistance aux anthelminthiques..................................................24
3. METHODES ALTERNATIVES DE LUTTE CONTRE LES STRONGLES GASTRO-INTESTINAUX
.........................................................................................................................................26
3.1. Tarir les sources de contamination.........................................................................27
3.1.1. La gestion raisonnée des pâturages..................................................................27
3.1.2. Les champignons et bactéries nématophages ...................................................28
3.2. Augmenter la résistance de l’hôte ..........................................................................29
3.2.1. La vaccination.................................................................................................29
3.2.2. Interactions nutrition-parasitisme ....................................................................33
3.2.3. La sélection de la résistance aux nématodes gastro-intestinaux ........................35
4. LA REPONSE IMMUNITAIRE DES OVINS FACE AUX STRONGLES GASTRO-INTESTINAUX .49
4.1. Organisation générale de la réponse immunitaire..................................................49
4.2. La réponse immunitaire innée ................................................................................49
4.3. La réponse immunitaire adaptative ........................................................................51
4.3.1. Présentation des antigènes parasitaires et initiation de la réponse immunitaire
adaptative .................................................................................................................52
4.3.2. Orientation de la réponse immunitaire : Th1 ou Th2 ?.......................................54
4

4.3.3. Mise en place et rôle des effecteurs de l’immunité dans les strongyloses gastro-
intestinales................................................................................................................58
4.3.4. Conséquences de la réponse immunitaire adaptative sur les traits de vie des
parasites : manifestations de l’immunité et régulation des populations de strongles ...70
4.3.4.1. Manifestations de l’immunité contre les nématodes parasites adultes........70
4.3.4.2. Manifestations de l’immunité contre les larves de nématodes parasites .....71
4.3.5. Régulation de la réponse immunitaire..............................................................73
4.3.5.1. Induction de types cellulaires immunomodulateurs par les strongles gastro-
intestinaux.............................................................................................................73
4.3.5.2. Production de molécules parasitaires immunomodulatrices.......................75
CHAPITRE III : OBJECTIFS DES TRAVAUX DE THESE..........................................79
CHAPITRE IV : LES PROCEDURES EXPERIMENTALES (OUTILS
METHODOLOGIQUES) ..................................................................................................82
1. MODELES EXPERIMENTAUX.........................................................................................83
1.1. Les animaux...........................................................................................................83
1.1.1. Ovins de race INRA 401 .................................................................................83
1.1.2. Ovins de race Barbados Black Belly................................................................83
1.1.3. Age et sexe des animaux .................................................................................84
1.2. Les parasites..........................................................................................................84
1.3. Infestations expérimentales ....................................................................................84
2. ETUDE DES POPULATIONS PARASITAIRES .....................................................................85
2.1. Comptage des œufs de strongles dans les matières fécales .....................................85
2.2. Mise en culture in vitro des œufs de Haemonchus contortus...................................86
2.3. Etude quantitative et qualitative de la population parasitaire chez l’hôte (bilans
parasitaires) .................................................................................................................87
2.4. Etude de la fécondité des femelles parasitaires adultes...........................................87
3. ETUDE DE PARAMETRES PHYSIOPATHOLOGIQUES CHEZ L’HOTE .................................88
3.1. Suivi de l’éosinophilie sanguine .............................................................................88
3.2. Suivi de l’hématocrite ............................................................................................88
4. ETUDE DE L’ORIENTATION DE LA REPONSE IMMUNITAIRE...........................................89
4.1. Principe de la PCR quantitative.............................................................................89
4.2. Du tissu à l’ARN….................................................................................................90
5

4.3. Isolement des cellules CD4 positives du nœud lymphatique abomasal pour
extraction spécifique des ARN de cette fraction cellulaire.............................................91
4.4. De l’ARN à l’ADN complémentaire (ADNc)… .......................................................92
4.5. PCR quantitative....................................................................................................92
5. EXPLORATION DE LA REPONSE HUMORALE GENERALE GENERALE ET LOCALE............94
5.1. Collecte des prélèvements ......................................................................................94
5.2. Préparation des antigènes......................................................................................94
5.3. Détermination des conditions optimales pour l’ELISA ...........................................95
5.4. Technique ELISA ...................................................................................................98
6. ETUDE DE LA REPONSE CELLULAIRE LOCALE ..............................................................98
6.1. Histologie conventionnelle et immunohistochimie sur coupes en paraffine .............99
6.1.1. Collecte des prélèvements ...............................................................................99
6.1.2. Technique histologique ...................................................................................99
6.1.3. Colorations à l’Hémalun/Eosine et au Giemsa .................................................99
6.1.4. Immunohistochimie sur coupes en paraffine..................................................101
6.2. Immunohistochimie sur coupes en congélation.....................................................102
6.2.1. Collecte et technique des prélèvements..........................................................102
6.2.2. Immunohistochimie.......................................................................................102
7. ETUDE DE LA LYMPHOPROLIFERATION SPECIFIQUE D’ANTIGENES PARASITAIRES.....103
7.1. Principe ...............................................................................................................103
7.2. Technique ............................................................................................................104
7.2.1. Préparation des cellules .................................................................................104
7.2.2. Mise en culture et stimulation des cellules mononucléées..............................104
7.3. Interprétation des résultats ..................................................................................105
8. ANALYSES STATISTIQUES ...........................................................................................105
CHAPITRE V : RESULTATS.........................................................................................107
PARTIE I : ETUDE DE LA REPONSE IMMUNITAIRE ADAPTATIVE CHEZ DES
AGNEAUX DE RACE SENSIBLE, INRA 401, INFESTES PAR H. CONTORTUS OU T.
COLUBRIFORMIS...........................................................................................................108
ARTICLE I :HAEMONCHUS CONTORTUS (NEMATODA : TRICHOSTRONGYLIDAE) INFECTION
IN LAMBS ELICITS AN UNEQUIVOCAL TH2 IMMUNE RESPONSE........................................111
6

ANNEXE A L’ARTICLE « HAEMONCHUS CONTORTUS (NEMATODA :
TRICHOSTRONGYLIDAE) INFECTION IN LAMBS ELICITS AN UNEQUIVOCAL TH2 IMMUNE
RESPONSE »....................................................................................................................127
ARTICLE II : IMMUNE RESPONSES IN LAMBS INFECTED WITH TRICHOSTRONGYLUS
COLUBRIFORMIS..............................................................................................................131
PARTIE II : ETUDE COMPARATIVE DE LA REPONSE IMMUNITAIRE
ADAPTATIVE CHEZ DES AGNEAUX DE RACE RESISTANTE, BARBADOS
BLACK BELLY, ET DE RACE SENSIBLE, INRA 401, INFESTES PAR H.
CONTORTUS....................................................................................................................165
ARTICLE III : DYNAMICS OF THE ADAPTIVE IMMUNE RESPONSE TO HAEMONCHUS
CONTORTUS IN SUSCEPTIBLE INRA 401 AND RESISTANT BARBADOS BLACKBELLY LAMBS
.......................................................................................................................................167
CHAPITRE VI : DISCUSSION GENERALE................................................................197
1. REGULATION DES POPULATIONS DE NEMATODES CHEZ L’HOTE.................................198
1.1. Variations selon le parasite au sein de la race INRA 401 .....................................198
1.2. Variations selon la race pour un même parasite : Haemonchus contortus............199
2. L’IMPLICATION DE LA REPONSE IMMUNITAIRE ADAPTATIVE DANS LA REGULATION DES
POPULATIONS DE NEMATODES GASTRO-INTESTINAUX....................................................200
2.1. Orientation de la réponse immunitaire adaptative : variations selon l’espèce de
parasite considérée.....................................................................................................200
2.2. Orientation de la réponse immunitaire adaptative : variations selon la race ovine
considérée ..................................................................................................................202
2.3. Rôle des mécanismes effecteurs dans la protection contre les nématodes gastro-
intestinaux ..................................................................................................................202
3. PERSPECTIVES DANS LA COMPREHENSION DE LA RESISTANCE ...................................205
3.1. Le rôle de la réponse immunitaire innée...............................................................205
3.2. Régulation de la réponse immunitaire adaptative.................................................206
3.3. L’exploration de la résistance : aspects génétiques et identification de gènes
candidats ....................................................................................................................207
4. CONCLUSION..............................................................................................................208
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ........................................................................210
7

Préambule
CHAPITRE I : PREAMBULE
8

Un problème économique … et scientifique
Préambule
La compréhension des mécanismes de résistance de certaines races ovines aux nématodes
gastro-intestinaux représente un véritable défi scientifique avec des conséquences
économiques non négligeables dans le contexte actuel d’extension des résistances aux
principales molécules anthelminthiques dans les populations parasitaires. En effet, une
meilleure connaissance de la réponse immunitaire des ovins (dont l’implication est supposée
dans la protection contre les strongles chez des individus résistants) pourrait permettre à
l’avenir de développer de nouvelles méthodes de lutte, comme la sélection d’animaux
résistants ou la mise en place de schémas de vaccination efficaces et applicables à large
échelle.
Notre travail de thèse a ainsi principalement concerné la caractérisation et l’étude de la
dynamique de la réponse immunitaire adaptative i) des ovins infestés soit par Haemonchus
contortus, soit par Trichostrongylus colubriformis, et ii) les effets de cette réponse dans la
régulation des populations de ces nématodes. Dans un premier temps, notre étude a été
réalisée dans une race ovine (INRA 401) considérée comme sensible à ces deux espèces de
strongles. Puis, dans un second temps, nous avons comparé les éléments de la réponse
immunitaire adaptative entre cette race et une race « tropicale » (Barbados Black Belly)
considérée comme résistante.
Ce travail conduit au laboratoire de Parasitologie de l’UMR 1225 INRA/Ecole Nationale
Vétérinaire de Toulouse est divisé en trois grandes parties. La première partie est un rappel
bibliographique sur les deux nématodes utilisés comme modèles, les solutions de lutte
envisagées comme alternatives aux traitements anti-parasitaires et les connaissances actuelles
de la réponse immunitaire dans les strongyloses gastro-intestinales. Dans une deuxième partie
sont exposés les principaux outils méthologiques utilisés et les résultats de nos travaux. Ces
derniers sont présentés sous la forme de trois articles. Enfin, une discussion générale, au sein
de laquelle sont également envisagées les perspectives pour la poursuite de ce travail, clôt le
manuscrit.
9

Contexte bibliographique
CHAPITRE II : CONTEXTE
BIBLIOGRAPHIQUE
10

1. GENERALITES SUR LES STRONGLES GASTRO-INTESTINAUX DES OVINS
Contexte bibliographique
Le cheptel ovin français représente environ 9 millions d’animaux, dont 6 millions de brebis
(majoritairement constituées de brebis allaitantes), répartis en plus de 50 000 exploitations
(source OFIVAL, 2003). La région Midi-Pyrénées est la première région d’élevage ovin en
France ; les autres grandes zones d’implantation étant la région Poitou-Charentes, le
Limousin, l’Aquitaine, la région Provence-Alpes-Côte d’Azur et l’Auvergne. Une large part
des dépenses en élevage conventionnel (7 à 12%) est attribuable aux pathologies ovines et à
leur contrôle (Cabaret, 2004). Le contrôle des helminthes parasites, dont les nématodes, est
considéré comme un élément essentiel de la gestion de la santé des troupeaux. Au sein des
nématodoses, les strongyloses gastro-intestinales ovines représentent une pathologie
dominante largement répandue. Les deux strongles les plus fréquents des petits ruminants,
Trichostrongylus colubriformis et Teladorsagia circumcincta, sont présents dans tous les
élevages ovins d’Europe tempérée. Les autres espèces de nématodes sont plus irrégulièrement
rencontrées. C’est notamment le cas pour Haemonchus contortus, très pathogène chez les
ovins, dont la répartition géographique irrégulière serait influencée par les conditions
climatiques ou par des phénomènes plus aléatoires relatifs aux conduites d’élevage
(introduction à un moment adéquat au sein d’un troupeau). De plus, Haemonchus contortus
représente l’espèce majeure en région tropicale.
1.1. Classification et critères d’identification des Trichostrongles gastro-intestinaux des ovins
La classification des Trichostrongles a été établie par Durette-Desset et Chabaud (1993) :
Phylum Némathelminthes
Classe Nématodes
Sous-Classe Secernentea
Ordre Strongylida
Sous-Ordre Trichostrongylina
Super-Famille Trichostrongyloidea
Famille Trichostrongylidae
La majorité des strongles gastro-intestinaux des ruminants appartiennent à la famille des
Trichostrongylidae, subdivisée en quatre sous-familles (Haemonchinae, Trichostrongylinae,
Ostertagiinae et Cooperiinae) (Tableau 1).
11

Sous-famille
Haemonchinae
Contexte bibliographique
Espèces Localisation chez l’hôte Hôtes
Haemonchus contortus Caillette Ovins, caprins
Haemonchus placei Caillette Bovins
Haemonchus similis Caillette Bovins
Haemonchus longistipes Caillette Dromadaires
Trichostrongylus colubriformis Intestin grêle Ovins, caprins
Trichostrongylinae Trichostrongylus axei Caillette Bovins, ovins, caprins
Teladorsagia circumcincta Caillette Ovins
Ostertagiinae Ostertagia ostertagi Caillette Bovins (ovins, caprins)
Cooperia curticei Intestin grêle Bovins, ovins, caprins
Cooperiinae Cooperia oncophora Intestin grêle Bovins, ovins
Tableau n°1 : Principales espèces de Trichostrongles parasites des ruminants.
La distinction des différentes espèces de Trichostrongles est depuis longtemps réalisée à
l’aide de caractéristiques morphologiques des vers adultes (longueur, aspect de la bourse
caudale et de la capsule buccale, longueur des spicules…). La présence d’une bourse caudale
avec des spicules caractéristiques au niveau de l’extrémité postérieure, rend les vers adultes
mâles plus facilement identifiables que les femelles (Gibbons, 1979 ; Jacquiet et al., 1997).
Chez certaines femelles (en particulier pour le genre Haemonchus), le polymorphisme des
ornementations supra-vulvaires permet de définir trois morphotypes : lisse, boutonné et
linguiforme (Roberts et al., 1954). La diagnose morphologique au stade œuf est difficile et
limitée au genre (exemple : genre Haemonchus). L’identification des larves infestantes (L3)
fait appel à des critères morphologiques et morphométriques (longueur totale, longueur de la
queue ou de la gaine, forme des extrémités antérieure et postérieure, nombre et forme des
cellules intestinales).
A l’heure actuelle, le développement de techniques de phylogénie moléculaire permet
d’affiner voire de réviser la classification des Trichostrongles par des outils moléculaires
(Humbert et Cabaret, 1995 ; Durette-Desset et al., 1999 ; Gouÿ de Bellocq et al., 2001) sur la
base du polymorphisme de l’ADN génomique ou des gènes eux-mêmes, du polymorphisme
de certaines enzymes des Trichostrongles…
12

1.2. Le cycle biologique des Trichostrongles gastro-intestinaux
Contexte bibliographique
Les Trichostrongles gastro-intestinaux des ovins ont un cycle monoxène (absence d’hôte
intermédiaire) en deux phases : (i) une phase libre dans le milieu extérieur ou phase externe et
(ii) une phase parasitaire chez l’hôte ou phase interne (Figure 1).
Figure n°1 : Cycle biologique général des Trichostrongles gastro-intestinaux chez les ovins.
Les photographies représentent les différents stades d’Haemonchus contortus.
La phase libre débute avec l’élimination d’œufs pondus par les vers femelles dans les matières
fécales de l’hôte. Ces œufs s’embryonnent, donnent naissance à des larves de stade 1 (L1) qui
muent ensuite en 1 ou 2 jours en larves L2. Ces deux premiers stades se nourrissent de
matières organiques et de micro-organismes des matières fécales, et sont peu résistants dans le
milieu extérieur ce qui explique un taux de mortalité très élevé. Les larves L2 évoluent ensuite
en larves infestantes L3 au cours d’une deuxième mue incomplète (la larve infestante reste
engainée dans la gaine ou exuvie de L2 qu’elle perdra lors de son passage dans le tractus
digestif proximal de l’hôte). Les larves de stade L3 sont très résistantes dans l’environnement
puisque protégées par leur exuvie. Elles peuvent survivre plusieurs mois sur une pâture grâce
à leurs réserves lipidiques. La durée de la phase libre dépend étroitement des conditions de
température et d’humidité ambiantes (température supérieure à 18°C et degré d’humidité de
13

Contexte bibliographique
plus de 70%). L’évolution de l’œuf en larve L3 s’effectue généralement en 8 à 10 jours. Pour
H. contortus, cette évolution peut se faire plus rapidement (5-6 jours).
La phase parasitaire proprement dite commence par l’ingestion des larves L3 par l’hôte lors du
pâturage. Ces larves vont perdre leur exuvie lors du passage dans le rumen ou la caillette puis
vont migrer dans la muqueuse digestive. Les larves L3 y subissent alors une nouvelle mue en
larves L4. A ce stade, il est fréquent que les larves s’enkystent dans la muqueuse digestive et
retardent leur développement (phénomène d’‘hypobiose larvaire’, ou de ‘développement
retardé des larves’, observé en hiver, les larves ne reprenant leur développement normal qu’au
printemps suivant). Les larves L4 évoluent alors en stades 5 dits juvéniles, avant de donner des
adultes (mâles et femelles). Après fécondation, les femelles pondent des œufs qui sont
excrétés dans les matières fécales de l’hôte et deviennent une nouvelle source de
contamination du pâturage. La durée comprise entre l’ingestion des larves infestantes et la
ponte par des femelles se définit comme la période prépatente ; en l’absence d’hypobiose au
stade L4, celle-ci est d’environ 3 semaines (Bowman, 1999).
Dans le cycle des Trichostrongles, la phase libre représente une étape décisive dont dépend
l’épidémiologie des strongyloses. En revanche, ce sont les étapes de développement chez
l’hôte, ainsi que la localisation et le régime alimentaire des larves et des adultes, qui vont
conditionner la pathogénicité de chaque espèce et définir les interactions entre l’hôte et le
parasite. Dans cet objectif, la connaissance des étapes clés du développement des parasites au
sein de l’hôte est indispensable. Le tableau n°2 résume la chronologie du développement des
différents stades parasitaires pour les deux espèces de Trichostrongles choisies comme
modèles dans nos travaux.
Haemonchus contortus Trichostrongylus colubriformis
Présence des larves L3 dans l’organe
cible après ingestion
2ème jour 2 ème – 5 ème jours
Mue des larves L3 en larves L4
4 ème – 5 ème jours 7 ème – 8 ème jours
Evolution des larves L4 en stades 5
juvéniles
Apparition des premiers stades
adultes
9 ème - 11ème jours 15 ème jour
18 ème jour 20 ème jour
Tableau n°2 : Etapes du développement d’Haemonchus contortus et de Trichostrongylus
colubriformis chez leur hôte (d’après Veglia, 1915 et Soulsby, 1982).
14

Contexte bibliographique
1.3. Les deux espèces de Trichostrongles utilisées comme modèles dans nos travaux
expérimentaux : Haemonchus contortus et Trichostrongylus colubriformis
Dans nos travaux expérimentaux, nous nous sommes intéressés à ces deux parasites gastro-
intestinaux pathogènes du mouton, en raison :
(i) de leur représentativité des strongles gastro-intestinaux des ovins , chacun dans
leur habitat respectif (caillette pour H. contortus, et intestin grêle proximal pour T.
colubriformis)
(ii) de leur fréquence dans les élevages ovins sur le territoire français, à l’origine d’un
impact médical et économique majeur et de la nécessité de leur contrôle.
1.3.1. Haemonchus contortus et l’haemonchose ovine
Haemonchus contortus est un parasite de la caillette des petits ruminants (ovins et caprins).
Ce parasite, hématophage dès le stade L4, est responsable de pertes importantes de production
dans les élevages de petits ruminants (dégradation de l’état général des animaux ; troubles
digestifs avec diarrhée et perte de poids ; laine de mauvaise qualité, altération des capacités de
reproduction (Poppi et al., 1990), mais également de mortalité par anémie, notamment chez
les agneaux au pâturage. Dans les zones tropicales, 45% de la mortalité des jeunes agneaux
est attribuable à ce parasite (Vlassoff et McKenna, 1994). Sa distribution géographique est
mondiale en raison de ses grandes capacités d’adaptation aux variations climatiques (Waller,
1997). Voici quelques caractéristiques notables du cycle biologique de ce Trichostrongle :
(i) les œufs, excrétés dans les matières fécales, ont une température optimale
de développement de 20-30°C (Veglia, 1916) ; les œufs embryonnés sont
plus résistants que les œufs non embryonnés (Silverman et Campbell,
1959) ; toutefois, ils ne se développent pas lorsque la température est trop
basse (Coyne et Smith, 1992a) d’où une forte mortalité au stade œuf dans
des régions où les températures hivernales sont inférieures à 5°C.
(ii) les larves infestantes sont relativement résistantes dans le milieu extérieur,
notamment à la dessiccation, en raison de la présence de lipides dans leurs
cellules intestinales (Veglia, 1916).
(iii) ce parasite possède une forte propension à l’arrêt de développement au
stade L4, ce qui est considéré par certains auteurs comme le principal moyen
de survie à la période hivernale en régions tempérées (Blitz et Gibbs, 1971 ;
15

Contexte bibliographique
Barger et Le Jambre, 1988), et par d’autres comme le résultat d’une
résistance acquise de l’hôte (Dineen et al., 1965 ; Soulsby, 1966).
(iv) les adultes sont facilement visibles à l’œil nu à la surface de la muqueuse
abomasale en raison de leur taille (2-3 cm) et de leur coloration rougeâtre
liée à leur mode d’alimentation hématophage ; en effet, juste avant leur
dernière mue, ces parasites se dotent d’une dent vestigiale perforante dans
leur capsule buccale, qui leur permet d’atteindre la lumière des capillaires
sanguins de la muqueuse (Urquhart et al., 1996).
(v) les vers femelles ont une fécondité très élevée par rapport aux autres
espèces de strongles, avec en moyenne une production de 5000-7000 œufs
par jour (Coyne et al., 1991) ; cette caractéristique permet de contrebalancer
la mortalité des œufs excrétés dans les matières fécales, notamment lorsque
les conditions climatiques ne sont pas favorables à leur développement.
L’haemonchose ovine se manifeste essentiellement par un syndrome d’anémie (Chermette,
1982). Elle est connue sous trois formes :
• Haemonchose suraiguë : forme peu fréquente, liée à des infestations
massives chez des animaux apparemment en bonne santé, qui meurent de
façon subite d’une gastrite hémorragique sévère.
• Haemonchose aiguë : forme typique, caractérisée par une anémie avec
chute progressive et dramatique de l’hématocrite, survenant généralement
deux semaines environ après l’infestation ; malgré une stimulation
compensatrice de l’érythropoïèse, la moelle osseuse est rapidement
dépassée et l’hématocrite chute jusqu’à la mort de l’animal. Le phénomène
est également aggravé par la perte continuelle en protéines et en fer.
Symptômes généraux Faiblesse, essoufflement, amaigrissement
Symptômes locaux Pâleur sévère des muqueuses (oculaire, buccale, vulvaire) ; apparition
d’œdèmes en régions déclives (« signe de la bouteille » au niveau de l’auge)
Paramètres hématologiques Anémie hypochrome et microcytaire, avec chute de la concentration en
hémoglobine (30 à 50%), hyposidérémie, hématocrite entre 10 et 20%
Evolution Variable mais généralement fatale en 1-6 semaines chez les animaux les
plus faibles
Tableau n°3 : Tableau clinique d’une forme aiguë d’haemonchose (d’après Chermette, 1982)
16

Contexte bibliographique
• Haemonchose chronique : forme la plus fréquente, à l’origine des pertes
économiques les plus importantes en raison d’une morbidité élevée. Elle
apparaît de façon discrète et insidieuse et aboutit à une dégradation de l’état
général rappelant la malnutrition.
Le pouvoir pathogène d’Haemonchus contortus est principalement lié à son action spoliatrice
sur l’hôte (mode d’alimentation hématophage ayant pour conséquence une spoliation de sang
et une anémie) (Hoste et al., 1997), mais également à un effet traumatique local (lors de la
phase parasitaire intra-muqueuse des stades larvaires et lors de la phase de nutrition des
adultes). La perturbation des fonctions digestives abomasales (modification de la perméabilité
de la muqueuse, altération des fonctions sécrétoires, troubles de la motricité et du débit
abomaso-duodénal) est à l’origine d’une réduction de la dégradation des protéines
alimentaires et d’une malabsorption et peut favoriser la survenue d’infections secondaires
(Chermette, 1982 ; Bueno, 1982).
Figure n°2 : Œdème de l’auge (« bottle
jaw ») chez un ovin atteint d’haemonchose
aiguë.
1.3.2. Trichostrongylus colubriformis et la trichostrongylose ovine
Trichostrongylus colubriformis est un parasite de la portion proximale de l’intestin grêle des
petits ruminants. Comme H. contortus, sa distribution géographique est mondiale. Cette
espèce tolère des températures plus basses que le genre Haemonchus pour le développement
des stades libres. Son cycle biologique est comparable au cycle général des Trichostrongles
mais quelques particularités le distinguent de notre premier modèle :
• les larves infestantes perdent leur gaine lors de leur passage dans la caillette
avant de gagner leur habitat définitif, à savoir la muqueuse intestinale ; la
phase parasitaire intra-muqueuse est courte et l’essentiel du cycle chez
l’hôte est réalisé à la surface de la muqueuse digestive,
17

Contexte bibliographique
• la tendance à l’hypobiose larvaire semble moins marquée que pour
Haemonchus, en raison probablement d’une meilleure adaptation aux
conditions climatiques tempérées (Soulsby, 1982),
• les adultes, difficilement discernables à l’œil nu (longueur généralement
inférieure à 7 mm, faible diamètre) se logent dans des tunnels créés entre
les cellules épithéliales et s’accrochent à la muqueuse grâce à la présence
des crêtes cuticulaires du synlophe ; ces parasites ont un régime alimentaire
de type chymivore et sont ainsi dépourvus de capsule buccale,
• la fécondité des femelles est moins importante que celles du genre
Haemonchus : le nombre d’œufs excrétés dans les matières fécales excède
rarement 100 œufs par femelle.
Les manifestations cliniques de l’infestation des ovins par T. colubriformis sont moins
spectaculaires que ce que l’on peut observer avec des parasites plus pathogènes comme
Haemonchus contortus. Les infestations asymptomatiques sont d’ailleurs très fréquentes. Lors
d’infestations importantes, les signes cliniques sont principalement un syndrome diarrhéique
plus ou moins marqué, associée à un amaigrissement progressif. Quelques cas de mortalité
aiguë sont rencontrés lors d’infestations sévères.
Le pouvoir pathogène de ce parasite est lié au développement d’une entéropathie avec
atrophie plus ou moins sévère des villosités intestinales. Macroscopiquement, la muqueuse
intestinale peut apparaître épaissie et oedémateuse. L’augmentation de la perméabilité
vasculaire, associée à l’atrophie villositaire, conduit à une fuite plasmatique vers la lumière
donc à une perte de protéines et une hypoalbuminémie (Barker, 1973). La perte de poids est
également accentuée par une stimulation de la sécrétion de cholecystokinine (CCK) qui
déprime le centre de l’appétit au niveau cérébral. Enfin, une altération de la croissance
osseuse (de type ostéoporose) est parfois constatée sur des agneaux en croissance. Elle est liée
à une diminution de l’absorption du calcium et du phosphore (Coop, 1981).
18

Contexte bibliographique
Les principaux Trichostrongles gastro-intestinaux des ovins appartiennent à quatre
grandes sous-familles (Haemonchinae, Trichostrongylinae, Ostertagiinae, et
Cooperiinae). Leur cycle biologique est un cycle monoxène, comprenant une phase libre
dans le milieu extérieur (développement du stade œuf jusqu’au stade de larve infestante)
et une phase parasitaire chez l’hôte (débutant par l’ingestion de larves infestantes et
aboutissant à la maturation de stades adultes avec ponte d’œufs dans les matières fécales
par les vers femelles).
Parmi ces Trichostrongles, Haemonchus contortus et Trichostronglyus colubriformis sont
deux espèces parasites majeures des ovins, dont la distribution géographique est
mondiale, et qui sont à l’origine de pathologies graves entraînant des pertes
économiques importantes en élevage.
19

2. MOYENS DE LUTTE CONTRE LES STRONGLES GASTRO-INTESTINAUX
Contexte bibliographique
En raison des pertes économiques engendrées, le contrôle des strongyloses gastro-intestinales
est un enjeu majeur pour la rentabilité des élevages ovins. La mise en place de plans de
prophylaxie est indispensable. Pendant de nombreuses années, l’emploi de molécules
anthelminthiques de synthèse a été le moyen quasi-exclusif de lutte contre ces parasites. En
effet, les anthelminthiques présentent de multiples avantages : efficacité sur un large spectre
d’espèces de nématodes parasites, faible coût et relative simplicité d’utilisation (Hoste et
Chartier, 1997). L’objectif de ces traitements n’est toutefois pas de faire disparaître
complètement les parasites mais de limiter leur impact économique dans les élevages. La
persistance d’une population parasitaire résiduelle demeure favorable dans le sens où elle
permet le développement de mécanismes immunitaires protecteurs.
2.1. Les anthelminthiques et leur mode d’action
Il existe à ce jour trois grandes familles de molécules anthelminthiques efficaces contre les
strongles gastro-intestinaux des ovins (Lanusse et Prichard, 1993) : les benzimidazoles, les
imidazothiazoles et les lactones macrocycliques. A cela, s’ajoute la famille des
salicylanilides, molécules actives contre les strongles hématophages. Le tableau n°4 présente
ces différentes molécules, les posologies recommandées chez les ovins et les contraintes
d’utilisation (temps d’attente pour la consommation des viandes et abats et du lait).
20

Famille Molécule Noms déposés
Benzimidazoles
Oxfendazole
Imidazothiazoles Lévamisole
Salicylanilides
(actifs contre les strongles
hématophages)
Lactones
macrocycliques
Oxfenil®
Synanthic®
Posologie
recommandée et
voie
d’administration
5 mg/kg VO
Fenbendazole Panacur® 5 mg/kg VO
Fébantel Rintal® 5 mg/kg VO
Albendazole Valbazen® 3.8 mg/kg VO
Closantel
Nitroxinil
Ivermectine
Lévamisole®
Némisol®
Supaverm®
(association de closantel et
mébendazole)
Seponver®
7.5 mg/kg VO
10 mg/kg VO
Dovenix® 10 mg/kg SC
Ivomec®
Oramec®
0.2 mg/kg SC
0.2 mg/kg VO
Doramectine Dectomax® 0.2 mg/kg IM ou SC
Moxidectine Cydectine® 0.2 mg/kg VO ou SC
Légende : VO : voie orale, SC : sous-cutanée ; IM : intra-musculaire
Contexte bibliographique
Temps d’attente
Viandes et abats :
14 jours
Lait : nul
Viandes et abats : 8
jours
Lait : nul
Viandes et abats :
10 jours
Lait : nul
Viandes et abats :
10 jours
Lait : interdit*
Viandes et abats : 3
jours
Lait : interdit*
Viandes et abats :
28 jours
Lait : interdit*
Viandes et abats :
28 jours
Lait : 10 traites
Viandes et abats : 3
jours
Lait : interdit*
Viandes et abats :
35 (IM) ou 56 (SC)
jours
Lait : interdit*
Viandes et abats : 3
jours
Lait : interdit*
Tableau n°4 : Principaux anthelminthiques actifs chez les ovins, noms déposés, posologies
recommandées et temps d’attente à respecter (*molécules interdites chez les brebis laitières
dont le lait est destiné à la consommation humaine) (Source Dictionnaire des médicaments
Vétérinaires, 12 ème édition, 2003).
Les benzimidazoles agissent en bloquant certains systèmes enzymatiques du métabolisme
anaérobie des parasites, les privant ainsi de leurs ressources énergétiques (Prichard, 1973),
21

Contexte bibliographique
mais également en inhibant la formation des microtubules du cytosquelette des parasites, sans
altérer ceux de l’hôte (Lacey, 1988 ; Martin et al., 1997)
Le lévamisole (famille des imidazothiazoles) est un agoniste de l’acétylcholine ; en se fixant
sur les récepteurs nicotiniques du parasite, il entraîne une paralysie spastique de celui-ci et sa
mort (Martin, 1993 et 1997 ; Kohler, 2001). Cette molécule n’a en revanche aucun effet sur
les larves inhibées.
Les salicylanilides sont actifs contre les strongles hématophages (H. contortus); ils inhibent la
phosphorylation oxydative du parasite sans affecter celle de l’hôte (Swan, 1999). Ces
molécules présentent la particularité de se fixer à l’albumine plasmatique, ce qui leur confère
une importante rémanence (Rothwell et al., 2000).
Les lactones macrocycliques comprennent les avermectines (ivermectine et doramectine) et
les milbémycines (moxidectine) (Blackhall et al., 2003). Elles sont agonistes du récepteur de
l’acide gamma-aminobutyrique et du récepteur au glutamate. Elles entraînent une paralysie
flasque du parasite en augmentant la perméabilité membranaire aux ions chlorures (Sangster,
1996 ; Martin, 1997 ; Beugnet et al, 1997).
2.2. Les limites d’utilisation des anthelminthiques
Outre les restrictions d’emploi pour les brebis et les chèvres laitières, ainsi qu’en agriculture
biologique, certaines interrogations concernant l’utilisation quasi-exclusive de la
chimiothérapie anthelminthique ont vu le jour ces dernières années :
- la préoccupation du public et des consommateurs vis à vis de l’usage de substances
chimiques en agriculture et de la présence de résidus médicamenteux dans les
denrées alimentaires d’origine animale est de plus en plus vive (Hoste et Chartier,
1997).
- l’impact des résidus de certaines lactones macrocycliques toxiques pour les
organismes responsables de la décomposition des fécès de ruminants au pâturage
(coléoptères, diptères coprophages, lombriciens) (Lumaret et Errouissi, 2002).
- enfin, l’apparition et le développement de résistances au sein des populations de
parasites remet largement en cause leur efficacité et leur utilisation.
2.3. La résistance aux anthelminthiques : définition et mécanismes
« Une population chimiorésistante est une population de parasites ayant génétiquement
acquis la capacité de résister à des concentrations d’anti-parasitaires habituellement létales
pour des individus de cette espèce » (Kelly et Hall, 1979). Plusieurs types de résistance ont
22

Contexte bibliographique
été décrits selon les capacités des parasites à résister à une substance unique (résistance
simple), à un groupe de substances ayant le même mode d’action (résistance de famille, la
plus fréquente) ou à un ensemble de composés qui ont des modes d’action différents
(résistance multiple) (Beugnet et Kerboeuf, 1997).
Le déterminisme de la résistance est génétique (Dobson et al., 1996) et peut être considéré
comme un phénomène pré-adaptatif (Jackson, 1993). La pression environnementale (comme
l’utilisation des anthelminthiques) sélectionne certaines mutations dans une population de
parasites. Le succès reproductif de ces individus résistants est plus important que celui des
individus sensibles. Comme le temps de génération est court chez les strongles, la proportion
d’individus résistants augmente rapidement dans la population (Prichard, 2001).
La diffusion de gènes de résistance est un phénomène complexe dont on ne connaît pas tous
les fondements. Plusieurs facteurs sont toutefois bien identifiés :
- la fréquence d’utilisation d’un anthelminthique conduit à une pression de sélection
élevée et favorise l’extension des résistances ; le risque maximal est représenté par une
utilisation à une fréquence correspondant à la période pré-patente des parasites où,
dans ce cas, chaque nouvelle génération est soumise à un traitement (Beugnet et
Kerboeuf, 1997). Il est ainsi souvent recommandé d’alterner les molécules anti-
parasitaires mais dans ce cas, le risque de favoriser des multi-résistances est non
négligeable.
- l’utilisation de procédés rémanents comme les diffuseurs intra-ruminaux exerce une
pression de sélection permanente (Beugnet et Kerboeuf, 1997).
- les erreurs de dosage volontaires ou non (surdosage et sous-dosage) interviennent pour
une large part pour favoriser la sélection de parasites chimiorésistants : les sous-
dosages permettent la survie d’individus hétérozygotes portant un allèle de résistance ;
à l’inverse, les surdosages favorisent l’émergence d’individus extrêmement résistants
(Jackson, 1993 ; Borgsteede et al., 1996).
- évidemment, l’introduction d’ovins porteurs de strongles gastro-intestinaux résistants
dans un troupeau est un facteur de risque important.
L’adoption de mesures visant à utiliser les anthelminthiques de façon raisonnée est donc
nécessaire pour limiter ces problèmes (Tableau n°5). En effet, le phénomène de réversion
d’une population parasitaire vers un état à nouveau sensible est en général très lent et difficile
à obtenir, voire impossible lorsque les allèles de résistance sont fixés (Sangster, 1999).
23

Contexte bibliographique
*Une fréquence d’utilisation minimale : contrôler les parasites sans pour autant viser à leur
éradication
*Mise en œuvre des traitements lorsque les infestations sont maximales
*Prise en compte de la rémanence de certains produits employés
*Choisir des posologies adaptées pour les traitements en évitant les sous-dosages et les sur-
dosages
*Développer des méthodes zootechniques et agronomiques capables de diminuer les nombres
de traitements
*Préserver un « refuge de sensibilité » permettant de maintenir des gènes de sensibilité au
sein de la population de parasites
Tableau n°5 : Six mesures afin de limiter la sélection d’individus chimiorésistants (d’après
Coles et al, 1994 ; Bjorn, 1994 ; Coles, 2005).
2.4. Prévalence de la résistance aux anthelminthiques
La résistance aux anthelminthiques est un phénomène d’ampleur mondiale, en augmentation
constante tant sur le plan géographique, qu’au niveau des espèces de parasites affectées et du
spectre des molécules impliquées (Sangster, 1999). Ces résistances sont décrites chez la
majorité des espèces de ruminants, mais sont plus sévères chez les ovins et les caprins que
chez les bovins. Toutes les espèces de strongles ainsi que les trois grandes familles
d’anthelminthiques sont concernées (Prichard, 1990). L’hémisphère sud (Australie, Nouvelle-
Zélande, Afrique du Sud) est la première zone concernée par ce phénomène (Wolstenholme et
al., 2004). Les conditions climatiques et le mode intensif de l’élevage y favorisent la
résistance de genres Haemonchus et Trichostrongylus (Jackson, 1993 ; Waller, 1997). Sur les
continents nord et sud-américains, le phénomène est quasi-similaire : un fort degré de
résistance aux benzimidazoles a été mis en évidence (Uhlinger et al., 1992). Les situations
sont considérées comme critiques au Paraguay, voire alarmantes dans certains pays (Uruguay)
(Waller, 1997). Le continent européen n’est pas épargné même si l’on considère que la
résistance y est moindre. En France, cette résistance est toutefois bien réelle, tant dans des
élevages ovins que caprins (Kerboeuf et Hubert, 1985 ; Kerboeuf et al., 1999 ; Chartier et al.,
2001).
24

Contexte bibliographique
Pendant de nombreuses années, les méthodes de lutte contre les strongles gastro-
intestinaux des ovins ont largement recouru à l’utilisation de molécules
anthelminthiques (benzimidazoles, imidazothiazoles, lactones macrocycliques…). A
l’heure actuelle, de nombreuses contraintes remettent en cause l’emploi à grande échelle
de ces substances anti-parasitaires :
♣interdiction d’utilisation chez les brebis laitières dont le lait est destiné à la
consommation humaine,
♣préoccupation de plus en plus vive des pouvoirs publics et des consommateurs vis à vis
des résidus médicamenteux dans les denrées alimentaires d’origine animale, et impact
de ces substances sur l’environnement et la faune non cible,
♣apparition et extension de résistances à ces molécules au sein des populations
parasitaires à l’échelle mondiale.
25

Contexte bibliographique
3. METHODES ALTERNATIVES DE LUTTE CONTRE LES STRONGLES GASTRO-INTESTINAUX
Il existe aujourd’hui de fortes limites ou restrictions à l’usage des anti-parasitaires en élevage
ovin. Les possibilités de synthèse, de mise au point et de commercialisation de nouvelles
molécules efficaces semblent réduites dans un avenir proche (Geary et al., 1999 et 2003), bien
que quelques molécules, comme l’émodepside (famille des cyclooctadepsipeptides) puissent
avoir leur intérêt dans la lutte contre les nématodes gastro-intestinaux (Jeschke et al., 2005).
La recherche de méthodes alternatives ou complémentaires aux anthelminthiques visant à
contrôler le parasitisme gastro-intestinal est donc urgente (Van Wyk et al., 1997 et 1999).
La figure n°3 résume les principaux axes de lutte contre les strongles gastro-intestinaux chez
les ovins.
Figure n°3 : Les trois principaux axes de lutte contre les strongles gastro-intestinaux (Hoste
et Chartier, 1997 ; Jackson, 2000)
26

3.1. Tarir les sources de contamination
3.1.1. La gestion raisonnée des pâturages
Contexte bibliographique
Elle consiste à minimiser le contact entre les ovins et les larves infestantes afin de maintenir la
productivité à un niveau acceptable. Connue depuis longtemps, cette méthode est facilement
et rapidement applicable et elle a un faible coût. Cependant, si cette gestion des pâturages est
réalisée avec succès dans les régions tropicales où la durée de vie des larves infestantes est
courte dans le milieu extérieur, il n’en va pas de même dans les régions tempérées où la survie
de ces larves est bien plus longue (Hoste et Chartier, 1997). Certaines mesures
recommandées, comme le ‘Treat and Move’ qui consiste à déplacer les animaux sur des
parcelles saines après traitement, sont pertinentes en l’absence de résistances, mais peuvent
favoriser une contamination exclusive du milieu extérieur avec des souches résistantes dans le
cas contraire.
Dans cet objectif, plusieurs catégories de méthodes ont été décrites (Yvore et al., 1996 ; Hoste
et Chartier, 1997 ; Cabaret et al., 2002) :
- méthode préventive, consistant à placer des animaux sains sur des parcelles
exemptes de larves infestantes,
- méthodes comme le ‘Treat and Move’ ou assainissements par mise au repos
court ou prolongé des parcelles ; pratique du retournement des prairies par
labour,
- méthodes par dilution consistant en un pâturage mixte ou alterné avec
plusieurs types d’hôtes (bovins et ovins, ou équins et ovins) ou avec un seul
type d’hôte (la différence de sensibilité entre ovins jeunes et adultes peut être
mise à profit afin de réduire la pression d’infection rencontrée par les animaux
jeunes qui sont les plus réceptifs ; le principe général consiste à ce que les
jeunes animaux précèdent toujours les adultes sur des parcelles saines).
Le succès de ces méthodes repose avant tout sur une gestion rigoureuse des systèmes de
pâturage. Cependant, cette gestion est en général établie selon des motifs agronomiques de
valorisation des parcs fourragers et d’herbe sur pied ; la prise en compte du risque parasitaire
n’étant en général considérée qu’en seconde intention.
27

3.1.2. Les champignons et bactéries nématophages
Contexte bibliographique
Plus de 50 espèces de champignons sont capables de capturer et détruire les larves de
nématodes sur les pâturages (Siddiqui et Mahmood, 1996). Parmi ceux-ci, Duddingtonia
flagrans est probablement l’espèce sur laquelle se sont concentrées la majorité des études.
Larsen et al. (1998) ont montré que les chlamydospores du champignon nématophage
Duddingtonia flagrans étaient capables de survivre lors du passage dans le tractus digestif des
ruminants. Ceci a ouvert la possibilité d’exploiter ce champignon comme agent biologique de
contrôle des parasites nématodes sur les pâturages (Waller et al., 1994 et 2001). Son intérêt
réside d’une part, dans la capacité des filaments mycéliens issus des spores à immobiliser ou
envahir les larves de strongles dans les matières fécales et d’autre part, dans le caractère
polyvalent de son action contre les strongles des ruminants, des équidés et des porcins. Dans
l’espèce ovine, Larsen et al. (1998) ont constaté une réduction de plus de 80% du nombre de
larves infestantes dans les matières fécales d’ovins expérimentalement infestés avec plusieurs
espèces de nématodes et recevant par voie orale des spores de D. flagrans.
De même, les capacités prédatrices du champignon Arthrobotrys cladodes var. macroides ont
récemment été mises en évidence (Eslami et al., 2005). L’activité nématophage de cette
espèce est identique à celle décrite pour D. flagrans : les conidies piègent les larves
infestantes d’Haemonchus contortus dans les matières fécales en formant des boucles autour
de celles-ci. Ces résultats sont similaires à ceux décrits par Mendoza-De Gives et Vazquez-
Prats (1994) avec une autre espèce de champignon nématophage, Monacrosporium
eudermatum.
Par ailleurs, les cristaux protéiques contenus dans les spores de la bactérie Bacillus
thuringiensis sont connus pour leur toxicité vis à vis d’une large variété d’insectes : ces
protéines cristallines sont activées dans le tube digestif de l’insecte et se lient aux récepteurs
membranaires intestinaux, entraînant la formation de pores et la mort de l’insecte (Schnepf et
al., 1998). Certaines de ces protéines sont également toxiques pour les nématodes et les
acariens (Feitelson et al., 1992). Dans une récente étude, Knotze et al. (2005) se sont
intéressés à la toxicité in vitro des spores bactériennes vis à vis des trois espèces majeures de
nématodes des ovins (H. contortus, T. colubriformis et T. circumcincta). La mise en évidence
d’un réel pouvoir destructeur vis à vis des stades larvaires, mais également contre les
nématodes adultes, pourrait faire de cette bactérie une alternative aux méthodes de contrôle
classiques comme les anthelminthiques. Toutefois, même si l’on sait que B. thuringiensis est
capable de traverser le tractus digestif de nombreuses espèces de mammifères et donc de
28

Contexte bibliographique
germer dans les cultures de matières fécales pour former des colonies produisant les
inclusions parasporales toxiques (Lee et al., 2002), des investigations plus poussées sont
nécessaires pour trouver une méthode d’administration in vivo compatible avec une survie de
la bactérie dans l’environnement acide et donc hostile de la caillette des ruminants.
3.2. Augmenter la résistance de l’hôte
3.2.1. La vaccination
*La vaccination contre Haemonchus contortus :
La vaccination contre ce parasite hématophage a fait l’objet de nombreuses études et certains
antigènes potentiellement protecteurs sont bien caractérisés à l’heure actuelle. Trois grandes
catégories d’antigènes peuvent être utilisés comme antigènes vaccinaux : les antigènes issus
d’homogénats totaux de vers, les enzymes protéolytiques et autres produits d’excrétion-
sécrétion (PSE) de vers adultes ou de larves, et les antigènes dits « cachés », correspondant
le plus souvent à des protéines du tractus digestif du parasite avec lesquelles le système
immunitaire de l’hôte n’est pas directement en contact.
♣Homogénats totaux des vers
Ces antigènes sont obtenus par gel filtration d’homogénats de vers entiers. Une fraction
contenant des antigènes de faible poids moléculaire induit un fort niveau de protection chez
des ovins préalablement infestés avec 20,000 larves infestantes d’H. contortus. Cet essai de
vaccination a permis de réduire de 99,9% l’excrétion fécale d’œufs du parasite et de 97,6% le
nombre total de vers retrouvés dans la caillette, par rapport à des ovins non vaccinés ou
auxquels seul l’adjuvant avait été administré (Schallig et van Leeuwen, 1997). Toutefois, la
protection conférée par ces antigènes n’était pas totale puisque un ovin sur les quatre vaccinés
n’était pas protégé.
♣Enzymes protéolytiques et produits d’excrétion-sécrétion
Deux protéines majeures, respectivement de 15 et 24 kDa, ont été caractérisées, isolées et
produites sous forme de protéines recombinantes (Schallig et al., 1997a). La vaccination
d’ovins adultes avec ces protéines a permis de réduire de plus de 70% l’excrétion fécale et le
nombre total de vers (Schallig et al., 1997b). La fonction biologique de la protéine de 15 kDa
n’est pas établie, mais se rapproche de deux antigènes de 11 et 30 kDa isolés dans les PES de
29

Contexte bibliographique
T. colubriformis, qui confèreraient une protection significative chez le cobaye (Savin et al.,
1990 ; Dopheide et al., 1991). La protéine de 24 kDa, uniquement détectée dans les stades
adultes, immatures et L4, serait produite dans l’œsophage du parasite et aurait un rôle dans la
phase d’alimentation (Takats et al., 1995).
La protection induite après immunisation avec ces deux protéines (15 et 24 kDa) est âge-
dépendante : les ovins de 6 et 9 mois d’âge ont une réduction significative du nombre total de
vers (respectivement 77 et 82%) après vaccination, alors que l’on observe aucune réduction
de la charge parasitaire chez des ovins de 3 mois (Vervelde et al., 2001).
♣Les antigènes « cachés »
Un antigène caché est défini comme un antigène non reconnu par l’hôte après infection. Les
hôtes ne sont généralement pas exposés aux protéines de la membrane digestive des
nématodes gastro-intestinaux. Cependant, si ces nématodes sont hématophages, comme H.
contortus, la surface intestinale du parasite peut être exposée aux immunoglobulines de l’hôte
et donc potentiellement à des anticorps spécifiquement dirigés contre ses propres constituants
(Knox et al., 2003). L’utilisation de protéines de la membrane digestive a été utilisée pour la
première fois dans des essais de vaccination contre les tiques et a permis l’obtention d’un
vaccin contre Boophilus microplus (Willadsen et al., 1995).
La même approche a permis de mettre en évidence plusieurs antigènes de la membrane
digestive d’H. contortus, dont l’utilisation vaccinale est prometteuse. La plupart de ces
antigènes ont été identifiés comme des enzymes impliquées dans la digestion du sang.
L’activité de certaines enzymes peut être inhibée par des anticorps vaccinaux in vitro (Smith
et al., 1997). Ce même mécanisme semble également efficace in vivo : il est possible que
l’accumulation de complexes antigène/anticorps à la surface intestinale du ver agisse comme
une barrière contre l’absorption des nutriments (Munn et al., 1987 ; Newton et Munn, 1999),
conduisant alors à une privation alimentaire du parasite, à une réduction de la ponte par les
femelles et à l’incapacité de résister aux contractions péristaltiques intestinales d’où une
élimination physique des vers. L’établissement des larves infestantes n’est en revanche pas
diminuée (Smith et Smith., 1993).
L’immunité conférée par les antigènes cachés n’interfère pas avec l’immunité naturelle
acquise contre le parasite (Smith et Smith, 1993). De même, la réponse vaccinale n’est pas
entretenue par les infestations naturelles, ce qui rend les rappels indispensables au maintien
d’une bonne immunisation.
30

Contexte bibliographique
Le tableau n°6 présente les différents antigènes de membrane digestive identifiés chez H.
contortus, ainsi que leurs caractéristiques biochimiques et le degré de protection obtenu dans
différentes études. L’antigène H11 est celui qui a fait l’objet du plus grand nombre d’études et
reste à ce jour le meilleur immunogène connu issu d’un nématode parasite.
Il est clair que des progrès substantiels dans l’élaboration de vaccins basés sur des antigènes
exprimés par la membrane digestive d’H. contortus ont été obtenus au cours des dernières
décennies avec d’excellents niveaux de protection démontrés lors d’études sur le terrain.
Toutefois, à l’heure actuelle, aucun vaccin commercialisable n’a vu le jour en raison
notamment des difficultés d’obtention à large échelle de ces antigènes, soit sous forme native,
soit sous forme de protéines recombinantes (Knox et al., 2003).
Le facteur majeur déterminant la production de masse puis la commercialisation d’un vaccin
issu de la technologie des protéines recombinantes, comme des stratégies d’atténuation ou
d’inactivation de la virulence, est son coût de production. Cette constatation est
particulièrement vraie pour la production de protéines recombinantes. Les systèmes de
production procaryotes telles que les levures (Saccharomyces cerevisiae) ou les bactéries (E.
coli) ont l’avantage de produire des protéines en grande quantité, mais l’inconvénient
d’entraîner des glycosylations parfois très différentes de celles pratiquées par les parasites.
L’immunogénicité de ces protéines recombinantes en est alors très diminuée. Pour remédier à
ce problème, de nouveaux systèmes eucaryotes de production de protéines recombinantes ont
vu le jour notamment avec Caenorhabditis elegans (Newton et Meeusen, 2003). Si la
conformation et la glycosylation des protéines obtenues par cette approche alternative sont
plus proches de celles des parasites cibles (Haslam et al., 1996), le rendement reste toutefois
nettement inférieur à celui des systèmes procaryotes et, par conséquent, les coûts de
production largement supérieurs. Une autre alternative à cette approche est de développer des
lignées cellulaires du nématode parasite lui-même (Newton et Meeusen, 2003). Coyne et
Brake (2001) ont créé une lignée cellulaire dérivée de larves infestantes d’H. contortus,
maintenue in vitro pendant une période prolongée (>48 mois). Les antigènes obtenus à partir
de cette lignée ont montré un pouvoir protecteur chez des ovins vaccinés (60% de réduction
du nombre total de parasites dans la caillette).
31

Contexte bibliographique
Nom de l’antigène Caractéristiques Activité Immunoprotection Références
H11
H-Gal-GP
(Haemonchus
galactose-containing
glycoprotein complex)
Contortine
Glycoprotéine membranaire de 110 kDa exprimée par
les microvillosités intestinales des stades parasitaires
Complexe natif d’environ 1000 kDa, comprenant 4
zones protéiques majeures (environ 230, 170, 45 et

*La vaccination contre Trichostrongylus colubriformis :
Contexte bibliographique
Contrairement à H. contortus, très peu de données existent sur la vaccination des ovins contre
les autres nématodes gastro-intestinaux et, en particulier, T. colubriformis (Emery, 1996).
Plusieurs antigènes d’excrétion-sécrétion issus de larves ou de vers adultes de T.
colubriformis ont toutefois été identifiés et isolés. C’est le cas de plusieurs antigènes de 11,
17, 30 et 37 kDa isolés à partir de PES de vers adultes, qui conféreraient une immunité
protectrice de plus de 50% chez le cobaye (Savin et al., 1990 ; Dopheide et al., 1991 ; Frenkel
et al., 1992). Chez le même hôte, un résidu de 94 kDa isolé de PES de larves L3 a donné une
protection variable de 30 à 50% chez le cobaye (O’Donnell et al., 1989a). Une tropomyosine
de 41 kDa isolée dans les mêmes conditions a permis d’obtenir des niveaux de protection
similaires, toujours chez le cobaye (O’Donnell et al., 1989b). Cependant, les études dans
l’espèce ovine restent très limitées et les essais d’immunisation sont en général cantonnés à
des infestations expérimentales répétées avec des parasites vivants (et parfois tronquées)
terminées par un traitement anthelminthique (Stankiewicz et al., 1996 ; McClure et al., 1998).
3.2.2. Interactions nutrition-parasitisme
La régulation des populations de nématodes chez les ovins est un phénomène complexe,
influencé par de nombreux facteurs, comme l’âge des animaux, leur race, leur statut
immunitaire et leur statut nutritionnel. L’interaction entre le parasitisme et la nutrition peut
être considérée sous deux aspects intrinsèquement liés : l’influence du parasite sur le
métabolisme de l’hôte et l’effet de la nutrition de l’hôte sur les populations de parasites (Coop
et Holmes, 1996).
Chez les ruminants, l’infestation par des nématodes gastro-intestinaux est à l’origine (i) d’une
diminution de l’ingestion volontaire de la ration, (ii) d’une malabsorption et d’une
maldigestion des nutriments et (iii) d’une ré-orientation de l’anabolisme vers le maintien de
l’homéostasie tissulaire et sanguine (Coop et Holmes, 1996 ; Coop et Kyriazakis, 1999 et
2001). Les déficits engendrés par les nématodes gastro-intestinaux sont principalement de
nature protéique (Bown, et al., 1991). Une amélioration des apports protéiques, de façon
quantitative ou qualitative, pourrait permettre aux animaux infestés de couvrir ces besoins
supplémentaires.
Plus récemment, l’incorporation de fourrages bio-actifs, et plus particulièrement des plantes
riches en tannins, a été envisagée. En protégeant les protéines de la ration des dégradations
ruminales et en favorisant leur absorption par l’intestin, ces composés contribueraient
indirectement à une meilleure réponse face aux nématodes parasites du tractus digestif (Jones
33

Contexte bibliographique
et Mangan, 1977). Une action anti-parasitaire directe de ces plantes est également suspectée
(Athanasiadou et al., 2000 et 2001).
De nombreuses plantes contiennent des mélanges complexes de tannins condensés et
hydrolysables, dont la teneur varie en fonction des espèces et variétés végétales, de la partie
végétale considérée, de leurs stades végétatifs et de conditions environnementales (Tableau
n°7).
Espèces végétales Dénomination
Teneur en tannins condensés (en
g/kg de matière sèche)
Légumineuses tempérées Lotus corniculatus (lotier corniculé) 48
Lotus pedunculatus (lotier des marais ou
pédonculé)
Onychobrychis viciifolia (sainfoin) 29
Hedysarum cornarium (sulla) 51-84
Medicago sativa (luzerne) 0.5
Trifolium repens (trèfle rampant) 1.7
Légumineuses tropicales Lespedeza cuneata (Lespedeza de Chine) 46
Leucanea diversifolia 96
Desmodium ovalifolium 232
Plantes herbacées Lolium perenne (ray-grass) 1.8
Chicorium intybus (chicorée) 3.1
Tableau n°7 : Quelques exemples de plantes et leur teneur en tannins condensés (d’après Min
et Hart, 2002).
Les effets des tanins condensés sur le parasitisme gastro-intestinal ont été étudiés chez des
ovins infestés de façon naturelle ou expérimentale. L’ingestion de légumineuses contenant ces
molécules a été associée à de meilleures résistance et résilience aux strongles gastro-
intestinaux (Niezen et al., 1994, 1995, 1998a et b ; Robertson et al., 1995 ; Marley et al.,
2003). La consommation de plantes riches en tannins par des moutons infestés par des
Trichostrongles du tractus digestif a été corrélée dans la majorité des cas à une diminution de
l’excrétion fécale des œufs, ainsi qu’à une diminution de la charge parasitaire totale. Par
contre, la fécondité des femelles nématodes ne semble pas affectée par l’ingestion de tannins
condensés. Certaines plantes diminueraient significativement le rendement d’éclosion des
œufs ainsi que le développement larvaire dans les matières fécales (Niezen et al., 2002).
77
34

3.2.3. La sélection de la résistance aux nématodes gastro-intestinaux
Contexte bibliographique
L’utilisation d’animaux génétiquement résistants représente une approche séduisante pour
réduire considérablement l’utilisation des anthelminthiques et freiner la diffusion de la
chimiorésistance dans les populations parasitaires. D’un point de vue épidémiologique, la
sélection d’animaux résistants offre l’avantage de diminuer l’excrétion fécale d’œufs et par
conséquent la contamination du pâturage (Barger, 1989).
*Définition de la résistance et de la résilience :
La résistance des ovins aux nématodes gastro-intestinaux est définie comme la capacité de
l’hôte à réguler l’installation, le développement, la fécondité et la survie des nématodes
(Douch et al., 1996a).
La résilience est la capacité de l’hôte à maintenir son niveau de production tout en étant
infesté (Albers et al., 1987 ; Bisset et al., 1994).
Le terme de tolérance fait référence à l’aptitude de l’hôte à survivre malgré les infestations
parasitaires. Ce terme ne doit toutefois pas être confondu avec la notion de tolérance
immunologique, couramment employé pour définir l’absence de réponse paradoxale de l’hôte
vis à vis d’antigènes du soi ou de la flore intestinale commensale (Baker, 1997).
*Les bases de la résistance :
La résistance est sous contrôle génétique (Wakelin, 1985 ; Gill, 1991 ; Bisset et al., 1996). Au
sein d’une population d’hôtes, il existe une variabilité génétique sur laquelle la sélection
naturelle peut agir en favorisant le succès reproductif de certains individus particulièrement
bien adaptés à leur environnement (Kassai et Sréter, 1992). Les helminthes se répartissent
dans une population d’hôtes selon une distribution agrégée qui suit une loi binomiale négative
(Barger, 1985a ; Windon, 1990a) : une faible proportion d’animaux héberge la majorité de la
population parasitaire tandis que la plupart des hôtes hébergent peu de parasites. Cette
variabilité trouve son origine dans la différence de réponse immunitaire face aux infestations
(Kassai et Sréter, 1992) mais aussi dans le caractère stochastique de l’ingestion des L3 sur le
pâturage.
La résistance semble indissociable de la réponse immunitaire mise en jeu lors d’infestations
parasitaires. Ceci expliquerait que les ovins adultes ou âgés répondent plus efficacement et
plus rapidement aux infestations parasitaires que les jeunes animaux (Gregg et al., 1978 ;
Douch, 1988 ; Douch et Morum, 1993). Ainsi, la plupart des auteurs conçoivent la résistance
35

Contexte bibliographique
en termes immunologiques (capacité d’acquérir et de « monter » une réponse immunitaire
efficace contre les nématodes). Les variations de la résistance face aux strongles gastro-
intestinaux observées chez les ovins font donc appel à des notions quantitatives (degrés
d’infestations variables selon les individus) et non à une notion du « tout ou rien » puisque la
résistance absolue face aux strongles ne semble pas exister dans cette espèce animale.
*Les races résistantes aux strongles gastro-intestinaux (variations entre races ovines) (Tableau
8A) :
Les races ovines ne présentent pas toutes la même résistance aux parasites gastro-intestinaux,
en particulier Haemonchus contortus, Teladorsagia spp et Trichostrongylus spp (Baker,
1997). Plusieurs races d’Afrique (Red Maasai, Djallonké, Sabi), des Caraïbes (Sainte
Croix, Barbados Black Belly), des USA (Florida native, Navajo) et d’Inde (Garole)
semblent être particulièrement résistantes aux strongles gastro-intestinaux. Les données chez
les caprins sont nettement moins nombreuses et convaincantes. Mais là encore certaines races
locales comme la « Small East African » ou la « West African Dwarf » semblent être
également plus résistantes que les races européennes (Baker, 1997 et 1998). Il est intéressant
de noter que la plupart des races connues pour leur résistance sont des races locales de milieu
tropical, vraisemblablement soumises à une pression de sélection intense par les nématodes
gastro-intestinaux (Baker, 1997).
Les données obtenues proviennent de différentes expérimentations en infestations naturelles,
ou en infestations expérimentales, uniques ou répétées. L’exposition préalable non contrôlée
des animaux aux nématodes gastro-intestinaux dans la majorité des études rend
l’interprétation de leur degré de résistance difficile. Toutefois, quelques études, peu
nombreuses, semblent mettre en évidence l’existence de races ovines plus résistantes que
d’autres dès la première exposition au parasite. Ainsi, les ovins de race Sainte-Croix ont une
moindre excrétion fécale que celle des ovins de race Dorset, préalablement immunisés ou
naïfs, lors de leur primo-infestation par H. contortus (Gamble et al., 1992). De même, chez les
ovins de race Barbados Black Belly l’excrétion fécale des œufs d’H. contortus et de T.
colubriformis est significativement inférieure à celle observée dans une race sensible (l’INRA
401) dès la première exposition aux parasites (Gruner et al., 2003). La résistance observée
dans cette race a une origine génétique car les ovins issus du croisement entre les deux races
ont une résistance intermédiaire (Gruner et al., 2003).
36

LIEU DE L’ETUDE RACES ETUDIEES / SUJETS
Maryland (Etats
Unis)
Maryland (Etats
Unis)
Sainte Croix et Dorset
Agneaux
Sainte Croix et Dorset
Agneaux
Kenya Red Maasai et Dorper
Louisiane (Etats
Unis)
Texas (Etats Unis)
Ohio (Etats Unis)
Suffolk et Gulf Coast Native
Florida Native, Rambouillet,
F1 et F2
Exotiques (Sainte Croix,
Barbados Black Belly et
Florida Native)
Locales (Finn-Dorset x
Rambouillet)
Croisées (1/2 exotiques – ½
locales)
TYPE D’INFESTATION ET
PARASITES
Naturelle (pâture contaminée avec
Hc)
Expérimentale
Ovins immunisés : 500 L 3 Hc par
jour / 5 jours / traitement /
challenge avec doses identiques
Ovins naïfs : challenge identique
Expérimentale (5,000 L 3 Hc /
traitement AH) puis naturelle
(pâture contaminée avec Hc)
Naturelle (pâtures différentes sur
les 3 premières années puis pâture
commune pendant 5 ans)
Parasites dominants : Hc et Tspp
Naturelle puis expérimentale
(6,000 L3 Hc)
Naturelle (pâture contaminée avec
plusieurs parasites dont Hc et Tspp
dominants)
Allemagne Rhön et Mérinoland Expérimentale (5,000 L 3 Hc)
Ethiopie Horro et Menz
France
Barbados Black Belly (BB),
INRA 401 et F1
Ovins de 3.5 et 7 mois
Expérimentale (deux infestations
avec Hc suivie d’une troisième
avec Hc, Tc et L. elongata)
Expérimentale
Hc, Tc et Oc (10,000 L3 /
traitement AH / challenge avec
10,000 L 3)
Contexte bibliographique
PARAMETRES CONSIDERES CONCLUSIONS REFERENCE
OPG
Nombre total de vers
OPG
OPG
OPG
OPG
Nombre total de vers
OPG
Nombre total de vers
OPG
Nombre total de vers
OPG
Nombre total de vers
OPG
Nombre total de vers
Ovins Ste Croix ont OPG et nombre
total de vers significativement
inférieurs à ceux des Dorset
1 ère infestation : pas de différences entre
les deux races
2 ème infestation : Ste Croix naïfs et
ovins des deux races immunisés ont
OPG significativement inférieurs à ceux
des Dorset naïfs
OPG plus faibles chez les brebis Red
Maasai que chez les Dorper, y compris
lors du periparturient rise
OPG significativement plus faibles chez
les ovins de race Gulf Coast Native
OPG Rambouillet > F1 > F2 > Florida
Native
Nombre total de vers Rambouillet et F1
> F2 et Florida Native
OPG significativement plus faibles chez
les Florida Native
Nombre total de vers plus faibles chez
les races exotiques
OPG Rhön > OPG Mérinoland
Pas de différences entre les deux races
en nombre total de vers
Infestation 1 : OPG Menz > OPG Horro
Infestations 2 et 3 : OPG idem ; charge
parasitaire Hc Horro > Menz ; charge
parasitaire Tc idem)
OPG INRA 401 > F1 > BB (dès
première infestation)
Nombre total vers F1 < INRA 401 (BB
non disponibles)
Tableau n°8A : Quelques études montrant la résistance entre races ovines face aux strongles gastro-intestinaux.
AH : anthelminthique, Hc : Haemonchus contortus ; Tc : Trichostrongylus colubriformis, Tspp : Trichostrongylus spp.
Gamble et al. (1992)
Gamble et al. (1992)
Wanyangu et al. (1997)
Miller et al. (1998)
Amarante et al. (1999)
Courtney et al. (1985)
Gauly et al. (2002)
Haile et al. (2002)
Gruner et al. (2003)
37

LIEU DE L’ETUDE RACES ETUDIEES / SUJETS
Australie
Australie
Australie
Australie
Hongrie
Mérinos
Brebis de 3 ans : brebis non
traitées comparées à brebis
immunodéprimées à la
dexaméthasone
Mérinos
Lignées de brebis IRH
(Increased Resistance to
Haemonchus), DRH
(Decreased resistance to
Haemonchus) et contrôles
(CH)
Mérinos
Agneaux nés soit de bélier
résistant, soit de bélier
sensible
Mérinos
60 groupes d’agnelles
demi-sœurs
Mérinos
Lignées HR (highresponders)
et LR (low
responders)
TYPE D’INFESTATION ET
PARASITES
Expérimentale (15,000 L3 Hc,
15,000 L3 Tc, 150,000 L3 Hc ou
les deux) après exposition
naturelle faible
Naturelle (pâture contaminée
avec Hc)
Naturelle (pâtures contaminées
avec Hc, Tc et Oc)
Contexte bibliographique
PARAMETRESCONSIDERES CONCLUSIONS REFERENCE
OPG
OPG
OPG
Nombre total de vers
Expérimentale (11,000 L3 Hc) OPG
Expérimentale
Expérience 1 : double
infestation avec 7,000 L3 Hc
Expérience 2 : double
infestation avec 15,000 L3 Tc
OPG
Brebis Mérinos extrêmement
résistantes à un challenge avec Hc
ou Tc ou les deux, après exposition
naturelle faible au pâturage
Brebis de lignée IRH ont un
périparturient rise significativement
moins prononcé que les DRH ou les
CH
Agneaux issus de bélier résistant
ont OPG et nombre de vers plus
faibles
Un groupe montre un fort niveau de
résistance (bélier supposé porter un
gène majeur de résistance)
OPG significativement plus faibles
chez ovins de lignée HR
Adams et al. (1990)
Woolaston (1992)
Gray et al. (1992)
Albers et al. (1987)
Sréter et al. (1994)
Tableau n°8B : Quelques études montrant la possibilité de sélectionner la résistance aux strongles gastro-intestinaux au sein d’une même race
ovine.
Hc : Haemonchus contortus, Tc : Trichostrongylus colubriformis, Oc : Ostertagia circumcincta
38

*Sélection au sein d’une même race (Tableau 8B) :
Contexte bibliographique
Il existe suffisamment de variation individuelle au sein d’une même race pour qu’une
sélection génétique de la résistance aux nématodes gastro-intestinaux soit possible (Windon,
1996 ; Dominik, 2005). Ainsi, la sélection de lignées résistantes ou sensibles a été réalisée
dans les races Romney (Bisset et al., 1991), Mérinos (Woolaston, 1992), Rhön (Gauly et
Erhardt, 2001) ou Polish Long Wool (Bouix et al., 1998). Ces lignées divergentes sont
fréquemment dénommées :
- «high-responders» ou «increased resistance» pour les ovins identifiés comme
résistants au sein d’une race
- «low responders» ou «decreased resistance» pour les ovins considérés comme
les plus sensibles au sein d’une race.
*Identification des animaux résistants :
La recherche de races résistantes comme la création de lignées divergentes au sein d’une race,
posent le problème de l’identification du statut des individus d’une population (résistants ou
sensibles). Il est donc nécessaire de définir quel(s) critère(s) ou caractère(s) doivent être
sélectionnés. Ces critères sont regroupés sous le terme de marqueurs phénotypiques et sont
à la base de la sélection phénotypique (individuelle ou généalogique).
Le phénotype correspond à l’ensemble des caractéristiques d’un individu, que ce soit son
apparence physique ou sa physiologie. Il est en partie déterminé par le fond génétique de
l’individu, mais également par l’ensemble des facteurs environnementaux qui influent sur cet
individu. Les marqueurs phénotypiques de résistance aux nématodes gastro-intestinaux
peuvent être i) l’intensité de l’excrétion fécale des œufs de parasites, ii) la capacité à croître et
à produire malgré une infestation parasitaire (dans ce cas, on parle plutôt de marqueurs de
résilience), iii) l’intensité de la réponse immunitaire observée lors d’une infestation… ou la
combinaison de plusieurs de ces marqueurs (Douch et al., 1996a).
Idéalement, ces marqueurs doivent être faciles à mesurer, répétables et directement en
rapport avec l’intensité du parasitisme. Ils doivent également permettre une mesure de la
résistance, ou au moins une indication prédictive de celle-ci, qui soit indépendante à la fois de
l’infection et des facteurs environnementaux (Windon, 1996).
Pour finir, ces marqueurs doivent être héritables. L’héritabilité (h 2 ) se définit comme la part
de la variation phénotypique attribuable à la génétique ; elle s’exprime donc en valeur relative
(comprise entre 0 et 1). Ainsi, plus sa valeur est élevée, plus le caractère étudié est sous
39

Contexte bibliographique
dépendance génétique. On peut également la définir comme l’aptitude d’un caractère donné à
se transmettre au cours des générations. Les niveaux d’héritabilité peuvent être divisés en
trois grandes catégories :
- h 2 < 0,1 : Faible héritabilité : la variation du caractère phénotypique
considéré est très peu influencée par la génétique et l’amélioration de celui-ci
par un schéma de sélection sera très difficile car il existe peu de variabilité
génétique dans la population. Dans ce cas, la sélection génétique est
irréalisable.
- 0,1 < h 2 < 0,3 : Héritabilité modérée : le caractère est modérément influencé
par la génétique mais il reste possible de différencier des animaux sur la base
de celui-ci, même si le progrès génétique obtenu par la sélection sera lent.
- h 2 > 0,3 : Héritabilité forte : le caractère considéré est sous forte dépendance
génétique ; les animaux à haut potentiel seront facilement ciblés dans la
population d’origine et le progrès génétique escompté sera rapide.
*Les marqueurs phénotypiques :
Un grand nombre de paramètres parasitologiques, physiologiques ou immunologiques ont été
testés comme marqueurs de résistance (Windon, 1990a ; Douch et al., 1996a). Ils peuvent être
classés en marqueurs directs (ne nécessitant pas l’euthanasie des animaux) ou indirects
(étudiés lors de programme de recherche puisque conditionnés par le sacrifice des animaux).
♣Marqueurs directs :
Le caractère le plus fréquemment mesuré pour évaluer la résistance aux strongles gastro-
intestinaux est l’excrétion fécale des œufs de parasites (exprimée en nombre d’œufs par
gramme ou OPG) (Kassai et Sréter, 1992 ; Douch et al., 1996a ; Baker, 1997).
L’excrétion fécale des œufs de parasites est influencée par de nombreux facteurs :
- le degré d’infestation de l’animal : même si les OPG semblent bien refléter la
population parasitaire présente chez l’hôte (Douch et al, 1984), quelques
réserves ont été émises sur son intérêt dans la recherche d’individus résistants
(Gruner, 1991 ; Dargie, 1992) en raison notamment des phénomènes de
densité-dépendance : la présence de très nombreux parasites chez un même
animal peut conduire à une excrétion limitée d’œufs ; dans ce cas, les OPG ne
40

Contexte bibliographique
sont pas représentatifs du nombre de vers présents chez l’hôte (Bishop et Stear,
2000)
- la composition spécifique de la communauté de nématodes présente chez
l’hôte
- le stade d’infestation : l’excrétion fécale est nulle lors de la période pré-patente
ou en période d’hypobiose
- le statut immunitaire de l’hôte (influence sur le degré d’établissement larvaire,
sur la fécondité des femelles…)
- les facteurs diététiques et la gestion du pâturage
- le statut physiologique de l’hôte et notamment la parturition chez les brebis.
Enfin, les problèmes de stockage des matières fécales (incapacité de conserver des matières
fécales sur de longues périodes) et l’impossibilité d’automatiser le comptage des œufs dans
celles-ci représentent des inconvénients techniques non négligeables.
Toutefois, la mesure de l’excrétion d’œufs reste le paramètre le plus utilisé à l’heure actuelle
dans les schémas de sélection existants. Son héritabilité varie entre 0,2 et 0,4 selon les études.
De nombreux autres marqueurs phénotypiques directs ont été évalués comme alternatives ou
en complèment au dénombrement des œufs dans les matières fécales.
Le comptage des polynucléaires éosinophiles circulants : l’éosinophilie sanguine et
tissulaire est une caractéristique fréquemment observée chez les ovins en réponse à une
infestation par des helminthes, en particulier avec les nématodes du tractus digestif (Schallig,
2000). Il semblerait que l’éosinophilie sanguine soit également inversement corrélée aux OPG
(Buddle et al., 1992 ; Rothwell et al., 1993). Toutefois, des études ont démontré que le
dénombrement des éosinophiles sanguins ne présentait aucun avantage par rapport aux OPG,
puisque l’héritabilité estimée de ce paramètre n’est d’environ que de 0,2 (Dawkins et al.,
1989 ; Woolaston et al., 1996). De plus, sa spécificité est relativement faible : l’éosinophilie
sanguine peut être influencée par des infestations parasitaires autres que les strongyloses
gastro-intestinales, par des phénomènes allergiques ou lors de syndromes éosinophiliques.
Enfin, l’éosinophilie sanguine n’est pas un parfait reflet de l’éosinophilie tissulaire, car de
faibles comptages d’éosinophiles sanguins peuvent être liés soit à une baisse de production de
précurseurs par la moelle osseuse, soit à un recrutement tissulaire massif (Douch et al.,
1996a).
41

Contexte bibliographique
Les produits des mastocytes muqueux : l’hyperplasie des mastocytes muqueux et des
globules leucocytes (considérés à l’heure actuelle comme des mastocytes intra-épithéliaux
dégranulés) est également l’une des caractéristiques rencontrées dans les strongyloses du
tractus digestif (Schallig, 2000). Leur localisation tissulaire ne permet pas leur dénombrement
direct. Leur nombre peut être estimé de façon indirecte par le dosage des produits qu’ils
libèrent dans la circulation générale lorsqu’ils sont activés : leucotriènes, histamine et
protéinases (SMCP : sheep mast cell proteinases). Toutefois, même si les quantités de ces
produits sont plus élevés dans la circulation générale lors d’infestation par les nématodes
gastro-intestinaux (à l’exception des leucotriènes), ils ne semblent pas refléter les niveaux
observés dans les tissus parasités (Douch et al., 1984) et donc n’apporteraient aucun avantage
par rapport à la mesure de l’excrétion d’œufs.
L’hématocrite : l’estimation du volume relatif de globule rouges dans le sang permet
de quantifier l’anémie chez les ovins et pourrait représenter un bon indicateur de résistance
aux parasites internes à condition que ceux-ci soient hématophages comme H. contortus, ce
qui restreint son utilisation. De plus, les variations physiologiques de l’hématocrite en
fonction des races ovines en font un marqueur phénotypique controversé.
Réponses anticorps sériques spécifiques d’antigènes parasitaires : le développement de
tests ELISA ainsi que la disponibilité d’anticorps monoclonaux dirigés contre les différents
isotypes des immunoglobulines ovines a permis d’étudier la dynamique des anticorps dans le
sérum des ovins en réponse aux infestations par les nématodes gastro-intestinaux (Beh, 1987
et 1988 ; Dawkins et al., 1988). Les lignées ovines sélectionnées pour leur résistance ou leur
sensibilité aux infestations par les nématodes ont permis de comparer l’intensité des réponses
anticorps sériques comme indicateurs potentiels de résistance (Gill, 1991 ; Douch et al.,
1996a).
Autres marqueurs phénotypiques directs :
- le type d’hémoglobine (les ovins possédant une hémoglobine de type AA
seraient plus résistants et auraient des excrétions d’œufs plus faibles que les
ovins ayant une hémoglobine de type BB ou AB (Windon, 1990a)),
- les antigènes lymphocytaires ovins ou OVA (les ovins high-responders
porteraient plus fréquemment les allèles SY1a et SY1b alors que les low
42

Contexte bibliographique
responders porteraient plutôt l’allèle SY2 (Outteridge et al., 1985, 1986 et
1988)).
♣Marqueurs indirects :
Le paramètre de référence pour évaluer le degré de résistance des ovins aux strongles gastro-
intestinaux reste certainement le nombre total de vers présents chez l’hôte. Son évaluation est
toutefois indissociable du sacrifice de l’animal, ce qui est totalement inconciliable avec un
quelconque schéma de sélection à grande échelle (Kassai et Sréter, 1992).
L’étude des réponses cytokiniques à l’échelle des tissus parasités, comme l’estimation de la
réponse humorale locale, sont également le plus souvent conditionnées par des analyses post
mortem et ne sont pas applicables, hormis dans des programmes de recherche, et sont limités
à un nombre restreint d’animaux (Kassai et Sréter, 1992).
*La sélection génétique :
La variabilité génétique entre les individus d’un troupeau a été utilisée en vue d’une sélection
d’ovins résistants en Australie (Windon, 1990a ; Windon et al., 1993 ; Woolaston and Eady,
1995), et en Nouvelle-Zélande (Bisset et al., 1991 ; Morris et al., 1995). Ces programmes de
sélection ont pour objectifs:
- d’estimer les corrélations entre la résistance aux nématodes et les paramètres
de production,
- de comprendre les mécanismes de résistance sous contrôle génétique,
- d’identifier des marqueurs phénotypiques et génétiques associés à la résistance
afin de les inclure dans des programmes de sélection commerciaux,
- d’évaluer la spécificité de sélection.
La sélection génétique d’ovins résistants aux nématodes gastro-intestinaux peut être envisagée
selon trois approches différentes :
- une approche polygénique
- une approche oligogénique
- une approche monogénique
43

La sélection selon un modèle polygénique :
Contexte bibliographique
Dans le modèle polygénique, on considère que les phénotypes observés résultent de
l’expression d’une infinité de gènes, dont les effets individuels, faibles, s’additionnent pour
donner le phénotype étudié, et auxquels s’ajoute un effet du milieu dans lequel les animaux
évoluent. Cette sélection n’est évidemment possible qu’à partir de paramètres dont
l’héritabilité est élevée. C’est une méthode relativement simple, également lente mais qui
offre les avantages d’un possible retour en arrière et d’une estimation du progrès génétique au
cours des années.
La plupart de ces programmes expérimentaux de sélection mis en place sont basés sur cette
approche. Ils font appel à la sélection phénotypique des animaux et à la création de lignées
ovines divergentes, le plus fréquemment sur la base de l’excrétion d’œufs dans les matières
fécales (Windon, 1996).
La sélection selon un modèle oligogénique ou monogénique :
Il peut être parfois avantageux de prendre en compte dans la sélection, en plus du fond
polygénique habituel, l’existence d’un (modèle monogénique) ou plusieurs gènes (modèle
oligogénique) ayant un effet individuel « fort » sur le caractère étudié (Le Roy et Elsen,
2000). La recherche de tels gènes a été entreprise depuis plus de 10 ans, mais elle est
récemment devenue plus efficace grâce à l’établissement de cartes génétiques pour les
espèces d’élevage. Une démarche de recherche systématique a alors pu être mise en œuvre,
l’ensemble du génome étant alors balayé pour détecter les zones influençant le caractère : les
Quantitative Trait Loci (QTL) (Goffinet et al., 1994 ; Dominik, 2005).
La complexité des processus physiologiques suggèrent qu’un nombre important de gènes est
impliqué dans les mécanismes de résistance aux nématodes (Dominik, 2005). Une grande
partie de l’information sur la résistance aux nématodes gastro-intestinaux a été obtenue à
partir de modèles murins (Behnke et al., 2003). La différence de sensibilité entre les hôtes
peut être expliquée par des variations alléliques des gènes de la réponse immunitaire et/ou des
voies de signalisation intra-cellulaire.
Dans un modèle murin avec des souris F2 issues d’un croisement entre une lignée résistante
(SWR) et une lignée sensible (CBA), infestées par Heligmosomoïdes polygyrus, une première
étude a permis la mise en évidence de 7 QTL sur 6 chromosomes différents (1, 2, 8, 13, 17 et
19) (Iraqi et al., 2003), associés au contrôle de la survie des vers (nombre total de parasites à
l’autopsie) et de leur fécondité (OPG). Cette étude a été complétée par la recherche, dans le
même modèle, de QTL influençant la réponse immunitaire vis à vis de H. polygyrus (Menge
44

Contexte bibliographique
et al., 2003). Quatre caractères ont été pris en compte : les niveaux sériques de MMCP1
(mucosal mast cell protease 1), d’IgG1, d’IgE et la formation de granulomes tissulaires
associés à l’infestation. Des QTL associés à ces caractères ont été détectés sur plusieurs
chromosomes, dont les chromosomes 1 (récepteurs du CD28 et de l’IL-1), 12 (chaînes lourdes
des immunoglobulines), 13 (chaîne γ du T-cell recepteur), 17 (porteur du complexe majeur
d’histocompatibilité ou CMH, du TNFα), suggérant l’implication possible de ces différents
gènes dans le contrôle de la résistance au parasitisme. L’intérêt du modèle H. polygyrus chez
la souris est qu’il est très proche des infestations par les Trichostrongylidés chez les animaux
de rente. La recherche d’homologies entre les espèces de rente et la souris pourrait permettre
la mise en évidence de gènes d’intérêt chez les ovins (Iraqi et al., 2003 ; Menge et al., 2003).
Chez ces derniers hôtes, les résultats de recherche de QTL liés à la résistance aux nématodes
gastro-intestinaux (Sonstegard et Gasbarre, 2001 ; Dominik, 2005) ont souvent été
contradictoires. Ces différences trouvent probablement leur explication dans la diversité des
protocoles expérimentaux mis en œuvre (différentes races ovines, différentes espèces de
parasites utilisées, différents modes d’infestation, différents caractères de résistance étudiés et
plusieurs approches analytiques pour la recherche de QTL) (Dominik, 2005). Des zones
chromosomiques d’intérêt ont été détectées sur le chromosome 1 (Beh et al., 2002 ; Diez-
Tascon et al., 2002), sur le chromosome 6 (Beh et al., 2002), mais également sur les
chromosomes 3 et 20. Ces deux chromosomes sont porteurs respectivement des régions de
l’IFNγ et du CMH.
Dans des lignées divergentes d’ovins de race Romney, Paterson et al. (2001) ont détecté 5
QTL dans la région de l’IFNγ, en relation avec l’intensité de l’excrétion d’œufs. De même,
une étude des niveaux d’IgA sériques mesurés après une infestation avec T. circumcincta sur
des ovins de race Soay, a établi une association significative avec le premier intron de la
région de l’IFNγ (Coltman et al., 2001). Cette zone chromosomique est ainsi la seule à avoir
été identifiée dans plusieurs études (Beh et al., 1998 ; Crawford, 1998 ; Crawford et McEwan,
1998) chez les ovins, mais également chez l’homme lors d’infestation par Schistosoma
mansoni (Quinnell, 2003).
Des associations significatives entre divers caractères phénotypiques et la région du CMH II
sur le chromosome 20 ont également été mises en évidence dans plusieurs travaux :
associations entre les OPG lors d’infestation par T. circumcincta et le locus DRB1 du CMH
(Schwaiger et al., 1995 ; Stear et al., 1996), associations similaires entre OPG et CMH
(Feichtlbauer et al., 1998 ; Paterson et al., 1998 ; Charron et al., 2000). Toutefois, ces
45

Contexte bibliographique
associations doivent être considérées avec précaution puisque d’autres travaux évoquent
aucune ou une très faible influence du locus CMH sur les OPG chez les ovins (Hohenhaus et
Outteridge, 1995 ; Crawford et al., 1997) ou chez la souris (Wakelin, 1988).
Lorsque les gènes de résistance et leurs fonctions seront identifiés, de nouvelles avancées
dans la compréhension des bases moléculaires de la résistance de l’hôte aux nématodes
gastro-intestinaux seront possibles et auront d’importantes applications pour le
développement de nouvelles stratégies de contrôle. Une approche récente (DNA Micro-array)
devrait également contribuer à la découverte de gènes candidats impliqués dans cette
résistance (Diez-Tascon et al., 2005).
Intérêts de la sélection génétique :
L’intérêt de la sélection génétique est double car elle induit :
(i) une réduction durable de la contamination des pâtures. Une étude menée en
Australie pendant 224 jours sur des jeunes ovins de race Mérinos, infestés par
H. contortus, a démontré l’efficacité de la sélection d’ovins résistants. Les
résultats indiquent que l’effet le plus large et le plus persistant sur l’excrétion
fécale est obtenu par cette sélection (diminution de 69% des OPG), en
comparaison avec une supplémentation protéique (diminution de 35% des
OPG), un traitement anthelminthique à base de closantel et d’ivermectine
(diminution de 28% des OPG) ou à une vaccination expérimentale des agneaux
(aucun effet sur les OPG) (Eady et al., 2003).
(ii) une résistance étendue à un groupe d’espèces proches. La résistance à T.
circumcincta semble ainsi associée à une meilleure résistance à H. contortus
(Scrivner, 1967) ; de même, la résistance à T. colubriformis semble corrélée à
un certain degré de résistance à T. rugatus, T. axei, T. circumcincta, et, à un
degré moindre, à H. contortus (Kassai et Sréter, 1992).
Les limites de la sélection génétique :
La sélection de la résistance aux strongles gastro-intestinaux ne pourrait-elle pas augmenter la
sensibilité à d’autres pathogènes, viraux ou bactériens par exemple (Kassai et Sréter, 1992) ?
Pour cela, les schémas de sélection basés sur des programmes de sélection polygénique
offrent l’avantage d’une sélection relativement lente permettant de détecter précocement la
sélection de caractères non souhaitables, avec un retour en arrière possible.
46

Contexte bibliographique
Toutefois, le risque majeur réside dans l’apparition de communautés de parasites adaptées à
des hôtes résistants (Kassai et Sréter, 1992 ; Beh et Maddox, 1996). La forte variabilité
génétique des nématodes gastro-intestinaux, leur grand potentiel de reproduction et leur temps
de génération relativement court ont déjà permis l’extension de la résistance aux molécules
anti-parasitaires. Ces mêmes causes pourraient entraîner une adaptation des parasites à des
hôtes sélectionnés pour leur résistance. Deux études de passages en série d’H. contortus sur
des ovins immunisés n’ont pas permis de montrer une adaptation de ce parasite à des hôtes
résistants (Adams, 1988 ; Albers et Burgess, 1988). De même, les passages en série (10
générations) de lignées d’H. contortus sur des ovins jumeaux monozygotes rendus résistants,
ou sensibles par un traitement immuno-dépresseur, n’ont pas mis en évidence de différences
dans les traits de vie des lignées parasitaires (Saulai et al., 2001). En revanche, certains
auteurs font état d’un pouvoir infestant accru des larves de T. colubriformis issues d’animaux
résistants (Windon, 1990b).
Conséquences économiques de la sélection génétique :
La résistance aux nématodes gastro-intestinaux ne semble pas avoir d’effets défavorables sur
la productivité des animaux. Au contraire, les bénéfices de cette sélection devraient être
d’autant plus importants que la pression d’infection est élevée : les animaux les plus résistants
survivraient plus facilement dans un environnement infesté et auraient donc des pertes de
production moins importantes.
Les conséquences éventuelles de la sélection génétique sur la fertilité des animaux semblent
par contre plus conflictuelles. En effet, une étude a montré une association négative entre la
fertilité des brebis et la résistance (Piper, 1987). Néanmoins, en l’absence de données plus
étayées, cette association mérite d’être ré-évaluée.
Enfin, la réduction de 50 à 95% des OPG dans des troupeaux d’ovins sélectionnés pour leur
résistance aux nématodes gastro-intestinaux a évidemment d’importantes conséquences en
termes d’épidémiologie des infestations parasitaires : l’accumulation de larves infestantes
sur les pâtures est réduite de façon durable, ainsi que les risques de pertes économiques ou de
maladie clinique (Windon, 1990b). Ainsi, il est probable que l’exclusion des béliers et brebis
« low-responders » des programmes de sélection devrait améliorer considérablement la
situation épidémiologique.
47

Contexte bibliographique
Les possibilités réduites de commercialisation de nouvelles molécules anthelminthiques
efficaces dans un avenir proche rendent urgentes la recherche de méthodes alternatives
ou complémentaires au traitement chimique pour la lutte contre les nématodes gastro-
intestinaux. Parmi ces méthodes, certaines sont lourdes à appliquer (gestion raisonnée
des pâturages) ou encore cantonnées à des programmes de recherche expérimentaux et
non utilisées à grande échelle (utilisation de champignons ou bactéries nématophages).
D’autres méthodes alternatives semblent toutefois prometteuses : vaccination des
animaux avec des antigènes parasitaires ou sélection d’animaux résistants aux strongles
gastro-intestinaux. Là encore, les essais expérimentaux n’ont pas permis de développer
des vaccins commercialisables et utilisables sur le terrain, et les programmes de sélection
d’animaux résistants ne sont appliqués que dans certains pays comme l’Australie ou la
Nouvelle-Zélande. Le frein majeur de l’utilisation de ces méthodes alternatives reste
toutefois la méconnaissance des interactions hôte/nématodes et en particulier la réponse
immunitaire des ovins face aux strongles gastro-intestinaux.
48

Contexte bibliographique
4. LA REPONSE IMMUNITAIRE DES OVINS FACE AUX STRONGLES GASTRO-INTESTINAUX
4.1. Organisation générale de la réponse immunitaire
Il existe deux grandes composantes de la réponse immunitaire (Janeway, 2001a ; Goldsby et
al., 2003 ; Tosi, 2005) :
- la réponse immunitaire innée dans laquelle des mécanismes non spécifiques
contre un pathogène sont rapidement mis en œuvre. L’immunité naturelle n’est
pas toujours suffisante pour éliminer le pathogène, mais elle est indispensable
pour mener à bien une première défense en attendant que l’immunité
adaptative prenne le relais.
- la réponse immunitaire adaptative, dans laquelle des réponses plus tardives
et très spécifiques du pathogène rencontré sont mises en jeu. Cette réponse
présente à la fois un haut degré de spécificité ainsi que la remarquable
propriété de « mémoire » : la ré-exposition à un même antigène a pour
conséquence une réponse mnémonique plus rapide et souvent plus efficace
pour neutraliser l’agent pathogène en cause.
Après une brève présentation de la réponse immunitaire innée, nous nous attacherons plus
spécifiquement, dans ce chapitre, aux mécanismes de la réponse immunitaire adaptative,
composante essentielle de la réponse face aux strongles gastro-intestinaux et objet de nos
travaux de recherche.
4.2. La réponse immunitaire innée
L’immunité naturelle représente la première ligne de défense de l’hôte face à un agent
pathogène. Au niveau du tractus gastro-intestinal, cette ligne de défense est assurée par :
- des moyens non immunologiques : l’épithélium digestif représente une barrière
physique qui peut prévenir l’invasion par des organismes pathogènes ; cette
barrière est également renforcée par le renouvellement rapide de cet
épithélium, les sécrétions muqueuses présentes à sa surface (mucines en
particulier), ainsi que le péristaltisme intestinal qui aident à l’expulsion des
agents pathogènes (Béné et Faure, 2000 ; Basset et al., 2003 ; Sansonetti,
2004),
- des moyens immunologiques complexes, véritables bases de l’immunité innée.
49

Contexte bibliographique
Le système immunitaire inné repose sur une série de récepteurs (PRR : pattern recognition
receptors, dont les Toll-like receptors ou TLR) qui reconnaissent des patterns moléculaires
conservés, trouvés seulement chez les micro-organismes (PAMPs pour pathogen-associated
molecular patterns) (Medzhitov et Janeway, 1998 ; Clark et Kupper, 2005). Les PRR ont été
initialement définis comme des récepteurs de surface des cellules de l’immunité innée, mais
cette définition a été étendue aux molécules sécrétées ou produites localement, qui initient de
nombreuses étapes de l’inflammation (Janeway et Medzhitov, 2002). Du fait que les PAMPs
ne sont produits que par des micro-organismes et non par l’hôte, leur reconnaissance par les
PRR signale la présence de pathogènes. Cette reconnaissance permet alors d’activer
directement les mécanismes de la réponse immunitaire innée, comme la phagocytose (rôle
des monocytes, macrophages et polynucléaires neutrophiles), l’activation du système du
complément, l’induction de la synthèse de peptides anti-microbiens, l’induction de la nitric
oxyde synthétase dans les macrophages, la synthèse et la sécrétion de cytokines par les
macrophages, la lyse des cellules infectées par les cellules Natural Killer (NK)…
L’ensemble de ces mécanismes permet de détruire les cellules infectées par le micro-
organisme pathogène ou le pathogène lui-même (Figure n°4).
Figure n°4 : Schématisation de la réponse immunitaire innée (d’après Tosi, 2005). Le contact initial entre
l’hôte et un micro-organisme microbien, ou ses produits, résulte en une série de signaux d’activation qui
mobilisent à la fois des effecteurs cellulaires et humoraux contre leur cible finale. Les composantes de la réponse
de l’hôte sont figurées en grisé. Abréviations : TLR : Toll-like Receptor, Mφ : macrophages, AP : voie alterne du
complément, MBLP : voie des lectines liées au mannose, MAC : complexe d’attaque des membranes).
50

Contexte bibliographique
Dans le domaine des parasites métazoaires, le rôle de l’immunité innée est mal connu, même
s’il est probable. En effet, des composés glycoconjugués immunogènes produits par les
schistosomes induisent des réponses immunitaires innées caractéristiques chez l’hôte infecté
(Hokke et Yazdanbakhsh, 2005). Pour les strongles gastro-intestinaux, la compréhension des
mécanismes d’activation précoce des voies de l’immunité, ainsi que la découverte de patterns
moléculaires spécifiques de type PAMPs, devraient permettre de confirmer à l’avenir le rôle
de l’immunité innée dans les mécanismes de réponse (Gause et al., 2003). Des TLR ou autres
PRR capables d’identifier certaines caractéristiques des antigènes helminthiques existeraient
(MacDonald et al., 2002). Dans une étude récente, Jackson et al. (2005) ont démontré une
association positive entre la réponse TNF-α et le ligand bactérien du TLR4 (LPS :
lipopolysaccharide) chez des enfants de l’archipel de Pemba Island (Tanzanie) fortement
exposés à différents nématodes du tractus gastro-intestinal (Ascaris lumbricoïdes, Trichuris
trichuria, Ankyslostomatidés). Les résultats de cette étude montreraient que les nématodes
gastro-intestinaux modulent les réponses immunitaires innées et donc pourraient induire des
mécanismes interférant avec les réponses vis à vis d’autres agents pathogènes, en particulier
bactériens.
4.3. La réponse immunitaire adaptative
Les études sur modèles murins infestés par différents nématodes gastro-intestinaux
(Trichinella spiralis, Heligmosomoïdes polygyrus, Nippostrongylus brasiliensis et Trichuris
muris) ont fourni beaucoup informations sur les mécanismes immunitaires mis en jeu dans les
nématodoses gastro-intestinales et leur régulation (Finkelman et al., 1997).
Ainsi, quatre grandes étapes de la réponse immunitaire adaptative dans les strongyloses du
tractus digestif ont été proposées (Figure n°5) :
1 – Présentation des antigènes parasitaires aux lymphocytes T CD4+
2 – Orientation de la réponse immunitaire dans l’une des deux grandes voies de
polarisation : Th1 ou Th2
3 – Mise en place des effecteurs de l’immunité représentés par les cellules et les
anticorps
4 – Conséquences sur les traits de vie des strongles gastro-intestinaux : installation des
larves, développement chez l’hôte, fécondité des femelles, excrétion fécale des œufs,
survie des vers adultes.
51

Contexte bibliographique
Figure n°5 : Organisation générale de la réponse immunitaire adaptative (d’après C. Lacroux
et dessiné par Y. Gras, ENVT).
Dans la suite de ce chapitre, nous allons envisager successivement ces quatre grandes parties
de la réponse immunitaire, en mettant l’accent sur les éléments connus dans les modèles
murins ou les infestations naturelles chez l’homme, que l’on retrouve dans les strongyloses
gastro-intestinales des ruminants (ovins en particulier). Cependant, de nombreuses inconnues
subsistent chez les ruminants. Une dernière partie sera consacrée aux mécanismes de
régulation de la réponse immunitaire. En effet les parasites ont la capacité d’inhiber certains
mécanismes effecteurs de l’immunité, les protégeant ainsi d’une élimination physique
(Maizels et Yazdanbakhsh, 2003).
4.3.1. Présentation des antigènes parasitaires et initiation de la réponse immunitaire
adaptative
L’événement essentiel de l’initiation des réponses immunitaires adaptatives est l’expansion
clonale de lymphocytes T spécifiques et leur différenciation vers une fonction effectrice (Liu
52

Contexte bibliographique
et Janeway, 1992). L’expansion de lymphocytes T CD4+ est induite par des cellules
présentatrices d’antigènes (CPA) qui présentent des fragments peptidiques d’antigènes
étrangers, liés aux molécules de classe II du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH
II), aux récepteurs des lymphocytes T (TcR : T cell receptor). L’expansion clonale est
également conditionnée par la délivrance de signaux de co-stimulation aux lymphocytes T
par les CPA (Jenkins et al, 1987 ; Liu et Janeway, 1991). De nombreuses études indiquent que
la stimulation de lymphocytes T matures via leur TcR en l’absence de signal de co-
stimulation spécifique aboutit à une inactivation clonale sous la forme d’une anergie ou d’une
mort cellulaire (Liu et Janeway, 1990).
La première étape de cette initiation consiste en une capture des antigènes parasitaires par les
cellules présentatrices d’antigènes situées dans la muqueuse digestive. L’épithélium gastro-
intestinal et le mucus présent à sa surface constituant une barrière physique à la capture des
antigènes, celle-ci s’effectue dans les structures lymphoïdes disséminées tout au long de la
muqueuse digestive : les plaques de Peyer et autres formations lymphoïdes associées au
tube digestif (GALT). Des cellules spécialisées, les cellules M, permettent le transport des
antigènes vers les cellules présentatrices d’antigènes situées dans un dôme sous-épithélial où
ont lieu les interactions initiales entre CPA et lymphocytes T (Owen, 1994 ; Onah et Nawa,
2000) (Figure n°6).
Figure n°6 : Organisation d’une plaque de Peyer intestinale (d’après Mowat, 2003).
Abréviations : SED : dôme sous-épithélial, TDA : zone thymo-dépendante.
53

Contexte bibliographique
On ne connaît pas encore le mode de présentation des antigènes de nématodes gastro-
intestinaux dans le tube digestif des ruminants. A partir d’études in vitro, au moins quatre
types cellulaires (cellules dendritiques, macrophages, lymphocytes B et cellules épithéliales)
semblent capables de présenter des antigènes au sein du tissu lymphoïde associé au tube
digestif (Owen, 1994). Cependant, en raison du nombre restreint d’études sur la capture, le
processing et la présentation des antigènes de nématodes, il n’existe aucune preuve solide in
vivo de l’implication de ces cellules dans la présentation antigénique (Miller, 1996a). De
même, il reste à déterminer quels sont les types d’antigènes de nématodes capables d’initier
ces mécanismes : antigènes cuticulaires, antigènes de liquide de mue, produits d’excrétion-
sécrétion larvaires ou de vers adultes ? (Onah et Nawa, 2000).
Le rôle du CMH II dans le contrôle des réponses immunitaires contre les nématodes a
largement été étudié chez la souris (Wakelin, 1992). Les niveaux d’expression élevés du
CMH II par les cellules dendritiques confortent leur rôle dans la présentation d’antigènes
parasitaires (Johansson et Kelsall, 2005). D’autres types cellulaires, dont les mastocytes et les
polynucléaires éosinophiles, peuvent exprimer les molécules de classe II du CMH et donc
présenter des peptides aux lymphocytes T CD4+ ( Del Pozo et al., 1992 ; Frandji et al., 1993).
Leur capacité de présentation antigénique, et leur présence dans les muqueuses, notamment
digestive, en font également de bons candidats pour l’initiation des réponses immunitaires
dans ces sites (Coffman et von der Weid, 1997).
En conclusion, il apparaît qu’il existe plusieurs voies d’induction de la réponse immunitaire
adaptative au sein des muqueuses gastro-intestinales.
4.3.2. Orientation de la réponse immunitaire : Th1 ou Th2 ?
La présentation de peptides aux lymphocytes CD4+ naïfs par une cellule présentatrice
d’antigène, ainsi que les cytokines présentes dans le micro-environnement de ces cellules,
déterminent l’orientation de la réponse immunitaire adaptative vers l’une des deux grandes
voies Th1 ou Th2. Ce paradigme Th1/Th2 a été établi par l’analyse des cytokines produites par
un panel de clones de lymphocytes T CD4+ murins : ces clones sécrètaient soit de
l’interféron γ (IFN-γ) et de l’interleukine 2 (IL-2), soit de l’IL-4 (Mosmann et Coffman,
1989). Le premier type a été désigné Th1 et le second Th2 (Mosmann et al., 1986 ;
Romagnani, 1997). D’une façon caricaturale, les réponses de type Th1 seraient initiées lors
d’infections intra-cellulaires (virales, bactériennes, infections à protozoaires), alors que les
54

Contexte bibliographique
réponses Th2 le seraient lors d’infections par des parasites métazoaires extra-cellulaires (Paul
et Seder, 1994).
Dans les réponses de type Th2, les lymphocytes T CD4+ produisent de l’IL-4 (cytokine clé de
la polarisation Th2), mais aussi de l’IL-13, de l’IL-5 et de l’IL-9. Aussitôt après une
infestation, les sources précoces d’IL-4 ne sont pas complètement connues (Coffman et von
der Weid, 1997). Différents types cellulaires, dont des cellules non T, pourraient produire
cette cytokine. Des études sur souris infectées par N. brasiliensis confirment qu’au moins
trois types cellulaires produisent de l’IL-4 : les cellules lymphocytaires T CD4+, mais
également les polynucléaires éosinophiles et les basophiles (Voehringer et al., 2004). L’IL-4
peut également être produite par les cellules T Natural Killer (NK), les lymphocytes T γδ et
les mastocytes (Brown et al., 1987 ; Yoshimoto et Paul, 1994). La plupart de ces cellules
semblent produire également de l’IL-13. Les récepteurs de l’IL-4 et de l’IL-13 ont en
commun la même chaîne α et une même activation intra-cellulaire via Stat6. L’IL-13 pourrait
avoir une importance au moins égale à celle de l’IL-4 pour la protection de l’hôte lors de
certaines infestations par des helminthes gastro-intestinaux (Finkelman et al., 1999).
L’importance relative de ces deux cytokines, du récepteur de l’IL-4 et de Stat6, a été prouvée
sur des souris déficientes en l’un ou l’autre de ces composés, qui développent des réponses
Th2 inefficaces contre les nématodes gastro-intestinaux (Urban et al., 1991 ; Bancroft et al.,
1998 ; McKenzie et al., 1999 ; Urban et al., 2001). L’IL-4, seule, est toutefois capable
d’induire des réponses Th2 caractéristiques, même en l’absence combinée d’IL-5, d’IL-9 et
d’IL-13 (Fallon et al., 2002).
La présence de cellules sources de cytokines Th2 ainsi que la concentration locale en
cytokines dans un site anatomique donné, en particulier la muqueuse digestive, déterminent
un micro-environnement cytokinique indispensable à l’orientation de la réponse
immunitaire (Kourilsky et Truffa-Bachi, 2001) ; l’IL-4 étant nécessaire pour l’amplification
des cellules Th2 (Gause et al., 2003).
La différenciation de clones de lymphocytes T CD4+ naïfs en cellules productrices d’IL-4 est
donc l’étape déterminante pour la mise en place d’une réponse Th2 efficace et protectrice.
L’orientation de la réponse immunitaire lors d’infestations par des helminthes est clairement
de type Th2 dans les modèles murins. La production d’IL-4 est nécessaire pour la protection
de l’hôte et pour limiter la sévérité des infestations. A l’inverse, la production de cytokines
55

Contexte bibliographique
Th1 (IL-12 et IFN-γ) inhibe cette immunité protectrice et favorise la survie des nématodes
gastro-intestinaux (Urban et al., 1996 ; Finkelman et al., 1997). Toutefois, des variations
importantes existent selon l’espèce de nématode en cause ou la souche murine utilisée en
expérimentation (Gause et al., 2003).
Nippostrongylus brasiliensis et Heligmosomoides polygyrus sont deux nématodes parasites
largement utilisés comme modèles d’infestations gastro-intestinales chez la souris. Ils sont
capables de déclencher des réponses Th2 hautement polarisées avec des niveaux élevés de
production d’IL-4 et d’IL-13 (Svétic et al., 1993). Toutefois, alors qu’une infestation avec N.
brasiliensis est éliminée en deux semaines après inoculation, une primo-infestation avec H.
polygyrus se traduit par une infection chronique. Ces deux parasites, bien qu’initiant une
réponse immunitaire similaire dans sa polarisation, établissent des interactions avec l’hôte très
différentes. La réponse aiguë observée avec N. brasiliensis, parasite dont l’hôte habituel est le
rat, pourrait être la conséquence d’une inadaptation à un environnement murin.
Les différences de réponse entre souches murines vis à vis d’un même parasite sont mises en
évidence lors d’infections avec Trichuris muris : une forte réponse Th2 avec expulsion rapide
des vers est observée chez des souris BALB/c, une réponse mixte Th1/Th2 avec expulsion
retardée des vers est mise en place chez des souris BL/6 alors qu’une réponse Th1 résultant en
une infection chronique est initiée chez des souris AKR (Gause et al., 2003).
Des intensités d’infestation différentes sont également la source de variations de réponses. En
effet, des doses faibles de larves infestantes de T. muris génèrent des réponses de type Th1
alors que des doses plus fortes initient des réponses Th2 protectrices (Bancroft et al., 1994).
Des souris primo-infestées avec des doses fortes sont résistantes à un challenge ultérieur, par
des doses faibles ou fortes, alors que des souris infectées avec des doses faibles en primo-
infection restent sensibles à un challenge ultérieur (Bancroft et al., 2001).
Qu’en est-il des infestations par les helminthes dans les autres espèces et, en particulier, chez
l’homme ? Cooper et al. (2000) ont montré que des cellules mononucléées sanguines
humaines stimulées par des antigènes d’Ascaris lumbricoïdes donnent des réponses Th2 plus
fortes chez des individus issus de communautés rurales d’Equateur que chez des individus
non-infectés des environnements urbains. De même, l’intensité de production de cytokines
Th2 (IL-4, 9, 10 et 13) est inversement corrélée à l’intensité de l’infection par A. lumbricoïdes
chez des individus âgés de plus de 11 ans (Turner et al., 2003). Ces résultats sont retrouvés
lors d’infestations par d’autres espèces de nématodes comme Trichuris trichuria et Necator
56

Contexte bibliographique
americanus (Loukas et Prociv, 2001 ; Jackson et al., 2004 ; Quinnell et al., 2004) dans
lesquelles l’IL-5 et l’IL-13 jouent un rôle majeur.
Chez les ruminants, et en particulier chez les ovins, la polarisation de la réponse
immunitaire adaptative ne semble pas aussi nette que dans des modèles murins ou lors
d’infections naturelles chez l’homme. Il faut souligner que la dichotomie Th1/Th2 définie pour
des clones de cellules T murines ainsi que les régulations mutuelles par les cytokines des deux
types de réponses, n’ont pas été établis avec certitude chez les ruminants. En effet, la majorité
de plus de 60 clones de cellules lymphocytaires T antigènes-spécifiques étudiés par Brown et
al. (1998) chez des bovins co-expriment l’IL-4 et l’IFN-γ et des profils cytokiniques polarisés
ne sont que rarement observés. De plus, les cytokines régulatrices majeures, IL-4, IL-10 et IL-
12, ne semblent pas exercer de façon sélective leur effets négatifs (IL-4 et IL-10) ou positifs
(IL-12) sur des cellules Th1-like (Brown et al., 1998 ; Gill et al., 2000). L’existence d’une
dichotomie claire entre Th1 et Th2 chez les ruminants est donc encore un sujet controversé ;
l’orientation Th2 de la réponse immunitaire dans les strongyloses gastro-intestinales chez les
ruminants, ainsi que son rôle dans la protection, reste à prouver.
Chez les ovins, il est difficile de quantifier l’expression des cytokines au niveau protéique en
raison d’un manque d’anticorps spécifiques pour cette espèce (Scheerlinck et al., 1998).
Cependant, le clonage et le séquençage des gènes de plusieurs cytokines ovines, dont l’IL-4 et
l’IFN-γ (McInnes et al., 1990 ; Seow et al., 1993), a rendu possible le développement
d’anticorps (techniques ELISA) ou d’amorces spécifiques (techniques de PCR quantitative)
applicables à cette espèce (Montagne et al., 2001 ; Konnai et al., 2003, Bendixsen et al., 2003)
et donc l’étude de la polarisation de la réponse immunitaire adaptative dans les strongyloses
gastro-intestinales.
Les données disponibles quant à l’orientation de la réponse immunitaire dans divers modèles
de strongyloses chez les ruminants apparaissent conflictuelles et ne permettent pas à l’heure
actuelle d’affirmer qu’une immunité protectrice de type Th2, telle que prouvée dans les
modèles murins, se met en place lors d’une infestation.
Par exemple, lors d’une primo-infestation par Ostertagia ostertagi chez des veaux, l’analyse
par RT-PCR de l’expression des ARNm de différentes cytokines dans des lymphocytes issus
de la muqueuse abomasale, révèle une sur-expression à la fois des ARNm de l’IL-4 et de
l’IFN-γ à 10 et 60 jours post-infestation (Almeria et al., 1997). Une sur-expression similaire
des ARNm de ces deux cytokines est également constatée dans le nœud lymphatique drainant
57

Contexte bibliographique
de la caillette (Canals et al., 1997). De façon similaire, une réponse mixte Th1/Th2 semble se
mettre en place lors d’une infestation primaire par le nématode respiratoire Dictyocaulus
viviparus chez des génisses (Johnson et al., 2005).
Des réponses mixtes Th1/Th2 ont également été observées chez des ovins. Chez des ovins
infestés par T. colubriformis, des cytokines Th2-like comme l’IL-4 semblent prédominer et
déboucher sur une réponse Th2 typique après environ 4 semaines d’infestation, faisant suite à
une réponse inflammatoire initiale médiée par l’IFN-γ (Pernthaner et al., 1997). De même,
alors qu’une réponse Th1 non protectrice, caractérisée par une forte expression des ARNm de
l’IL-2 et de l’IFN-γ, semble se mettre en place lors d’une primo-infestation par H. contortus
chez des ovins, une infestation ultérieure induit une réponse protectrice Th2 avec un fort
niveau d’expression de l’IL-4, mais pas d’IL-5 (Schallig, 2000).
Enfin, dans une étude très récente, Pernthaner et al. (2005) ont démontré une sur-expression
de deux cytokines de type Th2 (IL-5 et IL-13), mais pas de l’IL-4, par des cellules de la
lymphe intestinale d’ovins sélectionnés pour leur résistance accrue à T. colubriformis.
Toutefois, dans la plupart de ces études, les observations ont été réalisées sur des cellules
isolées d’animaux à un seul ou lors de quelques points d’étude, puis cultivées in vitro et
soumises à des stimuli spécifiques, ce qui conduit à certaines incertitudes sur la pertinence de
tels modèles dans l’étude de la réponse immunitaire. En particulier, il n’est pas certain que ces
observations reflètent précisément les modifications dynamiques qui surviennent in vivo sur
de plus longues périodes. Comme le soulignait H. Schallig dans sa revue sur les réponses
immunologiques des ovins face à H. contortus (Schallig, 2000), des études complémentaires
des profils cytokiniques induits par les infestations et/ou la vaccination, sous la forme d’essais
ELISA ou de RT-PCR (Bell et Ranford-Cartwright, 2002), sont nécessaires pour approfondir
la connaissances des mécanismes qui sous-tendent l’immunité protectrice chez les ovins.
4.3.3. Mise en place et rôle des effecteurs de l’immunité dans les strongyloses gastro-
intestinales
Les strongyloses gastro-intestinales sont traditionnellement accompagnées de réponses
cellulaires et humorales, dont la mise en place dépend de la polarisation Th2 initiale de la
réponse immunitaire (Finkelman et al., 1997 ; Schallig, 2000 ; Gause et al., 2003). Ces
réponses sont caractérisées par :
- une éosinophilie sanguine et tissulaire,
58

Contexte bibliographique
- une mastocytose tissulaire, avec apparition de globules leucocytes intra-
épithéliaux (stade ultime supposé de la différenciation des mastocytes),
- la production d’anticorps sériques ou locaux (sites tissulaires d’infiltration)
dominés par des immunoglobulines de type IgG1, des IgA et des IgE.
Ces effecteurs de l’immunité sont étroitement orchestrés par l’environnement cytokinique
induit par la polarisation de la réponse immunitaire (Figure n°7).
Figure n°7 : Séquence postulée des événements au cours d’une infestation intestinale par un
nématode dans un modèle murin, de la présentation antigénique jusqu’à l’induction de la réponse
effectrice. La production d’IL-4 par des cellules T naïves et/ou d’autres sources cellulaires non
identifiées, polarise la réponse vers la voie Th2 et inhibe le développement des cellules Th1 (indiqué
par le signe -). Les réponses de type Th2 sont protectrices et promeuvent une mastocytose, une
éosinophilie, la production d’anticorps par les lymphocytes B et probablement l’hyperplasie des
cellules à mucus. A l’inverse, les réponses de type Th1 sont associées à la susceptibilité vis à vis des
nématodes intestinaux, induisent la production de forts niveaux d’IgG2a et activent les macrophages,
résultant en une hypersensibilité retardée (d’après Else et Finkelman, 1998).
Les cytokines de type Th2 ont de nombreuses activités biologiques sur les cellules
lymphocytaires T ainsi que sur les précurseurs de cellules hématopoïétiques. Elles permettent
la différenciation, l’activation et le recrutement dans les tissus infestés, des polynucléaires
éosinophiles et des mastocytes. Ces cytokines ont également des effets sur les lymphocytes B,
permettant la synthèse et la libération des immunoglobulines G1, A et E. Les rôles principaux
des différentes cytokines de type Th2 sont résumées dans le tableau n°9.
59

Cytokine Activité biologique
Contexte bibliographique
IL-3 Facteur de croissance pour cellules souches hématopoïétiques
Mastocytose
IL-4 Inhibition de la production d’IFN-γ et de la synthèse de cytokines inflammatoires (IL-1, TNF) par
les macrophages
Croissance, survie et différenciation des lymphocytes T en cellules Th2
Activation, croissance et commutation isotypique des lymphocytes B (production d’IgE et d’IgG1)
Contraction des muscles lisses
Hyperplasie des cellules à mucus
IL-5 Différenciation des lymphocytes B et production d’IgA
Croissance, différenciation, survie, migration et activation des éosinophiles
Hyperplasie des cellules à mucus
IL-6 Différentiation des lymphocytes B en plasmocytes produisant des immunoglobulines
IL-9 Stimulation de la production d’IgE
Eosinophilie, mastocytose, hyperplasie des cellules à mucus
IL-10 Inhibition de la voie Th1 par les lymphocytes T
Inhibition de la libération de cytokines par les macrophages
Croissance des mastocytes
IL-13 Production d’IgE
Hyperplasie des cellules à mucus
Contraction des muscles lisses
Eotaxine Chimio-attraction des éosinophiles dans les sites tissulaires
Tableau n°9 : Activité biologique des principales cytokines Th2 (d’après Kishimoto et al.,
1995 ; Garcia-Zepeda et al., 1996 ; Fradelizi et Theze, 1998 ; Janeway et al., 2001b).
*Rôle des polynucléaires éosinophiles :
L’augmentation du nombre de polynucléaires éosinophiles circulants ou présents dans les
muqueuses digestives est une caractéristique constante des infestations par les nématodes
gastro-intestinaux. Une cytokine, l’IL-5, et une chémokine, l’éotaxine, sont les facteurs
principaux de la maturation, du recrutement et du chimiotactisme des polynucléaires
éosinophiles. L’IL-5 permet l’augmentation du pool de polynucléaires éosinophiles dans la
moelle osseuse et promeut leur maturation ainsi que l’éosinophilie sanguine (Sanderson,
1992). L’éotaxine est en revanche responsable de leur migration trans-endothéliale et de leur
recrutement tissulaire (Dombrowicz et Capron, 2001).
Les fonctions effectrices in vivo des polynucléaires éosinophiles font encore l’objet de débats,
en dépit de leur capacité à tuer des larves d’helminthes in vitro : schistosomules de S. mansoni
en présence d’anticorps de classe IgG (Butterworth et al., 1975) ou larves infestantes d’H.
contortus (Rainbird et al., 1998 ; Meeusen et Balic, 2000).
60

Contexte bibliographique
Le mécanisme en cause serait la cytotoxicité cellulaire anticorps dépendante (ADCC :
antibody dependant cellular cytotoxicity) dans lequel la fixation d’anticorps sur les récepteurs
Fc de la surface des polynucléaires éosinophiles (IgG, IgE et IgA) permettrait la libération des
protéines cationiques contenues dans leurs granulations cytoplasmiques (MBP : major basic
protein ; ECP : eosinophil cationic protein ; EDN : eosinophil-derived neurotoxin…) ainsi que
la génération de médiateurs néoformés. Ceux-ci auraient un effet cytolytique sur le tégument
des parasites, induisant une immobilisation puis la mort des larves (Figure n°8) (Capron,
1993 ; Weller, 1994).
Bien que ce mécanisme n’ait pas été démontré in vivo, le polynucléaire éosinophile est
considéré comme une cellule protectrice pour l’hôte lors d’infestation parasitaire. Cette
hypothèse est notamment étayée par l’observation histologique de parasites dans les tissus de
l’hôte : de nombreux polynucléaires éosinophiles sont mis en évidence en association avec
des parasites intacts ou endommagés et semblent dégranuler à proximité de ceux-ci in vivo
(Butterworth, 1984). Toutefois, on ne sait pas si ces associations sont présentes au moment où
le parasite est attaqué par les polynucléaires éosinophiles ou si elles sont une conséquence de
la mort de celui-ci et des dommages tissulaires (Meeusen et Balic, 2000).
Figure n°8 : Immobilisation de larves d’H.
contortus par des polynucléaires éosinophiles
in vitro (microscopie électronique en balayage)
(Photo C. Grisez et P. Jacquiet).
Une preuve possible du rôle des polynucléaires éosinophiles dans la protection de l’hôte
contre les helminthes du tractus digestif est également apportée par les corrélations
significatives qui existent entre les variations génétiques de sensibilité à l’infection et
l’intensité de la réponse éosinophilique (Meeusen et Balic, 2000). Dans les modèles murins, la
résistance de souris à Trichuris muris (Else et Grencis, 1991) ou Nippostrongylus brasiliensis
(Zhou et al., 1996) est positivement corrélée avec leur capacité à générer une éosinophilie
61

Contexte bibliographique
tissulaire après infestation. De même, chez des souris sélectionnées comme résistantes ou
sensibles à H. polygyrus, l’immunité était fortement corrélée à l’intensité de l’éosinophilie
sanguine après une première ou une seconde infestation (Zhong et Dobson, 1996). Chez les
ovins, l’éosinophilie sanguine et tissulaire semble liée à la résistance à T. colubriformis
(Buddle et al., 1992), à T. circumcincta (Stear et al., 1995a) et à Nematodirus battus (Winter
et al., 1997).
Toutefois, il semble que l’IL-5 et les polynucléaires éosinophiles aient des effets différents
selon l’helminthe cible. En effet, des études sur des modèles murins génétiquement modifiés
ont permis d’aboutir à des conclusions différentes (Behm et Ovington, 2000) :
- dans certaines infestations, comme avec Mesocestoides corti ou Toxocara
canis, l’IL-5 et les polynucléaires éosinophiles ne semblent pas affecter de
façon substantielle l’évolution des infestations,
- il existe un certain degré de protection de l’hôte lié à l’IL-5, et aux
polynucléaires éosinophiles, lors d’infestations par H. polygyrus et N.
brasiliensis,
- l’IL-5 et les polynucléaires éosinophiles seraient protecteurs chez des souris
infestées par S. mansoni.
A l’heure actuelle, le dogme « polynucléaire éosinophile / cellule protectrice » in vivo
commence toutefois à être remis en question. Tout d’abord, les polynucléaires éosinophiles
sont la cause de dommages tissulaires, comme ceux que l’on peut observer dans le
parenchyme pulmonaire lors d’asthme allergique (Walsh, 1999). Lors d’infestation par les
nématodes, il n’est pas exclu que les parasites puissent favoriser l’hyperéosinophilie tissulaire
et ainsi contribuer à la pathogénie et aux lésions tissulaires. Les dommages muqueux locaux
induits par les polynucléaires éosinophiles pourraient fournir un micro-environnement
bénéfique au parasite (Klion et Nutman, 2004 ; Wildblood et al., 2005). Cette hypothèse
pourrait être confortée par la démonstration récente que des extraits totaux de stades larvaires
ainsi que les produits d’excrétion-sécrétion de parasites gastro-intestinaux des ovins (T.
circumcincta et H. contortus) ont une puissante activité chimio-attractrice pour les
polynucléaires éosinophiles in vitro, alors que ces mêmes produits issus d’un nématode libre
non-parasite, Caenorhabditis elegans, n’en sont pas capables (Wildblood et al., 2005).
Enfin, un rôle non négligeable et souvent négligé des polynucléaires éosinophiles in vivo est
leur capacité de production de certaines cytokines (facteurs de croissance et de régulation
62

Contexte bibliographique
cellulaire) dans leur environnement immédiat (Capron, 1993). En particulier, les
polynucléaires éosinophiles produisent de l’IL-3 (Kita et al., 1991) et de l’IL-5 (Desreumaux
et al., 1992), suggérant un rôle dans la mastocytose associée aux infestations helminthiques
ainsi que dans l’amplification de l’éosinophilie via une activité IL-5 autocrine ou sur les
autres polynucléaires éosinophiles (Weller, 1994).
*Rôle des mastocytes et des globule leucocytes :
L’infestation par des nématodes gastro-intestinaux se traduit également par une hyperplasie
des mastocytes muqueux et des globule leucocytes intra-épithéliaux dans les muqueuses
gastrique et intestinale et ce, quel que soit l’hôte ou le nématode considéré (Stankiewicz et al.,
1995 ; Else et Finkelman, 1998 ; Schallig, 2000). L’origine cellulaire des globule leucocytes
était au départ incertaine : plusieurs auteurs ont proposé que les globule leucocytes étaient des
plasmocytes modifiés ou bien se développaient à partir de lymphocytes ; toutefois, il est à
l’heure actuelle clairement admis que ce type cellulaire est dérivé des mastocytes muqueux
sub-épithéliaux de la muqueuse digestive (Murray et al., 1968 ; Huntley et al., 1984).
Cette mastocytose est contrôlée par plusieurs cytokines Th2, principalement IL-3, IL-4, IL-9
et IL-10 (Hamaguchi et al., 1987 ; Hultner et al., 1989 ; Thompson-Snipes et al., 1991). Les
mastocytes sont responsables du développement de réponses d’hypersensibilité immédiates
(de type I) à médiation IgE dans le tractus digestif lors d’infestations par des nématodes
(Miller, 1996b). Ces réactions d’hypersensibilité au niveau des surfaces muqueuses sont
généralement considérées comme protectrices vis à vis des infestations par des nématodes
selon trois mécanismes :
- les médiateurs de faible poids moléculaire libérés directement par des
mastocytes (en présence d’anaphylatoxines C3a et C5a ou de certains
antigènes parasitaires), ou lors de leur sensibilisation par des IgE et leur
activation par des antigènes parasitaires, pourraient directement affecter la
survie des vers (Rothwell, 1989). La libération de médiateurs préformés
(histamine, protéoglycanes) ou néoformés (leucotriènes C4, D4 et E4) (Figure
n°9) est également impliquée dans l’inhibition de la migration des larves des
nématodes gastro-intestinaux chez le mouton (Douch et al., 1996b),
- la sensibilisation des mastocytes par des IgE spécifiques est à l’origine des
phénomènes d’hypersensibilité de type I impliqués dans l’expulsion rapide des
vers chez la souris (Miller, 1984). En effet, les mastocytes muqueux sont
étroitement liés au système nerveux autonome du tractus gastro-intestinal ; leur
63

Contexte bibliographique
dégranulation entraîne une stimulation électrique importante des terminaisons
nerveuses qui se traduit par une augmentation du péristaltisme et la sécrétion
d’eau et d’ions (Baird et O’Malley, 1993), dont l’objectif est d’éliminer le
pathogène présent dans la lumière digestive ou associé à la muqueuse par un
effet purgatif (McKay et Bienenstock, 1994),
- l’augmentation de la perméabilité muqueuse, en raison de protéases sécrétées
ou de cytokines, comme le TNF-α, pourrait favoriser la passage de protéines
plasmatiques vers la lumière digestive et, en particulier, la translocation
d’anticorps anti-parasitaires qui compromettraient la survie des vers (Miller,
1996).
Figure n°9 : Réponses biologiques des mastocytes activés (d’après Stevens et Austen, 1989).
Ainsi les mastocytes muqueux ont longtemps été considérés comme des effecteurs possibles
des surfaces muqueuses contre les nématodes du tractus digestif (Miller, 1984). Toutefois,
chez les rongeurs de laboratoire, la période pendant laquelle la mastocytose est avérée varie
en fonction des parasites et des hôtes expérimentaux considérés, et ne coïncide pas toujours
avec le moment de l’expulsion des vers (Lee et Wakelin, 1982). De plus, il y a des exemples
d’expulsion des vers en l’absence d’une mastocytose de la muqueuse, et inversement, des cas
d’absence d’expulsion des vers malgré une mastocytose importante (Onah et Nawa, 2000). La
64

Contexte bibliographique
suppression de la mastocytose au moyen d’anticorps anti-IL-3 ou anti-IL-4 lors d’une
infestation primaire chez la souris par N. brasiliensis ne prévient pas l’expulsion des vers
(Madden et al., 1991). A l’inverse, des souris Stat6 KO développent une forte mastocytose
intestinale lors d’infestation par N. brasiliensis mais sont incapables d’éliminer leurs parasites
(Urban et al., 1998).
Chez les ovins, le nombre de globule leucocytes, mais pas de mastocytes muqueux, dans la
muqueuse abomasale ou intestinale semble être un bon indicateur de la résistance des
animaux face à H. contortus, T. circumcincta et T. colubriformis (Douch et al., 1986 ; Stear et
al., 1995a). Cependant, le seul dénombrement de mastocytes muqueux et/ou de globule
leucocytes ne renseigne pas sur les capacités fonctionnelles de ces cellules. Une mesure
directe de l’activation et de la dégranulation mastocytaire est possible par le dosage chez les
ovins de la SMCP (Sheep Mast Cell-Derived Proteases) (Huntley et al., 1987 et 1992).
Stevenson et al. (1994) ont montré qu’il existe une corrélation négative entre le nombre total
de vers retrouvés à l’autopsie chez des ovins infestés par T. circumcincta, et les
concentrations en SMCP dans le mucus de la caillette, confortant ainsi l’hypothèse du rôle
protecteur de ce type cellulaire dans les strongyloses du tractus digestif.
Les ovins immunisés sont donc capables de sécréter des médiateurs inflammatoires dérivés
des mastocytes en réponse à une infestation avec des nématodes gastro-intestinaux et
l’intensité de cette réponse semble associée à la résistance vis à vis de ces parasites. L’effet de
ces médiateurs mastocytaires peut être indirect par la création d’une environnement hostile
pour la survie des parasites, ou bien direct en affectant la survie des parasites (Rothwell,
1989 ; Balic et al., 2000).
*Rôle des réponses anticorps :
Les infestations gastro-intestinales sont généralement accompagnées d’une élévation
d’anticorps IgG1, IgE et IgA (Else et Finkelman, 1998 ; Schallig, 2000), ces isotypes étant
initiés par les cytokines de type Th2. L’implication des anticorps dans la résistance aux
infestations gastro-intestinales a été suspectée à la suite du transfert d’immunité protectrice
chez les souris naïves grâce au sérum de souris pluri-infestées. Toutefois, certaines de ces
expériences ont donné des résultats équivoques et le rôle protecteur des anticorps n’a pas
toujours été démontré (Wakelin, 1978 ; Onah et Nawa, 2000). Ainsi, l’expulsion des vers
adultes de Trichinella spiralis est permise par le transfert du sérum d’un donneur immunisé
mais aussi de ses cellules immunitaires du nœud lymphatique mésentérique (Wakelin et
Lloyd, 1976). Des expériences similaires ont montré la nécessité de transférer à la fois du
65

Contexte bibliographique
sérum et des cellules immunitaires d’un donneur immunisé pour que l’immunité conférée au
receveur naïf soit protectrice (Wang et Bell, 1988 ; Ahmad et al., 1990). En revanche, si le
rôle de la réponse humorale systémique reste sujet à discussion, celui de la sécrétion
d’anticorps à la surface des muqueuses (réponse humorale locale) est plus généralement
admis (Else et Finkelman, 1998 ; Onah et Nawa, 2000).
Chez les ovins, les études des réponses anticorps utilisent fréquemment des extraits totaux de
différents stades parasitaires, ce qui rend les comparaisons difficilement interprétables entre
études (méthodes d’extraction différentes, compositions antigéniques variables des différents
pools d’extraits totaux de vers, dilution des antigènes d’intérêt par la présence de protéines
non immunogènes dans les pools). La purification d’antigènes parasitaires, à partir
d’antigènes d’excrétion/sécrétion de vers adultes ou de stades larvaires, permet des études
plus homogènes des réponses anticorps lors d’infestations gastro-intestinales (Balic et al.,
2000). Chez les ruminants, des immunoglobulines de classe et sous-classe IgG1, IgG2, IgM,
IgA et IgE sont sécrétées. Toutefois, le rôle des IgM est souvent considéré comme
d’importance mineure (Schallig et al., 1995).
Les IgA : dans les modèles d’infestation par les strongles gastro-intestinaux chez les
ruminants, les IgA sériques spécifiques sont souvent présentes à des concentrations très
faibles et ne seraient pas très représentatives de la réponse locale (Schallig et al., 1995).
Néanmoins, une corrélation modérée entre IgA sériques et IgA du mucus abomasal a été
démontrée chez des ovins infestés par T. circumcincta (Sinski et al., 1995). Les moutons
résistants à H. contortus présentent une augmentation très importante du nombre de
plasmocytes à IgA dans la muqueuse abomasale par rapport à des moutons sensibles (Gill et
al., 1994). Stear et al. (1995a) ont démontré que des ovins ayant des taux d’IgA locales contre
des antigènes de L4 de T. circumcincta hébergeaient des vers adultes plus petits et moins
prolifiques. En revanche, aucune corrélation entre la production d’IgA locales et le nombre
total de vers n’a pu être mise en évidence. L’importance des IgA a également été démontrée
dans la régulation de l’infestation de veaux par Ostertagia ostertagi : il existe une corrélation
négative entre l’intensité de la réponse IgA locale et l’excrétion d’œufs dans les matières
fécales ainsi que le nombre d’œufs par femelle adulte (Claerebout et al., 1999).
Les IgG : chez les ovins résistants à H. contortus (Gill et al., 1993) ou à T.
colubriformis (Douch et al., 1996a), les niveaux sériques d’IgG1 spécifiques sont plus élevés
que chez des ovins sensibles. De même, chez la souris, la réponse IgG1 est le principal facteur
66

Contexte bibliographique
de résistance à l’infestation par Heligmosomoïdes polygyrus (Williams et Behnke, 1983). En
revanche, la résistance à T. circumcincta chez les ovins, et à O. ostertagi ou Cooperia
oncophora chez des bovins, semble liée à une forte réponse IgG2 et à une faible réponse IgG1
(Claerebout et Vercruysse, 2000).
Les IgE : le rôle des IgE dans l’expulsion rapide des vers adultes de T. spiralis chez la
souris est bien connu (Else et Finkelman, 1998). De même, chez l’homme, des taux élevés
d’IgE sériques spécifiques sont associés à la résistance contre les nématodes gastro-
intestinaux (Pritchard et al., 1995). La situation est en revanche beaucoup plus nuancée chez
les ruminants. Dans le modèle ovin / H. contortus, la réponse IgE spécifique est rapidement
mise en place (entre 2 et 4 semaines post-infestation) et les taux sériques d’IgE sont
inversement proportionnels aux nombres de vers retrouvés à l’autopsie (Kooyman et al.,
1997). Ces IgE sont majoritairement dirigées contre des antigènes d’excrétion-sécrétion de
vers adultes et non contre des antigènes larvaires. Huntley et al. (1998) ont mesuré les
concentrations en IgE dans le sérum et dans la lymphe gastrique de moutons infestés par T.
circumcincta. Lors d’une primo-infestation, la réponse IgE est très faible tant vis à vis des
antigènes larvaires que des antigènes de vers adultes. Lors d’une seconde infestation, ces
auteurs notent une réponse IgE chez environ la moitié des animaux contre des antigènes
larvaires et aucune réponse contre des antigènes de vers adultes. La réponse IgE systémique
chez des ovins infestés par T. colubriformis est encore différente avec une forte réponse
contre des antigènes de vers adultes en primo-infestation et une forte réponse à la fois contre
des antigènes larvaires et de vers adultes en seconde infestation. Toutefois, dans ces deux
derniers cas (T. circumcincta et T. colubriformis), aucune relation directe n’a pu être établie
entre titres en IgE et protection contre ces deux nématodes.
En conclusion, une élévation des anticorps sériques spécifiques, de classe ou sous-classe
IgG1, IgG2 et IgE, est observée lors d’une primo-infestation chez les ruminants, avec en règle
générale, une réponse accrue et accélérée lors d’une deuxième infestation. Les réponses IgA
sont également généralement associées avec les infestations gastro-intestinales par des
nématodes, mais sont observées de façon prédominante dans les muqueuses infestées (Balic et
al., 2000).
Les mécanismes d’action des anticorps sur les nématodes du tractus digestif ne sont pas bien
connus. Toutefois, deux voies principales sont évoquées :
67

Contexte bibliographique
- les IgA et IgG pourraient avoir un effet direct sur le parasite en neutralisant ou
en inactivant des enzymes métaboliques d’H. contortus (Gill et al., 1993) ou en
interférant avec les capacités des vers à se nourrir (Smith, 1988). Des IgG
spécifiques pourraient inhiber la nutrition in vitro de T. colubriformis (Bottjer
et al., 1985).
- un rôle indirect des anticorps peut être proposé via la participation aux
réactions d’hypersensibilité médiées par les mastocytes, ou la cytotoxicité
dépendante d’anticorps médiée par les polynucléaires éosinophiles et les
mastocytes (Meeusen et Balic, 2000 ; Klion et Nutman, 2004).
*Rôle des cellules caliciformes et des mucines, rôle de la motricité du tractus digestif :
Dans des modèles murins et ovins, l’activation du système immunitaire du tractus digestif lors
d’infestation par des strongles gastro-intestinaux induit des altérations de la physiologie
intestinale : augmentation de la motricité intestinale et de la production de mucus (Miller,
1996a ; Harrison et al., 1999 ; Khan et Collins, 2004). Les deux principales cytokines Th2, IL-
4 et IL-13, promeuvent l’hyperplasie des cellules caliciformes (cellules à mucus) et
l’augmentation de la production de mucus (Khan et al., 1995 ; Ishikawa et al., 1997) ainsi que
la contraction des muscles lisses intestinaux lors d’infestation par des nématodes (Zhao et al.,
2003).
Les mécanismes d’action du mucus dans la protection contre les strongles gastro-intestinaux
sont encore mal définis ; toutefois il a été démontré que le mucus peut « piéger » les parasites,
inhiber leur mobilité ainsi que leur capacité à se nourrir (Miller, 1987 ; Rothwell, 1989 ;
Moncada et al., 2003). L’incorporation de médiateurs des cellules inflammatoires dans le
mucus pourrait également avoir des effets délétères sur les vers (Douch et al., 1983).
Lors d’une inflammation intestinale, l’hyper-contraction des muscles lisses est très importante
dans la partie proximale de l’intestin grêle alors qu’elle est plus réduite en partie distale
(iléon, côlon), augmentant ainsi la propulsion du contenu luminal et donc des parasites vers
les parties distales du tractus digestif et favorisant leur expulsion. Chez la souris une
association positive a été démontrée entre l’intensité de la contraction des muscles lisses
intestinaux et la capacité de l’hôte à expulser les parasites : des souris NIH Swiss, expulsant
très rapidement des T. spiralis adultes, ont un très fort degré de contraction musculaire, alors
que des souris B10.BR ont une contraction moindre et expulsent moins rapidement les
parasites (Vallance et al., 1997).
68

Contexte bibliographique
Ainsi, l’association de ces deux mécanismes (hyper-production de mucus et augmentation de
la contraction musculaire lisse), jouerait un rôle protecteur lors d’infestation gastro-
intestinale, en favorisant l’expulsion rapide des parasites (Figure n°10).
Figure n°10 : Rôle des altérations de la physiologie digestive à médiation immunitaire dans la
défense de l’hôte contre les infestations par les nématodes gastro-intestinaux. L’infestation
génère une inflammation, active une réponse immunitaire Th2 qui altère la physiologie
digestive et entraîne une hyper-contractibilité des muscles lisses de la paroi intestinale et une
hyperplasie des cellules caliciformes. Le mucus peut piéger les vers et prévenir leur
attachement à la surface de la muqueuse. L’augmentation de l’activité propulsive favorise
l’expulsion ultérieure des vers (d’après Khan et Collins, 2004). Abréviations : EE cells :
cellules entéro-endocrines.
L’hyperplasie des cellules caliciformes, ainsi qu’une modification qualitative des mucines
produites sont observées lors des infestations gastro-intestinales par des nématodes (Khan et
Collins, 2004). Lors d’une infestation par N. brasiliensis chez le rat, par T. colubriformis chez
des cobayes ou par H. contortus chez le mouton, la proportion de mucines sulfatées (acides)
par rapport aux mucines neutres augmente, coïncidant quasiment avec la moment de
l’expulsion des vers (Koninkx et al., 1988 ; Newlands et al., 1990 ; Manjili et al., 1998).
Ces modifications qualitatives des mucines pourraient avoir un effet sur :
69

Contexte bibliographique
- la liaison sélective des mucines à la surface des parasites, ce qui faciliterait leur
immobilisation,
- les fonctions chémo-réceptrices des parasites, indispensables à leurs activités
biologiques et en particulier leur nutrition (Khan et Collins, 2004).
4.3.4. Conséquences de la réponse immunitaire adaptative sur les traits de vie des
parasites : manifestations de l’immunité et régulation des populations de strongles
Les manifestations de l’immunité adaptative contre les nématodes parasites du tractus gastro-
intestinal peuvent s’observer à la fois contre les parasites adultes et contre les larves.
4.3.4.1. Manifestations de l’immunité contre les nématodes parasites adultes
L’immunité contre les parasites adultes peut se traduire par : l’expulsion des vers adultes,
une réduction de la taille des vers adultes, et une diminution de la fécondité des femelles.
*Expulsion des vers adultes :
L’expulsion des vers adultes lors d’une primo-infestation est un phénomène fréquemment
observé dans les modèles rongeurs (Onah et Nawa, 2000), alors qu’il est plus rare chez les
ruminants et chez l’homme (Behnke et al., 1992). En effet, l’expulsion des vers adultes de T.
spiralis, N. brasiliensis, Strongyloïdes ratti ou S. venezuelensis, s’effectue en général en 2 à 3
semaines après la primo-infestation (Onah et Nawa, 2000). La capacité d’expulsion des
adultes de T. muris est déterminée génétiquement (Else et Wakelin, 1988) : certaines souches
murines sont capables d’expulser ces vers avant qu’ils atteignent leur maturité sexuelle, alors
que d’autres en sont incapables et développent des infestations chroniques (Wakelin, 1987).
La seule exception chez les ovins est celle de Nematodirus battus : lors d’une primo-
infestation, les vers adultes sont expulsés dans des périodes de 18-21, 24-28, ou plus de 72
jours, en fonction de la dose de larves infestantes initialement administrées (Balic et al.,
2000).
En revanche, l’expulsion des nématodes adultes chez les ruminants est largement dépendante
de l’immunité acquise et représente donc une conséquence fréquente des infestations répétées.
Ceci a été démontré pour H. contortus (Barger et al., 1985b), T. circumcincta (Seaton et al.,
1989) et T. colubriformis (Dobson et al., 1990).
70

*Réduction de la taille des vers adultes :
Contexte bibliographique
Les observations de la modification de la morphologie des nématodes gastro-intestinaux chez
les ruminants ont permis de décrire une réduction de la taille des nématodes adultes (Balic et
al., 2000). Ce changement de morphologie, manifestation de l’immunité acquise, a été
observé chez des ovins infestés par H. contortus (Coyne et Smith, 1992b), T. circumcincta
(Seaton et al., 1989 ; Stear et al., 1995b), et T. colubriformis (Douch, 1988). De même, la
taille des adultes d’O. ostertagi diminue chez des bovins après une longue exposition à ce
strongle (Michel, 1969). Dans le cas des ovins infestés par T. circumcincta, la réduction de
taille des adultes serait liée à l’intensité de la réponse IgA (Stear et al., 1995a) mais également
à des phénomènes de densité-dépendance lors de très fortes infestations.
Cette manifestation de l’immunité est également observée chez la souris lors d’infestation par
T. spiralis, H. polygyrus et S. ratti (Onah et Nawa, 2000).
*Diminution de la fécondité des femelles :
La réduction de fécondité des vers femelles est considérée comme une forme de régulation
majeure des populations de strongles gastro-intestinaux chez les ovins (Stear et al., 1997). Les
mécanismes responsables de cette diminution de fécondité peuvent être la résultante soit
d’une compétition densité-dépendante, soit de l’immunité acquise, soit des deux, bien que les
données issues de différentes études soient conflictuelles (Balic et al., 2000). La diminution
de la fécondité des femelles a été rapportée dans différents modèles de strongyloses gastro-
intestinales des ovins comme la conséquence d’infestations répétées par T. colubriformis
(Barnes et Dobson, 1990 ; Bisset et al., 1996), H. contortus (Dineen et Wagland, 1966) et T.
circumcincta (Stear et al., 1995b), mais également chez des souris infestées par S. ratti, S.
venezuelensis ou H. polygyrus (Onah et Nawa, 2000).
La diminution de fécondité des femelles peut être appréciée indirectement par la mesure de
l’excrétion d’œufs dans les matières fécales (Claerebout et Vercruysse, 2000) ou directement
par le comptage du nombre d’œufs présents dans l’utérus des femelles retrouvées chez l’hôte.
4.3.4.2. Manifestations de l’immunité contre les larves de nématodes parasites
L’immunité contre les larves infestantes de nématodes se traduit principalement par la
résistance à l’établissement de nouvelles larves et par l’arrêt de développement des larves
au stade L4 (hypobiose larvaire).
71

*Arrêt du développement des larves (hypobiose) :
Contexte bibliographique
L’arrêt du développement des larves au stade L4 dans la muqueuse de l’hôte est un
phénomène fréquent associé à la résistance de l’hôte chez les ruminants (Balic et al., 2000).
Ce phénomène a été décrit chez des ovins infestés par H. contortus (Barger et al., 1985), T.
circumcincta (Seaton et al., 1989) et T. colubriformis (Barnes et Dobson, 1993). La fréquence
de ce phénomène parmi les strongles gastro-intestinaux des ruminants suggère qu’il
représente une stratégie efficace de survie des parasites (Balic et al., 2000).
L’arrêt de développement des larves n’est par contre pas décrit dans les modèles murins de
strongyloses gastro-intestinales (Onah et Nawa, 2000).
*Résistance à l’établissement de nouvelles larves :
La réduction du nombre de larves qui s’installent puis se développent en adultes est la
manifestation majeure et la plus aboutie de l’immunité acquise dans les strongyloses gastro-
intestinales des ruminants. Elle est également décrite chez la souris après une ré-infestation
avec différentes espèces de Strongyloïdes ou N. brasiliensis (Onah et Nawa, 2000).
Chez les ruminants, de nombreuses études sur la résistance aux larves infestantes ont permis
d’établir plusieurs points clés (Balic et al., 2000) :
- cette résistance à l’établissement larvaire est plus fortement exprimée à l’issue
de contacts répétés sur de longues périodes avec des larves infestantes : ainsi
on peut l’observer chez le mouton après des infestations expérimentales
quotidiennes par T. circumcincta (Seaton et al., 1989) ou H. contortus (Barger
et al., 1985) après six ou huit semaines ; en revanche, il faut 21 à 35 semaines
d’exposition selon les bovins pour acquérir une résistance à l’installation des
larves infestantes d’O. ostertagi (Claerebout et al., 1996),
- la résistance générée contre une espèce de nématode peut agir contre des
espèces hétérologues présentes dans le même tissu (résistance croisée à
l’installation de larves d’autres espèces de nématodes),
- plusieurs mécanismes d’expulsion existeraient permettant d’expliquer des
délais variables de rejet des larves : par exemple, l’expulsion des larves d’H.
contortus chez le mouton peut avoir lieu dans les heures qui suivent
l’infestation (Miller et al., 1983) ou bien 4 à 7 jours après l’ingestion des larves
(Adams, 1982).
72

4.3.5. Régulation de la réponse immunitaire
Contexte bibliographique
La réponse immunitaire adaptative de l’hôte, et probablement, pour une part encore largement
inconnue, la réponse immunitaire innée, régulent les populations de strongles gastro-
intestinaux. Cependant, il reste surprenant qu’en dépit d’un système immunitaire puissant et
doté de mécanismes effecteurs efficaces, ces parasites aient exploité cet habitat
potentiellement hostile que représente le tube digestif pour développer leur cycle sophistiqué,
survivre et se reproduire (Else, 2005). Il devient évident à l’heure actuelle que les strongles
gastro-intestinaux exercent des effets immunomodulateurs sur le système immunitaire de
l’hôte afin de vivre en équilibre avec celui-ci. Le meilleur exemple de ces effets sur le
système immunitaire est illustré par le traitement des maladies inflammatoires de l’intestin
grêle et de la maladie de Crohn par l’utilisation d’helminthes du tractus digestif (Summers et
al., 2003 ; Weinstock et al., 2004 ; Summers et al., 2005).
Dans les modèles murins, une possible explication des infestations chroniques et de longue
durée observées pour T. muris et H. polygyrus, est l’existence d’un phénotype Th2 modifié
qui résulterait de la capacité des parasites à contraindre ou à modifier la réponse Th2 initiée
par l’hôte lors de leur présence (Maizels et al., 2004 ; Else, 2005 ; Maizels, 2005). Les
parasites gastro-intestinaux seraient ainsi capables d’altérer ou de modifier la réponse
immunitaire de l’hôte via deux types majeurs de mécanismes ciblant des étapes clés de la
réponse immunitaire :
- l’induction de types cellulaires immunomodulateurs
- la production de molécules parasitaires immunomodulatrices.
4.3.5.1. Induction de types cellulaires immunomodulateurs par les strongles gastro-
intestinaux
*Les macrophages alternativement activés (MϕAA) :
L’activation des lymphocytes T et B dépend étroitement des signaux de co-stimulation
délivrés par les cellules présentatrices d’antigènes, qui représentent ainsi des cibles attractives
pour la modulation par les parasites. Le concept de MϕAA induit par les nématodes a été bien
caractérisé lors d’infestations par des filaires (Loke et al., 2000) ou par N. brasiliensis
(Ehigiator et al., 2000): ces macrophages inhibent la capacité de prolifération des
lymphocytes par un mécanisme dépendant des contacts cellulaires. Ces cellules sont opposées
aux macrophages classiquement activés car ils ne présentent pas de production accrue de la
nitric oxyde synthetase mais celle d’une enzyme régulatrice, l’arginase. Ce phénotype
73

Contexte bibliographique
particulier a initialement été démontré in vitro mais plusieurs études ont démontré qu’il existe
in vivo lors d’infestations helminthiques (Loke et al., 2002 ; Maizels et al., 2004). Les
données obtenues suggèrent que ces MϕAA auraient au moins deux fonctions distinctes :
comme cellules down régulatrices, ils pourraient inhiber la réponse inflammatoire dirigée
contre les parasites ; enfin, ils pourraient être nécessaires pour la réparation des dommages
tissulaires causés par ces helminthes (Maizels et al., 2004).
*Cellules dendritiques promouvant la réponse Th2 :
L’effet des produits parasitaires sur les cellules dendritiques commence à être étudié (Sher et
al., 2003) : la maturation de ces cellules avec des antigènes d’excrétion-sécrétion de N.
brasiliensis favorise le développement d’une population de cellules dendritiques pro-Th2
(Balic et al., 2004). Les raisons de l’existence d’antigènes parasitaires capables de favoriser le
développement de cellules dendritiques pro-Th2 ne sont pas claires, puisque ceci exacerberait
la génération de réponses Th2 anti-parasitaires. Toutefois, la régulation ultérieure possible de
ces réponses dans l’environnement du tube digestif, par des MϕAA par exemple, pourrait être
mise à profit par les parasites (Else, 2005).
*Lymphocytes T régulateurs :
Des études épidémiologiques chez l’homme suggèrent que les infestations helminthiques
confèrent une protection contre les allergies (à médiation Th2) et contre les maladies auto-
immunes (à médiation Th1) (Hagel et al., 1993). Deux hypothèses, non exclusives, sont
avancées pour expliquer ce phénomène : la régulation immunitaire et la déviation
immunitaire (Else, 2005).
La régulation immunitaire implique l’induction par les helminthes de lymphocytes T
régulateurs CD4+CD25+ (Akdis et al., 2005 ; Chatila, 2005), qui diminuent les réponses Th1
et Th2 via des cytokines anti-inflammatoires comme l’IL-10 ou le TGFβ. La déviation
immunitaire propose une diminution des réponses Th1 par l’induction d’une réponse Th2 par
les helminthes. La production de lymphocytes T régulateurs par les helminthes leur
permettrait, dans cette hypothèse, de prolonger leur survie et de protéger l’hôte contre des
réactions immunopathologiques potentiellement dommageables. L’existence directe de
lymphocytes T régulateurs a été démontrée lors d’infection par des schistosomes (Hesse et al.,
2004) ou lors d’onchocercose chez l’homme (Doetze et al., 2000). Leur existence lors
74

Contexte bibliographique
d’infestations par des strongles gastro-intestinaux chez la souris est moins claire, bien que
supposée lors d’infestations par H. polygyrus (Maizels et al., 2004).
4.3.5.2. Production de molécules parasitaires immunomodulatrices
*Molécules parasitaires mimant des molécules de l’hôte :
Certains strongles gastro-intestinaux seraient capables de sécréter une multitude de molécules
ressemblant à celles de l’hôte afin de détourner les réponses immunitaires en leur faveur
(Else, 2005). Certaines molécules parasitaires par exemple ont des épitopes communs avec
l’IFN-γ et pourraient se lier spécifiquement à son récepteur : chez la souris, la production d’un
homologue de l’IFN-γ par T. muris favoriserait le développement d’une réponse Th1 non
protectrice et donc la survie des parasites (Grencis et Entwistle, 1997). Les extraits de ce
même parasite contiennent un homologue du MIF (macrophage-migration inhibitory-factor)
impliqué dans l’activation des macrophages et qui pourrait avoir un rôle dans le
développement du phénotype « alternativement activé » des macrophages lors d’infestation
(Pennock et al., 1998). La déviation des réponses Th2 de l’hôte vers un phénotype Th1 par les
parasites est également illustrée lors d’infestation par N. americanus chez l’homme, qui
sécrète une protéine se liant aux cellules natural killer et induisant la production d’IFN-γ
(Hsieh et al., 2004).
*Molécules parasitaires altérant le recrutement des cellules effectrices et protégeant les
parasites de celles-ci :
N. americanus produit également des facteurs entravant le recrutement des polynucléaires
éosinophiles : ce sont des métalloprotéases qui clivent spécifiquement le CCL3 ou Eotaxine,
principale chémokine des éosinophiles (Culley et al., 2000). Chez la souris, N. brasiliensis a
adopté la même stratégie en sécrétant une PAF-acétylhydrolase qui inactive le PAF (platelet
activating factor) et donc diminue l’inflammation du tube digestif (Blackburn et Selkirk,
1992). Une caractéristique fréquente des nématodes gastro-intestinaux, dont Trichirus suis,
Ascaris sp. et Ankylostoma ceylanicum, est la possession d’inhibiteurs de protéases dont le
rôle immunomodulateur sur la réponse de l’hôte est suggéré (Hawley et al., 1994 ; Rhoads et
al., 2000 ; Milstone et al., 2000).
75

Contexte bibliographique
*Molécules parasitaires ayant un rôle sur la modulation de la présentation antigénique :
Certains nématodes gastro-intestinaux seraient capables d’interférer avec les cellules
présentatrices d’antigènes en produisant des inhibiteurs de protéases à cystéine (cystatines).
Ces protéases sont importantes dans la dégradation initiale des protéines/antigènes dans le
compartiment endosomal-lysosomal des cellules présentatrices d’antigènes. Ces cystatines ont
été identifiées chez N. brasiliensis et H. contortus (Hartmann et Lucius, 2003).
Les nématodes gastro-intestinaux possèdent donc une large variété de mécanismes immuno-
régulateurs entraînant une modification du phénotype de la réponse immunitaire de l’hôte en
leur faveur, ou la prévention des attaques immunitaires en rendant inefficace la réponse
effectrice (Figure n°11). Ces mécanismes pourraient avoir pour implication principale la
production de vaccins contre ces molécules immunomodulatrices pour permettre l’expression
d’une réponse effectrice correcte de la part de l’hôte, sans provoquer de pathologie
dommageable pour celui-ci.
Les données actuelles concernant la régulation de la réponse immunitaire par les nématodes
gastro-intestinaux proviennent essentiellement de l’étude des modèles murins et restent
largement méconnues chez les ovins. Néanmoins, l’aptitude des nématodes gastro-intestinaux
à réguler la réponse immunitaire de l’hôte dans cette espèce pourrait varier en fonction des
races ovines et peut-être expliquer des différences de sensibilité / résistance des ovins face
aux nématodes du tractus digestif.
76

Contexte bibliographique
Figure n°11 : Immunomodulation de la réponse immunitaire de l’hôte par les nématodes
gastro-intestinaux : induction de lymphocytes T régulateurs, modification du phénotype des
macrophages, production de molécules parasitaires capables d’interférer avec la présentation
antigénique, de mimer des cytokines de l’hôte, de détruire des facteurs chimio-attractifs et de
désarmer les réponses effectrices potentielles (d’après Else, 2005).
77

Contexte bibliographique
La réponse immunitaire dirigée contre les strongles gastro-intestinaux représente donc
une interaction complexe entre l’hôte et les parasites, mais semble également être la
résultante d’un équilibre subtil entre ces deux protagonistes, permettant à la fois :
- un contrôle par l’hôte des populations de strongles gastro-intestinaux et donc
d’éviter les manifestations pathologiques néfastes des infestations parasitaires,
- l’installation des parasites et la réalisation de leur cycle afin de pérenniser leur
espèce ; les capacités des parasites à moduler la réponse de l’hôte en leur faveur
illustrent bien cette notion d’équilibre qui se crée avec l’hôte.
Les connaissances actuelles sur la réponse immunitaire des hôtes face aux strongyloses
gastro-intestinales proviennent principalement des études dans des modèles murins.
Chez les ovins, de nombreuses questions subsistent :
- l’orientation initiale de la réponse immunitaire adaptative vers l’une des deux
grandes voies Th1 ou Th2 n’est pas aussi clairement établie que chez les rongeurs et reste
controversée,
- la cinétique des mécanismes effecteurs, cellulaires ou humoraux, ainsi que leur
rôle dans le contrôle des strongyloses, ne sont pas complètement élucidés,
- les phénomènes d’immunomodulation par les populations parasitaires
commencent à être étudiés chez les rongeurs mais restent inconnus dans l’espèce ovine,
- enfin, les variations de résistance aux nématodes gastro-intestinaux entre races
ovines restent à ce jour inexpliquées et le rôle éventuel que pourrait jouer la réponse
immunitaire adaptative dans cette résistance reste à élucider.
78

Objectifs des travaux de thèse
CHAPITRE III : OBJECTIFS DES
TRAVAUX DE THESE
79

Objectifs des travaux de thèse
La lutte contre les nématodes gastro-intestinaux dans l’espèce ovine représente dans le
contexte actuel un véritable enjeu d’élevage, notamment en raison de l’extension de la
résistance des parasites aux trois grandes familles de molécules anthelminthiques et des
perspectives peu encourageantes de mise au point et de commercialisation de nouvelles
molécules efficaces dans un avenir proche. Les méthodes de contrôle alternatives ou
complémentaires aux anthelminthiques, telles que la vaccination des animaux ou la sélection
d’ovins résistants, constituent aujourd’hui des pistes prometteuses. Néanmoins, l’absence de
connaissances solides des mécanismes de la réponse immunitaire adaptative des ovins contre
les strongles gastro-intestinaux, à l’instar des données obtenues dans des modèles de
parasitisme murin, est un frein majeur au développement à large échelle de ces méthodes. En
particulier, l’orientation de la réponse immunitaire (polarisation Th1 ou Th2), la mise en place
des mécanismes immunitaires effecteurs, et les effets de cette réponse sur les populations de
strongles, ne sont pas complètement élucidés dans l’espèce ovine. Enfin, l’existence de races
ovines résistantes au parasitisme gastro-intestinal est bien connue, mais les raisons de cet état
de résistance, ainsi que l’implication éventuelle de la réponse immunitaire adaptative dans
celui-ci restent une énigme.
Dans un premier temps, les objectifs de nos travaux de thèse ont été :
i) de définir la polarisation de la réponse immunitaire adaptative chez des ovins
de race sensible (INRA 401),
ii) d’étudier la cinétique de la mise en place des mécanismes effecteurs,
iii) de caractériser les effets de la réponse immunitaire adaptative sur les
nématodes gastro-intestinaux présents chez l’hôte.
Dans cette première partie, nous avons choisi deux modèles parasitaires : Haemonchus
contortus et Trichostrongylus colubriformis, en raison de :
i) leur fréquence dans les élevages ovins français et de leur impact médical et
économique non négligeable,
ii) leur habitat chez l’hôte (respectivement la caillette et l’intestin grêle
proximal) permettant de comparer les réponses immunitaires induites dans
deux organes différents,
iii) leur mode de nutrition (respectivement hématophage et chymivore),
impliquant un contact plus ou moins étroit avec le système immunitaire de
l’hôte.
80

Objectifs des travaux de thèse
Dans un deuxième temps, la réponse immunitaire adaptative mise en jeu lors des infestations
par ces strongles gastro-intestinaux a été comparée entre des ovins de race résistante
(Barbados Black Belly) et des ovins sensibles (INRA 401). Existe t-il des variations de la
réponse immunitaire (précocité ou intensité des réponses cytokiniques polarisantes, des
mécanismes effecteurs) susceptibles d’expliquer les différences de résistance / sensibilité aux
strongles du tractus digestif ? La première expérience de comparaison INRA 401 / Barbados
Black Belly a été réalisée en utilisant H. contortus. En raison d’un manque de temps et de
disponibilité des ovins Black Belly, la comparaison de ces deux races lors d’une infestation
par T. colubriformis n’a pu être effectuée à ce jour.
81

Procédures expérimentales
CHAPITRE IV : LES PROCEDURES
EXPERIMENTALES (OUTILS
METHODOLOGIQUES)
82

1. MODELES EXPERIMENTAUX
1.1. Les animaux
1.1.1. Ovins de race INRA 401
Procédures expérimentales
La race INRA 401 est le produit d’un programme de recherche INRA initié en 1963 pour
renforcer la productivité du troupeau ovin français. Elle a été créée au domaine expérimental
INRA de Bourges-La Sapinière, par croisements réciproques entre une race prolifique
(Romanov) et une race bouchère (Berrichon du Cher). A partir de 1980, cette race a été
diffusée vers des élevages privés et à l’heure actuelle, on rencontre ce type d’ovins
principalement dans le sud de la France (62%) (François et al., 1998). Dans notre travail, les
ovins de race INRA 401 ont été utilisés comme exemple d’ovins sensibles au parasitisme
gastro-intestinal et, en particulier, à Haemonchus contortus et Trichostrongylus colubriformis.
Figure n°12 : Ovin de race INRA 401 (Photo C. Lacroux)
1.1.2. Ovins de race Barbados Black Belly
Les ovins Barbados Black Belly représentent l’une des races ovines dites “à poils ou sans
laine” rencontrées aux petites Antilles et doivent leur nom à leur robe fauve-acajou avec un
ventre, des extrémités et des sourcils noirs. Ces ovins ont été introduits aux Antilles à partir
du XVème siècle ; leur origine la plus probable serait la côte du golfe de Guinée en Afrique
noire (Mahieu et al., 1997 ; Naves et al., 2001).
Le noyau Black Belly, entretenu et multiplié sur le domaine INRA de la Sapinière (Cher), a
été importé sous la forme d’embryons d’un élevage INRA de Guadeloupe dans le but initial
83

Procédures expérimentales
d’études sur la saisonnalité de la reproduction. Toutefois, la résistance de ce type d’ovins au
parasitisme gastro-intestinal en fait un excellent modèle d’étude de la réponse immunitaire et
de la régulation des populations de strongles, par comparaison avec une race sensible comme
l’INRA 401.
Figure n°13 : Ovins de race Barbados Black Belly (Photo C. Lacroux)
1.1.3. Age et sexe des animaux
Les animaux ont été inclus dans nos expérimentations à l’âge de 3-4 mois. Les deux
premières expérimentations ont été effectuées sur des agnelles de race INRA 401, alors que la
comparaison entre les deux races ovines a été effectuée sur des mâles , pour des raisons de
disponibilité limitée des femelles de race pure Barbados Black Belly.
1.2. Les parasites
Les larves d’H. contortus utilisées proviennent de la souche « Humeau » isolée d’un élevage
caprin dans la région du Quercy. Pour T. colubriformis, les larves infestantes sont issues de la
souche « Weybridge » au Royaume-Uni, souche maintenue dans l’unité de parasitologie de la
station INRA BASE de Tours-Nouzilly.
Les larves infestantes sont récoltées à partir de coprocultures des matières fécales d’ovins
infestés expérimentalement. Les larves utilisées en expérimentation ont environ 1 à 2 mois
d’âge et sont conservées à 4°C.
1.3. Infestations expérimentales
Les ovins ont été infestés par voie orale à la seringue, avec des doses de 10 000 L3, en primo
comme en ré infestation. Une telle dose est suffisante pour entraîner une réponse chez l’hôte,
84

Procédures expérimentales
mais n’entraîne pas de signes cliniques extrêmes voire la mort des animaux au cours de
l’expérimentation.
Les animaux ont été divisés en trois groupes :
- un groupe primo-infesté ou immunisé (Lot A) : ces animaux ont été infestés une
première fois 45 jours avant le début de l’expérimentation (immunisation) ; au
bout de 30 jours, ils ont reçu un traitement anthelminthique par voie orale
(Lévamisole 7.5 mg/kg ou Ivermectine ORAMEC® Ovin 0.2 mg/kg) visant à
terminer cette première infestation. Après 15 jours de repos, ces animaux ont été
ré-infestés avec une dose parasitaire similaire (J0).
- un groupe naïf : ces animaux ont été infestés une seule fois en début
d’expérimentation (J0)
- un groupe contrôle : ovins non infestés.
Afin de suivre la cinétique de la réponse immunitaire et de ses effecteurs, mais également
l’évolution de la population parasitaire au sein de l’hôte, les expérimentations ont été
conduites avec des points d’abattage des animaux correspondant aux grandes étapes de
développement des parasites : transformation des larves de stade 3 en stade 4 (J3 pour H.
contortus ; J4 pour T. colubriformis), apparition des premiers vers immatures (J7 et J10
respectivement), apparition des premiers vers adultes (J15 et J17 respectivement) et fin du
développement parasitaire avec présence d’adultes mâles, et femelles excrétrices d’œufs
(J28).
2. ETUDE DES POPULATIONS PARASITAIRES
2.1. Comptage des œufs de strongles dans les matières fécales
Le nombre d’œufs de strongles par gramme de matières fécales (ou OPG) est évalué par la
technique McMaster, modifiée par Raynaud (1970). Elle permet de suivre l’excrétion des
œufs pendant la période de ponte des femelles adultes, qui fait généralement suite à une
période dite prépatente, durant de 17 à 21 jours après l’infestation de l’hôte.
Les matières fécales sont directement prélevées dans le rectum des ovins et sont pesées. Un
volume de 42 mL de NaCl (d=1,19) est ajouté à une quantité d’environ 3 grammes de fèces
(obtention d’une suspension de matières fécales diluées au 1/15 ème ) ; l’ensemble est
homogénéisé à l’aide d’un agitateur puis filtré dans une passoire à thé. Cette solution saline,
85

Procédures expérimentales
d’une densité supérieure à celle de la plupart des œufs de parasites (d=1,19), permet la
remontée des éléments parasitaires, donc leur flottation, tout en laissant couler les débris
fécaux. Un échantillon du surnageant ainsi obtenu permet de remplir les deux cellules de la
lame de McMaster (environ 0.5 mL par cellule). Dans chaque cellule se trouve un réseau
quadrillé correspondant à un volume de 0.15 mL.
Le comptage des œufs est réalisé dans l’ensemble du réseau. Le nombre d’œufs par gramme
(OPG) est alors donné par la formule :
OPG = (nombre d’œufs/volume total du réseau)*(volume de NaCl + poids des fécès) / poids
des fécès
De façon plus simple, chaque cellule de la lame de McMaster a un volume connu de 0,15 mL
donc, comme la solution est diluée au 1/15 ème , le nombre d’œufs comptés est celui contenu
dans un centième de gramme de fèces. Pour obtenir le nombre d’œufs par gramme, on
multiplie le résultat obtenu lors du comptage sur une cellule par 100 (on conseille toutefois de
compter les deux cellules ; le facteur de multiplication est alors de 50), soit :
OPG = Nombre d’œufs dans les deux cellules de la lame de McMaster x 50
2.2. Mise en culture in vitro des œufs de Haemonchus contortus
Le développement des œufs en larves infestantes L3 correspond à la phase libre du cycle
parasitaire des Trichostrongles. Cette étape revêt une importance particulière puisque son
échec peut mettre en péril l’ensemble du cycle parasitaire. Nous nous sommes intéressés à la
capacité des œufs récoltés dans les matières fécales à se transformer en L3 afin de vérifier que
des œufs issus d’ovins résistants (comme les Barbados Black Belly) ont ou non la même
capacité à évoluer en L3 que des œufs excrétés par des animaux de race sensible.
Les matières fécales prélevées sur les ovins sont pesées et le nombre d’œufs par gramme
qu’elles contiennent est évalué. Elles sont alors placées à 23°C pendant une dizaine de jours,
période au cours de laquelle elles sont régulièrement humidifiées. Au bout de 10 jours, les
larves L3 ainsi obtenues sont récoltées par la méthode de Baermann sur une nuit. Le comptage
des larves récoltées permet ainsi de calculer le pourcentage d’œufs présents au départ qui ont
évolué en larve L3.
86

Procédures expérimentales
2.3. Etude quantitative et qualitative de la population parasitaire chez l’hôte (bilans
parasitaires)
L’analyse quantitative de la population de strongles chez l’hôte permet de calculer le taux
d’installation des larves infestantes grâce au nombre total de vers recueillis dans l’organe
cible, et donc de comparer l’installation entre races résistantes et sensibles, entre ovins
immunisés et naïfs, ou entre animaux d’un même groupe. A l’autopsie, l’organe cible de
l’infestation parasitaire (caillette pour H. contortus ; les cinq premiers mètres d’intestin grêle
pour T. colubriformis) sont isolés.
Pour chaque organe, les vers sont recherchés :
(i) dans le contenu de l’organe (ainsi que dans les lavages des parois de celui-ci),
(ii) mais également dans la paroi de l’organe, afin de récupérer et de dénombrer les
stades parasitaires non encore matures dans la muqueuse. Pour cela, l’organe
cible est digéré dans une solution d’acide chlorhydrique / pepsine pendant 6
heures à 37°C.
Ces différentes fractions sont filtrées dans un tamis à mailles de 40 µm afin d’éliminer les
débris alimentaires, puis préservées par addition d’un large volume d’éthanol 70° jusqu’à
analyse. Leur volume est ensuite ajusté à 1 litre et le nombre total de vers est estimé dans un
aliquot de 10%.
En parallèle du nombre total de vers, une analyse qualitative de la population de strongles est
réalisée en dénombrant les différents stades parasitaires : larves L4, vers immatures mâles et
femelles, vers adultes mâles et femelles. Cette analyse, lorsqu’elle est effectuée sur des
prélèvements en cinétique, permet d’apprécier le développement des vers sur la période
considérée, ainsi que la concordance ou non avec le schéma habituel de maturation larvaire.
2.4. Etude de la fécondité des femelles parasitaires adultes
Un des effets de la réponse immunitaire sur la population parasitaire est une diminution de la
fécondité des vers femelles. Cette fécondité peut être appréciée par deux paramètres :
- (i) la longueur totale des femelles,
- (ii) le nombre d’œufs parasitaires qu’elles contiennent dans leur utérus.
Lors des dénombrements des différents stades parasitaires, une vingtaine de femelles adultes
par animal sont prélévées et conservées dans de l’éthanol à 70°. Ces femelles sont, dans un
premier temps, mesurées, puis plongées dans une solution de sodium hypochloride 4%
jusqu’à complète désintégration. Cette étape a pour but de libérer les œufs de l’utérus de la
87

Procédures expérimentales
femelle. Leur paroi étant relativement épaisse, ils résistent plus facilement à la désintégration
dans la solution d’eau de Javel que le corps de la femelle, et peuvent ainsi être dénombrés
(Kloosterman et al ., 1978).
3. ETUDE DE PARAMETRES PHYSIOPATHOLOGIQUES CHEZ L’HOTE
3.1. Suivi de l’éosinophilie sanguine
La réponse d’un hôte face à une infestation par un helminthe se manifeste à différents
niveaux, et notamment par une hyperéosinophilie sanguine suivie d’une infiltration
éosinophilique de la muqueuse de l’organe infesté. Le suivi de cette éosinophilie permet :
- de vérifier l’efficacité de l’infestation des larves administrées chez l’hôte et ce, dès
le 7 ème jour,
- d’étudier l’intensité et la précocité de la réponse de l’hôte et de la comparer entre
différents groupes expérimentaux ou différentes races ovines.
L’éosinophilie sanguine (ou nombre de polynucléaires éosinophiles par mL de sang total) est
déterminée selon la méthode de Dawkins et al. (1989).
Le sang de l’hôte est prélevé à la jugulaire sur un tube contenant un anti-coagulant (EDTA) ;
ces tubes peuvent être conservés jusqu’à 4 jours à 4°C. Dans un premier temps, une solution
d’éosine est préparée dans les proportions suivantes :
- 2 mL d’Eosine 2% (Eosin Y, Sigma)
- 3 mL de formaldéhyde saturé en CaCO3 (Rectapur, Prolabo)
- 95 mL d’eau
Dans un tube à hémolyse, sont mélangés 900 µL de solution d’éosine et 100 µL de sang total.
Ce mélange est homogénéisé afin de colorer tous les polynucléaires éosinophiles. Un volume
de 20 µL de ce mélange est déposé sur une lame Fast Read (ISL, Royaume-Uni). La lecture et
le comptage sont effectués au microscope au grossissement 400. Les polynucléaires
éosinophiles sont reconnaissables à leur taille (15 µm environ), leur noyau généralement
bilobé et leur cytoplasme chargé de fines granulations éosinophiles (rose vif).
3.2. Suivi de l’hématocrite
Haemonchus contortus est un parasite hématophage capable d’entraîner chez son hôte une
anémie plus ou moins sévère, parfois létale. Cet impact négatif du parasite sur son hôte peut
88

Procédures expérimentales
être estimé grâce à la mesure de l’hématocrite (ou pourcentage d’hématies dans le sang). Les
valeurs physiologiques de l’hématocrite chez les ovins sont de 30-35%.
Le sang est récupéré sur tube EDTA à la jugulaire (le tube servant à estimer l’éosinophilie
sanguine peut également permettre la mesure de l’hématocrite). L’analyse doit cependant être
réalisée dans la demi-journée suivant le prélèvement afin d’éviter l’hémolyse. Après
homogénéisation, le sang est prélevé dans un tube capillaire aux extrémités colmatées par de
la pâte à modeler. Une centrifugation pendant 5 minutes à 4000 rpm permet la séparation du
culot de globules rouges, des globules blancs (buffy-coat) et du plasma. L’hématocrite est
déterminé grâce à une grille de lecture et le résultat exprimé en pourcentage.
4. ETUDE DE L’ORIENTATION DE LA REPONSE IMMUNITAIRE
Nous avons choisi d’étudier l’orientation de la réponse immunitaire (polarisation Th1 ou Th2)
par une technique de PCR quantitative en système « TaqMan » (GeneAmp 5700 Sequence
Detector, Perkin Elmer). Le terme de TaqMan représente, par abus de langage, une
contraction des mots Taq Polymérase et PacMan, et désigne l’appareil de mesure utilisé dans
cette technique.
4.1. Principe de la PCR quantitative
La PCR correspond à l’amplification d’un fragment d’ADN spécifique, grâce à l’utilisation
d’une ADN polymérase (Taq Polymérase), et d’un couple d’amorces (« primers »)
spécifiques. L’intensité de l’amplification de l’ADN ainsi obtenue peut être représentée par
une courbe d’allure sigmoïde, dépendante du nombre de cycles de PCR (abscisse) et de
l’intensité de la fluorescence émise (ordonnée). La fluorescence est obtenue par l’utilisation
d’un agent intercalant : le SYBR Green I, colorant qui ne devient fluorescent que lorsqu’il se
lie à l’ADN double brin. L’utilisation de ce colorant permet de s’abstenir de la conception de
sondes spécifiques. Toutefois, la fluorescence mesurée peut alors provenir d’une
amplification non spécifique, d’où l’intérêt de s’assurer de la spécificité du couple d’amorces
utilisé ainsi que des produits de PCR.
89

Procédures expérimentales
Figure n°14 : Représentation schématique de l’amplification par PCR quantitative
4.2. Du tissu à l’ARN…
d’échantillons d’ADN.
Les échantillons collectés à l’autopsie (fragments de muqueuse, de nœud lymphatique) sont
immédiatement congelés en azote liquide dans une solution de TRIzol Reagent (Invitrogen,
référence 15596-018) puis conservés à –70°C jusqu’à utilisation.
Les échantillons, placés dans des tubes à vis contenant des microbilles de céramique, sont
alors broyés et homogénéisés par un ribolyseur (Hybaid RiboLyser TM ), lors de deux cycles
d’agitation de 30 secondes à une vitesse de 4.5. Pour éviter une dégradation des ARN lors de
cette étape, la vitesse utilisée n’est pas maximale (ce qui évite l’échauffement des tubes) et les
échantillons sont immédiatement placés sur la glace entre et après les cycles de broyage.
L’extraction ultérieure d’ARN fait appel à une contraction de deux protocoles : une extraction
classique manuelle utilisant un mélange TRIzol/chloroforme, suivie d’un passage sur des
colonnes d’extraction prévues à cet effet. Brièvement, 50 µL d’échantillon broyé sont
mélangés à 950 µL de TRIzol auxquels sont ajoutés 200 µL de chloroforme. Les échantillons
sont alors centrifugés pendant 15 minutes à 12 000g à température ambiante. Cette étape
permet de séparer les ARN (surnageant après centrifugation) des protéines et de l’ADN.
Afin d’obtenir des ARN dénués au maximum d’inhibiteurs de PCR, classiquement présents
dans le contenu digestif (sels biliaires par exemple …), cette première étape d’extraction est
90

Procédures expérimentales
suivie d’un « nettoyage » des ARN selon le protocole RNA Clean Up Qiagen (RNEasy Mini
Kit).
La concentration en ARN de chaque échantillon est obtenue par spectrophotométrie à la
longueur d’onde 260 nm. La qualité / dégradation des ARN peut également être évaluée par
électrophorèse en gel d’agarose à 1%, comportant du bromure d’éthidium.
4.3. Isolement des cellules CD4 positives du nœud lymphatique abomasal pour extraction
spécifique des ARN de cette fraction cellulaire
Le nœud lymphatique abomasal est retiré lors de l’autopsie et plongé dans une solution de
PBS (Phosphate Buffered Saline) 1X sur la glace. Il est broyé à l’aide d’un tamis cellulaire
muni de pores de 40 µm de diamètre et les cellules obtenues sont collectées dans une solution
d’HBSS (Hank´s Balanced Salt Solution). Après deux lavages, 1.10 7 cellules sont remises en
suspension dans 500 µL de tampon FACS (PBS 1X, 2mM EDTA et 0.5 % de BSA (Bovine
Serum Albumin)) et incubées pendant 30 minutes sur la glace en présence de l’anticorps
primaire dirigé contre l’épitope CD4 marqué FITC (Mouse anti-ovine CD4 :FITC,
SEROTEC, référence MCA2213F) dilué au 1/150 ème . Après lavage, le culot cellulaire est
repris dans 80 µL de tampon FACS et incubé 15 minutes à 4°C avec 20 µL de billes
magnétiques couplées à un anticorps monoclonal anti-FITC (Anti-FITC Microbeads, Miltenyi
Biotec, référence 130-048-701). Les cellules sont alors reprises sous un volume de 1 mL de
tampon FACS après deux lavages, et triées au moyen d’un AUTOMACS® (Miltenyi Biotec)
selon le programme POSSEL-D (tri en double colonne, permettant d’obtenir un excellent
degré de pureté). Brièvement, l’appareil de tri cellulaire est muni de deux colonnes de tri qui
retiennent les billes magnétiques ayant accroché les cellules d’intérêt. L’élution ultérieure
permet de récupérer une fraction positive (contenant dans notre cas les cellules positives
CD4+) et une fraction négative (cellules non marquées par l’anticorps primaire). Toutes les
étapes de lavage sont réalisées à 4°C afin de préserver au maximum l’intégrité des cellules.
La fraction positive d’intérêt récupérée après tri cellulaire est alors conservée en tampon RLT
à –70°C, à raison de 1.10 6 cellules dans 350 µL de RLT additionné de β-mercaptoéthanol.
L’ARN de ces cellules sera alors extrait selon le protocole Qiagen décrit ci-dessus (Qiagen
RNEasy Mini Kit).
Après chaque tri cellulaire, une analyse de confirmation a été effectuée en cytométrie de flux
(analyse FACS) sur un échantillon des fractions cellulaires obtenues, afin de vérifier la pureté
91

Procédures expérimentales
des cellules CD4+ triées ainsi que le pourcentage d’enrichissement de ces cellules par rapport
à la population ganglionnaire totale de départ.
4.4. De l’ARN à l’ADN complémentaire (ADNc)…
Dans nos travaux, l’étape de RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) a été effectuée sur une
quantité totale de 2 µg d’ARN pour chaque échantillon, ajustée à 16 µL dans de l’eau ppi. Les
2 µg d’ARN sont préalablement digérés pendant une heure à 37°C en présence d’1U de
DNAse RNAse-free, afin d’éliminer toute trace d’ADN génomique.
Un premier mix contenant les oligonucléotides (Random Primers, Invitrogen, référence
48190-011) est rajouté à chaque échantillon, suivi d’une incubation de 10 minutes à 65°C. Un
deuxième mix, contenant des dNTP et l’enzyme de reverse transcription (M-MLV,
Invitrogen, référence 28025-013, 400 unités/échantillon) est ensuite ajouté aux échantillons.
Après une incubation d’une heure à 42°C, la réaction de transcription est stoppée par une
incubation de 5 minutes à 95°C. Les ADNc ainsi obtenus sont alors congelés à –20°C en
attente d’être utilisés pour la PCR quantitative.
4.5. PCR quantitative
Les échantillons d’ADNc sont utilisés dilués au 1/100 ème et en duplicate pour l’étape de PCR
quantitative.
Les couples d’amorces utilisées ont été dessinées à l’aide du logiciel Primer Express Software
(Applied Biosystems) et sont listées dans le Tableau n°10. Pour être utilisables en système
SYBR Green, ces primers doivent posséder certaines caractéristiques :
- température d’hybridation d’environ 60°C
- %GC entre 40 et 60
- absence d’hybridation des deux amorces entre elles (absence de dimérisation) et
absence de repliement d’une amorce sur elle même (repliement en épingle).
Dans le cas où la séquence du gène des cytokines d’intérêt était connue pour l’espèce ovine,
les primers ont été déterminés directement à partir de celle-ci (cas des gènes de la β-actine,
des interleukines (IL) 3, 4, 5, 10, 12, du TNF-α et de l’interféron-γ). Dans le cas contraire (IL-
13 et Eotaxine), l’alignement entre les séquences des gènes des cytokines connues dans
d’autres espèces animales (bovin, caprin, souris, rat…) a permis d’obtenir une séquence dite
« consensus » sur laquelle les primers ont été déterminés. Ceux-ci ont été utilisés en PCR
classique sur des cellules sanguines ovines (Peripheral Blood Mononuclear Cells stimulés
92

Procédures expérimentales
avec un mitogène tel que la Phytohématoagglutinine ou PHA) afin de tester leur compatibilité
avec l’espèce ovine (obtention d’une bande sur gel au poids moléculaire de la cible attendue).
Cytokine
Ovine Beta-actin
Ovine IFN-γ
Ovine IL-4
Ovine IL-10
Ovine TNF-α
Ovine IL-12p40
Ovine IL-13
Ovine Eotaxin
Ovine IL-5
Ovine IL-3
Séquence sens
ACCAGTTCGCCATGGATGAT
ATCTCTTTCGAGGCCGGAGA
GGAGCTGCCTGTAGCAGACG
CTGAGAACCATGGGCCTGAC
CCCGTCTGGACTTGGATCCT
GAATTCTCGGCAGGTGGAAG
CACTCAGCATCCTCTTGGTCC
ACAAGAAAATCTGTGTTGATCCCC
CTGCTGATAGGTGATGGGAACTT
AAGAATATCCTGGCGAATAAGAGC
SEQUENCE ANTI-SENS
AGCCGTTGTCAACCACGAG
ATTGCAGGCAGGAGAACCAT
TTCTCAGTTGCGTTCTTTGGG
TCTCCCCCAGCGAGTTCAC
TGCTTTTGGTGCTCATGGTG
GTGCTCCACGTGTCAGGGTA
TGATCAGCATCTCCAACTGCA
CCATGGCATTCTGGACCC
GGTGATTTGTATGCTGAGGAGTAGG
GAACGCTTTCAGGTTTGCCT
Tableau n°10 : Séquences sens et anti-sens des amorces utilisées en PCR quantitative.
La quantification des échantillons analysés en PCR quantitative a été réalisée au moyen d’une
gamme externe standard de plasmide déterminée pour chaque cytokine testée (séries de
dilution au 1/10 ème , couvrant généralement un nombre de copies allant de 1.10 7 à 1.10 1 ) . Ces
plasmides ont été obtenus après clonage des produits de PCR classique pour chaque cytokine
en système TOPO TA Cloning® Kit (Invitrogen).
Les résultats obtenus pour chaque cytokine ont été normalisés par rapport au niveau
d’amplification du gène de ménage β-actine et donc exprimés en nombre de copies relatives à
celle-ci. Enfin, pour chaque réaction ont été inclus des contrôles négatifs sans ADNc (Non
93

Procédures expérimentales
template control ou NTC) afin de vérifier l’absence d’amplification non spécifique et
l’absence de dimérisation des amorces.
5. EXPLORATION DE LA REPONSE HUMORALE GENERALE GENERALE ET LOCALE
La réponse humorale ou réponse « anticorps » peut être étudiée à l’échelle de l’organisme
(réponse générale ou systémique) ou à l’échelle de l’organe cible de l’infestation parasitaire
(réponse locale) soit, dans notre cas, la caillette (H. contortus) ou le duodénum (T.
colubriformis). Dans le sérum ou le mucus digestif sont ainsi mis en évidence des anticorps,
principalement des immunoglobulines (Ig) A ou IgG, spécifiques des antigènes parasitaires, et
correspondant à différents stades de développement des vers, par une méthode ELISA
(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay).
5.1. Collecte des prélèvements
La réponse humorale générale est étudiée au niveau sérique. Une prise de sang sur tube sec est
réalisée sur l’animal par ponction jugulaire, et le sérum est récupéré puis congelé à –20°C
après une centrifugation de 5 minutes à 5000 rpm.
La réponse humorale locale est explorée au niveau du mucus abomasal ou intestinal. Le
mucus est récupéré sur des bandelettes de papier filtre de 5 cm de long sur 1 cm de large,
imprégnées de PBS, déposées sur la muqueuse digestive pendant 5 minutes. Ces bandelettes
sont ensuite placées dans une solution de PBS sous agitation pendant 2 heures à température
ambiante. Les surnageants obtenus sont alors congelés à –20°C pour analyse ultérieure.
5.2. Préparation des antigènes
Différentes préparations antigéniques ont été utilisées pour mettre en évidence des anticorps
spécifiques :
- produits d’excrétion-sécrétion de vers adultes (PES),
- produits d’excrétion-sécrétion de larves de stade L4 (non disponibles pour H.
contortus en raison de la grande difficulté d’isoler des larves L4 de la paroi de la
caillette),
- broyats totaux de larves L3.
L’obtention de vers adultes est réalisée par infestation massive (50 000 larves infestantes)
d’un mouton donneur, euthanasié 30 jours après le challenge. Les vers adultes sont isolés du
contenu alimentaire abomasal ou duodénal. Après plusieurs lavages dans du PBS contenant
94

Procédures expérimentales
de la pénicilline (100 UI/mL) et de la streptomycine (1 mg/mL), ces vers sont maintenus à
37°C, pendant une nuit environ (H. contortus) ou 48 heures (T. colubriformis), sous 5 % de
CO2 dans la même solution de PBS à raison d’une densité maximale de 50 adultes par puits
de plaque de culture cellulaire pour H. contortus, et de 200 adultes par puits pour T.
colubriformis. Le surnageant de cette culture (produits d’excrétion-sécrétion) est alors collecté
et filtré (0.2 µm).
L’obtention des larves L4 nécessite également une infestation similaire d’un ovin donneur,
avec une euthanasie réalisée seulement 4 jours après l’infestation. Les cinq premiers mètres
d’intestin grêle sont mis à tremper dans du sérum physiologique à 37°C pendant 2 heures pour
faire sortir les larves de la muqueuse. Le contenu intestinal est ensuite filtré sur un appareil de
Büchner : brièvement, les larves ainsi que les débris alimentaires sont aspirés et retenus sur un
filtre Wathmann par un système de pompe à vide. Une fois tout le contenu absorbé sur le
papier, ce dernier est retourné dans une boîte de Pétri contenant une solution de PBS
additionnée d’antibiotiques (concentrations identiques à celles décrites pour l’obtention des
vers adultes). Les larves L4, mobiles, passent activement dans cette solution et sont ensuite
mises en culture à raison de 1000 larves par puits de plaque de culture, pendant environ 48-72
heures. Le surnageant de culture obtenu contient les produits d’excrétion-sécrétion de ces
larves.
Les antigènes de larves L3 sont obtenus après trois cycles de congélation / décongélation des
larves (-70°C ; 25°C), homogénéisation à 4°C et centrifugation à 30 000g pendant 30 minutes
à 4°C.
La concentration en protéines de ces surnageants est déterminée par la méthode de Lowry et
al. (1951).
5.3. Détermination des conditions optimales pour l’ELISA
Les concentrations optimales des réactifs utilisés (anticorps secondaire, conjugué), des
préparations antigéniques et les dilutions des échantillons (mucus ou sérum) sont déterminées
par séries de test sur des échantillons positifs (mucus ou sérum d’ovins immunisés avec le
parasite d’intérêt) et négatifs (mucus ou sérum d’ovins contrôles, non-infestés).
Les paramètres retenus sont présentés dans les tableaux n°11 (H. contortus) et n°12 (T.
colubriformis). Ils permettent d’obtenir un bruit de fond minimal et une distinction maximale
entre les échantillons positifs et négatifs.
95

ISOTYPE
Type d’antigène
Concentration de
l’antigène (µg/mL)
Dilution du sérum ou
mucus
Dilution de l’anticorps
secondaire
Dilution du conjugué
ESP
Ad
2
1:100
1:1000
-
IgG
CEL3
2
1:100
1:1000
-
SERUM MUCUS
ESP
Ad
5
1:5
1:100
1:500
IgA
CEL3
2
1:5
1:100
1:500
ESP
Ad
5
1:1
1:1000
-
IgG
Procédures expérimentales
CEL3
0.5
1:1
1:1000
-
ESP
Ad
5
1:1
1:250
1:500
Tableau n°11 : Conditions optimales utilisées pour la détection d’IgA et IgG dans le sérum et
le mucus, dirigées contre des antigènes d’excrétion-sécrétion de vers adultes (ESP Ad) ou
contre des antigènes de broyat total de larves L3 (CEL3) d’H. contortus, par technique ELISA.
IgA
CEL3
2
1:1
1:250
1:500
96

ISOTYPE
Type
d’antigène
Concentration
de l’antigène
(µg/mL)
Dilution du
sérum ou
mucus
Dilution de
l’anticorps
secondaire
Dilution du
conjugué
ESP
Ad
0.5
1:200
1:2000
-
IgG
ESP
L4
0.5
1:100
1:2000
-
SERUM MUCUS
CEL3
1
1:100
1:2000
-
ESP
Ad
1
1:200
1:250
1:500
IgA
ESP
L4
1
1:100
1:250
1:500
CEL3
1
1:200
1:250
1:500
ESP
Ad
1
1:1
1:1000
-
IgG
ESP
L4
1
1:1
1:1000
-
Procédures expérimentales
CEL3
0.5
1:1
1:1000
-
ESP
Ad
2
1:1
1:250
1:500
IgA
ESP
L4
1
1:1
1:250
1:500
Tableau n°12 : Conditions optimales utilisées pour la détection d’IgA et IgG dans le sérum et
le mucus, dirigées contre des antigènes d’excrétion-sécrétion de vers adultes (ESP Ad), de
larves L4 (ESP L4) ou contre des antigènes de broyat total de larves L3 (CEL3) de T.
colubriformis, par technique ELISA
97
CEL3
1
1:1
1:250
1:500

5.4. Technique ELISA
Procédures expérimentales
La méthode employée dans nos travaux est un test ELISA de type indirect. Des plaques à
fond plat (Nunclon, VWR International) sont coatées pendant une nuit à 4°C avec 100
µL/puits d’antigène dilué dans un tampon sodium carbonate. Ces plaques sont ensuite lavées
deux fois avec du PBS pH=7.2 contenant 0.1% de Tween 20 (PBS-T). Afin de minimiser la
fixation non spécifique des anticorps, les plaques sont ensuite incubées pendant une heure à
37°C avec 200 µL/puits de PBS-T contenant 5 % de lait écrémé (PBS-TM). Les plaques sont
alors vidées de cette dernière solution, incubées pour une heure à 37°C avec le sérum ou le
mucus, pur ou à la dilution optimale préalablement déterminée, puis lavées trois fois avec du
PBS-T.
- Mise en évidence des IgG totales : les plaques sont incubées avec 100 µL/puits
d’anticorps secondaire directement couplé à HRP (donkey anti-sheep IgG-HRP, SIGMA,
référence A3415)
- Mise en évidence des IgA : 100 µL/puits de l’anticorps secondaire (mouse IgG1 anti-
IgA bovine/ovine, SEROTEC, référence MCA628) sont incubés pendant une heure avant
d’appliquer 100 µL/puits de conjugué couplé à HRP (Goat anti-mouse IgG1-HRP,
SEROTEC, référence STAR81P), ces deux étapes étant séparées par trois lavages des
plaques.
La révélation est alors réalisée selon une réaction colorimétrique par une incubation des
plaques avec 100 µL/puits de 2,2’-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid, ABTS)
pendant une heure à 37°C. La réaction est stoppée en plaçant les plaques pendant 15 minutes
à 4°C.
La densité optique est alors mesurée à la longueur d’onde 405 nm par un lecteur de plaques
(Microplate Reader, Dynatech). Le résultat final a été exprimé en densité optique corrigée,
c’est à dire la densité optique obtenue par le lecteur à laquelle a été retirée la valeur obtenue
pour les puits « blancs » contrôles, ne contenant que du PBS initialement.
6. ETUDE DE LA REPONSE CELLULAIRE LOCALE
La réponse cellulaire locale (dans la muqueuse abomasale lors d’infestation par H. contortus,
et dans la muqueuse du duodénum proximal lors d’infestation par T. colubriformis) a été
étudiée par un dénombrement des différentes populations cellulaires présentes dans la
muqueuse. Ont été ainsi dénombrées :
98

Procédures expérimentales
(i) des cellules inflammatoires ou cellules effectrices de l’immunité :
polynucléaires éosinophiles, globule leucocytes et mastocytes ; ces cellules ont
été comptées sur des lames traitées par histologie conventionnelle (colorations
classiques Hémalun-éosine ou Giemsa)
(ii) des cellules impliquées dans la réponse immunitaire non spécifique
(macrophages) ou spécifique (lymphocytes T, ainsi que les deux sous-types
lymphocytaires T CD4+ et CD8+, et les lymphocytes B). La différenciation de
ces types cellulaires fait appel à des marquages immunohistochimiques, sur
coupes en paraffine ou en congélation.
Pour chaque type cellulaire, les comptages ont été effectués sur 5 champs sélectionnés de
manière aléatoire sur la lame, au grossissement 400. Les résultats ont été exprimés par la
somme du nombre de cellules d’intérêt des 5 champs microscopiques examinés.
6.1. Histologie conventionnelle et immunohistochimie sur coupes en paraffine
6.1.1. Collecte des prélèvements
A l’autopsie, des fragments de tube digestif (paroi de la caillette en régions fundique, antrale
et pylorique pour les études sur H. contortus ; paroi duodénale pour T. colubriformis) sont
immédiatement plongés dans une solution de formaldéhyde à 10% jusqu’à fixation complète
de l’échantillon.
6.1.2. Technique histologique
Après déshydratation dans des bains successifs d’alcool de degrés croissants et de toluène
(cycle automatisé complet de 18 heures), les échantillons sont inclus en paraffine. Des coupes
de 3 µm d’épaisseur sont réalisées à partir des blocs à l’aide d’un microtome (Microm,
France) et récupérées sur des lames prétraitées (lames Superfrost Plus, Labonord, France).
6.1.3. Colorations à l’Hémalun/Eosine et au Giemsa
Pour le dénombrement des polynucléaires éosinophiles et des globule leucocytes, les lames
sont colorées selon un protocole classique d’Hémalun-éosine. Les polynucléaires éosinophiles
sont aisément reconnaissables grâce à leur noyau généralement bilobé et leur cytoplasme
hébergeant de nombreuses granulations éosinophiles de petite taille (Figure n°15A). Les
globule leucocytes, stade ultime de la différentiation des mastocytes, sont en général situés en
position intra-épithéliale (épithélium superficiel ou épithélium glandulaire) (Figure n°15B).
99

Procédures expérimentales
Ces cellules possèdent un noyau arrondi central et de nombreuses et volumineuses
granulations arrondies, éosinophiles nettes. En revanche, les lames destinées au comptage des
mastocytes ont été traitées selon une coloration de Giemsa, qui permet de mieux visualiser les
granulations mastocytaires, qui prennent ainsi une teinte violet-pourpre vive (Figure n°15C).
Figure n°15 : Coupes histologiques de caillette d’ovins infestés par H. contortus, mettant en
évidence des polynucléaires éosinophiles (A, coloration Hémalun-Eosine, grossissement 400),
des globule leucocytes (B, coloration Hémalun-Eosine, grossissement 400) et des mastocytes
(C, coloration Giemsa, grossissement 400).
100

6.1.4. Immunohistochimie sur coupes en paraffine
Procédures expérimentales
Le protocole utilisé pour l’immunohistochimie est celui décrit par Andréoletti et al. (2002).
Les lames sont chauffées à 56°C pendant une nuit avant d’être déparaffinées et réhydratées
(différents bains de 5 minutes : toluène, éthanol absolu, éthanol 95° puis rinçage à l’eau
courante). Les sections tissulaires sont alors autoclavées pendant 10 minutes à 121°C dans
une solution de tampon citrate 10mM (pH 6.15) afin de démasquer les épitopes antigéniques,
la fixation au formaldéhyde pouvant créer des ponts méthylènes sur les protéines et ainsi
« cacher » certains antigènes d’intérêt. Les peroxydases endogènes sont inhibées par
incubation des lames dans une solution de peroxyde d’hydrogène 30% dans du méthanol
pendant 30 minutes à température ambiante. Une incubation ultérieure de 20 minutes dans
une solution de PBS contenant 20% de sérum normal de chèvre permet de bloquer les sites
non spécifiques d’attache des anticorps primaires.
L’incubation de l’anticorps primaire se fait à température ambiante pendant 1 heure. Elle est
suivie d’une incubation de 30 minutes d’un anticorps secondaire de chèvre dirigé contre les
chaînes lourdes d’immunoglobulines de souris et de lapin, dilué au 1/100 ème . Un complexe
streptavidine-peroxydase dilué également au 1/100 ème est ensuite appliqué pendant 30
minutes. La révélation est réalisée avec de la 3,3’-diaminobenzidine (DAB) (ChemMate
Detection Kit Peroxydase/DAB, DAKO, référence K5001). Les sections tissulaires sont
finalement contre-colorées à l’Hématoxyline de Mayer.
Dans notre travail, les anticorps primaires utilisés ont été :
- un anticorps spécifique des macrophages / monocytes : mouse anti-human CD68,
clone Ki-M6 (SEROTEC), dilution 1/150 ème ,
- un anticorps spécifique des lymphocytes B : mouse anti-human CD20-like, clone
BLA-36 (NOVOCASTRA), dilution 1/50 ème ,
- un anticorps spécifique des lymphocytes T : rabbit anti-human CD3, A0542
(DAKO), dilution 1/100 ème ,
La réactivité de ces différents anticorps contre les antigènes ovins avait été préalablement
vérifiée (Ramos-Vara et al., 1994 ; Andréoletti et al., 2002 ; Tabouret et al., 2003 ; Valentine
et McDonough, 2003).
101

Procédures expérimentales
Figure n°16 : Coupes histologiques de caillette d’ovins infestés par H. contortus, mettant en
évidence des macrophages (A, marquage immunohistochimique sur coupes en paraffine,
anticorps Ki-M6, grossissement 400) et des lymphocytes B (B, marquage
immunohistochimique sur coupes en paraffine, anticorps BLA-36, grossissement 400).
6.2. Immunohistochimie sur coupes en congélation
6.2.1. Collecte et technique des prélèvements
Des fragments de muqueuse digestive, identiques à ceux prélevés pour histologie
conventionnelle, ont été immédiatement congelés lors de l’autopsie dans de l’azote liquide,
après avoir été placés sur des bouchons de liège préalablement imprégnés de Tissue-Tek
(Labonord). Le support de liège permet de conserver une orientation correcte des
prélèvements pour leur utilisation ultérieure (dans le cas particulier de la muqueuse digestive,
conservation d’une orientation transversale nécessaire à l’observation microscopique des
différentes couches de la paroi). Les échantillons sont alors conservés à –70°C jusqu’à la
coupe. Celle-ci est effectuée à l’aide d’un cryomicrotome (Leika). Les sections de 5 µm
d’épaisseur ainsi obtenues sont montées sur des lames prétraitées (Superfrost Plus, Labonord)
et fixées pendant 20 minutes dans un bain d’acétone.
6.2.2. Immunohistochimie
Le protocole utilisé sur des coupes obtenues en congélation est identique à celui décrit pour
les coupes en paraffine, à la seule différence qu’il n’existe évidemment pas d’étapes de
déparaffinage ni de démasquage antigénique. Cette technique est nécessaire pour la mise en
102

Procédures expérimentales
évidence d’antigènes qui seraient détruits par une fixation préalable des échantillons, ce qui
est le cas pour les marqueurs membranaires qui nous intéressaient : CD4+ et CD8+.
Les anticorps primaires utilisés dans ces deux cas sont :
- un anticorps spécifique des lymphocytes T CD4+ : mouse anti-ovine CD4,
MCA2213 (SEROTEC), dilution 1/2000 ème ,
- un anticorps spécifique des lymphocytes T CD8+ : mouse anti-bovine CD8,
MCA837G (SEROTEC), dilution 1/800 ème .
Là encore, la réactivité de ces anticorps dans l’espèce ovine est connue et précisée par le
fabricant.
Figure n°17 : Coupe histologique de caillette d’ovin infesté par H. contortus mettant en
évidence des lymphocytes CD4+ (marquage immunohistochimique sur coupe en congélation,
anticorps anti-CD4, grossissement 1000).
7. ETUDE DE LA LYMPHOPROLIFERATION SPECIFIQUE D’ANTIGENES PARASITAIRES
7.1. Principe
Nous avons choisi d’évaluer l’intensité de la réponse immunitaire par un test de
transformation lymphoblastique in vitro, ou lymphoprolifération. Cette technique permet de
déterminer la proportion de lymphocytes T spécifiques d’un antigène, capables de réagir à ce
dernier par une expansion clonale. Elle est applicable aux lymphocytes sanguins, mais
également aux lymphocytes tissulaires et, en particulier, ceux des structures ganglionnaires.
L’antigène parasitaire est processé par des cellules présentatrices d’antigènes et présenté aux
103

Procédures expérimentales
lymphocytes T via le complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) de type II. Les signaux
transduits suite à l’interaction entre le CMH II et l’antigène via le récepteur lymphocytaire T
entraîne leur activation et leur progression dans le cycle cellulaire.
7.2. Technique
7.2.1. Préparation des cellules
- A partir du sang circulant : une prise de sang est effectuée à la jugulaire sur tube
EDTA et dilué volume à volume dans du RPMI 1640. Le sang ainsi dilué est
déposé sur de l’Histopaque 1.077 (Sigma Diagnostics) et centrifugé pendant 30
minutes à 1100g. Les cellules mononucléées sont recueillies et lavées deux fois
dans du RPMI 1640 (deux centrifugations de 12 minutes à 200g et 4°C séparant les
lavages).
- A partir d’un nœud lymphatique : un fragment de nœud lymphatique est prélevé
aseptiquement lors de l’autopsie et coupé en deux parties égales, qui sont broyées
dans un gaze stérile au dessus d’une boîte de Pétri contenant du RPMI 1640. La
suspension cellulaire obtenue est alors déposée sur l’Histopaque 1.077 et les
cellules mononucléées sont obtenues et lavées comme précédemment décrit.
7.2.2. Mise en culture et stimulation des cellules mononucléées
Les cellules sont re-suspendues dans un milieu de culture adapté (RPMI 1640, 20% de sérum
de veau fœtal, 1% pénicilline-streptomycine, 1% glutamine). Leur viabilité est appréciée par
une coloration d’exclusion au Bleu Trypan (colore en bleu les cellules mortes).
Ces cellules sont mises en culture à raison de 12 x 10 5 cellules par puits dans des plaques 96
puits (Microtest 96, Flacon, Becton-Dickinson) pendant 7 jours à 37°C dans une atmosphère
humide à 5% de CO2.
Trois modalités de culture sont mises en place :
- culture en présence d’un agent mitogène, la PHA (phytohémagglutinine, PHA-L,
Sigma) à raison de 10 µg/mL : ces puits de culture représentent un témoin positif
de prolifération des lymphocytes face à un mitogène non spécifique,
- culture en présence d’antigènes parasitaires de vers adultes ou de larves 4
(antigènes d’excrétion-sécrétion), ou d’antigènes totaux de larves 3, issus de H .
contortus ou T. colubriformis en fonction des expérimentations (concentrations
d’antigènes variables entre 10 et 20 µg/mL),
104

Procédures expérimentales
- culture en l’absence de tout mitogène ou antigène parasitaire (puits contrôles, 6 par
plaque).
Chaque modalité est réalisée en triplicate.
7.3. Interprétation des résultats
La prolifération des cellules en fin de culture est évaluée par un test colorimétrique (CellTiter
96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega). La densité optique (DO) de
chaque puits est déterminée par spectrophotométrie à une longueur d’onde de 450 nm.
Les résultats sont exprimés par un index de stimulation (SI) déterminé par la formule :
SI = ((DO moyenne des triplicates de culture en présence d’antigène parasitaire / DO
8. ANALYSES STATISTIQUES
moyenne des six puits contrôles) x100) –100
Les comparaisons entre les différents groupes expérimentaux et entre les différentes dates de
la cinétique ont été effectuées au moyen de tests statistiques non paramétriques (Kruskall-
Wallis, Mann-Whitney) grâce au logiciel SYSTAT. Le suivi de certains paramètres
(éosinophilie sanguine, coproscopies…) sur les mêmes animaux à des dates successives a fait
l’objet d’une analyse de variance en données répétées (SYSTAT). Une probabilité inférieure à
5% a été considérée comme significative.
Les analyses discriminantes ont été réalisées avec le logiciel STAT-ITCF (Institut Technique
des Céréales et des Fourrages, 1991). L’interprétation de cette analyse multivariée a été faite
selon Lebart et al. (1995). Elle permet de déterminer les corrélations entre les variables
étudiées et de déterminer celles ayant un poids significatif dans l’analyse. Cette analyse
détermine deux axes discriminants (nombre de groupes moins 1), qui sont des combinaisons
linéaires entre les variables quantitatives mesurées. Ces deux combinaisons linéaires sont
choisies pour permettre une discrimination optimale entre les différents groupes : variabilité
maximale entre les groupes et variabilité minimale au sein d’un groupe donné. Les
corrélations entre les différentes variables sont représentées par un cercle : les variables
positivement corrélées entre elles sont très proches sur le cercle, alors que les variables
négativement corrélées sont situées sur des côtés opposés du cercle (Figure n°18).
105

Axis 1 (72% inertia)
IL-10
Eotaxin
IFN-γ
IL-3
IL-12
TNF-α
IL-13
Axis 2 (28% inertia)
0
Epg21
IL-5
Feotaxin
Procédures expérimentales
AdF
Epg28 Macrophages
Globule Leukocytes FIL-5
Ab2
Mast cells Ab3
FIL-3 Bcells
Ab1 Ab6
Eosinophils Tcells Ab7 CD4
FIL-4
Ab4
Lymphocytes proliferation
ImF CD8
Ab5 Length
El4 FIL-13
Ll4 AdM
ImM Eggs IL-4 Worms
Figure n°18 : Exemple de cercle de corrélations obtenu par analyse discriminante. La
détermination de deux axes discriminants (ainsi que leur inertie respective) permet de
visualiser les variables positivement corrélées entre elles (proches sur le cercle, ex : Globule
leucocytes et FIL-5) ou bien négativement corrélées entre elles (situées sur des côtés opposés
du cercle, ex : FIL-4 et IFN-γ). Dans cet exemple, les variables discriminantes (ayant un poids
dans l’analyse) étaient représentées par des triangles noirs.
L’analyse discriminante permet également d’étudier la variabilité individuelle (entre les
individus inclus dans l’analyse, soit dans notre cas, les différents ovins utilisés en
expérimentation) Là encore, la représentation schématique des individus par leurs
coordonnées sur les deux axes discriminants de l’analyse, et le calcul de leur distance
(distance de Mahalanobis) par rapport au centre de gravité de chaque groupe, permet de
déterminer un pourcentage d’individus bien classés (compatibilité entre le groupe d’origine et
le groupe déterminé par l’analyse).
106

Résultats
CHAPITRE V : RESULTATS
107

Résultats
PARTIE I : ETUDE DE LA REPONSE IMMUNITAIRE
ADAPTATIVE CHEZ DES AGNEAUX DE RACE SENSIBLE,
INRA 401, INFESTES PAR H. CONTORTUS OU T.
COLUBRIFORMIS
La réponse immunitaire mise en jeu lors d’infestations par des strongles gastro-intestinaux est
classiquement décrite comme une réponse protectrice d’orientation Th2. Cette orientation a
clairement été démontrée lors d’infestations expérimentales dans des modèles murins (Urban
et al., 1996 ; Finkelman et al., 1997) ou lors d’infestations naturelles chez l’homme (Cooper
et al., 2000). Au moment où ce travail a été initié, cette polarisation dans l’espèce ovine (et
chez les ruminants en général) était supposée mais non démontrée (Brown et al., 1998 ; Gill et
al., 2000 ; Schallig, 2000).
Les degrés d’interactions entre l’hôte et son parasite, en relation avec la localisation et le
mode de nutrition de ce dernier, pourraient influencer à la fois l’induction de la réponse
immunitaire adaptative de l’hôte, et son efficacité à réguler les populations parasitaires. Deux
strongles gastro-intestinaux, fréquemment rencontrés chez les ovins, illustrent parfaitement
deux modèles distincts d’interaction hôte/parasite :
- Haemonchus contortus : parasite de la caillette, très vulnérant, et dont le mode de
nutrition hématophage dès le stade L4 laisse supposer un contact étroit avec le
système immunitaire de l’hôte
- Trichostrongylus colubriformis : parasite de surface de l’intestin grêle proximal,
dont le mode de nutrition chymivore à l’état adulte suggère une interaction avec
l’hôte plus limitée.
En utilisant des infestations expérimentales par ces deux modèles, la dynamique de la réponse
immunitaire adaptative a été étudiée chez des ovins de race sensible, INRA 401.
Nous nous sommes principalement attachés :
108

Résultats
- à la polarisation Th1/Th2 de la réponse immunitaire par la caractérisation en PCR
quantitative de l’expression de l’ARNm des principales cytokines impliquées dans
la balance Th1/Th2,
- à la dynamique de mise en place des effecteurs de la réponse immunitaire,
cellulaires (grâce au dénombrement des différents types cellulaires dans les
organes cibles au moyen de techniques d’histologie classique ou
d’immunohistochimie) et humoraux (cinétique d’anticorps sériques ou locaux par
des techniques ELISA),
- enfin, aux effets de la réponse immunitaire chez les ovins immunisés ou naïfs sur
les populations de strongles présentes chez l’hôte (effets sur l’établissement des
larves, le développement des parasites, la fécondité des femelles adultes).
Ces travaux ont donné lieu à deux publications et deux communications :
Caroline LACROUX, Thi Hai Chi NGUYEN, Olivier ANDREOLETTI, Françoise
PREVOT, Christelle GRISEZ, Jean-Paul BERGEAUD, Lucas GRUNER, Jean-Claude
BRUNEL, Dominique FRANCOIS, Philippe DORCHIES et Philippe JACQUIET
« Haemonchus contortus (Nematoda : Trichostrongylidae) infection in lambs elicits an
unequivocal Th2 immune response » Veterinary Research, In Press, 2006.
Caroline LACROUX, Françoise PREVOT, Christelle GRISEZ, Olivier ANDREOLETTI,
Jean-Paul BERGEAUD, Jacques CORTE, Christine SAUVE, Lucas GRUNER, Jean-Claude
BRUNEL, Dominique FRANCOIS, Philippe DORCHIES et Philippe JACQUIET « Immune
response in lambs infected with Trichostrongylus colubriformis” Soumis pour publication
à Veterinary Parasitology
Caroline LACROUX, Christelle GRISEZ, Françoise PREVOT, Olivier ANDREOLETTI,
Jean-Paul BERGEAUD, Philippe DORCHIES et Philippe JACQUIET « Riposta
immunitaria degli ovini infestati da Haemonchus contortus o Trichostrongylus
colubriformis » Conférence invitée – Corso d’aggiornamento su Attualita sulle parassitosi
109

Résultats
gastro-intestinali degli ovini e dei caprini – Milan, 03 Novembre 2005 – Sassari, 04
Novembre 2005.
Caroline LACROUX, Christelle GRISEZ, Françoise PREVOT, Olivier ANDREOLETTI,
Jean-Paul BERGEAUD, Philippe DORCHIES et Philippe JACQUIET “Immune responses
of sheep infected with Trichostrongylus colubriformis or Haemonchus contortus”
Symposium Toulouse-Munich-Saragosse – Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse – 17
Novembre 2005.
110

Vet. Res. 37 (2006) 1–16
© INRA, EDP Sciences, 2006
DOI: 10.1051/vetres:2006022
1
Original article
Haemonchus contortus (Nematoda:
Trichostrongylidae) infection in lambs elicits
an unequivocal Th 2 immune response
Caroline LACROUX a , Thi Hai Chi NGUYEN b , Olivier ANDREOLETTI a ,
Françoise PREVOT a , Christelle GRISEZ a , Jean-Paul BERGEAUD a ,
Lucas GRUNER c , Jean-Claude BRUNEL d , Dominique FRANCOIS e ,
Philippe DORCHIES a , Philippe JACQUIET a *
a UMR INRA-ENVT 1225 Interactions Hôtes Agents Pathogènes – École Nationale Vétérinaire
de Toulouse, 23 chemin des Capelles, 31076 Toulouse Cedex 03, France
b Université d’Agriculture et de Foresterie de Ho Chi Minh Ville, Vietnam
c INRA, Écologie et Génétique des Parasites, BioAgresseurs Santé et Environnement,
37880 Nouzilly, France
d INRA, Domaine Expérimental de la Sapinière, 18390 Osmoy, France
e INRA, Station d’Amélioration Génétique des Animaux, BP 27, 31326 Castanet-Tolosan, France
(Received 28 October 2005; accepted 7 February 2006)
Abstract – Selection of resistant animals and host immunization have been proposed as alternative
methods for the control of gastrointestinal nematode parasites. However, a better knowledge of the
mechanisms involved in protective immunity against these parasites is required for the development
of optimal strategies. In this study, 3 month old INRA 401 lambs (n = 81) were allocated into three
groups: uninfected control, challenged either once (primary-infected animals) or twice (previouslyinfected
animals) with 10 000 Haemonchus contortus L 3 . Uninfected control and challenged
animals were sequentially sacrificed at 3, 7, 15 and 28 days post challenge. In both challenged
groups, a clear Th 2 -oriented immune response was observed in the abomasal lymph node and
mucosa. IL-4 and IL-13 mRNA over-expression, recruitment of eosinophils, mast cells and globule
leukocytes and production of specific systemic IgG and mucosal IgA were observed earlier in
previously-infected animals than in primary-infected ones. At 28 days post infection, no differences
between intensities of these responses were observed between the challenged groups. Worm
establishment rates were similar in previously-infected and primary-infected lambs. However,
reductions of worm development, female fecundity and fecal egg output were observed in
previously-infected sheep. We conclude that H. contortus infection in young INRA 401 lambs
induced an unequivocal Th 2 immune response resulting in the regulation of worm egg production
without affecting their establishment.
Haemonchus contortus / sheep / Th 2 immune response / quantitative PCR / antibody and
cellular response
* Corresponding author: p.jacquiet@envt.fr

2 C. Lacroux et al.
1. INTRODUCTION
Haemonchus contortus is a common
nematode parasite of small ruminants that
causes important losses of milk, meat and
wool production and death in young animals
[33, 37]. Due to the emergence of
anthelmintic resistance [29, 39] and public
concern about chemical residues in animal
products, alternative control strategies are
needed. Vaccination and genetic resistance
of hosts have been viewed as sustainable
methods of parasite control. Substantial
progress and results have been obtained by
using several H. contortus antigens, such as
native H11 and H-gal-GP, to stimulate efficient
levels of protective immunity in sheep
[20]. Nevertheless, no commercial vaccine
is yet available. Between and within breed
differences in host resistance are currently
reported throughout the world [22, 38] but
the mechanisms underlying this resistance
are not well known. The immune response
against gastrointestinal nematodes has been
extensively studied in rodents infected with
Trichinella spiralis, Nippostrongylus brasiliensis,
Heligmosomoïdes polygyrus and
Trichuris muris. Protective immunity against
these parasites is largely dependant on the
activation of CD4+ T helper cells and on the
Th 2 polarization of the immune response
[35], while a Th 1 response is associated
with the survival of these parasites and
increased host susceptibility to infection
[13, 14]. In humans, the protective immune
response observed in natural Ascaris lumbricoïdes
or Necator americanus infections
is similarly associated with a high Th 2-type
cytokine polarization [11, 26]. In ruminants,
the nature of the immune response
towards gastrointestinal helminths is less
clear and the existence of a true Th 1/Th 2
dichotomy was questioned in the late nineteen-nineties
[9, 15, 24]. Few studies on the
polarization of the adaptative immune
response in H. contortus infected sheep are
available and the results have failed to
prove an unequivocal Th 2 response [31].
Nevertheless, a Th 2 polarization has been
recently demonstrated in Trichostrongylus
colubriformis infections in sheep [25].
In rodent models, Th 2 immune
responses are almost invariably accompanied
by local and systemic eosinophilia and
mucosal mast cell hyperplasia, but also
with local and general specific antibody
responses (mainly IgA, IgG1 and IgE) [23].
The same features are also encountered in
sheep infected with H. contortus [31], Teladorsagia
circumcincta [32] and Trichostrongylus
colubriformis [8]. The impact of
these effectors and their relative importance
in host protection are still unclear. Moreover,
sequences of the immune response and
mobilization of the antibody and cellular
effectors have not been systematically characterized
in H. contortus infections. Therefore,
the objectives of this study were (i) to
define, using a quantitative reverse transcriptase
(RT) PCR, the polarization of the
immune response in lambs infected with
H. contortus, (ii) to investigate the kinetics
of Th 2 -type-associated effectors in the abomasal
mucosa and (iii) to characterize the
effects of this immune response on the nematode
populations within the host.
2. MATERIALS AND METHODS
2.1. Experimental design
2.1.1. Animals
Eighty-one 3-month old female INRA
401 lambs were randomly allocated into
three experimental groups: Group A: previously-infected,
anthelmintic-treated and
then challenged sheep (n = 29), Group B:
primary-infected sheep (n = 28), and Group
C: uninfected control sheep (n = 24). All
sheep were born, reared and maintained
worm-free in three separate pens before the
experiments. Limited infections with coccidia
occurred in all groups despite diclazuril
treatments (Vecoxan, Janssen-Cilag,
Issy-les-Moulineaux, France, 1 mg/Kg BW)
before the commencement of the experiment,

ut no clinical signs of coccidiosis were
observed. Experimental lambs received
granulated feed adapted to their age, as well
as forage and tap water ad libitum. The animals
were reared following European
Union recommendations for animal welfare
and under the supervision of the local
INRA ethics committee.
2.1.2. Experimental infections
and necropsies
Lambs of group A (previously-infected)
were orally infected with 10 000 H. contortus
third-stage larvae (L 3) of the Humeau
strain (kindly provided by L. Gruner, INRA
BASE, Tours-Nouzilly, France) 35 days
before challenge. All lambs were treated
with an oral administration of Levamisole
(7.5 mg/kg) at day –7. The lambs of groups
A (previously-infected) and B (primaryinfected)
were orally infected with 10 000
H. contortus L 3 at D 0 . Six animals of each
group were humanely killed at each of days
3, 7 and 15 post challenge (dpc) by exsanguination
following intravenous injection
of 10 mg/kg pentobarbital sodium. At day
28, eleven lambs from group A, ten from
group B and six from group C were killed
(Tab. I). Necropsy days were chosen to conform
with the expected development of the
parasite within the host: only early fourthstage
larvae (L 4 ) at 3 dpc, majority of late
L 4 at 7 dpc, immature worms at 15 dpc, and
adult worms at 28 dpc [10].
Th 2 response in H. contortus infected sheep 3
Table I. chematic description of the experimental design.
Treatment
and group
Initial
infection*
Levamisole Challenge
infection*
Number of sheep killed
Days from challenge –35 –7 0 3 7 15 28
Previously-infected (A) + + + 6 6 6 11
Primary-infected (B) – + + 6 6 6 10
Uninfected control (C) – + – 6 6 6 6
*10 000 H. contortus L 3.
2.2. Parasitological examinations
Fecal samples from animals necropsied
at 28 dpc were taken on days 21 and 28 post
challenge to measure the nematode egg
excretion. Fecal egg counts were performed
according to the modified McMaster technique
[28]. After necropsies, the contents
and washings of the abomasum were collected
and passed through a 40 µm sieve to
eliminate coarse materials. The whole abomasum
was digested in pepsin-hydrochloric
acid solution (37 °C, 6 h) to collect the
tissue dwelling nematode stages. The contents,
washings and digested materials,
were preserved in absolute alcohol. The
volumes of these materials were then
adjusted to 1 L and worms were counted in
a 10% aliquot and classified as adult male
or female, immature male or female, or
early and late L 4 . Twenty adult female
worms were randomly picked from each
28 dpc sample for total length measurement
and egg counts in utero. For this purpose,
individual female worms were allowed to
disintegrate in sodium hypochloride 4%
solution [19] and all eggs liberated from the
uterus were counted for each worm.
2.3. Cytokine expression in abomasal
lymph node and fundic mucosa
2.3.1. mRNA extraction and RT-PCR
About 300 mg of the abomasal lymph
node or fundic mucosa were snap frozen in

4 C. Lacroux et al.
Table II. Forward and reverse primer sequences for quantitative reverse-transcriptase (RT) PCR.
Cytokine Forward sequence Reverse sequence Tm amplicon (°C)
Ovine Beta-actin ACCAGTTCGCCATGGATGAT AGCCGTTGTCAACCACGAG 78
Ovine IFN- ATCTCTTTCGAGGCCGGAGA ATTGCAGGCAGGAGAACCAT 77
Ovine IL-4 GGAGCTGCCTGTAGCAGACG TTCTCAGTTGCGTTCTTTGGG 79
Ovine IL-10 CTGAGAACCATGGGCCTGAC TCTCCCCCAGCGAGTTCAC 80
Ovine TNF-α CCCGTCTGGACTTGGATCCT TGCTTTTGGTGCTCATGGTG 75
Ovine IL-12p40 GAATTCTCGGCAGGTGGAAG GTGCTCCACGTGTCAGGGTA 80
Ovine IL-13 AGAACCAGAAGGTGCCGCT GGTTGAGGCTCCACACCATG 80
Ovine Eotaxin ACAAGAAAATCTGTGTTGATCCCC CCATGGCATTCTGGACCC 75
Ovine IL-5 CTGCTGATAGGTGATGGGAACTT GGTGATTTGTATGCTGAGGAGTAGG 74
Ovine IL-3 AAGAATATCCTGGCGAATAAGAGC GAACGCTTTCAGGTTTGCCT 75
1 mL of Trizol Reagent (Invitrogen, Cergy-
Pontoise, France, reference 15596-018),
and stored at –70 °C before use. Samples
were homogenized using a Hybaid RiboLyser
TM (two cycles of 30 s each at a speed of
4.5). Fifty µL of the obtained homogenate
were mixed with 950 µL of Trizol before
adding 200 µL of chloroform at room temperature
for 10 min. The samples were then
centrifuged for 15 min at 20 000 g at 4 °C.
The supernatants were placed on an RNeasy
Column (RNeasy Mini Kit, Qiagen,
Courtabœuf, France) and then processed
using the Qiagen protocol for RNA cleanup.
This complete protocol allows the
recovery of highly pure RNA. The RNA
concentration was measured by spectrophotometry
at 260 nm and RNA quality was
assessed by electrophoresis on 1.2% agarose
gels stained with ethidium bromide.
Two µg of total RNA were digested with 1U
of RNase-free DNAse (Promega, Charbonnières,
France) for 1 h at 37 °C to remove
any trace of genomic DNA, and then incubated
10 min at 65 °C with DNase Stop
Solution. Treated RNA was used as the
template for single-stranded cDNA synthesis.
They were incubated 10 min at 65 °C
with Random Primer oligonucleotides
(Invitrogen) and chilled on ice; a mixture
containing M-MLV transcriptase (400 IU/
sample), 5× first-strand buffer (Life Technologies,
Cergy-Pontoise, France), dithiothreitol
(DTT) 0.1 M (Life Technologies),
40 U of RNase Out Ribonuclease Inhibitor
(Invitrogen), 10 mM of each four dNTP
(Promega) was then added and the mixture
was incubated for 1 h at 42 °C. The reaction
was heat-inactivated at 95 °C for 5 min and
kept at –20 °C until use. For quantitative
PCR, cDNA were used at dilutions of
1:100.
2.3.2. PCR primers
Specific primers and amplicon sizes are
listed in Table II. For each target cDNA, a
primer pair was determined using Primer
Express Software (Applied Biosystems,
Courtabœuf, France) for SYBR Green realtime
PCR assay on a GeneAmp 5700
Sequence Detection System (Applied Biosystems)
and based on known ovine gene
sequences (β-actin, IFN-γ , TNF-α, IL-3,
IL-4, IL-5, IL-10, IL-12p40). Oligonucleotides
were designed to amplify a product
with a size of 51 bp, with a melting temperature
(Tm) of 58–60 °C. When the ovine

gene sequence was not known (Eotaxin, IL-
13), a consensus sequence was created,
based on a minimum of three known
sequences in other mammalian species. A
first primer pair was then designed using
Primer 3 Software in order to amplify the
largest possible mRNA in all aligned
sequences. PCR amplification on reverse
transcript RNA obtained from ovine
peripheral blood mononuclear cells (PBMC)
stimulated with concanavalin A (ConA,
10 µg/mL, 24 h in a 5% CO 2 and 37 °C
atmosphere) was then performed. Amplicons
were purified before cloning in the
TopoCloning system (Invitrogen) and
sequenced (using M13 universal primers).
The sequences thus obtained were then
compared with the GenBank database
using blast to validate the identity of the
amplified product. After validation, a new
set of primers suitable for quantitative PCR
was designed using the obtained sequence.
For IL-13, the primers used were those published
by Hein et al. [17].
2.3.3. Quantitative PCR
Quantitative PCR was performed on a
GeneAmp 5700 (Applied Biosystems),
using the double-stranded DNA binding
dye SYBR Green I. PCR products corresponding
to the different amplicons (see
Tab. I) of target cytokines were cloned in
PBR 2.1 plasmid (TopoClonA, Invitrogen)
and sequenced (M13 universal primers).
The plasmids harboring the cloned
sequence were then quantified by spectrometry
to establish the number of target
copy/µL. Ten-fold dilution series were prepared
from the stock plasmid solution corresponding
to 10 7 to 10 1 copies of the target
sequence. Serial dilution of the plasmid was
then used as an external standard, allowing
the determination of the number of copies
of the target cDNA in each assay. Each sample
for each investigated cytokine was performed
in duplicate. Ovine Beta-actin was
used as a housekeeping gene to normalize
expression between different samples. The
results obtained for each cytokine are
Th 2 response in H. contortus infected sheep 5
expressed as a ratio of the number of
cytokine mRNA copies/Beta-actin mRNA
copies. A non-template control reaction
(NTC) was included in each run. Finally,
the specificity of the amplification reaction
was assessed by acquisition of a dissociation
curve. Data was obtained by slowly
increasing the temperature of the PCR reaction
from 60 to 95 °C; denaturation of nonspecific
PCR products is followed by a
faster decrease of fluorescence than for specific
products. The melting profile of the
distinct PCR product was obtained by plotting
the first derivative (-dF/dT) of fluorescence
(F) versus temperature (T).
2.4. Detection of antibodies in mucus
and serum by indirect ELISA
A blood sample from each animal was
recovered just before euthanasia and centrifuged
for 5 min at 5 000 rpm. Serum was
then frozen at –20 °C until analysis. A
mucus sample from each animal was collected
during necropsy using PBS impregnated
filter paper strips of 4 cm 2 each
deposited between the folds of the abomasal
fundic mucosa for 5 min. The strips were
then gently agitated in 2 mL of PBS for 2 h
at room temperature to dilute the mucus.
The liquid was centrifuged and stored frozen
at –70 °C until analysis.
2.4.1. Worm antigen preparation
A donor sheep infected with 50 000 L 3
of H. contortus (Humeau strain) was sacrificed
and adult worms were harvested from
the abomasum. These worms were thoroughly
washed in PBS (pH 7.4) containing
penicillin (100 IU/mL) and streptomycin
(1 mg/mL). Fifty adult worms per milliliter
of the same buffer were maintained in a 5%
CO 2 atmosphere at 37 °C overnight. Next,
the supernatant (containing excretorysecretory
products) was collected, filtered
(0.2 µm) and stored at –70 °C until further
use. A crude extract of H. contortus L 3
(CEL 3 ) was prepared after three cycles of
freezing and thawing (–70 °C – +25 °C),

6 C. Lacroux et al.
Table III. Reagents and procedures used for antigen ELISA detection in serum and mucus.
homogenization at 4 °C and centrifugation
at 30 000 g for 30 min at 4 °C. The supernatant
was used as the crude extract of the
L 3 antigen. The protein concentration of
both antigenic preparations was determined
with the method of Lowry et al. [21].
2.4.2. Determination of optimal assay
conditions and the ELISA
technique
The optimal concentrations of ELISA
reagents and the optimal test conditions
were determined by chequerboard titrations
of H. contortus antigens, positive (group A
at 28 dpc) and negative (group C) reference
sera or mucus and specific conjugates
(Tab. III). An indirect ELISA was used on
serum and mucus samples, as described by
Jacquiet et al. [18]. The results are
expressed as optical densities (OD) for
serum and mucus IgG and IgA minus the
OD of PBS wells (corrected absorbance).
2.5. Histology
At necropsy, two tissue samples from the
fundic area of the abomasal wall were
taken; one was fixed in 10% formalin for
conventional histology and immunohisto-
Serum Mucus
Isotype IgG IgA IgG IgA
Type of antigen ESP Ad CEL3 ESP Ad CEL3 ESP Ad CEL3 ESP Ad CEL3
Concentration of antigen
(µg/mL)
2 2 5 2 5 0.5 5 2
Dilution of serum or
mucus
1:100 1:100 1:5 1:5 1:1 1:1 1:1 1:1
Dilution of secondary
antibody
1:1000 1:1000 1:100 1:100 1:1000 1:1000 1:250 1:250
Dilution of conjugate – – 1:500 1:500 – – 1:500 1:500
Type of antigens: ESP Ad: Excretory-secretory products from H. contortus adult worms; CEL 3: crude
extract of H. contortus infective third-stage larvae. For IgG determination, the secondary antibody is a
Donkey anti-sheep IgG HRP-conjugated. For IgA determination, an anti-IgA bovine / sheep mouse IgG 1
is first applied before a goat anti-mouse IgG1 HRP-conjugated.
chemistry (IHC), while the second was
stored at –70 °C for frozen IHC.
2.5.1. Conventional histology and IHC
with paraffin-embedded samples
Abomasal tissue was paraffin-embedded
and 3 µm sections were mounted on
glass slides. Eosinophils and globule leukocytes
were counted on haematoxylin-eosin
stained slides whereas mast cells were
counted after Giemsa staining. Immunohistochemistry
was performed using antibodies
already described for cell phenotyping
on paraffin-embedded tissues in sheep [2,
27, 36]. This antibody set allows specific
labeling of macrophages/monocytes
(mouse anti-human CD68 antibody, clone
Ki-M6, Serotec, Cergy-Saint-Christophe,
France, 1:150 dilution), B lymphocytes
(mouse anti-human CD20-like antibody,
clone BLA-36, Novocastra, Le-Perray-en-
Yvelines, France, 1:50 dilution), or T lymphocytes
(rabbit anti-human CD3 antibody,
A 0542, DAKO, 1:100 dilution).
2.5.2. IHC on frozen samples
Five µm sections of abomasal tissue
were obtained using a Leika cryomicrotome.
Slides were fixed for 20 min in a

–20 °C acetone bath before drying. Slides
were then directly processed for IHC. Monoclonal
antibodies directed against CD4
(mouse anti-ovine CD4, SEROTEC, reference
MCA2213, 1:2000 dilution), or CD8
(mouse anti-bovine CD8, SEROTEC, reference
MCA837G, 1:800 dilution) antigens
were used.
For each type, cells were counted on five
randomly selected fields at high magnification
(× 400). The results are expressed as
the sum of the five fields.
2.6. Statistical analysis
Comparisons between the three groups
(previously-infected, primary-infected and
uninfected control) and between the killing
times (3, 7, 15 and 28 dpc) within a group
were performed using the Kruskal-Wallis
and Mann-Whitney non parametric tests
(SYSTAT software). P < 0.05 was considered
significant. For the 81 observations in
this study, Spearman correlation coefficients
(r) were statistically significant when
r > 0.217 (P < 0.05) and r > 0.283 (P < 0.01).
3. RESULTS
3.1. Efficiency of experimental
H. contortus challenge
No worm or egg excretions were
observed in uninfected control animals
throughout the study (group C). All lambs
in groups A and B became infected after
challenge with establishment rates ranging
from 4% to 28%. Highly variable individual
worm counts were observed within each
group and there were no significant differences
between groups A and B (Tab. IV).
3.2. Cytokine mRNA transcription
in abomasal lymph node and
in fundic mucosa
A clear increase of IL-4 m-RNA transcription
was observed in the abomasal
Th 2 response in H. contortus infected sheep 7
lymph node and fundic mucosa of both
challenged groups but not in uninfected
control sheep (Figs. 1A and 1B). In the previously-infected
group, an over-expression
of IL-4 m-RNA was present as early as
3 dpc and remained significant and stable
until the end of the experiment. In the primary-infected
group, the IL-4 mRNA
increase was not observed before 7 dpc but
reached similar levels to previouslyinfected
animals at 15 dpc. In fundic
mucosa, IL-5 mRNA was higher (P < 0.05)
in challenged lambs (groups A and B) than
in uninfected control sheep at 7 dpc and 15
dpc (Fig. 1D). In the abomasal lymph node,
the increase of IL-5 m-RNA was observed
at 28 dpc only (data not shown). In fundic
mucosa, IL-13 mRNA was higher in both
challenged groups (A and B) than in uninfected
control sheep (Fig. 1C) as early as
7 dpc, while no differences were recorded
between the three groups in abomasal
lymph node (data not shown). In both investigated
tissues, no modifications of IL-3 or
Eotaxin mRNA transcription were observed
(data not shown). No significant group differences
were recorded in the IFN-γ
(Fig. 1E), IL-12 (Fig. 1F), IL-10 or TNF-α
mRNA transcription profile during the
whole experiment (data not shown). No
cytokine mRNA transcription profiles could
be directly correlated to the worm establishment
rate, worm development or female
fecundity.
3.3. Specific antibody detection
in abomasal mucus and serum
At 7 and 15 dpc, a significant (P < 0.05)
and specific CEL 3 IgA response (Fig. 2E)
was observed in the mucus of previouslyinfected
animals only. At 28 dpc, levels of
specific CEL 3 IgA in mucus were similar in
both infected groups and significantly
higher than in uninfected controls (P = 0.01).
In challenged groups, significant (P < 0.05)
systemic IgG and IgA and local antibody
responses against excretory-secretory products
(ESP) of adult worms were observed at
15 and 28 dpc (Figs. 2A, 2B, 2C and 2D). No

8 C. Lacroux et al.
Table IV. Egg excretion, total worm burden, length and number of eggs in utero of adult female worms, stage and sex composition of Haemonchus
contortus populations.
Adult
females
(%)
Adult
males
(%)
Immature
females
(%)
Immature
males
(%)
Late
L4
(%)
Early
L4
(%)
Number of
eggs in utero
(mean ± SD)
Adult female
length (mm)
(mean ± SD)
Total worm burden
(mean ± SD)
Epg at 28 dpc
(mean ± SD)
Epg at 21 dpc
Group
(mean ± SD)
Days post
challenge
3 A – – 438 ± 231 – – 100 – – – – –
B – – 1126 ± 500 – – 98.8 0.2 – – – –
7 A – – 1255 ± 1210 – – 71 29 – – – –
B – – 1183 ± 750 – – 22 78 – – – –
15 A – – 898 ± 940 – – 59.6 20 8 12.4 – –
B – – 955 ± 838 – – 33.3 18.7 16.5 30.6 0.4 0.5
28 A 86 ± 197 1149 ± 2845 2169 ± 1950 15.9 ± 2.1 174 ± 160.6 8 8 11.3 20.3 29.4 23
B 870 ± 2272 6165 ± 7485 2814 ± 2650 17.7 ± 2.7 275.4 ± 154.3 8.9 4.6 11.7 12.5 25.6 36.7
Group A: previously-infected and challenged sheep; Group B: primary-infected sheep. Six animals per group were sacrificed at 3, 7 and 15 days post challenge
(dpc), and 11 and 10 sheep at 28 dpc for groups A and B respectively. Coprological examinations were performed at 21 and 28 dpc for sheep sacrificed
at 28 dpc.

Th 2 response in H. contortus infected sheep 9
Figure 1. Th 1 /Th 2 cytokine mRNA transcription in the abomasal lymph node (ALN) and in the fundic
mucosa (AFM) from previously-infected, primary-infected and uninfected control sheep. IL-4
mRNA (A: in ALN and B: in AFM), IL-13 mRNA in AFM (C), IL-5 mRNA in AFM (D), IFN-γ
in ALN (E) and IL-12 in ALN (F) were quantified and measured in each duplicate sample using an
external standard. The results are expressed after normalisation (ratio) with a housekeeping gene
(ovine Beta-actin) (means and SD). a, b, c Values with no letter in common are significantly different
(P < 0.05).

10 C. Lacroux et al.
Figure 2. Local and systemic IgG and IgA responses to parasite (excretory-secretory products (ESP)
of H. contortus adult worms or crude extract of L 3 (CEL 3 )) antigens, in previously-infected, primaryinfected
and uninfected control sheep. A: Total mucus IgG against ESP; B: Total systemic IgG
against ESP, C: Mucus IgA against ESP; D: Systemic IgA against ESP, E: Mucus IgA against CEL 3,
F: Systemic IgA against CEL 3 (means and SD). a, b, c Values with no letter in common are significantly
different (P < 0.05).

significant systemic CEL 3 specific IgA
(Fig. 2F) or IgG (data not shown) response
was observed during the study. Concentrations
of mucus ESP or CEL 3 specific IgA
or IgG antibodies were significantly correlated
with those found in the serum (ESP
specific IgG (r = 0.606, P < 0.01), ESP specific
IgA (r = 0.494, P < 0.01) and CEL 3
specific IgA (r = 0.586, P < 0.01)).
3.4. Dynamics of the cellular abomasal
infiltration
In the abomasal mucosa of previouslyinfected
sheep, eosinophils, mast cells and
globule leucocytes were already present in
significantly higher numbers than in primary-infected
or uninfected control sheep
(P < 0.01) at 3 or 7 dpc. In both challenged
groups, a gradual increase of these cell populations
was observed between 7 and 28 dpc.
However, the cellular recruitment was
delayed in the primary-infected group when
compared to the previously-infected one.
Eosinophil counts were higher in primaryinfected
animals than those of uninfected
control animals at 7 dpc, at 15 dpc for mast
cells and at 28 dpc for globule leukocytes.
At the end of the experiment (28 dpc), similar
mucosal infiltrations (three cell types)
were observed in previously-infected and
primary-infected sheep (Figs. 3A, 3B and
3C). Significant correlations were established
between mucosal IL-4 mRNA transcription
level and recruitment of (i)
eosinophils, mast cells and globule leucocytes
at 3 and 7 dpc (P < 0.01), and (ii) mast
cells and globule leucocytes at 15 dpc (P <
0.05). These correlations strongly suggest a
relation between the Th 2-cytokine level
response and intensity and the rapidity of
mucosal cellular infiltration. Concerning
CD3+-T cells, BLA 36+-B cells, and
CD68+-monocyte/macrophage cells, no
significant differences between group A, B
and C animals were observed (data not
shown). The CD4+/CD8+ ratio (approximately
3:1) remained similar among the
three groups and stable during the course of
the experiment (data not shown).
Th 2 response in H. contortus infected sheep 11
Figure 3. Cellular infiltration in the abomasal
mucosa (fundus): mast cells (A), globule leukocytes
(B) and eosinophils (C), in previouslyinfected,
primary-infected and uninfected control
sheep (means and SD). For each cell type,
the evaluation of cell number was performed on
five randomly selected fields at high magnification
(× 400). The results are expressed as the
sum of five fields. a, b, c Values with no letter in
common are significantly different (P < 0.05).
3.5. Impact of immune responses
on parasite populations
3.5.1. Similar total worm burdens
in previously-infected and
primary-infected lambs
No significant difference in the total
worm burden was observed between

12 C. Lacroux et al.
Table V. Correlations between abomasal eosinophils, mast cells or globule leukocytes and worm
parameters 28 days post challenge.
previously-infected and primary-infected
sheep. Total worm burdens were not significantly
correlated with antibody responses,
or with eosinophils, mast cells or globule
leukocytes (Tab. V).
3.5.2. Delayed worm development
At 3 and 7 dpc, only fourth-stage larvae
(L 4 ) were observed in the challenged animals.
Both early and late stage L 4 were
observed at 7 dpc in groups A and B but the
relative proportion of late L 4 was significantly
(P < 0.01) increased in group B
(78%) compared to group A (29%). Similarly,
the mean ratio of immature worms/L 4
was 0.9 in primary-infected sheep and only
0.25 in previously-infected sheep (P < 0.01)
at 15 dpc and several lambs from the primary-infected
group already harbored adult
worms while none were observed in the previously-infected
group. At 28 dpc, the percentage
of adult worms was higher in the
primary-infected animals than in the previously-infected
animals (Tab. IV). Taken
together, these results suggest a delayed
development of the parasite in previouslyinfected
animals. The retarded development
of early L 4 to late L 4 was associated
with high eosinophil numbers in mucosa
(7 dpc, r = 0.661, P < 0.01) and with
increased IgA in the mucosa, both CEL 3
(r = 0.553, P < 0.01, at 7 dpc and r = 0.881,
Eosinophils Mast cells Globule leukocytes
% L 4 worms 0.308 0.189 0.019
% Immature worms 0.431* 0.439* 0.297
% Adults worms –0.413* –0.332 –0.170
Total worm burden –0.086 –0.102 –0.129
Adult female length –0.589** –0.508** –0.676**
Number of eggs in utero of adult females –0.477** –0.486** –0.592**
Fecal egg output –0.378* –0.402* –0.369*
* P < 0.05 and ** P < 0.01.
P < 0.01 at 15 dpc) and ESP specific (r =
0.712, P < 0.01 at 15 dpc). In the late phase
of the experiment (28 dpc), eosinophils and
mast cell populations were positively correlated
with the proportion of immature
worms. Eosinophil counts were also negatively
correlated with the proportion of
adult worms (Tab. V). Systemic ESP specific
IgG response and mucosal CEL 3 specific
IgA response were correlated with the
proportion of immature worms (respectively
r = 0.42, P < 0.05 and r = 0.59, P < 0.01).
3.5.3. Reduced female worm length
and number of eggs in utero
In previously-infected sheep, adult females
were shorter than in the primary-infected
group (15.9 ± 2.1 mm versus 17.7 ±
2.7 mm) and contained fewer eggs in their
uterus (174 ± 160.6 versus 275.4 ± 154.3 eggs
per female) but the differences were not significant.
Worm length and number of eggs
in the uterus were highly correlated (r = 0.847).
Increased eosinophils, mast cells and globule
leukocyte populations were negatively
correlated with the female worm length and
the in utero egg numbers (P < 0.01)
(Tab. V). Mucus CEL 3 specific IgA and
systemic ESP specific IgG levels were correlated
with the reduction of female worm
length (respectively r = –0.36, P < 0.05 and
r = –0.59, P < 0.01) (Tab. III).

3.5.4. Reduced fecal egg output
At 28 dpc, the number of egg-excreting
animals was the following: 8 of group A
(90 to 9 650 epg) and 9 of group B (300 to
25 000 epg). Despite the variability between
sheep, egg excretions were significantly
different between the two groups (P < 0.05)
with a seven-fold reduction in group A
compared to group B. Eosinophils, mast
cells and globule leukocyte numbers as well
as the systemic IgG response against ESP
of adult worms (r = –0.47, P < 0.05) were
negatively correlated with the intensity of
egg excretion in individual sheep (Tab. V).
4. DISCUSSION
The main objectives of this work were (i)
to establish the polarization of the adaptative
immune response in H. contortus
infected sheep, (ii) to describe the kinetics
of immune effector mechanisms following
a single H. contortus infection in primaryinfected
or previously-infected sheep and
(iii) to study the effects of these responses
on parasite establishment, development
and females fecundity.
Few data were available on the orientation
of the immune response in H. contortus
challenged sheep. In a preliminary study
using semi quantitative PCR, Schallig [31]
observed a non-protective Th 1 response in
primary-infected H. contortus infected sheep.
A second challenge induced a protective
Th 2 response with a high level of IL-4
mRNA expression without significant IL-5
over-expression. However, these results
were obtained with a limited number of
sheep. In our experiment, neither primaryinfected
nor previously-infected H. contortus
infected sheep showed a Th 1 cytokine
pattern. In contrast, a clear over transcription
of the IL-4 gene was observed in the
abomasal lymph node and in the mucosa in
both primary-infected and previouslyinfected
lambs. Furthermore, specific IgG
and IgA antibody responses in mucus and
Th 2 response in H. contortus infected sheep 13
serum and higher mucosal recruitment of
eosinophils, mast cells and globule leukocytes
were observed in these two groups.
Taken together, IL-4 mRNA over-transcription
and immunoglobulin production/
cell recruitment strongly support a Th 2 orientation
of the immune response in lambs
challenged with H. contortus [4]. In the
present study, the over-expression of IL-5
and IL-13 in infected animals also suggested
the Th 2 polarization. Recently, Pernthaner
et al. [25] described an increased
expression of Th 2 related cytokines, IL-5
and IL-13 (but not IL-4), in intestinal lymph
cells of sheep selected for enhanced resistance
to T. colubriformis. Data collected in
these two nematode models support the
hypothesis of a Th 2 orientation in sheep, as
reported in rodent [6, 14] or in human [11]
gastro-intestinal nematode infections.
The second objective of our study was to
investigate the dynamics of the adaptative
immune response after a single H. contortus
infection. Repetitive or continuous infections
are usually used to study the host
immune response and to mimic natural
infections as well as possible [1, 5, 7]. Nevertheless,
single H. contortus infections
were necessary in our experiment which
was mainly designed to measure host
immune response effects on worm development.
IL-4 mRNA expression increased
gradually from 7 dpc to 28 dpc in primaryinfected
sheep but remained stable and high
in previously-infected sheep from 3 to
28 dpc. Eosinophil, mast cell, and globule
leukocyte recruitments were apparent at 7,
15 and 28 dpc respectively in primaryinfected
animals while these cells were still
present in previously-infected lambs at 3 dpc.
Antibody responses were delayed and low
in primary-infected lambs and rapid and
higher in previously-infected ones as previously
shown by Schallig et al. [30] and
Gomez-Munoz et al. [16]. Consequently,
while final response intensities were similar
in both infected groups, recruitment of
cells and secretion of immunoglobulins in
previously-infected sheep were observed
before their occurrence in primary-infected

14 C. Lacroux et al.
sheep. This difference could be explained
by (i) a rapid mobilization of immune
mechanisms after challenge in group A
compared to group B or from (ii) the presence
of remaining cells and antibodies
induced by the first infection. Unfortunately,
our experimental design did not
allow to state between these two hypotheses.
Interestingly, this earlier mobilization
of the immune effectors was associated
with significant higher IL-4 mRNA levels
at 3 dpc in previously-infected sheep.
No differences in the establishment rates
of worms were observed between previously-infected
and primary-infected lambs
in this experiment. Our data provide evidence
that the parasite development and the
female fecundity were depressed in previously-infected
animals compared to primary-infected
ones. This delay in parasite
development has been shown after repeated
exposure of lambs to H. contortus [30] or
T. circumcincta [32]. Here we established
that alterations of parasite life traits (development
of worm and female fecundity) are
related to the earliness of effector mobilization
rather than to the final level of the
responses. Eosinophils, mast cells and
globule leucocyte recruitment are typically
associated with helminth infections [3]. In
our study, these cells were strongly and
negatively correlated with adult female
length and number of eggs in utero. Moreover,
positive correlations were also observed
between mast cell and eosinophil numbers
and the relative proportion of immature
worms while a strong negative correlation
was seen between eosinophils and the proportion
of adult worms (Tab. V). Thus,
these cells may have a role in the delayed
development of the parasite and the decrease
of fecal egg output as previously shown by
many authors [4, 12, 34]. In the present
study, two antibody responses (CEL 3 specific
IgA response in abomasal mucus and
ESP specific IgG in serum) were positively
correlated to the proportion of immature
worms and negatively correlated to the
female length and number of eggs in utero
suggesting that they could interfere with
H. contortus development within the host.
The importance of the local IgA response in
host protection has already been indicated
in T. circumcincta infected sheep, where
the production of local IgA against somatic
or L 4 ESP molecules induced a reduction in
the female parasite length and fecundity [32].
ACKNOWLEDGEMENTS
We are very grateful to Gilles Aumont,
Getachew Terefe and Mike Stear for their valuable
contributions to the present manuscript. We
are very indebted to the technical staff of La Sapinière
INRA experimental station (INRA,
Department of Animal Genetics) for rearing and
providing INRA 401 lambs. This work was supported
by the FEOGA program (Région Centre)
“Résistance génétique aux nématodes”.
REFERENCES
[1] Adams D.B., Infection with Haemonchus
contortus in sheep and the role of adaptive
immunity in selection of the parasite, Int. J.
Parasitol. 18 (1988) 1071–1075.
[2] Andreoletti O., Berthon P., Levavasseur E.,
Marc D., Lantier F., Monks E., Elsen J.M.,
Schelcher F., Phenotyping of protein-prion
(PrPsc)-accumulating cells in lymphoid and
neural tissues of naturally scrapie-affected
sheep by double-labeling immunohistochemistry,
J. Histochem. Cytochem. 50 (2002)
1357–1370.
[3] Balic A., Bowles V.M., Meeusen E.N., Cellular
profiles in the abomasal mucosa and lymph
node during primary infection with Haemonchus
contortus in sheep, Vet. Immunol.
Immunopathol. 75 (2000) 109–120.
[4] Balic A., Bowles V.M., Meeusen E.N., The
immunobiology of gastrointestinal nematode
infections in ruminants, Adv. Parasitol. 45
(2000) 181–241.
[5] Balic A., Bowles V.M., Meeusen E.N., Mechanisms
of immunity to Haemonchus contortus
infection in sheep, Parasite Immunol. 24
(2002) 39–46.
[6] Bancroft A.J., Grencis R.K., Th1 and Th2
cells and immunity to intestinal helminths,
Chem. Immunol. 71 (1998) 192–208.
[7] Barger I.A., Le Jambre L.F., Georgi J.R., Davies
H.I., Regulation of Haemonchus contortus

populations in sheep exposed to continuous
infection, Int. J. Parasitol. 15 (1985) 529–533.
[8] Bendixsen T., Emery D.L., Jones W.O., The
sensitization of mucosal mast cells during
infections with Trichostrongylus colubriformis
or Haemonchus contortus in sheep, Int. J.
Parasitol. 25 (1995) 741–748.
[9] Brown W.C., Rice-Ficht A.C., Estes D.M.,
Bovine type 1 and type 2 responses, Vet.
Immunol. Immunopathol. 63 (1998) 45–55.
[10] Coadwell W.J., Ward P.F., Observations on
the development of Haemonchus contortus in
young sheep given a single infection, Parasitology
71 (1975) 505–515.
[11] Cooper P.J., Chico M.E., Sandoval C., Espinel
I., Guevara A., Kennedy M.W., Urban J.F. Jr.,
Griffin G.E., Nutman T.B., Human infection
with Ascaris lumbricoides is associated with
a polarized cytokine response, J. Infect. Dis.
182 (2000) 1207–1213.
[12] Dawkins H.J., Windon R.G., Eagleson G.K.,
Eosinophil responses in sheep selected for
high and low responsiveness to Trichostrongylus
colubriformis, Int. J. Parasitol. 19
(1989) 199–205.
[13] Else K.J., Finkelman F.D., Intestinal nematode
parasites, cytokines and effector mechanisms,
Int. J. Parasitol. 28 (1998) 1145–1158.
[14] Finkelman F.D., Shea-Donohue T., Goldhill
J., Sullivan C.A., Morris S.C., Madden K.B.,
Gause W.C., Urban J.F. Jr., Cytokine regulation
of host defense against parasitic gastrointestinal
nematodes: lessons from studies with
rodent models, Annu. Rev. Immunol. 15
(1997) 505–533.
[15] Gill H.S., Altmann K., Cross M.L., Husband
A.J., Induction of T helper 1- and T helper 2type
immune responses during Haemonchus
contortus infection in sheep, Immunology 99
(2000) 458–463.
[16] Gomez-Munoz M.T., Cuquerella M., Gomez-
Iglesias L.A., Mendez S., Fernandez-Perez
F.J., de la Fuente C., Alunda J.M., Serum
antibody response of Castellana sheep to
Haemonchus contortus infection and challenge:
relationship to abomasal worm burdens, Vet.
Parasitol. 81 (1999) 281–293.
[17] Hein W.R., Barber T., Cole S.A., Morrison L.,
Pernthaner A., Long-term collection and characterization
of afferent lymph from the ovine
small intestine, J. Immunol. Methods 290
(2004) 153–168.
[18] Jacquiet P., Ngoc T.T.T., Nouvel X., Prévot F.,
Grisez C., Yacob H.T., Bergeaud J.P., Hoste
H., Dorchies P., Tabouret G., Regulation of
Oestrus ovis (Diptera: Oestridae) populations
in previously exposed and naïve sheep, Vet.
Immunol. Immunopathol. 105 (2005) 95–103.
Th 2 response in H. contortus infected sheep 15
[19] Kloosterman A., Albers G.A., Van den Brink
R., Counting eggs in utero of individual female
worms, Vet. Parasitol. 4 (1978) 353–368.
[20] Knox D.P., Redmond D.L., Newlands G.F.,
Skuce P.J., Pettit D., Smith W.D., The nature
and prospects for gut membrane proteins as
vaccine candidates for Haemonchus contortus
and other ruminant trichostrongyloids, Int. J.
Parasitol. 33 (2003) 1129–1137.
[21] Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L.,
Randall R.J., Protein measurement with the
Folin phenol reagent, J. Biol. Chem. 193
(1951) 265–275.
[22] Miller J.E., Bahirathan M., Lemarie S.L.,
Hembry F.G., Kearney M.T., Barras S.R.,
Epidemiology of gastrointestinal nematode
parasitism in Suffolk and Gulf Coast Native
sheep with special emphasis on relative susceptibility
to Haemonchus contortus infection,
Vet. Parasitol. 74 (1998) 55–74.
[23] Onah D.N., Nawa Y., Mucosal immunity
against parasitic gastrointestinal nematodes,
Korean J. Parasitol. 38 (2000) 209–236.
[24] Pernthaner A., Vlassoff A., Douch P.G.,
Maass D.R., Cytokine mRNA and IFN-γ production
in nematode resistant and susceptible
line lambs artificially infected with gastrointestinal
nematodes, Acta Parasitol. 42
(1997) 55–61.
[25] Pernthaner A., Cole S.A., Morrison L., Hein
W.R., Increased expression of interleukin-5
(IL-5), IL-13, and tumor necrosis factor alpha
genes in intestinal lymph cells of sheep
selected for enhanced resistance to nematodes
during infection with Trichostrongylus colubriformis,
Infect. Immun. 73 (2005) 2175–
2183.
[26] Quinnell R.J., Pritchard D.I., Raiko A., Brown
A.P., Shaw M.A., Immune responses in
human necatoriasis: association between
interleukin-5 responses and resistance to reinfection,
J. Infect. Dis. 190 (2004) 430–438.
[27] Ramos-Vara J.A., Miller M.A., Lopez E.,
Prats N., Brevik L., Reactivity of polyclonal
human CD3 antiserum in lymphoid tissues of
cattle, sheep, goats, rats and mice, Am. J. Vet.
Res. 55 (1994) 63–66.
[28] Raynaud J.P., Étude de l’efficacité d’une technique
de coproscopie quantitative pour le
diagnostic de routine et le contrôle des infestations
parasitaires des bovins, ovins, équins
et porcins, Ann. Parasitol. Hum. Comp. 45
(1970) 321–342.
[29] Sangster N.C., Anthelmintic resistance: past,
present and future, Int. J. Parasitol. 29 (1999)
115–124.
[30] Schallig H.D., van Leeuwen M.A., Hendrikx
W.M., Isotype-specific serum antibody

16 C. Lacroux et al.
responses of sheep to Haemonchus contortus
antigens, Vet. Parasitol. 56 (1995) 149–162.
[31] Schallig H.D., Immunological responses of
sheep to Haemonchus contortus, Parasitology
120 Suppl. (2000) S63–S72.
[32] Stear M.J., Bishop S.C., Doligalska M., Duncan
J.L., Holmes P.H., Irvine J., McCririe L.,
McKellar Q.A., Sinski E., Murray M., Regulation
of egg production, worm burden, worm
length and worm fecundity by host responses
in sheep infected with Ostertagia circumcincta,
Parasite Immunol. 17 (1995) 643–652.
[33] Tembely S., Lahlou-kassi A., Rege J.E.,
Sovani S., Diedhiou M.L., Baker R.L., The
epidemiology of nematode infections in sheep
in a cool tropical environment, Vet. Parasitol.
70 (1997) 129–141.
[34] Terefe G., Yacob H.T., Grisez C., Prevot F.,
Dumas E., Bergeaud J.P., Dorchies Ph., Hoste
H., Jacquiet P., Haemonchus contortus egg
excretion and female length reduction in
sheep previously infected with Oestrus ovis
To access this journal online:
www.edpsciences.org
(Diptera: Oestridae) larvae, Vet. Parasitol.
128 (2005) 271–283.
[35] Urban J.F. Jr., Madden K.B., Svetic A.,
Cheever A., Trotta P.P., Gause W.C., Katona
I.M., Finkelman F.D., The importance of Th2
cytokines in protective immunity to nematodes,
Immunol. Rev. 127 (1992) 205–220.
[36] Valentine B.A., McDonough S.P., B-cell
leukemia in a sheep, Vet. Pathol. 40 (2003)
117–119.
[37] Waller P.J., Rudby-Martin L., Ljungstrom
B.L., Rydzik A., The epidemiology of abomasal
nematodes of sheep in Sweden, with particular
reference to over-winter survival strategies,
Vet. Parasitol. 122 (2004) 207–220.
[38] Woolaston R.R., Baker R.L., Prospects of
breeding small ruminants for resistance to
internal parasites, Int. J. Parasitol. 26 (1996)
845–855.
[39] Wolstenholme A.J., Fairweather I., Prichard
R., von Samson-Himmelstjerna G., Sangster
N.C., Drug resistance in veterinary helminths,
Trends Parasitol. 20 (2004) 469–476.

Résultats
Annexe à l’article « Haemonchus contortus (Nematoda :
Trichostrongylidae) infection in lambs elicits an unequivocal Th2
immune response »
Dans un souci de concision et afin de ne pas surcharger cette publication, certaines données
ont été retirées du manuscrit. Toutefois, il nous a paru intéressant de les présenter en annexe.
*Mesure de la lymphoprolifération des lymphocytes sanguins et des lymphocytes isolés
du nœud lymphatique abomasal :
Les lymphocytes sanguins et les lymphocytes du nœud lymphatique abomasal ont été isolés,
mis en culture et stimulés selon les techniques décrites dans la section « Matériel et
Méthodes ».
Pour les lymphocytes isolés du sang total, aucune différence significative de
lymphoprolifération n’a pu être mise en évidence entre les trois lots expérimentaux aux
différentes dates d’étude en raison d’une variabilité individuelle importante (Figure n°19).
% de lymphoprolifération / lymphocytes non
stimulés
25
20
15
10
5
0
-5
3 dpc 7 dpc 15 dpc 28 dpc
Lot A
Lot B
Lot C
Figure n°19 : Lymphoprolifération des lymphocytes sanguins suite à une stimulation par les
produits d’excrétion-sécrétion d’H. contortus adultes(10 µg/ml).
Pour les lymphocytes isolés du nœud lymphatique abomasal, les lymphoproliférations
observées sont totalement différentes entre 3 et 7 jours post-challenge (dpc) : aucun signal
n’est détecté à 3 dpc alors qu’un pic est observé à 7 dpc chez les animaux des lots A et B
127

Résultats
(animaux primo-infestés et animaux naïfs). La lymphoprolifération à 7 dpc est
significativement différente entre les trois lots (P < 0.05). Celle-ci diminue ensuite à 15 dpc et
28 dpc et à ces dates, aucune différence statistique entre les trois lots expérimentaux n’est
notée (Figure n°20).
% de lymphoprolifération / lymphocytes non
stimulés
20
15
10
5
0
-5
3 dpc 7 dpc 15 dpc 28 dpc
Lot A
Lot B
Lot C
Figure n°20 : Lymphoprolifération des lymphocytes du nœud lymphatique abomasal suite à
une stimulation par les produits d’excrétion-sécrétion d’H. contortus adultes(20 µg/ml).
L’expansion clonale des lymphocytes T spécifiques des produits d’excrétion-sécrétion des
vers adultes est donc limitée dans le temps (J7) et en intensité (+12% en moyenne pour les
animaux lors de la seconde infestation). Des réponses limitées dans le temps (une semaine
après infestation) ont également été retrouvées par McClure et al. (1998).
*Analyse statistique discriminante :
L’analyse statistique discriminante permet d’obtenir une représentation graphique (cercle) de
la corrélation entre les différentes variables étudiées, grâce à la détermination de deux axes
discriminants qui sont une combinaison linéaire de l’ensemble de ces variables quantitatives.
Ces deux combinaisons linéaires sont choisies pour permettre la meilleure discrimination
entre les groupes expérimentaux : variabilité maximale entre les groupes et variabilité
minimale au sein d’un groupe donné.
a
b
c
128

Résultats
Les corrélations entre les variables sont représentées sur un cercle : les variables positivement
corrélées entre elles occupent une position proche sur le cercle, alors que des variables
négativement corrélées sont situées sur les côtés opposés du cercle.
Dans notre étude, le cercle de corrélation obtenu par analyse discriminante a permis :
Axis 1 (72% inertia)
- de déterminer les variables ayant un poids réel dans l’analyse (variables
discriminantes) : à elles seules, ces variables permettent d’expliquer une grande
partie de la variation entre les trois groupes expérimentaux. Elles sont représentées
par un triangle noir et une police en gras sur le schéma (Figure n°21).
- d’observer les corrélations entre ces différentes variables quantitatives. Les
données obtenues confirmaient celles issues des corrélations effectuées par le test
de Spearman.
IL-10
Eotaxin
IFN-γ
IL-3
IL-12
TNF-α
IL-13
Axis 2 (28% inertia)
0
Epg21
IL-5
Feotaxin
AdF
Epg28 Macrophages
Globule Leukocytes FIL-5
Ab2
Mast cells Ab3
FIL-3 Bcells
Ab1 Ab6
Eosinophils Tcells Ab7 CD4
FIL-4
Ab4
Lymphocytes proliferation
ImF CD8
Ab5 Length
El4 FIL-13
Ll4 AdM
ImM Eggs IL-4 Worms
Figure n°21 : Cercle de corrélation obtenu par analyse statistique discriminante.
L’analyse discriminante permet de résumer les principales observations de l’étude. La
combinaison linéaire des variables sur les deux axes discriminants est plus efficace pour
différencier les trois groupes expérimentaux que n’importe quelle variable quantitative
129

Résultats
étudiée prise isolément (Pseudo-F = 174.54 alors que le plus grand des F de variable isolée
n’est que de 17.45).
La présence des vers est positivement corrélée à une augmentation de l’expression des gènes
de l’IL-4 et de l’IL-5 dans la muqueuse abomasale et le nœud lymphatique abomasal, ce qui
confirme que l’infestation par H. contortus est associée à une réponse immunitaire de type
Th2. La présence des vers est également positivement corrélée au recrutement de mastocytes,
globule leucocytes et polynucléaires éosinophiles dans la muqueuse abomasale, et à des
réponses IgA et IgG locales et systémiques. En revanche, il est intéressant de noter que
l’expression des cytokines de type Th1 et pro-inflammatoires (IL-12, IFN-γ et TNF-α) est en
opposition avec la majorité des autres variables sur le cercle et en particulier, avec les
paramètres parasitologiques.
130

Article II : Immune responses in lambs infected with
Trichostrongylus colubriformis
Caroline LACROUX a , Françoise PREVOT a , Christelle GRISEZ a , Olivier
Résultats
ANDREOLETTI a , Jean-Paul BERGEAUD a , Jacques CORTE b , Christine SAUVE b ,
Lucas GRUNER b , Jean-Claude BRUNEL c , Dominique FRANCOIS d , Philippe
DORCHIES a and Philippe JACQUIET a*
a – UMR INRA-ENVT 1225 Interactions Hôtes Agents Pathogènes – Ecole Nationale
Vétérinaire de Toulouse – 23, chemin des Capelles – 31076 Toulouse Cedex 03, France
b – INRA, Ecologie et Génétique des Parasites, BioAgresseurs Santé et Environnement –
37880 Nouzilly, France
c – INRA, Domaine Expérimental de la Sapinière, 18390 Osmoy, France
d – INRA, Station d’Amélioration Génétique des Animaux , BP 27, 31 326 Castanet-Tolosan,
France
*Corresponding author : P. Jacquiet (p.jacquiet@envt.fr)
Tel : (33) 5 61 19 39 67 ; Fax : (33) 5 61 19 39 44
Submitted to Veterinary Parasitology
131

Abstract
Résultats
The sheep immune response towards gastro-intestinal nematodes has became of great
importance in the current context of extensive resistances to anthelmintic molecules in
parasite populations and the need of alternative strategies such as vaccination or selective
breeding for resistance. In this study, 3 month old INRA 401 lambs (n=79) were randomly
allocated into three groups: uninfected control, challenged either once (primary-infected
animals) or twice (previously-infected animals) with 10,000 Trichostrongylus colubriformis
L3. Uninfected control and once and twice challenged animals were sequentially sacrificed at
4, 10, 17 and 28 days post challenge. No clear polarization of the adaptive immune response
was detected in infected lambs. Nevertheless, delayed cellular and humoral responses
corresponding to well-known described Th2-type effectors were observed in previously-
infected sheep and were strongly correlated to a significant decrease in faecal egg excretion.
No differences in worms’ establishment or worms’ development were noticed between the
two challenged groups. We conclude that two successive exposures to this parasite are
probably not sufficient to induce an unequivocal and detectable Th2 cytokine response in
young lambs but that the effect of this response could limit the larval burden on pastures by
decreasing the faecal egg output.
Keywords : Trichostrongylus colubriformis / sheep / immune response / real-time
quantitative PCR / antibody response
132

1. INTRODUCTION
Résultats
Due to the emergence of anthelmintic resistance in parasite populations (Sangster,
1999 ; Jackson and Coop, 2000) and increased public concern about chemical residues in
animal products, the knowledge of immune mechanisms involved in gastrointestinal
helminthic infections has become of crucial importance for their control in sheep. The
characterization of the underlying immune response to parasitic infections is also a
prerequisite for the development of alternative and effective control strategies such as
vaccination or selective breeding for resistance.
Immune response to gastrointestinal nematodes has been extensively studied in
rodents models where protective immunity against these parasites is dependent on the
activation of CD4+ T helper cells, and on the Th2 polarization of the immune response (Urban
et al., 1992 ; Finkelman et al., 1997 ; Else and Finkelman, 1998). Similar features are also
encountered in natural human nematode gut infections (Cooper et al., 2000 ; Quinnell et al.,
2004). In sheep, the nature of the immune response towards gastrointestinal helminths, like
the existence of a true Th1/Th2 dichotomy, were discussed (Brown et al., 1998 ; Gill et al.,
2000). In a previous study, we have shown that 5-6 months old INRA 401 lambs developed
an unequivocal Th2 immune response following an experimental H. contortus infection. This
response was characterized by high levels of Th2 cytokines mRNA transcription (IL-4, IL-5
and IL-13), and a rapid and intense mobilization of cellular (mast cells, eosinophils and
globule leukocytes) and humoral Th2 effectors (Lacroux et al., 2006). The intensities of these
immune effectors were negatively correlated to the development of worms, the size and the
fecundity of females and to the egg excretion (Lacroux et al., 2006). However, data
concerning the polarization of the immune response in Trichostrongylus colubriformis
infections in sheep are more conflicting and most of them are coming from infections in
133

Résultats
divergent sheep lines, selected for their enhanced or decreased resistance to T. colubriformis
(Pernthaner et al., 1997 ; 2005). The latter study concluded for a Th2-like orientation of the
immune response, as indicated by the over-expression of IL-5 and IL-13 by efferent intestinal
lymph cells, but without IL-4-detected over-transcription (Pernthaner et al., 2005). As these
studies were performed using selected sheep lines and a reduced number of animals, without
control of the immunization (two years-old animals or more, kept on pasture with multiple
infections), results cannot be extended to fully susceptible sheep exposed for the first time to
the parasite.
Therefore, in this experiment, young INRA 401 lambs bred in controlled worm-free
conditions were submitted to one or two successive mono-specific challenges with T.
colubriformis separated by anthelmintic treatment. The in vivo polarization of the immune
response and kinetics of immune-associated humoral and cellular effectors were investigated.
In the meanwhile, the effects of the immune response on nematode populations life-traits
were characterized.
134

2. MATERIAL AND METHODS
2.1. Experimental design
2.1.1. Animals
Résultats
Seventy-nine 3 month old female INRA 401 lambs were randomly allocated in three
experimental groups (Table 1) : Group A : previously-infected, anthelmintic-treated and then
challenged sheep (n=27), Group B : primary-infected sheep (n=28), and Group C : uninfected
control sheep (n=24). All sheep were born, reared and maintained worm-free in three separate
pens before the experiments. Limited infections with coccidia occurred in all groups despite
diclazuril treatments (Vecoxan, Janssen-Cilag, 1 mg/kg BW) before the experiment start, but
no clinical coccidiosis signs were observed. Lambs received granulated feed adapted to their
age, as well as forage and tap water ad libitum. Animals were cared following European
Union recommendations for animal welfare and under the supervision of the local INRA
ethics committee.
2.1.2. Experimental infections and necropsies
Lambs of group A (previously-infected) were orally infected with 10,000 T.
colubriformis third-stage larvae (L3) of Weybridge strain (kindly provided by L. Gruner,
INRA BASE Tours-Nouzilly) 35 days before challenge. All lambs were treated with an oral
administration of Levamisole (7.5 mg/kg) at day –7. Lambs of group A (previously-infected)
and B (primary-infected) were then orally infected with 10,000 T. colubriformis L3 at day 0.
Six animals of each group were humanely killed at 4, 10, 17 days post challenge (dpc) by
exsanguination following intravenous injection of 10 mg/kg pentobarbital sodium. At day 28,
nine lambs from group A, ten lambs of group B and six lambs form group C were killed.
Necropsy days were chosen to conform with the expected development of the parasite within
the host (Soulsby, 1982).
135

2.2. Parasitological measurements
Résultats
Faecal samples were taken on all sheep killed on days 17 and 28 after the start of
experiment to measure the nematode egg excretion. Faecal egg counts were performed using
the modified MacMaster technique (Raynaud, 1970). After necropsies, the contents and
washing of the first five meters of duodenum were collected and passed through a 40 µm
sieve to eliminate coarse materials. The duodenum segment was digested in pepsin-
hydrochloric acid solution (37°C, 6 h) to collect the tissue dwelling nematode stages. The
contents, washings and digested materials were preserved in absolute alcohol. The volumes of
these materials were then adjusted to 1L and worms were counted in a 10% aliquot and
classified as adult male or female, immature male or female, or L4.
2.3. mRNA cytokine transcription in duodenal mesenteric lymph node and duodenal
mucosa
2.3.1. mRNA extraction and RT-PCR
About 300 mg of the duodenal mesenteric lymph node or duodenal mucosa were snap
frozen in 1 mL of Trizol Reagent (Invitrogen, reference 15596-018), and stored at –70°C
before use. Samples were homogenized using a Hybaid RiboLyser TM (two cycles of 30s each
at a speed of 4.5). Fifty µL of the obtained homogenate was mixed with 950 µL of Trizol
before adding 200 µL of chloroform at room temperature for 10 min. Samples were then
centrifuged for 15 min at 20,000g at 4°C. Supernatants were placed on a RNeasy Column
(Rneasy Mini Kit, Qiagen, reference 74106) and then processed using the Qiagen protocol for
RNA clean-up. That complete protocol allows the recovery of highly pure RNA. The RNA
concentration was measured by spectrophotometry at OD260 and RNA quality was assesses
by gel electrophoresis on 1.2% agarose gels stained with ethidium bromide. Two µg of total
136

Résultats
RNA were digested with 1U of RNase-free DNAse (Promega) for 1h at 37°C as to remove
any trace of genomic DNA, and then incubated 10 min at 65°C with DNase Stop Solution.
Treated RNA was used for single-stranded cDNA synthesis. They were incubated 10 min at
65°C with Random Primers oligonucleotides (Invitrogen, reference 48190-011) and chilled on
ice; a mix containing M-MLV transcriptase (400 IU/sample, Invitrogen, reference 28025-
013), 5x first-strand buffer (Life Technologies), dithiothreitol (DTT) 0.1 M (Life
Technologies), 40 U of RNase Out Ribonuclease Inhibitor (Invitrogen, reference 10777-019),
10 mM of each four dNTPs (Promega) was then added and the mixture incubated for 1h at
42°C. Reaction was heat-inactivated at 95°C for 5 min and kept at –20°C until used. For
quantitative PCR, cDNA were used at dilutions of 1:100.
2.3.2. PCR primers
Specific primers are listed in Table 2. For each target cDNA, a primer pair was
determined using Primer Express Software (Applied Biosystems) for SYBR Green real-time
PCR assay on a GeneAmp 5700 Sequence Detection System (Applied Biosystems) and based
on known ovine gene sequences (β-actin, IFN-γ, TNF-α, IL-3, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12p40).
In cases where the ovine gene sequence was not known (IL-13), a consensus sequence was
created, based on a minimum of three known sequences in other mammalian species. A first
primer pair was then designed using Primer 3 Software as to amplify the largest possible
mRNA in all aligned sequence. PCR amplification on reverse transcript RNA obtained from
ovine peripheral blood mononuclear cells (PBMC) stimulated with concanavalin A (ConA, 10
µg/mL, 24 hours in a 5% CO2 and 37°C atmosphere) was then performed. Amplicons were
purified before cloning in TopoCloning system (Invitrogen) and sequenced (using M13
universal primers). The sequences thus obtained were then compared with GenBank database
as to validate the nature of the amplified product. After validation a new set of primers
suitable for quantitative PCR was designed using the obtained sequence.
137

2.3.3. Quantitative PCR
Résultats
Real-time quantitation was performed on a GeneAmp 5700 (Applied Biosystems),
using the double-stranded DNA binding dye SYBR Green I. PCR products corresponding to
the different amplicons (see Table 1) of target cytokines were cloned in PBR 2.1 plasmid
(TopoClonA, Invitrogen) and sequenced (M13 universal primers). The plasmid harboring the
cloned sequence were then quantified by spectrometry as to establish the number of target
copy/µl. From the stock plasmid solution 10-fold dilution series were prepared corresponding
to 10 7 to 10 1 copies of the target sequence. Serial dilution of the plasmid was then used as an
external standard, allowing the determination of the number of copies of the target cDNA in
each assay. Each sample for each investigate cytokine was performed in duplicate. Ovine
Beta-actin was used as a housekeeping gene to normalize expression between different
samples. The results obtained for each cytokine are expressed as a ratio of the number of
cytokine mRNA copies / Beta-actin mRNA copies. A non-template control reaction (NTC)
was included in each run. Finally, specificity of amplification reaction was assessed by
acquisition of a dissociation curve. Data was obtained by slowly increasing the temperature of
PCR reaction from 60 to 95°C ; denaturation of non-specific PCR products was followed by a
faster decrease of fluorescence than for specific products. The melting profile of distinct PCR
product is obtained by plotting the first derivative (-dF/dT) of fluorescence (F) versus
temperature (T).
2.4. Antibodies detection in mucus and serum by indirect ELISA
A blood sample from each animal were taken just before euthanasia and centrifuged
for 5 min at 5000 rpm. Serum was then frozen at –20°C until analysis. A mucus sample from
each animal was collected during necropsy using PBS-impregnated filter paper strips of 4 cm 2
deposited onto the duodenal mucosa for 5 min. The strips were then gently agitated in PBS
138

Résultats
for 2h at room temperature for eluting the mucus. The liquid was then centrifuged and stored
frozen at –70°C until analysis.
2.4.1. Worm antigen preparation
Two donor sheep infected respectively with 50,000 and 100,000 T.colubriformis L3
(Weybridge strain) were sacrificed, and adult and L4 worms were respectively harvested from
the duodenum. These worms were thoroughly washed in PBS (pH 7,4) containing penicillin
(100 IU/ml) and streptomycin (1 mg/ml). Two hundred adults/mL and 2000 L4/mL were then
maintained in the same buffer in a 5% CO2 atmosphere at 37°C overnight. Next, the
supernatant (containing excretory-secretory products (ESP)) was collected, filtered (0,2 µm)
and stored at –70°C until further use. A crude extract of T. colubriformis L3 (CEL3)was
prepared after three cycles of freezing and thawing (-70°C / +25°C), homogenisation at 4°C
and centrifugation at 30,000g for 30 min at 4°C. The supernatant was used as crude extract of
L3 antigen. The protein concentration of these three antigenic preparations was determined
with the method of Lowry et al. (1951).
2.4.2. Determination of optimal assay conditions
The optimal concentrations of ELISA reagents and the optimal tests conditions were
determined by chequerboard assays using serial dilutions of T. colubriformis antigens, of
positive (group A at 28 dpc) and negative (group C) reference sera or mucus and of specific
conjugates. These concentrations and dilutions are presented in Table 3.
2.4.3. ELISA technique
An indirect ELISA was used on serum and mucus samples, as described by Jacquiet et
al. (2005). Briefly, each well of a flat-bottomed microtitre plate (Nunclon Distr. VWR
International, France) was coated overnight with 100 µL of antigen diluted in sodium
carbonate buffer at 4°C. The plates were washed twice in PBS pH 7.2 containing 0.1% Tween
20 (PBS-T). To minimize non-specific binding of the antibody, the plates were then incubated
139

Résultats
for 1h at 37°C with 200 µL of 5% skimmed milk PBS-T (PBS-TSM). Subsequently the PBS-
TSM was discarded and the plates dried, before adding 100 µL of serum diluted in PBS-TSM
or undiluted mucus to each well for 1h at 37°C. After three washes with PBS-T (the third
being of 5 minutes), the plates were subsequently incubated for 1,5h with 100 µL of Donkey
anti-sheep IgG HRP (Sigma, reference A3415) (IgG determination) or for two periods of 1h
with the first (Mouse IgG1 anti-IgA bovine/ovine, Serotec, reference MCA628) and the
second (Goat anti-mouse IgG1 HRP, Serotec, reference STAR81P) conjugates separated by
three washings in PBS-T (IgA determination). Finally, the plates were washed three times
with PBS-T and 100 µL of 2-2’-azino-bis (3-ethylbenylthiazoline-6-sulphonic acid, ABTS) in
100 mM citrate buffer (Sigma, reference 104.4) containing 0.01% H2O2 was added to each
well. The colour was allowed to develop for 1h at 37°C. To stop the reaction, the plates were
placed 15 min at 4°C. The optical density was measured at 405 nm using a Microplate Reader
(System Dias, Dynatech).
2.5. Histology
At necropsy, two tissue samples from duodenum (between 50 and 100 cm from the
pylorus) were taken ; the first one was fixed in a 10% formalin for conventional histology and
immunohistochemistry (IHC), and the second was frozen at –70°C for frozen IHC.
2.5.1. Conventional histology and IHC with paraffin-embedded samples
Duodenal tissue was embedded in paraffin wax and tissue sections of 3 µm were
mounted on glass slides. Eosinophils and globule leukocytes were counted on
haematoxylin/eosin stained slides, whereas mast cells were counted on Giemsa stained slides.
Immunohistochemistry was performed using antibodies already described for cell
phenotyping on paraffin-embedded tissues in sheep (Lacroux et al., 2006). This antibody set
allows specific labelling of macrophages/monocytes (mouse anti-human CD68 antibody,
140

Résultats
clone Ki-M6, Serotec, 1:150 dilution), B lymphocytes (mouse anti-human CD20-like
antibody, clone BLA-36, Novocastra, 1:50 dilution), or T lymphocytes (rabbit anti-human
CD3 antibody, A 0542, DAKO, 1:100 dilution).
2.5.2. IHC on frozen samples
Five µm sections of duodenal tissue were obtained using a Leika cryomicrotome.
Slides were fixed for 20 min in an acetone bath then directly processed for IHC with the same
method as for paraffin-embedded samples, using monoclonal antibodies directed against CD4
(mouse anti-ovine CD4, SEROTEC, reference MCA2213, 1:600 dilution) or CD8 (mouse
anti-bovine CD8, SEROTEC, reference MCA837G, 1:800 dilution) antigens.
For each cell type, cells were counted on ten randomly selected optical fields at high
magnification (x400), equally distributed between deep and superficial lamina propria. The
results were expressed as a sum of the ten fields.
2.6. Statistical analysis
Comparisons between the three groups (previously-infected, primary-infected and
uninfected control) and between the necropsy dates within a group was tested using the non-
parametric tests of Kruskall-Wallis and Mann-Withney (SYSTAT Software). P0.217 (P0.283 (P

Résultats
reallocated and a percentage of well-classified individuals (agreement between the group of
origin and the allocated group by analysis) was estimated.
142

3. RESULTS
3.1. Dynamics of the worm population (Table 4)
Résultats
No worm and no egg excretion were recorded in uninfected control lambs during the
whole experiment. All lambs challenges were followed by a worm establishment with
efficiency rates ranging from 3% to 85% (mean 40%) ; a high individual variability among
total worm counts was observed within each group but no differences in the total worm
burdens were observed between the groups A and B. Furthermore, the development of worms
was similar in the two infected groups : only fourth-stage larvae (L4) were recovered at 4 days
post challenge (dpc) ; a majority of immature forms were present at 10 dpc ; a majority of
adult worms were observed at 17 dpc and almost only adult worms at 28 dpc. Nevertheless at
10 dpc, one lamb of group A harboured few adult worms.
Some differences were observed in faecal egg output between both infected groups. At
17 dpc, three lambs of the primary-infected group, but none of the previously-infected sheep,
shed egg in their faeces. At the end of the experiment (28 dpc), all lambs of groups A and B
shed eggs in their faeces but the difference between these two groups in egg excretion was
statistically significant (395 +/- 360 versus 795 +/- 272 for groups A and B respectively,
P

Résultats
in the duodenal mesenteric lymph node of some previously-infected lambs at 17 and 28 dpc,
when compared to the primary-infected and uninfected control sheep (Fig. 1B). Due to this
great individual variability, theses differences were not statistically significant.
In both duodenal mucosa or lymph node, no qualitative or statistical differences were
observed in the transcription of IL-4 mRNA (Fig. 1C and 1D), IFN-γ, IL-12, IL-10, TNF-α
and IL-13 (data not shown) between the three experimental groups.
3.3. Specific antibody detection in duodenal mucus and in serum (Fig. 2)
A late and significant (P

3.4. Dynamics of the duodenal cellular infiltration (Fig. 3)
Résultats
Late but significant eosinophil and mast cell recruitments in the duodenal mucosa
(P

3.6. Discriminant analysis
Résultats
Individual re-arrangement revealed that 89.9% of animals were well-classified by the
multivariate analysis. All lambs of the uninfected control group were considered as non-
infected animals. In the previously-infected group, 25/27 lambs were well-classified, one was
considered as primary-infected and one as uninfected control. These two sheep could be
considered as low-responders.
In the primary-infected group, 22/28 lambs were effectively considered as primary-
infected, while 2 animals had characteristics comparable to previously-infected sheep (high-
responders), and four sheep were comparable to uninfected controls (low-responders).
146

4. DISCUSSION
Résultats
In this study, no clear Th2 polarized response evaluated at the mRNA cytokine gene
transcription level was observed. This is in contradiction to descriptions in rodent models
(Urban et al., 1992) and in previous studies using T. colubriformis infected sheep (Pernthaner
et al., 2005). Moreover, these results are conflicting with our previous study of H. contortus
infected lambs, where an unequivocal Th2 immune response was demonstrated by using
identical experimental design and molecular tools (Lacroux et al., 2006). Thishis failure in
detection of a clear polarized immune response could find its origin in different but non
exclusive explanations. First, the immune response induced by T. colubriformis could require
longer or repetitive exposures to be expressed in sufficient detectable levels. Our experiment
was ended after a short course of infection challenge (28 days). This immunization protocol is
clearly different from repeated or continuous infections, as carried out in many studies of the
immune response towards this parasite (Dobson et al., 1990a, b, c ; Emery et al., 1992 ;
McClure et al., 1998). This could explain the low although significant effector humoral and
cellular responses obtained in this study. A priming infection of four weeks is also probably
too short do develop anti-larval responses and could explain why no differences in larval
establishment were noticed between previously-infected and primary-infected lambs. Indeed,
a 12 weeks exposure to infection was shown to be necessary for developing resistance to
incoming larvae to develop, while worms removed by anthelmintic treatment after only 1 to 4
weeks of infection were completely replaced (Barnes and Dobson, 1993). In this way, our
protocol is also clearly different from Pernthaner’s experiments in which previously-infected
sheep were obtained after 1 or 2 years of free grazing onto naturally infected pastures
(Pernthaner et al., 2005). Secondly, despite similar technical investigations, differences in
immune polarization were observed between H. contortus and T. colubriformis infections.
147

Résultats
This could be linked to the parasite biology and interaction with his host. For H. contortus,
the host-parasite relationships (L4, immature and adult worms are blood feeding) imply
repetitive breakings of the abomasal mucosa basal membrane to reach the lamina propria
blood vessels. On the contrary, T. colubriformis adult stages of are living in the sub epithelial
region of the intestinal mucosa, without impairment of the basal membrane and without
contact with the lamina propria (Miller, 1984). This particularity could lead to limited
contacts with the immune system and immune cells of the lamina propria and then require
several exposures to initiate effective and detectable cytokine gene mRNA transcriptions.
This could also explain that these transcriptions could only be detectable after amplification
on selected specific cell subsets, like immune cells in efferent intestinal lymph (Pernthaner et
al., 2005) and not in the whole intestinal mucosa or draining lymph node like in our
experiments. Finally, the specific cytokinic response induced by the nematode infection could
be drowned in the whole cytokinic background of the intestinal environment and the limited
coccidia infections observed in our lambs may have impaired also the cytokine balance.
Nevertheless, despite no significant group differences, some animals of the previously-
infected group had an increased IL-5 gene expression in both investigated tissues at the end of
our experiment (28 dpc). This data support those of Pernthaner et al. (2005) and plead
although for a classical Th2 orientation of the immune response. However, in total duodenal
mucosa or lymph node (our study) or in intestinal lymph cells (Pernthaner et al., 2005), no
differences were observed in the expression of IL-4 mRNA cytokine considered as the key of
the Th2 orientation pathway.
Despite an equivocal polarization of the adaptive immune response in this study, the
effector mobilization (antibodies and cellular recruitment in duodenal mucosa) support a Th2
mechanism, similar to features encountered in rodent models. In mice, gastrointestinal
148

Résultats
nematode infections elicit Th2 immune responses and are almost invariably accompanied by
local and systemic eosinophilia, mucosal mast cell hyperplasia, and local and general specific
antibody responses (mainly IgA, IgE and IgG1) (Urban et al., 1991). Similar features are
described in sheep infected with Haemonchus contortus (Schallig, 2000 ; Lacroux et al.,
2006), Teladorsagia circumcincta (Stear et al., 1995) and with T. colubriformis (Bendixsen et
al., 1995). In our study, mast cell and globule leukocytes hyperplasia, mucosal eosinophilia
and specific antibodies levels are detected at the end of the experiment (17 or 28 dpc) in
previously-infected sheep only. No significant cellular and humoral responses were observed
in the primary-infected group, as well as in uninfected control lambs, suggesting that a first
exposure to the parasite is not sufficient to induce significant Th2-type effector modifications.
The last objective of this study was to measure the effects of recruited cells or
antibodies on parasite establishment, development and fecundity. No differences in the
establishment rate of worms were observed between previously-infected and primary-infected
lambs. Moreover, the parasite development within the host was not delayed during the
secondary infection in contrast to other studies using H. contortus (Schallig et al., 1995 ;
Lacroux et al., 2006) or T. circumcincta infections (Stear et al., 1995). However, a significant
decrease in faecal egg output was observed in previously-infected lambs as soon as 17 dpc,
suggesting a stunting effect on female size and a reduced fecundity as demonstrated in H.
contortus infected lambs (Lacroux et al., 2006). These results corroborate previous
observations stating that young lambs are unable to control total worm burden due a
constitutive immunological hyporesponsiveness (Colditz et al., 1996), but are able to
influence parasite life traits like adult female worm length and then faecal egg output (Stear et
al., 1999). Strong negative correlations were observed between eosinophils, mast cells, a large
range of IgA and IgG antibody responses and the egg excretion at 28 dpc (Table 5),
149

Résultats
reinforcing the role of these immune effectors in decreasing the faecal egg output. Eosinophils
and mast cells are considered to play an important role in the response against gastrointestinal
nematode infections (Douch et al., 1986 ; Dawkins et al., 1989 ; Pfeffer et al., 1996 ; Balic et
al., 2000), as these cell types may kill infective larvae by releasing toxic proteins against the
target parasite, as least in vitro (Butterworth et al., 1975 ; Capron et al., 1984 ; Rainbird et al.,
1998). Traditionally the effector responses seems to act against incoming larvae and influence
their expulsion. In our study, as no differences in worms establishment are recorded, these
cells could also have a role on established parasites. Similarly, IgA and IgG antibodies could
have a direct effect i) on the immune rejection of incoming larvae (Harrison et al., 2003) and
ii) on established parasites by neutralizing or inactivating vital metabolic enzymes (Gill et al.,
1993) or by interfering with the worm’s ability to feed (Smith, 1988).
In conclusion, two successive one-month long T. colubriformis infections in young
lambs are sufficient to induce the mobilization of Th2 cellular and antibody responses, to
reduce the faecal egg excretion and then the larval contamination of pastures. Nevertheless
using this immunization protocol, no reduction of the total worm burden, nor modifications of
parasite development, are demonstrated, so benefits at the individual level remain limited. No
clear polarization of the immune response can be ruled out when considering a whole given
group, but individual variability observed in the previously-infected sheep for IL-5 mRNA
transcription, cellular and antibody responses, plead nevertheless for a Th2-type pathway
orientation. Repetitive or higher exposures may be required to initiate a strong Th2 protective
immune response in young INRA 401 lambs.
150

REFERENCES
Résultats
Balic, A., Bowles, V. M. and Meeusen, E. N. The immunobiology of gastrointestinal
nematode infections in ruminants. Adv Parasitol. 45 (2000) 181-241.
Barnes, E.H. and Dobson, R.J. Persistence of acquired immunity to Trichostrongylus
colubriformis in sheep after termination of infection. Int J Parasitol. 23 (1993) 1019-26.
Bendixsen, T., Emery, D. L. and Jones, W. O. The sensitization of mucosal mast cells during
infections with Trichostrongylus colubriformis or Haemonchus contortus in sheep. Int J
Parasitol. 25 (1995) 741-748.
Brown, W. C., Rice-Ficht, A. C. and Estes, D. M. Bovine type 1 and type 2 responses. Vet
Immunol Immunopathol. 63 (1998) 45-55.
Butterworth, A. E., Sturrock, R. F., Houba, V., Mahmoud, A. A., Sher, A. and Rees, P. H.
Eosinophils as mediators of antibody-dependent damage to schistosomula. Nature. 256 (1975)
727-9.
Capron, M., Nogueira-Queiroz, J. A., Papin, J. P. and Capron, A. Interactions between
eosinophils and antibodies: in vivo protective role against rat schistosomiasis. Cell Immunol.
83 (1984) 60-72.
Colditz, I.G., Watson, D.L., Gray, G.D. and Eady, S.J. Some relationships between age,
immune responsiveness and resistance to parasites in ruminants. Int J Parasitol. 26 (1996)
869-77.
Cooper, P. J., Chico, M. E., Sandoval, C., Espinel, I., Guevara, A., Kennedy, M. W., Urban Jr,
J. F., Griffin, G. E. and Nutman, T. B. Human infection with Ascaris lumbricoides is
associated with a polarized cytokine response. J Infect Dis. 182 (2000) 1207-1213.
Dawkins, H. J., Windon, R. G. and Eagleson, G. K. Eosinophil responses in sheep selected for
high and low responsiveness to Trichostrongylus colubriformis. Int J Parasitol. 19 (1989) 199-
205.
Dobson, R.J., Waller, P.J. and Donald, A.D. Populations dynamics of Trichostrongylus
colubriformis in sheep: the effect of infection rate on loss of adult parasites. Int J Parasitol. 20
(1990a) 359-63.
Dobson, R.J., Waller, P.J. and Donald, A.D. Populations dynamics of Trichostrongylus
colubriformis in sheep: the effect of host age on the establishment of infective larvae. Int J
Parasitol. 20 (1990b) 353-57.
Dobson, R.J., Waller, P.J. and Donald, A.D. Populations dynamics of Trichostrongylus
colubriformis in sheep: the effect of infection rate on the establishment of infective larvae and
parasite fecundity. Int J Parasitol. 20 (1990c) 347-52.
Douch, P. G., Harrison, G. B., Elliott, D. C., Buchanan, L. L. and Greer, K. S. Relationship of
gastrointestinal histology and mucus antiparasite activity with the development of resistance
to trichostrongyle infections in sheep. Vet Parasitol. 20 (1986) 315-31.
151

Résultats
Else, K. J. and Finkelman, F. D. Intestinal nematode parasites, cytokines and effector
mechanisms. Int J Parasitol. 28 (1998) 1145-1158.
Emery, D.L., McClure, S.J., Wagland, B.M. and Jones, W.O. Studies of stage-specific
immunity against Trichostrongylus colubriformis in sheep: immunization by normal and
truncated infections. Int J Parasitol. 22 (1992) 215-20.
Finkelman, F. D., Shea-Donohue, T., Goldhill, J., Sullivan, C. A., Morris, S. C., Madden, K.
B., Gause, W. C. and Urban, J. F., Jr. Cytokine regulation of host defense against parasitic
gastrointestinal nematodes: lessons from studies with rodent models. Annu Rev Immunol. 15
(1997) 505-533.
Gill, H. S., Altmann, K., Cross, M. L. and Husband, A. J. Induction of T helper 1- and T
helper 2-type immune responses during Haemonchus contortus infection in sheep.
Immunology. 99 (2000) 458-463.
Gill H.S., Watson D.L., Brandon M.R., 1993. Monoclonal antibody to CD4+ T cells
abrogates genetic resistance to Haemonchus contortus in sheep. Immunology, 78: 43-49.
Harrison, G.B., Pulford, H.D., Hein, W.R., Barber, T.K., Shaw, R.J., McNeill, M., Wakefield,
S.J. and Shoemaker, C.B. Immune rejection of Trichostrongylus colubriformis in sheep; a
possible role for intestinal mucus antibody against an L3-specific surface antigen. Parasite
Immunol. 25 (2003) 45-53.
Jackson, F. and Coop, R.L. The development of anthelmintic resistance in sheep nematodes.
Parasitology. 120 (2000) S95-107.
Jacquiet, P., Ngoc, T.T.T., Nouvel, X., Prévot, F., Grisez, C., Yacob, H.T., Bergeaud, J.P.,
Hoste, H., Dorchies, P., Tabouret, G. Regulation of Oestrus ovis (Diptera: Oestridae)
populations in previously exposed and naïve sheep. Vet Immunol Immunopathol. 105 (2005)
95-103.
Lacroux C., Nguyen T.H.C., Andreoletti O., Prévot F., Grisez C., Bergeaud J.P., Gruner L.,
Brunel J.C., Francois D., Dorchies P., Jacquiet P. Haemonchus contortus (Nematoda:
Trichostrongylidae) infection in lambs elicits an unequivocal Th2 immune response.
Veterinary Research. (2006) In Press.
Lebart, L., Morineau, A. and Piron, M. Statistique exploratoire multidimensionnelle. Dunod
Editions (1995). 439 pages.
Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L. and Randall, R. J. Protein measurement with the
Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193 (1951) 265-275.
McClure, S. J., Emery, D. L., Bendixsen, T. and Davey, R. J. Attempts to generate immunity
against Trichostrongylus colubriformis and Haemonchus contortus in young lambs by
vaccination with viable parasites. Int J Parasitol. 28 (1998) 739-745.
Miller, H.R. The protective mucosal response against gastrointestinal nematodes in ruminants
and laboratory animals. Vet Immunol Immunopathol. 6 (1984) 167-259.
152

Résultats
Pernthaner, A., Vlassoff, A., Douch, P. G. and Maass, D. R. Cytokine mRNA and IFN-γ
production in nematode resistant and susceptible line lambs artificially infected with gastrointestinal
nematodes. Acta Parasitologica. 42 (1997) 55-61.
Pernthaner, A., Cole, S. A., Morrison, L. and Hein, W. R. Increased expression of interleukin-
5 (IL-5), IL-13, and tumor necrosis factor alpha genes in intestinal lymph cells of sheep
selected for enhanced resistance to nematodes during infection with Trichostrongylus
colubriformis. Infect Immun. 73 (2005) 2175-2183.
Pfeffer, A., Douch, P. G., Shaw, R. J., Gatehouse, T. K., Rabel, B., Green, R. S., Shirer, C. L.,
Jonas, W. E. and Bisset, S. Sequential cellular and humoral responses in the abomasal mucosa
and blood of Romney sheep dosed with Trichostrongylus axei. Int J Parasitol. 26 (1996) 765-
773.
Quinnell, R. J., Pritchard, D. I., Raiko, A., Brown, A. P. and Shaw, M. A. Immune responses
in human necatoriasis: association between interleukin-5 responses and resistance to
reinfection. J Infect Dis. 190 (2004) 430-438.
Rainbird, M. A., Macmillan, D. and Meeusen, E. N. Eosinophil-mediated killing of
Haemonchus contortus larvae: effect of eosinophil activation and role of antibody,
complement and interleukin-5. Parasite Immunol. 20 (1998) 93-103.
Raynaud, J. P. Etude de l'efficacité d'une technique de coproscopie quantitative pour le
diagnostic de routine et le contrôle des infestations parasitaires des bovins, ovins, équins et
porcins. Ann Parasitol Hum Comp. 45 (1970) 321-342.
Sangster, N. C. Anthelmintic resistance: past, present and future. Int J Parasitol. 29 (1999)
115-124.
Schallig, H. D. Immunological responses of sheep to Haemonchus contortus. Parasitology.
120 Suppl (2000) S63-72.
Schallig, H. D., van Leeuwen, M. A. and Hendrikx, W. M. Isotype-specific serum antibody
responses of sheep to Haemonchus contortus antigens. Vet Parasitol. 56 (1995) 149-162.
Smith, G. The population biology of the parasitic stages of Haemonchus contortus.
Parasitology. 96 (1988) 185-95.
Soulsby, E.J. Helminths, arthropods and protozoa of domesticated animals. WB Saunders, 7 th
Edition (1982) 809 pages.
Stear, M. J., Bishop, S. C., Doligalska, M., Duncan, J. L., Holmes, P. H., Irvine, J., McCririe,
L., McKellar, Q. A., Sinski, E. and Murray, M. Regulation of egg production, worm burden,
worm length and worm fecundity by host responses in sheep infected with Ostertagia
circumcincta. Parasite Immunol. 17 (1995) 643-652.
Stear, M.J., Strain, S. and Bishop, S.C. How lambs control infection with Ostertagia
circumcincta. Vet Immunol Immunopathol. 72 (1999) 213-8.
153

Résultats
Urban, J. F., Katona, I. M., Paul, W. E. and Finkelman, F. D. Interleukin 4 is important in
protective immunity to a gastrointestinal nematode infection in mice. PNAS 88 (1991) 5513-
7.
Urban, J. F., Jr., Madden, K. B., Svetic, A., Cheever, A., Trotta, P. P., Gause, W. C., Katona,
I. M. and Finkelman, F. D. The importance of Th2 cytokines in protective immunity to
nematodes. Immunol Rev. 127 (1992) 205-220.
154

Table 1 : Schematic description of the experimental design.
Treatment and group
Days from
challenge
Previously
infected (A)
Primary
infected (B)
Uninfected
control (C)
*10,000 T. colubriformis L3
Initial infection*
Levamisole
Challenge infection*
Number of sheep killed
-35 -7 0 4 10 17 28
+ + + 6 6 6 9
- + + 6 6 6 10
- + - 6 6 6 6
Résultats
155

Table 2 : Forward and reverse primer sequences for quantitative reverse-transcriptase (RT) PCR.
Cytokine
Ovine Beta-actin
Ovine IFN-γ
Ovine IL-4
Ovine IL-10
Ovine TNF-α
Ovine IL-12p40
Ovine IL-13
Ovine IL-5
Ovine IL-3
Forward sequence
ACCAGTTCGCCATGGATGAT
ATCTCTTTCGAGGCCGGAGA
GGAGCTGCCTGTAGCAGACG
CTGAGAACCATGGGCCTGAC
CCCGTCTGGACTTGGATCCT
GAATTCTCGGCAGGTGGAAG
AGAACCAGAAGGTGCCGCT
CTGCTGATAGGTGATGGGAACTT
AAGAATATCCTGGCGAATAAGAGC
Reverse sequence
AGCCGTTGTCAACCACGAG
ATTGCAGGCAGGAGAACCAT
TTCTCAGTTGCGTTCTTTGGG
TCTCCCCCAGCGAGTTCAC
TGCTTTTGGTGCTCATGGTG
GTGCTCCACGTGTCAGGGTA
GGTTGAGGCTCCACACCATG
GGTGATTTGTATGCTGAGGAGTAGG
GAACGCTTTCAGGTTTGCCT
Tm amplicon (°C)
78
77
79
80
75
80
80
74
75
Résultats
156

Table 3 : Reagents and procedures used for antibody ELISA detection in serum and mucus.
ISOTYPE
Type of antigen
Concentration of antigen (µg/mL)
Dilution of serum or mucus
Dilution of secondary antibody
Dilution of conjugate
SERUM
ESP Ad
0.5
1:200
1:2000
-
IgG
ESP L4
0.5
1:100
1:2000
-
CEL3
1
1:100
1:2000
-
ESP Ad
1
1:200
1:250
1:500
IgA
ESP L4
1
1:100
1:250
CEL3
1
1:200
1:250
MUCUS
ESP Ad
1
1:1
1:1000
IgG
ESP L4
1
1:1
1:1000
CEL3
0.5
1:1
1:1000
ESP Ad
2
1:1
1:250
IgA
ESP L4
1
1:1
1:250
Résultats
Types of antigens : Excretory-secretory products from T. colubriformis adult (ESP Ad) or fourth-stage larvae (L4) worms (ESP L4), and crude
extract of T. colubriformis infective third-stage larvae (CEL3) were tested.
For IgG determination, secondary antibody is a Donkey anti-sheep IgG HRP-conjugated (Sigma, reference A3415). For IgA determination, an
anti-bovine/sheep IgA mouse IgG1 (Serotec, reference MCA628) is first applied before a goat anti-mouse IgG1 HRP-conjugated (Serotec,
reference STAR81P).
1:500
1:500
-
-
-
1:500
1:500
CEL3
1
1:1
1:250
1:500
157

Table 4 : Egg excretion, total worm burden, stage and sex composition of Trichostrongylus colubriformis populations.
Days post
challenge
4
10
17
28
A
B
A
B
A
B
A
B
Group
Epg
(mean +/- SD)
-
-
-
-
- *
33+/-64 *
395+/-360 *
795+/-272 *
Total worm burden
(mean +/- SD)
2715 ± 611
2270 ± 810
4920 ± 2409
4600 ± 1260
3827 ± 2644
6815 ± 1590
4036 ± 1027
4448 ± 631
L4 (%)
100
100
2.2
2.5
-
-
0.85
Immature
males (%)
-
-
40.4
43.9
3.1
0.5
Immature
females (%)
-
-
40.0
53.6
4.5
0.5
Adult males
(%)
-
-
7.1 (1)
-
37.3
41
Résultats
Adult females
(%)
Group A : previously-infected sheep. Group B : primary-infected sheep. Six animals per group were sacrificed at 4, 10 and 17 days post
challenge ; 9 and 10 sheep were sacrificed at 28 days post challenge for groups A and B respectively.
(1) Adult worms in group A at 10 days post challenge were observed in only one sheep.
*p

Table 5 : Correlations between cellular / antibody responses and the faecal egg excretion at 28 days post challenge.
Epg (eggs per
gram) at 28 dpc
Eosinophils
-0.554**
Mast
cells
-0.500*
Globule
leukocytes
-0.026
CEL3
-0.518*
IgA
L4 ESP
-0.502*
Adult
ESP
-0.565**
Serum
CEL3
IgG
L4 ESP
Adult
ESP
CEL3
IgA
L4 ESP
Adult
ESP
Mucus
Legend : CEL3 : crude extract of T. colubriformis third-stage larvae ; L4 ESP : excretory-secretory products of four –stage larvae ; Adult ESP :
excretory-secretory products of adult worms.
-0.203
-0.610**
0.497*
-0.365
-0.622**
-0.680**
For 19 observations at 28 dpc, *p0.433) and **p0.548).
CEL3
-0.182
Résultats
IgG
L4 ESP
-0.318
159
Adult
ESP
-0.557**

CAPTIONS TO FIGURES
Résultats
Fig. 1 : Th2 cytokine mRNA transcriptions in the duodenal mucosa (DM) and in the
duodenal mesenteric lymph node (MLN) from previously-infected, primary-infected and
uninfected control sheep.
IL-5 mRNA (A : in DM and B: in MLN), IL-4 mRNA (C: in DM and D : in MLN), were
quantified and measured in each duplicate sample using an external standard. Results are
expressed after normalization (ratio) with a housekeeping gene (ovine Beta-actin) Small black
squares represent the mean of each group.
Fig. 2 : Mucosal IgG and IgA responses to parasite (excretory-secretory products (ESP)
of T. colubriformis fourth-stage larvae (L4) or adult worms, or crude extract of L3
(CEL3)) antigens, in previously-infected, primary-infected and uninfected control sheep.
A : Total mucus IgG against CEL3 ; B : Total mucus IgG against L4 ESP ; C : Total mucus
IgG against adult worms ESP ; D : Mucus IgA against CEL3 ; E : Mucus IgA against L4 ESP
and F : Mucus IgA against adult worms ESP . Small black squares represent the mean of each
group. Asterisks are mentioned when a significant statistical difference exists between the
three groups (P

Résultats
PARTIE II : ETUDE COMPARATIVE DE LA REPONSE
IMMUNITAIRE ADAPTATIVE CHEZ DES AGNEAUX DE RACE
RESISTANTE, BARBADOS BLACK BELLY, ET DE RACE
SENSIBLE, INRA 401, INFESTES PAR H. CONTORTUS
Le contrôle des strongyloses gastro-intestinales chez les petits ruminants est fondé sur
l’utilisation de molécules anthelminthiques. Cependant, l’apparition de parasites résistants
aux trois grandes familles d’anthelminthiques, la diffusion rapide de ces résistances au sein
des populations de strongles ainsi qu’une demande croissante de la part des consommateurs
d’obtenir des denrées alimentaires exemptes de résidus chimiques (Waller, 1997 ; Sangster,
1999 ; Wolstensholme et al., 2004) orientent les acteurs des filières ovines vers des méthodes
alternatives de lutte contre les parasites gastro-intestinaux. Parmi ces méthodes, la sélection
d’animaux résistants représente une approche séduisante.
La résistance de certaines races ovines vis-à-vis de parasites gastro-intestinaux est connue
depuis longtemps. Ainsi, les ovins de races tropicales (Gulf Coast Native, Sainte-Croix…)
semblent plus résistants que la plupart des ovins de races européennes (Radhakrishnan et al.,
1972 ; Bradley et al., 1973 ; Courtney et al., 1984 et 1985 ; Burke et Miller, 2002). Les ovins
Barbados Black Belly, élevés dans les Caraïbes, présentent également une plus grande
résistance à H. contortus que les ovins de race INRA 401. Cette résistance s’étend à d’autres
espèces de nématodes comme T. colubriformis et T. circumcincta (Gruner et al., 2003).
Les mécanismes responsables de cette plus grande résistance demeurent toutefois inconnus.
Parmi les hypothèses avancées, une meilleure capacité de ces ovins à générer une réponse
immunitaire adaptative face aux strongles gastro-intestinaux peut être envisagée.
Dans cette seconde partie, des ovins de race sensible (INRA 401) et résistante (Barbados
Black Belly) ont été infestés par H. contortus afin :
- de comparer la dynamique de la réponse immunitaire adaptative dans ces deux
races,
- de mettre en évidence des différences d’intensité ou de précocité de la réponse
immunitaire et de ses mécanismes effecteurs, susceptibles d’expliquer la plus forte
résistance des ovins Barbados Black Belly.
165

Ces travaux ont donné lieu à une publication et à un enseignement post-universitaire :
Résultats
Caroline LACROUX, Getachew TEREFE, Olivier ANDREOLETTI, Christelle GRISEZ,
Françoise PREVOT, Jean-Paul BERGEAUD, Juliette PENICAUD, Virginie ROUILLON,
Lucas GRUNER, Jean-Claude BRUNEL, Dominique FRANCOIS, Philippe DORCHIES et
Philippe JACQUIET « Dynamics of the adaptative immune response to Haemonchus
contortus in susceptible INRA 401 and resistant Barbados Black Belly lambs» Manuscrit
en préparation.
Caroline LACROUX et Philippe JACQUIET « Résistance génétique des ovins aux
nématodes gastro-intestinaux » Cours au CEAV de Pathologie Animale en Régions
Chaudes – Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse – Février 2004, Février 2005 et Février
2006.
166

Résultats
Article III : Dynamics of the adaptive immune response to
Haemonchus contortus in susceptible INRA 401 and resistant
Barbados Blackbelly lambs
Running title:
Immune response in INRA 401 and Barbados Blackbelly lambs
infected by Haemonchus contortus.
Caroline LACROUX 1* , Getachew TEREFE 1* , Olivier ANDREOLETTI 1 , Christelle
GRISEZ 1 , Françoise PREVOT 1 , Jean-Paul BERGEAUD 1 , Juliette PENICAUD 1 , Virginie
ROUILLON 1 , Lucas GRUNER 2 , Jean-Claude BRUNEL 3 , Dominique FRANCOIS 4 ,
Philippe DORCHIES 1 and Philippe JACQUIET 1**
1 - UMR INRA-ENVT 1225 Interactions Hôtes Agents Pathogènes – Ecole Nationale
Vétérinaire de Toulouse – 23, chemin des Capelles – 31076 Toulouse Cedex 03, France
2 – INRA, Ecologie et Génétique des Parasites, BioAgresseurs Santé et Environnement –
37880 Nouzilly, France
3 – INRA, Domaine Expérimental de la Sapinière, 18390 Osmoy, France
4 – INRA, Station d’Amélioration Génétique des Animaux, BP 27, 31 326 Castanet-Tolosan,
France
*Both authors contributed equally to this study
Manuscrit en préparation
**Corresponding author: P. Jacquiet (p.jacquiet@envt.fr)
Tel: (33) 5 61 19 39 67; Fax: (33) 5 61 19 39 44
167

ABSTRACT
Résultats
Breeding for resistance has been viewed as an attractive alternative method to control
gastrointestinal nematode infections in sheep. Tropical breeds, like Barbados Blackbelly
(BBB), are well known for their enhanced resistance to gastrointestinal strongyles such as
Haemonchus contortus. However, the mechanisms underlying such phenomenon remain
unknown. Here we report the comparison in the dynamics of the adaptive immune response
between susceptible (INRA 401) and resistant (BBB) lambs infected by H. contortus. BBB
lambs were more resistant to H. contortus than INRA 401 lambs as early as the first exposure.
A dramatically lower egg excretion (coupled to reduced size and fecundity of female worms)
was observed in these animals. Conversely to what was observed in INRA 401 lambs, a
second infection did not further enhance the resistance of BBB lambs. The general cytokine
patterns were similar in the two breeds except for the persistence and higher intensity during
the whole infection-period of Th2 cytokine (IL-4, IL-5 and IL-13) mRNA over-transcriptions
in BBB lambs. The IL-5 mRNA over-transcription in BBB lambs was linked to a high and
long lasting blood eosinophilia. However, no clear-cut differences were observed in the
abomasal cellular recruitment between the two breeds at 4 and 30 days post infection.
Key-words: Barbados Blackbelly sheep– Haemonchus contortus – Adaptive immune
response – Th2 polarization – Genetic resistance.
168

1 - INTRODUCTION
Résultats
The control of parasitic diseases has often suffered from the development of drug
resistant parasites and the increasing consumer concern about drug residues in food products
of animal origin. The use of nematode resistant sheep breeds has recently been considered as
one alternative method for limiting the significant losses due to parasites. In this respect,
Santa Ines sheep were shown to better resist to Haemonchus contortus infections compared to
Suffolk or Ile de France sheep (Amarante et al., 2004). Other tropical breeds, such as the Gulf
Coast Native or the St. Croix, are also more resistant to H. contortus than the Suffolk,
Rambouillet, Finn-Dorset x Rambouillet, Dorset or Dorper breeds (Courtney et al., 1985a,b;
Gamble and Zajac, 1992; Burke and Miller, 2002). A simultaneous study carried out in
Guadeloupe (using Barbados Blackbelly (BBB) sheep) and in France (using INRA 401 sheep)
by Aumont et al. (2003) has indicated that the BBB breed was more resistant to both
allopatric and sympatric isolates of H. contortus than the INRA 401 breed. This was later
confirmed by Gruner et al. (2003) in their study on both breeds in France, where the
resistance was further extended to Trichostrongylus colubriformis and, to a lesser extent, to
Teladorsagia circumcincta.
However, the mechanisms underlying such inter-breed differences in the response to
parasitic infections are still poorly understood. One possible explanation for this difference
could be the observation that lambs from tropical breeds develop resistance to H. contortus at
an age when they are thought to be immune incompetent (Bahirathan et al., 1996). CD4+ T
helper cells have been found to be important in the genetic control of the development of
immunity against H. contortus in Merino lambs (Gill et al., 1993), which is associated to an
increase in the number of mast cells, blood and tissue eosinophils as well as specific antibody
levels (Schallig, 2000). In a previous study, we have shown that susceptible INRA 401 lambs
developed an unequivocal Th2 immune response following a H. contortus infection (Lacroux
169

Résultats
et al., 2006). While comparisons were made to elucidate differences in parasitological
parameters between H. contortus resistant BBB sheep and susceptible INRA 401 sheep, little
or no attempt has been made to discover the potential immune mechanisms underlying such
differences between these two breeds. Therefore, the aims of the experiments reported here
were first to confirm the higher resistance of BBB lambs compared to INRA 401 lambs, as
observed by Aumont et al. (2003). The cytokine polarization of the adaptive immune response
and the kinetics of the cellular effectors have been explored and compared between the two
breeds to define if i) BBB sheep develop a clear Th2 immune response and if ii) differences in
the timing or intensity of this response explain the higher resistance observed in BBB sheep.
170

2 - MATERIALS AND METHODS
2.1. Experimental design
2.1.1. Animals
Résultats
Six months old INRA 401 (n=28) and Barbados Blackbelly (BBB) male lambs (n=25)
were randomly allocated into three experimental groups for each breed: Group A: previously-
infected, anthelmintic-treated and then challenged sheep, Group B: primary-infected sheep,
and Group C: uninfected control sheep. All sheep were born, reared and maintained worm-
free in three separate pens before the experiments. Limited infections with coccidia occurred
in all groups despite diclazuril treatments (Vecoxan, Janssen-Cilag, 1 mg/Kg BW) before the
beginning of the experiment, but no clinical signs of coccidiosis were observed. Lambs
received granulated feed adapted to their age, as well as forage and tap water ad libitum.
Animals were handled following European Union recommendations for animal welfare and
under the supervision of the local INRA ethics committee.
2.1.2. Experimental infections and necropsies
For the initial infection, lambs of group A (previously-infected) received orally 10,000
H. contortus third-stage larvae (L3) of Humeau strain at day 0. All lambs were treated with an
oral administration of Ivermectin (Oramec® 0.2 mg/kg, Merial SAS) at day 30. Lambs of
group A (previously-infected) and B (primary-infected) were then orally challenged with
10,000 H. contortus L3 at day 45. Animals were humanely killed at Day 49 (4 days post
challenge (dpc)) and Day 75 (30 dpc) by intravenous injection of 10 mg/kg pentobarbital
sodium followed by exsanguinations (Table 1).
171

2.2. Parasitological monitoring
Résultats
Egg counts were performed according to the modified McMaster technique (Raynaud,
1970) on fecal samples collected twice a week from D15 to D30 for the previously-infected
groups (INRA 401 and BBB groups A) and from D60 to D75 for all three groups.
Immediately after necropsies, the contents and washings of the abomasum were collected and
passed through a 40 µm sieve to conserve the coarse material containing worms. The whole
abomasum was digested in pepsin-hydrochloric acid solution (37°C, 6 h) to collect the tissue
dwelling nematode stages. The contents, washings and digested materials, were preserved in
absolute alcohol. The volume of these materials was then adjusted to 1 L and worms were
counted in a 10% aliquot and classified as adult male or female, immature male or female, or
L4. Furthermore, twenty adult female worms were randomly picked from each D75 sample
for total parasite length measurement and counting of eggs in utero. For this purpose,
individual female worms were allowed to disintegrate in 200 µL of 20% Milton Sterilizing
fluid (Milton Pharmaceutical LTD, contains 2% w/v sodium hypochlorite and 16% w/v
sodium chloride) in distilled water (Kloosterman et al., 1978) and all eggs liberated from the
uterus were counted for each worm.
2.3. Fecal egg hatch test
At the end of experiment, fecal samples were collected during necropsy directly from the
rectum. 3g of each sample was taken for eggs per gram (EPG) determination, while the
remaining material was weighed and cultured at 23°C for 10 days with regular humidification.
The samples were then transferred to a Baermann apparatus for collecting infective larvae of
H. contortus. 24 hours later, all the fluid contained in the apparatus was collected and larvae
were counted in 500µL of the suspension. To maximize the number of counted larvae, the
remaining fecal material (after Baermann) was weighed again and 1g was dissolved in 100 ml
172

Résultats
of water. Larvae were counted in 10 ml of this suspension and the total value was added to the
previous corresponding value. Finally, the percentage of larvae obtained was calculated as:
% of larval output = 100 x total number of larvae counted / (EPG x quantity of fecal material cultured)
2.4. Blood eosinophilia monitoring
Blood samples were collected once a week from D0 to D75 for the previously-infected groups
(INRA 401 and BBB groups A) and from D45 to D75 for all groups in EDTA coated tubes.
100 µL of each blood sample was mixed in 900µL of eosin Y 0.5% (Carpenter’s solution,
Thermo Electron Corporation) and allowed to stain for 5 minutes. The solution was then
diluted with similar volume of PBS (1 mL) to facilitate cell visualization, and the mixture was
filled into a FAST READ 102 cell counting chamber (ISL UK). Eosinophils were counted in
the grids containing 1 µL of the mixture (Dawkins et al., 1989).
2.5. Cytokine expression in total abomasal lymph node and CD4+ cells isolated from the
abomasal lymph node and fundic mucosa
2.5.1. mRNA extraction and RT-PCR
About 300 mg of the total abomasal lymph node or fundic mucosa were snap frozen in
1 mL of Trizol Reagent (Invitrogen, reference 15596-018), and stored at –70°C before use.
Samples were homogenized using a Hybaid RiboLyser TM (two cycles of 30s each at a speed
of 4.5). Fifty µL of the obtained homogenate was mixed with 950 µL of Trizol before adding
200 µL of chloroform at room temperature for 10 min. Samples were then centrifuged for 15
min at 20,000 g at 4°C. Supernatants were placed on a RNeasy Column (RNeasy Mini Kit,
Qiagen) and then processed using the Qiagen protocol for RNA clean-up. This complete
protocol allows the recovery of highly pure RNA. The RNA concentration was measured by
173

Résultats
spectrophotometry at 260 nm and RNA quality was assessed by electrophoresis on 1.2%
agarose gels stained with ethidium bromide. Two µg of total RNA were digested with 1U of
RNase-free DNAse (Promega) for 1h at 37°C to remove any trace of genomic DNA, and then
incubated 10 min at 65°C with DNase Stop Solution. Treated RNA was used as the template
for single-stranded cDNA synthesis. They were incubated 10 min at 65°C with Random
Primers oligonucleotides (Invitrogen) and chilled on ice; a mix containing M-MLV
transcriptase (400 IU/sample), 5x first-strand buffer (Life Technologies), dithiothreitol (DTT)
0.1 M (Life Technologies), 40 U of RNase Out Ribonuclease Inhibitor (Invitrogen), 10 mM
of each four dNTPs (Promega) was then added and the mixture incubated for 1h at 42°C.
Reaction was heat-inactivated at 95°C for 5 min and kept at –20°C until used. For quantitative
PCR, cDNA were used at dilutions of 1:100.
2.5.2. CD4+ cells isolation from the abomasal lymph node
Immediately after death, a fragment of the abomasal lymph node of each animal was
placed in a 1X PBS solution and chilled on ice. The abomasal lymph node was then gently
crushed on a 40 µm cell strainer. Cells were collected in 50 mL HBSS and washed two times.
Approximately 1x10 7 cells were re-suspended in 500 µL FACS Buffer (PBS with 2mM
EDTA and 0.5% BSA) and incubated 30 minutes on ice with an anti-CD4 FITC-labeled
antibody 1:150 diluted (mouse anti-ovine CD4-FITC, Serotec, reference MCA2213F). After
washing, the cell pellet was re-suspended in 80µL FACS Buffer and incubated 15 minutes at
4°C with 20 µL magnetic micro-beads coupled to an anti-FITC monoclonal antibody (anti-
FITC micro-beads, Miltenyi Biotec, reference 130-048-701). After two washes in FACS
Buffer, CD4+ cells were sorted using AUTOMACS Cell Sorter (Miltenyi Biotec). About
1x10 6 cells of this positive fraction were conserved at –70°C in 350 µL RLT Buffer with 1%
β-Mercaptoethanol. Total RNA from this cell fraction was extracted using the Qiagen
174

Résultats
protocol. The purity of the CD4+ cell fraction was analyzed on a FACScalibur flow cytometer
(BD Biosciences).
2.5.3. PCR primers
Specific primers and amplicon sizes are listed in Table 2. For each target cDNA, a
primer pair was determined using Primer Express Software (Applied Biosystems) for SYBR
Green real-time PCR assay on a GeneAmp 5700 Sequence Detection System (Applied
Biosystems) and based on known ovine gene sequences (β-actin, IFN-γ, TNF-α, IL-3, IL-4,
IL-5, IL-10, IL-12p40). Oligonucleotides were designed to amplify a product with a size of 51
bp, with a melting temperature (Tm) of 58-60°C. When the ovine gene sequence was not
known (Eotaxin, IL-13), a consensus sequence was created, based on a minimum of three
known sequences in other mammalian species. A first primer pair was then designed using
Primer 3 Software in order to amplify the largest possible mRNA in all aligned sequence.
PCR amplification on reverse transcript RNA obtained from ovine peripheral blood
mononuclear cells (PBMC) stimulated with concanavalin A (ConA, 10 µg/mL, 24 hours in a
5% CO2 and 37°C atmosphere) was then performed. Amplicons were purified before cloning
in TopoCloning system (Invitrogen) and sequenced (using M13 universal primers). The
sequences thus obtained were then compared with Gene Bank database using blast to validate
the identity of the amplified product. After validation, a new set of primers suitable for
quantitative PCR was designed using the obtained sequence. For IL-13, primers used were
those published by Hein et al. (2004).
2.5.4. Quantitative PCR
Quantitative PCR was performed on a GeneAmp 5700 (Applied Biosystems), using
the double-stranded DNA binding dye SYBR Green I. PCR products corresponding to the
different amplicons of target cytokines were cloned in PBR 2.1 plasmid (TopoClonA,
Invitrogen) and sequenced (M13 universal primers). The plasmids harboring the cloned
175

Résultats
sequence were then quantified by spectrometry to establish the number of target copy/µl. 10-
fold dilution series were prepared from the stock plasmid solution corresponding to 10 7 to 10 1
copies of the target sequence. Serial dilution of the plasmid was then used as an external
standard, allowing the determination of the number of copies of the target cDNA in each
assay. Each sample for each investigated cytokine was performed in duplicate. Ovine Beta-
actin was used as a housekeeping gene to normalize expression between different samples.
The results obtained for each cytokine are expressed as a ratio of the number of cytokine
mRNA copies / Beta-actin mRNA copies. A non-template control reaction (NTC) was
included in each run. Finally, specificity of amplification reaction was assessed by acquisition
of a dissociation curve. Data was obtained by slowly increasing the temperature of PCR
reaction from 60 to 95°C; denaturation of non-specific PCR products is followed by a faster
decrease of fluorescence than for specific products. The melting profile of distinct PCR
product was obtained by plotting the first derivative (-dF/dT) of fluorescence (F) versus
temperature (T).
2.6. Histology
At necropsy, two tissue samples from the fundic area of the abomasal wall were taken;
one was fixed in 10% formalin for conventional histology and immunohistochemistry (IHC),
while the second was stored at –70°C for frozen IHC analysis.
2.6.1. Conventional histology and IHC with paraffin-embedded samples
Abomasal tissue was paraffin-embedded and 3 µm sections were mounted on glass
slides. Eosinophils and globule leukocytes were counted on haematoxylin-eosin stained slides
whereas mast cells were counted after Giemsa staining. Immunohistochemistry was
performed using antibodies already described for cell phenotyping on paraffin-embedded
tissues in sheep (Lacroux et al., 2006). This antibody set allows specific labeling of
176

Résultats
macrophages/monocytes (mouse anti-human CD68 antibody, clone Ki-M6, Serotec, 1:150
dilution), B lymphocytes (mouse anti-human CD20-like antibody, clone BLA-36, Novocastra,
1:50 dilution), or T lymphocytes (rabbit anti-human CD3 antibody, A 0542, DAKO, 1:100
dilution).
2.6.2. IHC on frozen samples
Five µm sections of abomasal tissue were obtained using a Leika cryomicrotome.
Slides were fixed for 20 min in an –20°C acetone bath before drying and directly processed
for IHC. Monoclonal antibodies directed against CD4 (mouse anti-ovine CD4, SEROTEC,
reference MCA2213, 1:2000 dilution), or CD8 (mouse anti-bovine CD8, SEROTEC,
reference MCA837G, 1:800 dilution) antigens were used.
For each type, cells were counted on five randomly selected fields at high
magnification (x 400). The results were expressed as the sum of five fields.
2.7. Statistical analysis
Comparisons between the three groups (previously-infected, primary-infected and
uninfected control), between the two necropsy dates (D49 and D75) within a group, and
between the two breeds for a given group were performed using Kruskal-Wallis non
parametric tests (SYSTAT software). P < 0.05 was considered significant. Kinetics of egg
excretions and blood eosinophil counts were compared between groups using analysis of
variance with repeated values (SYSTAT software).
177

3 – RESULTS
3.1. Parasitological values
3.1.1. Fecal egg excretion
Résultats
No fecal egg excretion was recorded in lambs of groups C (uninfected controls)
throughout the experimental period. This was confirmed later by the absence of worms in the
abomasum. During the initial infection, fecal egg excretion started on D19 in INRA 401
(group A) lambs while it was delayed for about 4 days (D23) in BBB (group A) lambs (Figure
1A). Furthermore, fecal egg counts (FEC) in the BBB breed were significantly lower than that
of INRA 401 (P < 0.001). During the challenge infection, i.e. the second phase of the
experiment, the first fecal egg excretion was observed on D64 for INRA 401 lambs and on
D66 for BBB lambs (Figure 1B) i.e. respectively 19 and 21 days post secondary infection.
The difference between previously-infected and primary-infected groups within a breed was
not significant. Similar to that observed during the initial infection of group A, FEC were
lower in the BBB group B lambs than in INRA 401 group B lambs (P = 0.005). Nevertheless,
FEC were not different between BBB and INRA 401 groups A.
3.1.2. Worm burden, size and fecundity of adult females
On D49 (4 days post challenge), only L4 stages of the parasite were found in the
abomasum of the two breeds of lambs. Both groups (A and B) of BBB lambs exhibited
significantly lower worm counts than their INRA 401 counterparts (P < 0.05), while there was
no group difference within breeds (Table 3).
On D75 (30 days post challenge), there was no significant difference for worm burdens
between previously-infected and primary-infected INRA 401 lambs. Surprisingly, higher
worm burden was registered (P < 0.05) in previously infected BBB lambs compared to the
primary-infected group. Moreover, only primary-infected BBB lambs had fewer worms than
INRA 401 (P < 0.05). Thirty days after challenge (D75), worms at any developmental stages
178

Résultats
(L4 to adults) were present in all groups of lambs. Higher percentages of L4 and immature
stages were observed in INRA 401 group A (P = 0.011) and BBB group B (P < 0.05)
suggesting a delayed worm development (Table 3). Female worms harbored by previously-
infected INRA 401 lambs were significantly shorter and contained fewer eggs in utero than
those in INRA 401 primary-infected lambs (P < 0.05). This difference was not noticed
between the two BBB groups. While they were statistically lower than those in INRA 401
group B lambs (P < 0.01), numbers of eggs in utero for worms in the BBB groups were
comparable to those of the previously-infected INRA 401 lambs (Table 3). A similar pattern
of statistical difference to eggs in utero was noted for female worm size except that worms in
BBB group B lambs were also found shorter than those in INRA 401 group A lambs.
3.1.3. Development of H. contortus eggs in infective larvae.
The proportions of H. contortus eggs developing into third stage larvae after 10 days
of culture ranged from 24.5 to 44.4% but were not different between breeds and groups.
3.2. Patterns of cytokine gene expression
3.2.1. Cytokines in the total abomasal lymph node and isolated CD4+ cells
Expression patterns or transcription intensities were similar between the cDNA
samples stemming from the total abomasal lymph node and those stemming from CD4+ cells
isolated from this lymph node, suggesting that mRNA expression at the level of this cell type
reflects correctly the mRNA transcription of the whole lymph node (data not shown). Then,
only values obtained in the total abomasal lymph node are given.
3.2.2. Cytokine mRNA transcription in abomasal lymph node and abomasal fundic
mucosa
For both breeds, H. contortus infections were followed by a significant increase in Th2
cytokine (IL-4, IL-5 and IL-13) gene expressions (Figure 3). This over-expression was
179

Résultats
present as early as 4 days post-challenge in the previously-infected groups (groups A). In
contrast, higher mRNA gene expression was only observed at 30 dpc in the primary-infected
groups (groups B) and reached similar or higher levels compared to those of groups A. Thirty
days post challenge, the IL-4, IL-5 and IL-13 mRNA transcription levels were significantly
higher in the abomasal lymph nodes of infected BBB lambs than in infected INRA 401 lambs
(P < 0.05). At least for IL-5, this breed difference was associated to a sharp drop in the level
of cytokine transcription in both INRA 401 groups compared to its level at 4 dpc. In contrast,
no breed differences were encountered for these cytokines in the abomasal fundic mucosa.
Similarly, no significant group or breed differences were noticed in IFN-γ, IL-12, IL-10,
TNF-α and Eotaxin mRNA transcription profiles both at 4 and 30 dpc.
3.3. Effector cells recruitment in blood and abomasal tissues
3.3.1. Kinetics of blood eosinophilia during infections
In the control groups, blood eosinophil counts remained low and stable during the
whole experiment (Figure 2). Nevertheless, these counts for control animals were higher in
BBB lambs when compared to those of INRA 401 lambs (P < 0.001) throughout the
experimental period. Each experimental infection was followed one week later by an increase
in blood eosinophil counts. Peak values were attained two to three weeks after infection. In
spite of the strong individual variability observed in infected groups, blood eosinophilia was
higher in BBB than in INRA 401 lambs in initial as well as in challenge infections (P < 0.01).
After anthelminthic treatment, eosinophil counts returned to pre-infection levels in INRA 401
lambs but remained higher than control values in BBB lambs. Moreover, the challenge
infection in BBB was followed by further increase in blood eosinophils counts (P = 0.04)
compared to the initial infection, which later declined but remained still higher than the
control values. In contrast, no difference was observed between the two successive infections
180

Résultats
in INRA 401 lambs and blood eosinophilia returned to the level of control values at the end of
the experiment.
3.3.2. Cellular recruitment in the abomasal mucosa
Numbers of mast cells, globule leucocytes and eosinophils in the abomasal mucosa
were very low in uninfected control animals (Figure 4). At 4 dpc, higher numbers of these cell
types were already present in the abomasal mucosa of previously-infected lambs (Groups A)
when compared to controls while in primary-infected lambs (groups B), the increase in
cellular infiltrations was only evident at 30 dpc in both breeds. Following the first exposure
to H. contortus, no difference in the cellular recruitment was noticed between the two breeds
at both 4 and 30 dpc except for mast cells where higher counts were noticed in INRA 401
lambs than in BBB lambs (Figure 4A). During the second exposure (groups A), higher
numbers of mast cells were counted in BBB lambs at 4 dpc compared to INRA 401 lambs (P
< 0.05) whereas values for globule leucocytes and eosinophils did not differ between breeds
both at 4 and 30 dpc (Figure 4A, 4B and 4C). Cell counts were comparable between breeds
and between groups including control animals for CD3+-T cells, BLA36+-B cells, CD68+-
monocyte/macrophage cells and CD4+/CD8+ ratio (data not shown).
181

4 – DISCUSSION
Résultats
The resistance of Barbados Blackbelly sheep to H. contortus infections has been
successfully demonstrated in previous studies (Yazwinsky et al., 1980; Courtney et al., 1985a,
b; Notter et al., 2003). In our study, the resistance status of BBB lambs to Haemonchus
contortus was compared with INRA 401 breed. In the primary-infected BBB animals, the
lower number of worms in the abomasum, the reduced female worm size and number of eggs
in utero registered after autopsy strongly justify the drastic reduction in FEC compared to that
in INRA 401 group B. Complementary to this, is the retarded worm development as reflected
by the number of immature worms and the longer prepatent period in the tropical breed. The
lower FEC and worm establishment rate in the primary-infected BBB lambs compared to
corresponding INRA 401 group agrees with the reports of Aumont et al. (2003). After the
secondary infection, reductions in worm development and female fecundity observed in
INRA 401 lambs confirm our previous observations (Lacroux et al., 2006). Contrary to that
observed in INRA 401, the regulation of Haemonchus contortus infection was not improved
in challenged BBB lambs. This may suggest that the mechanisms governing resistance to this
parasite was efficient enough in the first exposure and was not enhanced during a secondary
infection. In a similar vein, Bahirathan et al., (1996) demonstrated that the Gulf Coast Native
suckling lambs developed resistance to H. contortus infection at first exposure. Moreover,
Amarante et al. (1999) observed that Florida Native lambs had lower FEC compared to the
Rambouillet breeds during first exposure to natural infection while there was no difference
between the two breeds of lambs after the second natural infection. This is in contrast to the
findings of Gauly et al. (2002) for Rhön and Merinoland lambs, Aumont et al. (2003) for
Blackbelly and INRA 401 lambs and Gamble and Zajac (1992) for St. Croix and Dorset
lambs, where animals infected for the second time have demonstrated better resistance and
breed differences than the primary-infected animals. While there are differences in the
182

Résultats
experimental protocols, age and breed of experimental animals that could potentially cause
variations in the outcomes of different experiments, the origin for the discrepancy in different
works mentioned above is not clear.
The second objective of our study was to compare the adaptive immune responses in
BBB and INRA 401 lambs. CD4+ T helper cells are involved in the genetic control of sheep
immunity to H. contortus (Gill et al., 1993). Therefore, we hypothesized that the higher
resistance of BBB lambs could arise from a quicker and/or more intense Th2 polarization and
mobilization of Th2 effector cells. Following both initial and secondary infections, a clear
Th2-type immune response characterized by cytokine gene expressions and effector cell
mobilisation was demonstrated in the two breeds and this was consistent with previous data
for the INRA 401 genotype (Lacroux et al., 2006). mRNA cytokine transcriptions for IL-4,
IL-5 and IL-13 were moderately higher at 30 dpc in primary infected and previously-infected
BBB lambs than in their INRA 401 counterparts. As to our knowledge, this is the first work
comparing the cytokine gene expression in resistant and susceptible sheep breeds to H.
contortus infections. Similar works were already reported for Trichostrongylus colubriformis
resistant and susceptible Romney sheep lines (Pernthaner et al., 2005) in which animals of the
resistant category were found to develop stronger Th2-polarised cytokine (IL-5 and IL-13 but
not IL-4) gene expressions than the susceptible lines. Recently, Moreno et al. (2006) have
detected a QTL for resistance to H. contortus on ovine chromosome 5 in the INRA 401 x
Barbados Blackbelly backcross lines. The proximal most likely location of this QTL
corresponded to the IL-3/IL-4/IL-5 region. In this study, IL-5 gene over-expression was
apparent following H. contortus exposure and its level remained high in the Blackbelly sheep
till 30 dpc, while it was down regulated to very low values in INRA 401 lambs. In line with
the persistent IL-5 cytokine gene expression pattern, a higher and long lasting blood
eosinophilia was observed in BBB compared to INRA 401 lambs. Negative correlations were
183

Résultats
demonstrated between circulating eosinophil number and in utero egg counts in the BBB
group A (r = -0.856), FEC in BBB group B (r =-0.836) and female worm length in INRA 401
group A (r = -0.971) suggesting the possible role of these cells in the control of various
aspects of parasite development. Aumont et al. (2003) has also reported higher blood
eosinophil levels in the Blackbelly breed than in the INRA 401 lambs. On the other hand,
such differences in peripheral blood eosinophilia between resistant and susceptible breeds
were not observed in other works (Bahirathan et al., 1996; Rocha et al., 2004).
In the present study, the recruitment of effector cells into the abomasal mucosa was
measured at 4 and 30 dpc. The absence of significant breed differences in eosinophil counts in
the abomasal mucosa at both periods of examination does not conform to the persistent blood
eosinophilia, and reduced parasitological values observed in the Blackbelly group B.
Eosinophils are likely involved in protection against some tissue-dwelling nematodes (Klion
and Nutman, 2004), and they specifically congregate around invading larvae (Balic et al.,
2002). Negative correlations were previously reported between abomasal eosinophil counts
and adult female length, number of eggs in utero and faecal egg output (Lacroux et al., 2006).
Huge differences in abomasal globule leucocytes counts between St Croix and Dorset lambs
(Gamble and Zajac, 1992) and in abomasal eosinophil and globule leucocytes counts between
Corriedale and Crioula Lanada sheep (Bricarello et al., 2004) have been observed. In contrast
to these findings, similar mean values of these inflammatory cells were found in Santa Ines,
Suffolk and Ile de France breeds of sheep (Amarante et al., 2005) as in our study.
Whereas challenge infection resulted in a more pronounced cellular recruitment (mast
cells, globule leucocytes and eosinophils) than during the primary infection in both breeds,
there was no further corresponding reduction in parasitological values for the BBB sheep
while INRA 401 (group A) sheep were able to reduce worm development and fecundity in
184

Résultats
terms of female size, egg in utero and higher number of immature worms when compared to
primary infection.
In general, the BBB lambs proved their strong resistance to H. contortus but the
regulation of parasite populations seems to occur very quickly and the involvement of a
strong innate immune response could not be excluded (Tosi, 2005). Both breeds of animals
have demonstrated a clear Th2 type immune response characterized by an increase in Th2-
polarized cytokine gene expressions and corresponding recruitment of effector cells. Th2
cytokine expression in the resistant breed appeared persistent while it was generally down-
regulated through time in the susceptible breed. This could be due to down-regulatory
cytokines released by CD4+CD25+ T regulatory cells that switch off inflammatory and
protective immune responses such as IL-5 dependent blood eosinophilia (Maizels et al.,
2004). Irrespective of the difference in blood eosinophil levels, the recruitment of effector
cells especially eosinophils remained similar between breeds. Nevertheless, further
experiments, including cell counts at other time points such as in the middle of the
experimental period (10 to 20 dpc), and in vitro tests to assess the parasite killing potential of
these cells on infective larvae, are necessary to complete these findings.
185

REFERENCES
Résultats
Amarante, A.F.T., Craig, T.M., Ramsey, W.S., El-Sayed, N.M., Desouki, A.Y., Bazer, F.W.,
1999. Comparison of naturally acquired parasite burdens among Florida Native, Rambouillet
and crossbreed ewes. Veterinary Parasitology, 85: 61-69
Amarante A.F.T., Bricarello P.A, Rocha R.A., Gennari S.M., 2004. Resistance of Santa Ines,
Suffolk and Ile de France sheep to naturally acquired gastrointestinal nematode infections.
Veterinary Parasitology, 120: 91-106.
Amarante A.F.T., Bricarello P.A., Huntley J.F., Mazzolin L.P., Gomes J.C., 2005.
Relationship of abomasal histology and parasite-specific immunoglobulin A with the
resistance to Haemonchus contortus infection in three breeds of sheep. Veterinary
Parasitology, 128: 99-107.
Aumont G., Gruner L., Hostache G., 2003. Comparison of the resistance to sympatric and
allopatric isolates of Haemonchus contortus of Blackbelly sheep in Guadeloupe (FWI) and of
INRA 401 sheep in France. Veterinary Parasitology, 116: 139-150.
Bahirathan M., Miller J.E., Barras S.R., Kearney M.T., 1996. Susceptibility of Suffolk and
Gulf Coast Native suckling lambs to naturally acquired strongylate nematode infection.
Veterinary Parasitology, 65: 259-268.
Balic A., Bowles V.M., Meeusen E.N., 2002. Mechanisms of immunity to Haemonchus
contortus infection in sheep. Parasite Immunology, 24: 39-46.
Bricarello, P.A., Gennari, S.M., Oliveira-Sequeira, T.C.G., Vaz, C.M.S.L., Gonçalves de
Gonçalves, I., Echevarria, F.A.M., 2004. Worm burden and immunological responses in
Corriedale and Crioula Lanada sheep following natural infection with Haemonchus contortus.
Small Ruminant Research, 51: 75-83.
Burke J.M., Miller J.E., 2002. Relative resistance of Dorper crossbred ewes to gastrointestinal
nematode infection compared with St. Croix and Katahdin ewes in the south-eastern United
States. Veterinary Parasitology, 109: 265-275.
Courtney C.H., Parker C.F., McClure K.E., Herd R.P., 1985a. Resistance of exotic and
domestic lambs to experimental infection with Haemonchus contortus. International Journal
for Parasitology, 15: 101-109.
Courtney C.H., Parker C.F., McClure K.E., Herd R.P., 1985b. Resistance of nonlambing
exotic and domestic ewes to naturally acquired gastrointestinal nematodes. International
Journal for Parasitology, 15: 239-245.
Dawkins, H. J., Windon, R. G. and Eagleson, G. K., 1989. Eosinophil responses in sheep
selected for high and low responsiveness to Trichostrongylus colubriformis. International
Journal for Parasitolology, 19: 199-205.
Gamble H.R., Zajac A.M., 1992. Resistance of St. Croix lambs to Haemonchus contortus in
experimentally and naturally acquired infections. Veterinary Parasitology, 41: 211-225.
186

Résultats
Gauly, M., Kraus, M., Vervelde, L., van Leeuwen, M.A., Erhardt, G., 2002. Estimating
genetic differences in natural resistance in Rhon and Merinoland sheep following
experimental Haemonchus controtus infection. Veterinary Parasitology, 106: 55-67
Gill H.S., Watson D.L., Brandon M.R., 1993. Monoclonal antibody to CD4+ T cells
abrogates genetic resistance to Haemonchus contortus in sheep. Immunology, 78: 43-49.
Gruner L., Aumont G., Getachew T., Brunel J.C., Pery C., Cognié Y., Guérin Y., 2003.
Experimental infection of Blackbelly and INRA 401 straight and crossbred sheep with
trichostrongyle nematode parasites. Veterinary Parasitology, 116: 239-249.
Hein, W. R., Barber, T., Cole S. A., Morrison, L. and Pernthaner, 2004. A. Long-term
collection and characterization of afferent lymph from the ovine small intestine. Journal of
Immunological Methods, 290: 153-168.
Kloosterman, A., Albers, G. A. and Van den Brink, R., 1978. Counting eggs in utero of
individual female worms. Veterinary Parasitology, 24: 353-368.
Klion A.D., Nutman T.B., 2004. The role of eosinophils in host defence against helminth
parasites. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 113(1): 30-37.
Lacroux C., Nguyen T.H.C., Andreoletti O., Prévot F., Grisez C., Bergeaud J.P., Gruner L.,
Brunel J.C., Francois D., Dorchies P., Jacquiet P., 2006. Haemonchus contortus (Nematoda:
Trichostrongylidae) infection in lambs elicits an unequivocal Th2 immune response.
Veterinary Research, in press.
Maizels R.M., Balic A., Gomez-Escobar N., Nair M., Taylor M.D., Allen J.E., 2004.
Helminth parasites – masters of regulation. Immunological Reviews, 201: 89-116.
Moreno C., Gruner L., Scala A., Mura L., Schibler L., Amigues Y., Sechi T., Jacquiet P.,
Francois D., Sechi S., Roig A., Casu S., Barillet F., Brunel J.C., Bouix J., Carta A., Rupp R.,
2006. QTL for resistance to internal parasites in two designs based on natural and
experimental conditions of infection. Proceedings of the 8 th World Congress on Genetics
Applied to Livestock Production.
Notter D.R., Andrew S.A., Zajac A.M., 2003. Responses of hair and wool sheep to a single
fixed dose of infective larvae of Haemonchus contortus. Small Ruminant Research, 47: 221-
225.
Pernthaner A., Cole S.A., Morrison L., Hein W.R., 2005. Increased expression of interleukin-
5 (IL-5), IL-13 and Tumor Necrosis Factor Alpha genes in intestinal lymph cells of sheep
selected for enhanced resistance to Nematodes during infection with Trichostrongylus
colubriformis. Infection and Immunity, 73(4): 2175-2183.
Raynaud, J. P., 1970. Etude de l'efficacité d'une technique de coproscopie quantitative pour le
diagnostic de routine et le contrôle des infestations parasitaires des bovins, ovins, équins et
porcins. Annales de Parasitologie Humaine Comparée. 45: 321-342.
187

Résultats
Rocha R.A., Amarante A.F.T., Bricarillo P.A., 2004. Comparison of the susceptibility of
santa Ines and Ile de France ewes to nematode parasitism around parturition and during
lactation. Small Ruminant Research, 55: 65-75.
Schallig H.D.F.H., 2000. Immunological responses of sheep to Haemonchus contortus.
Parasitology, 120: S63-S72.
Tosi M.F., 2005. Innate immune responses to infection. Journal of Allergy and Clinical
Immunology, 116: 241-249.
Yazwinski T.A., Goode L., Moncol D.J., Morgan G.W., Linnerud A.C., 1980. Haemonchus
contortus resistance in straightbred and crossbred Barabados Blackbelly sheep. Journal of
Animal Science, 51(2): 279-284.
188

Table 1 : Schematic description of the experimental design.
Breed
INRA 401
Barbados
Black Belly
(BBB)
Treatment and
Group
Experimental
days
Previouslyinfected
(A)
Primaryinfected
(B)
Uninfected
control (C)
Previouslyinfected
(A)
Primaryinfected
(B)
Uninfected
control (C)
Legend : *10,000 Haemonchus contortus L3
Initial
infection*
Anthelminthic
treatment
Challenge
infection*
Number of sheep killed
0 30 45 49 75
+ + + n=5 n=5
- + + n=5 n=5
- + - n=4 n=4
+ + + n=4 n=5
- + + n=4 n=5
- + - n=3 n=4
Résultats
189

Table 2 : Forward and reverse primer sequences for quantitative reverse-transcriptase (RT) PCR.
Cytokine
Ovine Beta-actin
Ovine IFN-γ
Ovine IL-4
Ovine IL-10
Ovine TNF-α
Ovine IL-12p40
Ovine IL-13
Ovine Eotaxin
Ovine IL-5
Ovine IL-3
Forward sequence
ACCAGTTCGCCATGGATGAT
ATCTCTTTCGAGGCCGGAGA
GGAGCTGCCTGTAGCAGACG
CTGAGAACCATGGGCCTGAC
CCCGTCTGGACTTGGATCCT
GAATTCTCGGCAGGTGGAAG
AGAACCAGAAGGTGCCGCT
ACAAGAAAATCTGTGTTGATCCCC
CTGCTGATAGGTGATGGGAACTT
AAGAATATCCTGGCGAATAAGAGC
Reverse sequence
AGCCGTTGTCAACCACGAG
ATTGCAGGCAGGAGAACCAT
TTCTCAGTTGCGTTCTTTGGG
TCTCCCCCAGCGAGTTCAC
TGCTTTTGGTGCTCATGGTG
GTGCTCCACGTGTCAGGGTA
GGTTGAGGCTCCACACCATG
CCATGGCATTCTGGACCC
GGTGATTTGTATGCTGAGGAGTAGG
GAACGCTTTCAGGTTTGCCT
Tm amplicon (°C)
78
77
79
80
75
80
80
75
74
75
Résultats
190

Table 3 : Total worm burden, length and number of eggs in utero of adult female worms, stage and sex composition of Haemonchus contortus
populations.
Days post
challenge
4 dpc
(D49)
30 dpc
(D75)
Breed Group
INRA 401
BBB
INRA 401
BBB
Total worm
burden
(mean +/-
SD)
Adult female
length
(mean +/- SD)
Number of
eggs in utero
(mm)
(mean +/- SD)
L 4
(%)
Immature
males
(%)
Immature
females
(%)
Adult
males
(%)
A 1650 ± 467 a - - 100 - - - -
B 1892 ± 535 a - - 100 - - - -
A 695 ± 458 b - - 100 - - - -
B 1205 ± 246 b - - 100 - - - -
A 4370 ± 902 a 16.8 ± 1.2 a 334 ± 201 a 15 6 7 34 38
B 5558 ± 1763 a 19.8 ± 1.4 b 713 ± 129 b 6 2 4 41 47
A 4274 ± 1980 b 14.8 ± 1.9 a 234 ± 120 a 8 4 5 40 43
B 2465 ± 1623 a 14.6 ± 1.2 a 180 ± 70 a 10 12 13 35 30
a , b : At a given date, means with different letters on the same column are significantly different (P < 0.05).
Adult
females
(%)
Résultats
191

Captions of figures :
Résultats
Figure 1: Faecal egg excretions: (A) during the initial infection in BBB and INRA 401
groups A, and (B) following primary infection (groups B) and challenge infection (groups A)
of the two breeds. Each infected animal was orally drenched with 10.000 L3 of H. contortus.
Figure 2: Mean blood eosinophilia in BBB lambs (A) and INRA 401 lambs (B) during the
initial and challenge infections in groups A, and following primary infection in groups B of
the two breeds. Eosinophilia in control groups was also evaluated during the period of the
challenge infection.
Figure 3: Cytokine mRNA transcriptions for IL-4, IL-5 and IL-13 in the abomasal fundic
mucosa (AFM: A, C, E) and total abomasal lymph node (ALN: B, D, F) in all infected and
control groups at 4 and 30 dpc. Assays were performed in duplicate samples using an external
standard and results were expressed after normalisation (ratio) with a housekeeping gene
(ovine beta-actin).
Asterisks indicate significant statistical differences between the two breeds (P

Epg
Epg
30000
25000
20000
15000
10000
5000
0
30000
25000
20000
15000
10000
5000
0
A
D0 D16 D19 D21 D23 D26 D28 D30
B
Figure 1
Initial infection
D45 D61 D64 D66 D68 D71 D73 D75
Challenge infection
Résultats
INRA Group A
INRA Group B
BBB Group A
BBB Group B
193

Number of eosinophils per ml of whole blood
Number of eosinophils per ml of whole blood
Figure 2
500x10 3
400x10 3
300x10 3
200x10 3
100x10 3
0
500x10 3
400x10 3
300x10 3
200x10 3
100x10 3
0
A
D0 D5 D9 D16 D23 D30 D43 D47 D52 D59 D66 D73 D75
B
Anthelmintic treatment
Initial infection Challenge infection
Anthelmintic treatment
BBB Group A
BBB Group B
BBB Group C
INRA Group A
INRA Group B
INRA Group C
D0 D5 D9 D16 D23 D30 D43 D47 D52 D59 D66 D73 D75
Initial infection Challenge infection
Résultats
194

Résultats
195

Résultats
196

Discussion générale
CHAPITRE VI : DISCUSSION
GENERALE
197

1. REGULATION DES POPULATIONS DE NEMATODES CHEZ L’HOTE
1.1. Variations selon le parasite au sein de la race INRA 401
Discussion générale
L’objectif principal de nos travaux était d’étudier les mécanismes de régulation des
populations de strongles gastro-intestinaux en comparant des ovins exposés pour la première
fois au parasite et des ovins soumis à deux infestations successives séparées par un traitement
anti-parasitaire. Pour cela, la population parasitaire présente chez l’hôte a été évaluée par le
nombre total de vers et donc l’installation larvaire, le développement des vers chez l’hôte, la
fécondité des femelles et, in fine, l’intensité de l’excrétion fécale d’œufs. Au cours de nos
deux premières expérimentations, nous avons pu caractériser cette régulation dans la race
INRA 401 pour deux modèles de parasites : H. contortus et T. colubriformis. Dans ces deux
études, aucune différence d’installation larvaire n’a pu être mise en évidence entre les
animaux préalablement immunisés et les animaux naïfs, ce qui suggère que, chez les jeunes
ovins, la réponse immunitaire ne permet pas de contrôler l’intensité de l’infestation. Certains
auteurs estiment en effet que les jeunes ovins ne sont pas capables, de façon constitutive, de
réguler le nombre total de parasites qu’ils hébergent (Dineen et al., 1978 ; Schallig, 2000).
En revanche, dans le modèle H. contortus, le développement du parasite chez l’hôte était
clairement ralenti, avec une plus forte proportion de parasites immatures et la présence de
femelles plus courtes et moins prolifiques chez les agneaux préalablement immunisés. Ce
retard de développement a déjà été constaté chez des agneaux infestés par H. contortus
(Schallig et al., 1995) ou T. circumcincta (Stear et al., 1995a). Ainsi, dès la seconde
exposition au parasite, des agneaux de race INRA 401 sont capables d’influer sur divers traits
de vie des parasites en ralentissant leur développement et en diminuant la fécondité des
femelles adultes. Cette régulation se traduit notamment par un allongement de la période pré-
patente et surtout par une nette diminution de l’excrétion fécale d’œufs, avec toutes les
conséquences bénéfiques que cela peut avoir sur la contamination ultérieure des pâturages et
des autres animaux.
Les mécanismes de régulation de la population parasitaire semblent être toutefois différents
chez des ovins INRA 401 infestés par T. colubriformis. En effet, dans ce modèle les intensités
d’infestation observées entre des ovins préalablement exposés et des ovins naïfs étaient
identiques, tout comme le développement des vers chez l’hôte. Aucun retard de
développement, analogue à celui constaté avec les infestations par H. contortus n’a été noté.
La régulation des populations de ce parasite est toutefois réelle puisque, là encore, nous avons
mis en évidence un allongement de la période pré-patente ainsi qu’une réduction de
198

Discussion générale
l’excrétion fécale d’œufs lors de la deuxième infestation. Ceci suggère une réduction de la
taille et une diminution de la fécondité des femelles de T. colubriformis, comme ce que nous
avions démontré avec H. contortus. Dans ce modèle, des infestations répétées ou plus
massives semblent être nécessaires pour obtenir un effet marqué sur les divers traits de vie des
parasites.
1.2. Variations selon la race pour un même parasite : Haemonchus contortus
Les mécanismes de régulation des populations parasitaires entre races ovines ont pu être
appréhendés lors de notre dernière expérimentation d’infestations d’ovins sensibles (INRA
401) et résistants (Barbados Black Belly). Malheureusement, nous n’avons pu comparer la
régulation de T. colubriformis entre ces deux races, faute de temps et de disponibilité
d’animaux de race pure Barbados Black Belly.
Toutefois, les données obtenues avec le modèle H. contortus nous ont permis de confirmer la
résistance des ovins de race Barbados Black Belly aux nématodes gastro-intestinaux, comme
l’avaient déjà constaté d’autres auteurs (Yazwinski et al., 1979 ; Yazwinski et al., 1980 ;
Romjali et al., 1996 ; Aumont et al., 2003 ; Gruner et al., 2003 ; Vanimisetti et al., 2004).
Toutes ces études s’accordent pour montrer que l’excrétion fécale dans cette race est
nettement inférieure à celle que l’on peut constater chez des individus de race sensible,
comme les INRA 401. Cette diminution d’excrétion fécale peut trouver son origine dans
divers mécanismes non exclusifs affectant les traits de vie suivants du parasite :
- moindre installation des larves infestantes et donc charge parasitaire réduite chez
les animaux résistants,
- retard du développement des vers avec présence de vers adultes en plus faibles
proportions,
- taille réduite des femelles qui contiennent moins d’oeufs dans leur tractus génital.
Les traits de vie affectés lors d’infestations de Barbados Black Belly par H. contortus ne sont
pas connus avec certitude car de nombreuses discordances existent entre les études
disponibles. En effet, dans notre expérimentation, les ovins Barbados Black Belly exposés
pour la première fois à H. contortus ont une intensité d’infestation légèrement inférieure à
celle d’ovins de race INRA 401 préalablement immunisés, mais surtout des femelles
beaucoup plus courtes et moins prolifiques. Une infestation ultérieure des Barbados Black
Belly n’entraîne pas de résistance accrue, ce qui suggère que les mécanismes de régulation qui
influent sur les traits de vie des parasites sont actifs dès la première infestation dans cette race,
contrairement aux ovins d’une race sensible comme les INRA 401. En ce sens, nos résultats
199

Discussion générale
sont en désaccord avec l’étude de Aumont et al. (2003) pour qui une seconde infestation se
traduisait par une résistance accrue avec notamment une réduction de l’installation larvaire
chez des animaux préalablement immunisés.
De nouvelles infestations chez des animaux de race Barbados Black Belly, d’âges et de sexes
différents, ainsi que l’analyse exhaustive des paramètres parasitologiques (nombre total de
vers, cinétique du développement des vers chez l’hôte, taille et fécondité des femelles adultes,
excrétion fécale) devraient à terme éclairer les mécanismes gouvernant la moindre excrétion
fécale chez les individus résistants.
2. L’IMPLICATION DE LA REPONSE IMMUNITAIRE ADAPTATIVE DANS LA REGULATION DES
POPULATIONS DE NEMATODES GASTRO-INTESTINAUX
La comparaison de la dynamique de la réponse immunitaire adaptative i) entre deux modèles
de nématodes au sein d’une même race et ii) entre des ovins de race résistante et de race
sensible infestés par H. contortus, nous a permis de mieux cerner le rôle de cette réponse dans
la régulation des populations de strongles gastro-intestinaux.
2.1. Orientation de la réponse immunitaire adaptative : variations selon l’espèce de parasite
considérée
Nos travaux ont permis de démontrer clairement l’existence d’une réponse immunitaire
adaptative de type Th2 chez des ovins infestés par H. contortus. Cette réponse a été
pleinement caractérisée chez des ovins de race sensible (INRA 401) et de race résistante
(Barbados Black Belly). Cette infestation s’accompagne d’une transcription relativement
précoce et élevée des gènes des principales cytokines qui signent l’orientation Th2 (IL-4, IL-5
et IL-13). Elle est également associée à la mise en place d’effecteurs particuliers, avec une
éosinophilie sanguine et tissulaire marquée, ainsi qu’une infiltration par des mastocytes et des
globule leucocytes dans les muqueuses parasitées, et des réponses anticorps-spécifiques (IgA
et IgG) à la fois locales et systémiques. Dans ce modèle, nos travaux sont donc pleinement en
accord avec les données issues d’expérimentations sur modèles rongeurs (Finkelman et al.,
1997) et celles d’infestations naturelles chez l’homme (Cooper et al., 2000). Ils permettent
également de lever l’ambiguïté relative à l’existence ou non d’une dichotomie Th1/Th2 chez
les ruminants et en particulier chez les ovins (Brown et al., 1998 ; Gill et al., 2000).
Dans notre modèle d’infestation des ovins par T. colubriformis, l’orientation de la réponse
immunitaire adaptative semble moins claire, bien que la mise en place des réponses
200

Discussion générale
effectrices, cellulaires et humorales, semblent aller dans le sens d’une polarisation de type
Th2. En effet, en dépit de l’utilisation des mêmes techniques de détection, il ne nous a pas été
possible de démontrer l’existence d’une augmentation de la transcription des gènes des
cytokines Th2 dans la muqueuse duodénale ou le nœud lymphatique mésentérique drainant
des ovins infestés par ce parasite. L’absence de réponse Th2 apparente pourrait être la
conséquence de phénomènes non exclusifs :
- l’intensité de la réponse induite par ce parasite dans la muqueuse intestinale et le
système lymphatique associé pourrait être trop faible pour être détectée par les
techniques que nous avons mises en œuvre. En effet, la muqueuse intestinale,
contrairement à la muqueuse abomasale, représente le site majeur de présentation
de nombreux antigènes du non-soi (en particulier antigènes de la flore
commensale, antigènes alimentaires…). Les réponses initiées dans ce site du tube
digestif sont donc variées et complexes et pourraient masquer une réponse
spécifique initiée par T. colubriformis.
- les deux modèles de parasites que nous avons étudié diffèrent également par le
degré de contact avec leur hôte, notamment au stade adulte. H. contortus est en
effet un parasite qui dès le stade L4 se nourrit du sang de l’hôte. Les effractions
répétées de la membrane basale abomasale par le parasite pour atteindre les
vaisseaux sanguins du chorion multiplient donc ses contacts avec l’hôte et son
système immunitaire. A l’inverse, la localisation intra-épithéliale des adultes de T.
colubriformis (Miller, 1984), sans effraction de la membrane basale intestinale,
limitent le contact de ce parasite avec les cellules immunitaires de l’hôte présentes
dans le chorion. Ce contact plus limité pourrait donc être à l’origine de réponses
plus faibles de la part de l’hôte et expliquer la non détection d’une réponse Th2
claire dans nos expérimentations.
Les travaux récents menés sur des ovins de lignées résistantes ou sensibles infestés par T.
colubriformis plaident toutefois pour une orientation de type Th2 de la réponse immunitaire
dans ce modèle (expression accrue des gènes de l’IL-5 et de l’IL-13) sans toutefois de mise en
évidence d’une expression augmentée du gène de IL-4, cytokine pourtant considérée comme
clé de la réponse Th2 (Pernthaner et al., 2005) Le protocole expérimental utilisé dans cette
étude n’est cependant pas comparable avec nos travaux : utilisation de lignées divergentes
résistante et sensible au parasite, animaux plus âgés (environ 2 ans) et protocole
d’immunisation non maîtrisé (animaux laissés au pâturage). Des expériences d’immunisation
répétées avec T. colubriformis, ou avec des doses infestantes plus importantes, ainsi que
201

Discussion générale
l’infestation d’ovins résistants comme les Barbados Black Belly avec ce parasite
(expérimentation que nous n’avons pu mettre en place dans nos travaux de thèse) pourraient,
éventuellement, prouver l’existence d’une réelle polarisation Th2 dans ce modèle.
2.2. Orientation de la réponse immunitaire adaptative : variations selon la race ovine
considérée
Même s’il est évident que les Barbados Black Belly régulent plus efficacement leurs
populations parasitaires que des INRA 401, l’implication de la réponse immunitaire
adaptative dans ce phénomène demeure complexe. Lors d’une infestation, une réponse non
équivoque de type Th2 se met en place dans les deux races, avec une transcription des gènes
des principales cytokines impliquées dans cette polarisation. Toutefois, si l’intensité de cette
réponse cytokinique semble identique entre les deux races, la persistance accrue de
l’expression de ces gènes dans la race Barbados Black Belly pourrait être à l’origine d’une
meilleure efficacité de polarisation et donc de recrutement des effecteurs ayant un rôle dans la
régulation des populations parasitaires. Nous ne pouvons pas comparer nos travaux aux
données de la littérature puisqu’aucune étude ne s’est intéressée, à notre connaissance, à la
réponse cytokinique chez des races ovines considérées comme résistantes.
2.3. Rôle des mécanismes effecteurs dans la protection contre les nématodes gastro-
intestinaux
La cinétique des mécanismes effecteurs (réponses cellulaires locales et réponses humorales,
locales et systémiques) a pu être analysée au cours de nos deux premières expérimentations
sur des ovins de race INRA 401, infestés soit par H. contortus, soit par T. colubriformis, mais
également chez des ovins résistants Barbados Black Belly infestés par H. contortus. Malgré
l’absence d’orientation claire de la réponse immunitaire adaptative dans le modèle T.
colubriformis, les mécanismes effecteurs mis en jeu lors d’infestations par les deux parasites
que nous avons étudiés sont comparables et identiques à ceux classiquement décrits dans les
modèles rongeurs (Finkelman et al., 1997 ; Else et Finkelman, 1998). Nous observons en effet
un recrutement de mastocytes, polynucléaires éosinophiles et globule leucocytes dans les
muqueuses parasitées, qui s’accompagne d’une production accrue d’anticorps spécifiques de
classe IgA et IgG dans ces muqueuses et dans le sang circulant.
La cinétique de ces mécanismes effecteurs demeure toutefois différente entre des ovins
préalablement exposés au parasite et des ovins le rencontrant pour la première fois. En effet,
202

Discussion générale
chez des ovins naïfs, les réponses cellulaires et humorales se mettent en place
progressivement au cours de l’infestation par H. contortus. Chez des ovins préalablement
immunisés par cette espèce, ces réponses sont généralement présentes dès le premier point
d’étude (dans notre cas, 3 ou 4 jours après le challenge), plus intenses que chez les ovins naïfs
et se maintiennent à un niveau élevé tout au long de l’infestation. Toutefois, le dispositif
expérimental ne nous a pas permis de statuer entre i) une re-mobilisation rapide des effecteurs
cellulaires et humoraux lors d’une seconde infestation et ii) une persistance de ces effecteurs
entre les deux infestations successives malgré un traitement anthelminthique entre les deux.
Lors d’infestation par T. colubriformis, les mécanismes effecteurs ne se mettent en place
réellement que lors de la seconde infestation.
Dans nos trois expérimentations, des corrélations négatives ont été observées entre
l’infiltration cellulaire locale (mastocytes, éosinophiles et globule leucocytes) et la longueur
des femelles adultes et le nombre d’œufs qu’elles hébergeaient dans leur tractus génital. De
plus, des corrélations positives entre ces mêmes types cellulaires et la proportion de vers
immatures chez l’hôte ont été constatées. Ces données suggèrent que ces effecteurs cellulaires
pourraient jouer un rôle dans le retard de développement parasitaire chez l’hôte et la réduction
de l’excrétion fécale (Douch et al., 1996a ; Bricarello et al., 2004). Les polynucléaires
éosinophiles, comme les mastocytes / globule leucocytes sont considérés comme des éléments
importants de la réponse contre les infestations helminthiques et sont fréquemment associés à
l’expression de la résistance contre les strongles (Dawkins et al., 1989 ; Pfeffer et al., 1996 ;
Balic et al., 2000). Les polynucléaires éosinophiles sont même parfois considérés comme les
principales cellules effectrices de l’immunité protectrice contre les helminthes (Butterworth et
al., 1975) car elles peuvent tuer des larves d’helminthes in vitro en libérant des protéines
toxiques après dégranulation (Capron et al., 1984 ; Rainbird et al., 1998).
Les réponses anticorps locales et systémiques sont également positivement associées à la
proportion de vers immatures et négativement associées à la longueur des femelles adultes et
au nombre d’œufs contenus dans leur tractus génital. Ceci suggère que ces réponses
pourraient interférer avec le développement du parasite chez l’hôte. Toutefois, les
mécanismes par lesquels les IgG et les IgA influenceraient le développement et la fécondité
des parasites ne sont pas clairs : effet direct par neutralisation ou inactivation d’enzymes
métaboliques vitales du parasite (Gill et al., 1993), interférence avec la capacité du parasite à
se nourrir (Smith, 1988), participation aux réactions d’hypersensibilité associées aux
mastocytes ou aux polynucléaires éosinophiles (Meeusen et Balic, 2000 ; Klion et Nutman,
203

Discussion générale
2004) ? La réponse IgE n’a pas été envisagée dans nos travaux mais semble également
importante lors d’infestations par H. contortus, T. colubriformis (Kooyman et al., 1997) et T.
circumcincta (Huntley et al., 1998). Leur rôle dans l’expulsion rapide des adultes de T.
spiralis chez la souris est également bien connu (Else et Finkelman, 1998). L’étude de la
cinétique et de l’intensité des réponses IgE spécifiques dans nos modèles, ainsi que dans des
races ovines résistantes, serait nécessaire pour complèter l’étude globale des réponses
anticorps lors d’infestations par les nématodes gastro-intestinaux.
Dans ce domaine, nos travaux permettent de décrire une cinétique claire de mise en place des
mécanismes effecteurs (cellules et réponses anticorps-spécifiques) et d’établir des corrélations
avec les paramètres parasitologiques, mais ne démontrent pas avec certitude le rôle de ces
effecteurs sur la population parasitaire. L’exploration in vitro des effets des polynucléaires
éosinophiles sur la mobilité et le pouvoir infestant des larves L3, devrait permettre
prochainement de mieux comprendre le rôle de ces cellules sur les parasites. D’ores et déjà, il
semble que des larves infestantes d’H. contortus mises au contact pendant 24 heures avec des
fractions cellulaires enrichies en polynucléaires éosinophiles aient un taux d’installation
nettement inférieur à celui des larves infestantes n’ayant pas subi ce contact.
De plus, une autre étude menée avec des ovins Barbados Black Belly traités quotidiennement
avec du cromoglycate de sodium (famille des cromones), nous a permis de montrer que
l’administration de ces molécules levait de façon partielle la résistance de ces ovins. Le
cromoglycate de sodium est un stéroïde anti-allergique utilisé pour la prophylaxie de l’asthme
et des désordres inflammatoires gastro-intestinaux en médecine humaine. Son utilisation
permet de réduire la dégranulation mastocytaire, la libération précoce d’IL-5 dans le sang et
donc la mobilisation ultérieure des polynucléaires éosinophiles. Les résultats de cette étude
confortent donc le rôle des cellules mastocytaires, et probablement des polynucléaires
éosinophiles, dans la protection contre les nématodes gastro-intestinaux.
Dans notre expérimentation de comparaison inter-raciale, nous avons mesuré la transcription
des gènes des principales cytokines impliquées dans les deux grandes voies Th1/Th2 et la
dynamique et l’intensité du recrutement cellulaire dans la muqueuse abomasale à deux dates
seulement : J4 et J30. Ces mesures n’ont pas permis d’impliquer de façon certaine la réponse
immunitaire adaptative dans les différences parasitologiques majeures entre les deux races.
De nouvelles expérimentations comparant la réponse immunitaire adaptative entre race
sensible et race résistante sont nécessaires. L’addition d’un point de cinétique intermédiaire
204

Discussion générale
entre J4 et J30 (en particulier à J15, lors du pic d’éosinophilie sanguine) permettrait de
vérifier si un événement majeur surivent à ce moment de l’infestation. De même, le premier
point d’étude à 4 jours post-challenge est peut-être trop tardif pour mettre en évidence des
manifestations précoces de la réponse immunitaire.
3. PERSPECTIVES DANS LA COMPREHENSION DE LA RESISTANCE
Dans notre hypothèse initiale, l’intensité et la dynamique de la réponse immunitaire
adaptative étaient impliquées dans la différence de résistance observée entre les races
Barbados Black Belly et INRA 401. Or, dans notre dernière expérimentation, nous n’avons
pas mis en évidence de différences majeures dans les deux races étudiées. Dans un premier
lieu, il conviendrait de répéter ces expérimentations afin de confirmer nos premiers résultats.
La confirmation de ceux-ci permettrait alors d’envisager d’autres pistes pour la poursuite de
nos travaux dans la compréhension des mécanismes de résistance. Plusieurs points non
explorés ou en cours d’exploration mériteraient une attention particulière :
- le rôle de la réponse immunitaire innée,
- les mécanismes de régulation différentielle de la réponse immunitaire adaptative,
- et enfin, les différences d’expression géniques au moyen de techniques de DNA
micro-array ou de détection de régions du génome en relation avec la résistance
(QTL) pourraient nous orienter vers de nouveaux mécanismes de résistance.
3.1. Le rôle de la réponse immunitaire innée
Dans notre étude, les ovins Barbados Black Belly sont résistants à H. contortus dès la
première exposition à ce parasite. En effet, une immunisation préalable de ces animaux
n’entraîne pas de résistance accrue par comparaison avec des ovins naïfs, à l’inverse de ce que
nous avons pu observer dans la race INRA 401.
Ainsi, le rôle de la réponse immunitaire innée dans l’explication du phénomène de résistance
n’est pas à écarter (Tosi, 2005). Plusieurs aspects pourraient avoir leur importance dans une
résistance innée :
- le rôle de la réponse inflammatoire précoce (24-48 heures) lors d’une infestation et
en particulier le rôle des cellules phagocytaires (macrophages, et à un degré
moindre polynucléaires neutrophiles). Ces cellules représentent des effecteurs
essentiels de l’immunité innée (Basset et al., 2003). Les macrophages possèdent
des PRR qui leur permettent de reconnaître spécifiquement certains micro-
205

Discussion générale
organismes et de déclencher toute une cascade de mécanismes oxydatifs et non-
oxydatifs. De plus, les cytokines qu’ils sécrétent (IL-1β, TNF-α, IL-8…)
pourraient orienter très précocèment la réponse immunitaire et donc permettre la
mise en place rapide de mécanismes effecteurs dirigés contre les larves infestantes
(Basset et al., 2003).
- l’épithélium gastro-intestinal constitue la première ligne de défense de l’hôte
(Basset et al., 2003). Les mucines, sécrétées à sa surface par les cellules
caliciformes, sont variables à la fois dans leur quantité mais aussi dans leur nature.
Chez le cobaye, des différences quantitatives et qualitatives des mucines de
l’intestin ont été montrées entre lignées résistantes et sensibles à une infestation
par T. colubriformis. La proportion de mucines sulphonées augmente plus
précocément et plus intensément chez des cobayes de lignées résistantes dès la
première exposition au parasite (Manjili et al., 1998). Ainsi, la composition
chimique et la quantité de ces mucines pourraient être physiologiquement
différentes entre les races ovines.
- l’environnement gastro-intestinal (pH, motricité musculaire lisse…) pourrait
également être impliqué dans la protection contre l’installation des larves
infestantes. Chez la souris, une association positive a été démontrée entre
l’intensité de la contraction des muscles lisses intestinaux et la capacité de l’hôte à
expulser les parasites : des souris NIH Swiss, expulsant très rapidement des T.
spiralis adultes, ont un très fort degré de contraction musculaire, alors que des
souris B10.BR ont une contraction moindre et expulsent moins rapidement les
parasites (Vallance et al., 1997). Là encore, des variations physiologiques inter-
races chez les ovins pourraient être impliquées dans les mécanismes innés de
résistance.
3.2. Régulation de la réponse immunitaire adaptative
La régulation de la réponse immunitaire adaptative est un concept relativement récent et son
implication dans le contrôle de la réponse immunitaire mise en jeu lors d’infestations
parasitaires commence à être étudié dans des modèles rongeurs (Maizels et al., 2004). Le rôle
des lymphocytes T régulateurs (CD4+CD25+) en particulier semble intéressant. Ces
lymphocytes sécrètent des cytokines anti-inflammatoires telles que l’IL-10 et le TGF-β, qui
ont la particularité de diminuer les réponses Th1 et Th2 (Akdis et al., 2005 ; Chatila, 2005).
Leur induction lors d’infestations par des nématodes gastro-intestinaux est supposée chez la
206

Discussion générale
souris infestée par H. polygyrus (Maizels et al., 2004). Les effets de cette population
lymphocytaire sur les mécanismes effecteurs de la réponse immunitaire adaptative pourraient
expliquer l’atténuation des réponses observées chez les ovins parasités et la survie prolongée
des strongles. Dans nos travaux, nous avons effectivement constaté une diminution,
généralement à 30 jours post-infestation, de l’expression des gènes des cytokines Th2 chez les
ovins INRA 401, alors que cette expression semblait plus persistante chez des Barbados Black
Belly. Dans cette dernière race, l’induction des lymphocytes T régulateurs pourrait être moins
intense ou moins précoce et i) expliquer une meilleure persistance du recrutement des cellules
effectrices et favoriser leur action anti-parasitaire et ii) in fine jouer un rôle majeur dans la
régulation des populations parasitaires. L’exploration de cette population particulière de T
lymphocytes entre races ovines pourrait se faire notamment par techniques de cytométrie de
flux sur des fractions lymphocytaires, isolées soit du sang total, soit des noeuds lymphatiques.
L’analyse couplée de l’expression du marqueur CD25+ au sein de la population de
lymphocytes CD4+ apporterait de premiers renseignements sur leur présence et leur nombre
entre races ovines.
3.3. L’exploration de la résistance : aspects génétiques et identification de gènes candidats
Les différences de résistance aux strongles gastro-intestinaux entre races ovines trouvent
vraisembablement leur origine dans des variations d’ordre génétique. Ainsi, l’exploration du
génome de ces ovins constitue une nouvelle piste de recherche dans la compréhension des
phénomènes de résistance.
Au cours de la dernière décennie, de nombreux travaux ont mis en évidence, soit par études
d’associations (Coltman et al., 2001 ; Paterson et al., 2001 ; Benavides et al., 2002) soit par
détection de QTL (Beh et al., 2002 ; Davies et al., 2006), l’existence de gènes impliqués dans
la résistance aux parasites internes chez les ovins. La plupart des scans génomiques, complets
ou partiels, révèlent l’existence de QTL sur les chromosomes 1, 3, 6, 19 et 20 pour l’intensité
de l’excrétion d’oeufs lors d’infestations par T. colubriformis ou H. contortus. Les
associations entre ces QTL et des marqueurs ou gènes sont souvent fréquentes pour la région
de l’IFN-γ (Coltman et al., 2001) ou le CMH (Schwaiger et al., 1995 ; Stear et al., 1996 ;
Charon et al., 2000), ce qui conforte les hypothèses de l’implication de la réponse
immunitaire dans les mécanismes de résistance aux strongles gastro-intestinaux. Une étude
très récente de recherche de QTL sur 1046 ovins backcross Barbados Black Belly x INRA
401 infestés par H. contortus, a mis en évidence un QTL sur le chromosome 5, dans la région
des gènes de l’IL-3, IL-4 et IL-5 (Moreno et al., 2006), qui pourraient être des gènes candidats
207

Discussion générale
d’importance majeure, ainsi que l’avaient suspecté Benavides et al. (2002) par des études
d’associations.
La technologie des DNA micro-arrays est également devenue un outil majeur pour répondre à
des questions biologiques complexes grâce à l’analyse de l’expression de milliers de gènes
(Diez-Tascon et al., 2005). Les premiers résultats obtenus avec cette technique montrent une
expression différentielle de certains gènes entre des ovins de race résistante et de race sensible
lors de parasitisme gastro-intestinal. Diez-Tascon et al. (2005) démontrent notamment une
expression différente de gènes impliqués dans le développement de la réponse immunitaire
adaptative (CMH) et la structure de la musculature lisse intestinale. Ces résultats confortent
d’une part l’implication probable de la réponse immunitaire dans la résistance aux nématodes
gastro-intestinaux, mais également la possible implication de mécanismes physiologiques
différents entre races, comme l’effet des contractions musculaires lisses de l’intestin.
Toutefois, les DNA micro-arrays disponibles à l’heure actuelle sont développés dans l’espèce
bovine, pour laquelle le génome complet a été décrypté. La mise au point future de DNA
micro-arrays spécifiques ainsi que le séquençage complet du génome ovin seront évidemment
indispensables pour des études plus poussées dans cette espèce.
Ces techniques relativement récentes de recherche de QTL ou de gènes candidats impliqués
dans la résistance aux nématodes gastro-intestinaux n’en sont qu’à leurs débuts et la poursuite
des investigations entre races sensibles et résistantes par ces nouvelles technologies pourrait,
dans un avenir proche, permettre de mieux comprendre les bases de la résistance de certaines
races ovines lors de parasitisme gastro-intestinal.
4. CONCLUSION
Nos travaux de thèse ont permis de mieux caractériser la dynamique et l’orientation de la
réponse immunitaire adaptative des ovins lors d’infestations par deux espèces de nématodes
gastro-intestinaux, H. contortus et T. colubriformis. Sans apporter d’explication mécanistique
du contrôle des populations de strongles, ils nous ont permis de conforter le rôle probable de
certains types cellulaires (mastocytes et polynucléaires éosinophiles notamment) ainsi que des
réponses humorales dans la protection de l’hôte lors d’infestations parasitaires. La
comparaison entre deux races ovines, l’une résistante, l’autre sensible, a mis en évidence une
réponse immunitaire adaptative relativement comparable, qui ne nous permet toutefois pas
d’expliquer les différences parasitologiques majeures observées entre ces deux races.
Les moyens de lutte contre les strongles gastro-intestinaux pourraient à l’avenir se baser sur la
sélection d’animaux résistants ou sur des schémas de vaccination efficaces. Toutefois, la
208

Discussion générale
connaissance imparfaite des mécanismes de réponse immunitaire et de régulation des
populations parasitaires, et de la nature des antigènes parasitaires protecteurs, constituent
encore un frein majeur à l’application de ces méthodes. Dans ce domaine, les investigations se
multiplient et les résultats obtenus sont très encourageants quant à l’aboutissement, à plus ou
moins court terme, de moyens de lutte alternatifs aux traitements anthelminthiques.
209

Références bibliographiques
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
210

Références bibliographiques
Adams, D.B., 1982, Time of onset and target of immune reactions in sheep with acquired immunity against
Haemonchus contortus. Int J Parasitol 12, 439-443.
Adams, D.B., 1988, Infection with Haemonchus contortus in sheep and the role of adaptive immunity in
selection of the parasite. Int J Parasitol 18, 1071-1075.
Adams, D.B., Lynch, J.J., Anderson, B.H., Fell, L.R., Hinch, G.N., Munro, R.K., 1990, The intensity of
resistance by mature Merino ewes against Haemonchus contortus and Trichostrongylus colubriformis in
single-species and combined-species infection. Aust Vet J 67, 443-445.
Ahmad, A., Wang, C.H., Korenaga, M., Bell, R.G., Adams, L.S., 1990, Synergistic interaction between immune
serum and thoracic duct cells in the adoptive transfer of rapid expulsion of Trichinella spiralis in adult
rats. Exp Parasitol 71, 90-99.
Akdis, M., Blaser, K., Akdis, C.A., 2005, T regulatory cells in allergy: novel concepts in the pathogenesis,
prevention, and treatment of allergic diseases. J Allergy Clin Immunol 116, 961-968; quiz 969.
Albers, G.A., Gray, G.D., Piper, L.R., Barker, J.S., Le Jambre, L.F., Barger, I.A., 1987, The genetics of
resistance and resilience to Haemonchus contortus infection in young merino sheep. Int J Parasitol 17,
1355-1363.
Albers, G.A., Burgess, S.K., 1988, Serial passage of Haemonchus contortus in resistant and susceptible sheep.
Vet Parasitol 28, 303-306.
Almeria, S., Canals, A., Zarlenga, D.S., Gasbarre, L.C., 1997, Quantification of cytokine gene expression in
lamina propria lymphocytes of cattle following infection with Ostertagia ostertagi. J Parasitol 83, 1051-
1055.
Amarante, A.F., Craig, T.M., Ramsey, W.S., Davis, S.K., Bazer, F.W., 1999, Nematode burdens and cellular
responses in the abomasal mucosa and blood of Florida Native, Rambouillet and crossbreed lambs. Vet
Parasitol 80, 311-324.
Andreoletti, O., Berthon, P., Levavasseur, E., Marc, D., Lantier, F., Monks, E., Elsen, J.M., Schelcher, F., 2002,
Phenotyping of protein-prion (PrPsc)-accumulating cells in lymphoid and neural tissues of naturally
scrapie-affected sheep by double-labeling immunohistochemistry. J Histochem Cytochem 50, 1357-
1370.
Andrews, S.J., Hole, N.J., Munn, E.A., Rolph, T.P., 1995, Vaccination of sheep against haemonchosis with H11,
a gut membrane-derived protective antigen from the adult parasite: prevention of the periparturient rise
and colostral transfer of protective immunity. Int J Parasitol 25, 839-846.
Athanasiadou, S., Kyriazakis, I., Jackson, F., Coop, R.L., 2000, Effects of short-term exposure to condensed
tannins on adult Trichostrongylus colubriformis. Vet Rec 146, 728-732.
Athanasiadou, S., Kyriazakis, I., Jackson, F., Coop, R.L., 2001, Direct anthelmintic effects of condensed tannins
towards different gastrointestinal nematodes of sheep: in vitro and in vivo studies. Vet Parasitol 99,
205-219.
Aumont, G., Gruner, L., Hostache, G., 2003, Comparison of the resistance to sympatric and allopatric isolates of
Haemonchus contortus of Black Belly sheep in Guadeloupe (FWI) and of INRA 401 sheep in France.
Vet Parasitol 116, 139-150.
Baird, A.W., O'Malley, K.E., 1993, Epithelial ion transport - possible contribution to parasite expulsion.
Parasitol Today 9, 141-143.
Baker, R.L., 1997, Résistance génétique des petits ruminants aux helminthes en Afrique. INRA Productions
Animales 10, 99-110.
211

Références bibliographiques
Baker, R.L., Mwamachi, D.M., Audho, J.O., Aduda, E.O., Thorpe, W., 1998, Resistance of Galla and Small East
African goats in the sub-humid tropics to gastrointestinal nematode infections and the peri-parturient
rise in faecal egg counts. Vet Parasitol 79, 53-64.
Balic, A., Bowles, V.M., Meeusen, E.N., 2000, The immunobiology of gastrointestinal nematode infections in
ruminants. Adv Parasitol 45, 181-241.
Balic, A., Harcus, Y., Holland, M.J., Maizels, R.M., 2004, Selective maturation of dendritic cells by
Nippostrongylus brasiliensis-secreted proteins drives Th2 immune responses. Eur J Immunol 34, 3047-
3059.
Bancroft, A.J., Else, K.J., Grencis, R.K., 1994, Low-level infection with Trichuris muris significantly affects the
polarization of the CD4 response. Eur J Immunol 24, 3113-3118.
Bancroft, A.J., McKenzie, A.N., Grencis, R.K., 1998, A critical role for IL-13 in resistance to intestinal
nematode infection. J Immunol 160, 3453-3461.
Bancroft, A.J., Else, K.J., Humphreys, N.E., Grencis, R.K., 2001, The effect of challenge and trickle Trichuris
muris infections on the polarisation of the immune response. Int J Parasitol 31, 1627-1637.
Barger, I.A., 1985a, The statistical distribution of trichostrongylid nematodes in grazing lambs. Int J Parasitol
15, 645-649.
Barger, I.A., Le Jambre, L.F., Georgi, J.R., Davies, H.I., 1985b, Regulation of Haemonchus contortus
populations in sheep exposed to continuous infection. Int J Parasitol 15, 529-533.
Barger, I.A., Le Jambre, L.F., 1988, Regulation of Haemonchus contortus populations in sheep: mortality of
established worms. Int J Parasitol 18, 269-273.
Barger, I.A., 1989, Genetic resistance of hosts and its influence on epidemiology. Vet Parasitol 32, 21-35.
Barker, I.K., 1973, A study of the pathogenesis of Trichostrongylus colubriformis infection in lambs with
observations on the contribution of gastrointestinal plasma loss. Int J Parasitol 3, 743-757.
Barnes, E.H., Dobson, R.J., 1990, Population dynamics of Trichostrongylus colubriformis in sheep:
mathematical model of worm fecundity. Int J Parasitol 20, 375-380.
Barnes, E.H., Dobson, R.J., 1993, Persistence of acquired immunity to Trichostrongylus colubriformis in sheep
after termination of infection. Int J Parasitol 23, 1019-1026.
Basset, C., Holton, J., O'Mahony, R., Roitt, I., 2003, Innate immunity and pathogen-host interaction. Vaccine 21
Suppl 2, S12-23.
Beh, K.J., 1987, Production and characterization of monoclonal antibodies specific for sheep IgG subclasses
IgG1 or IgG2. Vet Immunol Immunopathol 14, 187-196.
Beh, K.J., 1988, Monoclonal antibodies against sheep immunoglobulin light chain, IgM and IgA. Vet Immunol
Immunopathol 18, 19-27.
Beh, K.J., Callaghan, M.J., Hulme, D.J., Leish, Z., DiIenno, K., Lenane, I., 1998, A search for genes affecting
gastrointestinal parasite resistance in sheep. Proceedings of the 26th International Conference on
Animal Genetics, Abstract E033, 102-103.
Beh, K.J., Hulme, D.J., Callaghan, M.J., Leish, Z., Lenane, I., Windon, R.G., Maddox, J.F., 2002, A genome
scan for quantitative trait loci affecting resistance to Trichostrongylus colubriformis in sheep. Anim
Genet 33, 97-106.
Behm, C.A., Ovington, K.S., 2000, The role of eosinophils in parasitic helminth infections: insights from
genetically modified mice. Parasitol Today 16, 202-209.
212

Références bibliographiques
Behnke, J.M., Barnard, C.J., Wakelin, D., 1992, Understanding chronic nematode infections: evolutionary
considerations, current hypotheses and the way forward. Int J Parasitol 22, 861-907.
Behnke, J.M., Iraqi, F., Menge, D., Baker, R.L., Gibson, J., Wakelin, D., 2003, Chasing the genes that control
resistance to gastrointestinal nematodes. J Helminthol 77, 99-110.
Bell, A., Ranford-Cartwright, L., 2002, Real-time quantitative PCR in parasitology. Trends Parasitol 18, 338.
Benavides, M.V., Weimer, T.A., Borba, M.F.S., Berne, M.E.A., Sacco, A.M.S., 2002, Associations between
microsatellite markers of sheep chromosome 5 and faecal egg counts. Small Ruminant Research 46, 97-
105.
Bendixsen, T., Bosward, K.L., Emery, D.L., 2003, Production and characterisation of monoclonal antibodies to
ovine interleukin-5. Parasitol Int 52, 281-290.
Béné, M.C., Faure, G.C., 2000, Immunité innée et congnitive aux interfaces muqueuses. Revue française des
laboratoires 327, 49-55.
Beugnet, F., Gevrey, J., Kerboeuf, D., 1997, Les endectocides : mode d'action et d'utilisation. Point vétérinaire
Numéro Spécial "Parasitologie des Ruminants" 28, 133-137.
Beugnet, F., Kerboeuf, D., 1997, La résistance aux antiparasitaires chez les parasites des ruminants. Point
vétérinaire Numéro Spécial "Parasitologie des Ruminants" 28, 167-174.
Bishop, S.C., Stear, M.J., 2000, The use of a gamma-type function to assess the relationship between the number
of adult Teladorsagia circumcincta and total egg output. Parasitology 121 ( Pt 4), 435-440.
Bisset, S.A., Morris, C.A., Squire, D.R., Hickey, S.M., Wheeler, M., 1994, Genetics of resilience to nematode
parasites in sheep. N Zeal J Agric Research 37, 521-534.
Bisset, S.A., Vlassoff, A., Douch, P.G., Jonas, W.E., West, C.J., Green, R.S., 1996, Nematode burdens and
immunological responses following natural challenge in Romney lambs selectively bred for low or high
faecal worm egg count. Vet Parasitol 61, 249-263.
Bisset, S.A., Vlassoff, A., West, C.J., 1991, Proceedings 21st seminar of the sheep and beef society. New Zeland
Veterinary Society, 83.
Bjorn, H., 1994, Workshop summary: anthelmintic resistance. Vet Parasitol 54, 321-325.
Blackburn, C.C., Selkirk, M.E., 1992, Inactivation of platelet-activating factor by a putative acetylhydrolase
from the gastrointestinal nematode parasite Nippostrongylus brasiliensis. Immunology 75, 41-46.
Blackhall, W.J., Prichard, R.K., Beech, R.N., 2003, Selection at a gamma-aminobutyric acid receptor gene in
Haemonchus contortus resistant to avermectins/milbemycins. Mol Biochem Parasitol 131, 137-145.
Blitz, N.M., Gibbs, H.C., 1971, An observation on the maturation of arrested Haemonchus contortus larvae in
sheep. Can J Comp Med 35, 178-179.
Borgsteede, F.H., Roos, M.H., Smith, G., Prichard, R.K., 1996, Workshop summary: anthelmintic resistance.
Vet Parasitol 64, 129-132.
Bottjer, K.P., Klesius, P.H., Bone, L.W., 1985, Effects of host serum on feeding by Trichostrongylus
colubriformis (nematoda). Parasite Immunol 7, 1-9.
Bowman, D.D., 1999, Georgi's Parasitology for Veterinarians, Seventh Edition Philadelphia, 414 p.
Bown, M.D., Poppi, D.P., Sykes, A.R., 1991, The effect of post-ruminal infusion of protein or energy on the
physiopathology of Trichostrongylus colubriformis infection and body composition in lambs. Aust J
Agric Res 42, 253-267.
213

Références bibliographiques
Bradley, R.E., Radhakrishnan, C.V., Patil-Kulkarni, C.G., Loggins, P.E., 1973, Responses in Florida Native and
Rambouillet lambs exposed to one and two oral doses of Haemonchus contortus. Am J Vet Res 34,
729-735.
Bricarello, P.A., Gennari, S.M., Oliveira-Sequeira, T.C.G., Vaz, C.M.S.L., Gonçalves de Gonçalves, I.,
Echevarria, F.A.M., 2004, Worm burden and immunological responses in Corriedale and Crioula
Lanada sheep following natural infection with Haemonchus contortus. Small Ruminant Research 51,
75-83.
Brown, M.A., Pierce, J.H., Watson, C.J., Falco, J., Ihle, J.N., Paul, W.E., 1987, B cell stimulatory factor-
1/interleukin-4 mRNA is expressed by normal and transformed mast cells. Cell 50, 809-818.
Brown, W.C., Rice-Ficht, A.C., Estes, D.M., 1998, Bovine type 1 and type 2 responses. Vet Immunol
Immunopathol 63, 45-55.
Buddle, B.M., Jowett, G., Green, R.S., Douch, P.G., Risdon, P.L., 1992, Association of blood eosinophilia with
the expression of resistance in Romney lambs to nematodes. Int J Parasitol 22, 955-960.
Bueno, L., 1982, Comment s'expliquent les troubles digestifs liés à l'haemonchose ovine ? Point Vétérinaire 13,
33-39.
Burke, J.M., Miller, J.E., 2002, Relative resistance of Dorper crossbred ewes to gastrointestinal nematode
infection compared with St. Croix and Katahdin ewes in the southeastern United States. Vet Parasitol
109, 265-275.
Butterworth, A.E., Sturrock, R.F., Houba, V., Mahmoud, A.A., Sher, A., Rees, P.H., 1975, Eosinophils as
mediators of antibody-dependent damage to schistosomula. Nature 256, 727-729.
Butterworth, A.E., 1984, Cell-mediated damage to helminths. Adv Parasitol 23, 143-235.
Cabaret, J., 2004, Parasitisme helminthique en élevage biologique ovin : réalités et moyens de contrôle. INRA
Productions Animales 17.
Canals, A., Zarlenga, D.S., Almeria, S., Gasbarre, L.C., 1997, Cytokine profile induced by a primary infection
with Ostertagia ostertagi in cattle. Vet Immunol Immunopathol 58, 63-75.
Capron, M., Nogueira-Queiroz, J.A., Papin, J.P., Capron, A., 1984, Interactions between eosinophils and
antibodies: in vivo protective role against rat schistosomiasis. Cell Immunol 83, 60-72.
Capron, M., 1993, Eosinophiles et maladies parasitaires. Aspects fonctionnels. Editions Techniques - Encycl.
Med. Chir. Maladies infectieuses - Pédiatrie, 4p.
Charon, K.M., Gruszczynska, J., Moskwa, B., 2000, Relationship between polymorphism in DRB1 gene and
nematode fecal egg count in sheep. Proceedings of the 27th International Conference on Animal
Genetics, Abstract C011.
Chartier, C., Soubirac, F., Pors, I., Silvestre, A., Hubert, J., Couquet, C., Cabaret, J., 2001, Prevalence of
anthelmintic resistance in gastrointestinal nematodes of dairy goats under extensive management
conditions in southwestern France. J Helminthol 75, 325-330.
Chatila, T.A., 2005, Role of regulatory T cells in human diseases. J Allergy Clin Immunol 116, 949-959; quiz
960.
Chermette, R., 1982, L'haemonchose ovine et ses particularités : importance et situation actuelle en France. Point
Vétérinaire 13, 21-28.
Claerebout, E., Hilderson, H., Meeus, P., De Marez, T., Behnke, J., Huntley, J., Vercruysse, J., 1996, The effect
of truncated infections with Ostertagia ostertagi on the development of acquired resistance in calves.
Vet Parasitol 66, 225-239.
214

Références bibliographiques
Claerebout, E., Dorny, P., Agneessens, J., Demeulenaere, D., Vercruysse, J., 1999, The effect of first season
chemoprophylaxis in calves on second season pasture contamination and acquired resistance and
resilience to gastrointestinal nematodes. Vet Parasitol 80, 289-301.
Claerebout, E., Vercruysse, J., 2000, The immune response and the evaluation of acquired immunity against
gastrointestinal nematodes in cattle: a review. Parasitology 120 Suppl, S25-42.
Clark, R., Kupper, T., 2005, Old meets new: the interaction between innate and adaptive immunity. J Invest
Dermatol 125, 629-637.
Coffman, R.L., von der Weid, T., 1997, Multiple pathways for the initiation of T helper 2 (Th2) responses. J Exp
Med 185, 373-375.
Coles, G.C., Borgsteede, F.H., Geerts, S., 1994, Recommendations for the control of anthelmintic resistant
nematodes of farm animals in the EU. Vet Rec 134, 205-206.
Coles, G.C., 2005, Anthelmintic resistance--looking to the future: a UK perspective. Res Vet Sci 78, 99-108.
Coltman, D.W., Wilson, K., Pilkington, J.G., Stear, M.J., Pemberton, J.M., 2001, A microsatellite polymorphism
in the gamma interferon gene is associated with resistance to gastrointestinal nematodes in a naturallyparasitized
population of Soay sheep. Parasitology 122, 571-582.
Coop, R.L., 1981, Feed intake and utilization by the parasitized ruminant. In : Isotypes and Radiation in
Parasitology VI. Vienna: IAEA.
Coop, R.L., Holmes, P.H., 1996, Nutrition and parasite interaction. Int J Parasitol 26, 951-962.
Coop, R.L., Kyriazakis, I., 1999, Nutrition-parasite interaction. Vet Parasitol 84, 187-204.
Coop, R.L., Kyriazakis, I., 2001, Influence of host nutrition on the development and consequences of nematode
parasitism in ruminants. Trends Parasitol 17, 325-330.
Cooper, P.J., Chico, M.E., Sandoval, C., Espinel, I., Guevara, A., Kennedy, M.W., Urban Jr, J.F., Griffin, G.E.,
Nutman, T.B., 2000, Human infection with Ascaris lumbricoides is associated with a polarized cytokine
response. J Infect Dis 182, 1207-1213.
Courtney, C.H., Parker, C.F., McClure, K.E., Herd, R.P., 1984, A comparison of the periparturient rise in fecal
egg counts of exotic and domestic ewes. Int J Parasitol 14, 377-381.
Courtney, C.H., Parker, C.F., McClure, K.E., Herd, R.P., 1985, Resistance of nonlambing exotic and domestic
ewes to naturally acquired gastrointestinal nematodes. Int J Parasitol 15, 239-243.
Coyne, M.J., Smith, G., Johnstone, C., 1991, A study of the mortality and fecundity of Haemonchus contortus in
sheep following experimental infections. Int J Parasitol 21, 847-853.
Coyne, M.J., Smith, G., 1992a, The development and mortality of the free-living stages of Haemonchus
contortus in laboratory culture. Int J Parasitol 22, 641-650.
Coyne, M.J., Smith, G., 1992b, The mortality and fecundity of Haemonchus contortus in parasite-naive and
parasite-exposed sheep following single experimental infections. Int J Parasitol 22, 315-325.
Coyne, C.P., Brake, D., 2001, Characterisation of Haemonchus contortus-derived cell populations propagated in
vitro in a tissue culture environment and their potential to induce protective immunity in sheep. Int J
Parasitol 31, 359-376.
Crawford, A.M., McEwan, J.C., Dodds, K.G., Wright, C.S., Bisset, S.A., MacDonald, P.A., Knowler, K.J.,
Greer, G.J., Shaw, R.J., Paterson, K.A., Cuthbertson, R.P., Vlassoff, A., Squire, D.R., West, C.J., Phua,
S.H., 1997, Resistance to nematode parasites in sheep : how important are the MHC genes ? Proc Assoc
Adv Anim Breed Gen 12, 58-62.
215

Références bibliographiques
Crawford, A.M., 1998a, Searching for disease resistance QTL. Proceedings of the 26th International Conference
on Animal Genetics, Abstract P010, 7-8.
Crawford, A.M., McEwan, J.C., 1998b, Identification of animals resistant to nematode parasite infection. New
Zeland Provisional Patent 330 201, New Zeland.
Culley, F.J., Brown, A., Conroy, D.M., Sabroe, I., Pritchard, D.I., Williams, T.J., 2000, Eotaxin is specifically
cleaved by hookworm metalloproteases preventing its action in vitro and in vivo. J Immunol 165, 6447-
6453.
Dargie, J.D., 1992, The influence of genetic factors on the resistance of ruminants to gastro-intestinal nematode
and Trypanosome infections, In: Animal Models in Parasitology (Owen, D.G., Ed.).McMillan Press
Ltd, London, UK, pp. 17-51.
Davies, G., Stear, M.J., Benothman, M., Abuagob, O., Kerr, A., Mitchell, S., Bishop, S.C., 2006, Quantitative
trait loci associated with parasitic infection in Scottish blackface sheep. Heredity 96, 252-258.
Dawkins, H.J., Windon, R.G., Eagleson, G.K., 1989, Eosinophil responses in sheep selected for high and low
responsiveness to Trichostrongylus colubriformis. Int J Parasitol 19, 199-205.
Dawkins, H.J., Windon, R.G., Outteridge, P.M., Dineen, J.K., 1988, Cellular and humoral responses of sheep
with different levels of resistance to Trichostrongylus colubriformis. Int J Parasitol 18, 531-537.
Del Pozo, V., De Andres, B., Martin, E., Cardaba, B., Fernandez, J.C., Gallardo, S., Tramon, P., Leyva-Cobian,
F., Palomino, P., Lahoz, C., 1992, Eosinophil as antigen-presenting cell: activation of T cell clones and
T cell hybridoma by eosinophils after antigen processing. Eur J Immunol 22, 1919-1925.
Desreumaux, P., Janin, A., Colombel, J.F., Prin, L., Plumas, J., Emilie, D., Torpier, G., Capron, A., Capron, M.,
1992, Interleukin 5 messenger RNA expression by eosinophils in the intestinal mucosa of patients with
coeliac disease. J Exp Med 175, 293-296.
Diez-Tascon, C., MacDonald, P.A., Dodds, K.G., McEwan, J.C., Crawford, A.M., 2002, A screen of
chromosome 1 for QTL affecting nematode resistance in an ovine outcross population. Proc 7th World
Cong Genet Appl Livest Prod, Montpellier, 19-23 August, INRA, Castanet-Tolosan, France, 13-37.
Diez-Tascon, C., Keane, O.M., Wilson, T., Zadissa, A., Hyndman, D.L., Baird, D.B., McEwan, J.C., Crawford,
A.M., 2005, Microarray analysis of selection lines from outbred populations to identify genes involved
with nematode parasite resistance in sheep. Physiol Genomics 21, 59-69.
Dineen, J.K., Donald, A.D., Wagland, B.M., Turner, J.H., 1965, The Dynamics of the Host-Parasite
Relationship. Ii. The Response of Sheep to Primary and Secondary Infection with Nematodirus
Spathiger. Parasitology 55, 163-171.
Dineen, J.K., Wagland, B.M., 1966, The dynamics of the host-parasite relationship. IV. The response of sheep to
graded and to repeated infection with Haemonchus contortus. Parasitology 56, 639-650.
Dineen, J.K., Gregg, P., Lascelles, A.K., 1978, The response of lambs to vaccination at weaning with irradiated
Trichostrongylus colubriformis larvae: segregation into 'responders' and 'non-responders'. Int J Parasitol
8, 59-63.
Dobson, R.J., Donald, A.D., Barnes, E.H., Waller, P.J., 1990, Population dynamics of Trichostrongylus
colubriformis in sheep: model to predict the worm population over time as a function of infection rate
and host age. Int J Parasitol 20, 365-373.
Dobson, R.J., LeJambre, L., Gill, J.H., 1996, Management of anthelmintic resistance: inheritance of resistance
and selection with persistent drugs. Int J Parasitol 26, 993-1000.
Doetze, A., Satoguina, J., Burchard, G., Rau, T., Loliger, C., Fleischer, B., Hoerauf, A., 2000, Antigen-specific
cellular hyporesponsiveness in a chronic human helminth infection is mediated by T(h)3/T(r)1-type
216

Références bibliographiques
cytokines IL-10 and transforming growth factor-beta but not by a T(h)1 to T(h)2 shift. Int Immunol 12,
623-630.
Dombrowicz, D., Capron, M., 2001, Eosinophils, allergy and parasites. Curr Opin Immunol 13, 716-720.
Dominik, S., 2005, Quantitative trait loci for internal nematode resistance in sheep: a review. Genet Sel Evol 37
Suppl 1, S83-96.
Dopheide, T.A., Tachedjian, M., Phillips, C., Frenkel, M.J., Wagland, B.M., Ward, C.W., 1991, Molecular
characterisation of a protective, 11-kDa excretory-secretory protein from the parasitic stages of
Trichostrongylus colubriformis. Mol Biochem Parasitol 45, 101-107.
Douch, P.G., Harrison, G.B., Buchanan, L.L., Greer, K.S., 1983, In vitro bioassay of sheep gastrointestinal
mucus for nematode paralysing activity mediated by substances with some properties characteristic of
SRS-A. Int J Parasitol 13, 207-212.
Douch, P.G., Harrison, G.B., Buchanan, L.L., Brunsdon, R.V., 1984, Relationship of histamine in tissues and
antiparasitic substances in gastrointestinal mucus to the development of resistance to trichostrongyle
infections in young sheep. Vet Parasitol 16, 273-288.
Douch, P.G., Harrison, G.B., Elliott, D.C., Buchanan, L.L., Greer, K.S., 1986, Relationship of gastrointestinal
histology and mucus antiparasite activity with the development of resistance to trichostrongyle
infections in sheep. Vet Parasitol 20, 315-331.
Douch, P.G., 1988, The response of young Romney lambs to immunization with Trichostrongylus colubriformis
larvae. Int J Parasitol 18, 1035-1038.
Douch, P.G., Morum, P.E., 1993, The effect of age on the response of Romney sheep to gastrointestinal
nematodes during grazing. Int J Parasitol 23, 651-655.
Douch, P.G., Green, R.S., Morris, C.A., McEewan, J.C., Windon, R.G., 1996a, Phenotypic markers for selection
of nematode-resistant sheep. Int J Parasitol 26, 899-911.
Douch, P.G., Morum, P.E., Rabel, B., 1996b, Secretion of anti-parasite substances and leukotrienes from ovine
gastrointestinal tissues and isolated mucosal mast cells. Int J Parasitol 26, 205-211.
Durette-Desset, M.C., Chabaud, A.G., 1993, Nomenclature of Strongylidae above the family group. Ann
Parasitol Hum Comp 68, 111-112.
Durette-Desset, M.C., Hugot, J.P., Darlu, P., Chabaud, A.G., 1999, A cladistic analysis of the
Trichostrongyloidea (Nematoda). Int J Parasitol 29, 1065-1086.
Eady, S.J., Woolaston, R.R., Barger, I.A., 2003, Comparison of genetic and nongenetic strategies for control of
gastrointestinal nematodes of sheep. Livestock Production Science 81, 11-23.
Ehigiator, H.N., Stadnyk, A.W., Lee, T.D., 2000, Modulation of B-cell proliferative response by a soluble
extract of Nippostrongylus brasiliensis. Infect Immun 68, 6154-6161.
Else, K., Wakelin, D., 1988, The effects of H-2 and non-H-2 genes on the expulsion of the nematode Trichuris
muris from inbred and congenic mice. Parasitology 96 ( Pt 3), 543-550.
Else, K.J., Grencis, R.K., 1991, Cellular immune responses to the murine nematode parasite Trichuris muris. I.
Differential cytokine production during acute or chronic infection. Immunology 72, 508-513.
Else, K.J., Finkelman, F.D., 1998, Intestinal nematode parasites, cytokines and effector mechanisms. Int J
Parasitol 28, 1145-1158.
Else, K.J., 2005, Have gastrointestinal nematodes outwitted the immune system? Parasite Immunol 27, 407-415.
217

Emery, D.L., 1996, Vaccination against worm parasites of animals. Vet Parasitol 64, 31-45.
Références bibliographiques
Eslami, A., Ranjbar-Bahadori, S., Zare, R., Razzaghi-Abyaneh, M., 2005, The predatory capability of
Arthrobotrys cladodes var. macroides in the control of Haemonchus contortus infective larvae. Vet
Parasitol 130, 263-266.
Fallon, P.G., Jolin, H.E., Smith, P., Emson, C.L., Townsend, M.J., Fallon, R., McKenzie, A.N., 2002, IL-4
induces characteristic Th2 responses even in the combined absence of IL-5, IL-9, and IL-13. Immunity
17, 7-17.
Feichtlbauer, P., Stear, M.J., Thaller, G., Fries, R., Buitkamp, J., 1998, Major histocompatibility complex alleles
are associated with faecal egg counts following infection predominately with Ostertagia circumcincta
in Scottish Blackface sheep. Proceedings of the 26th International Conference on Animal Genetics,
Abstract B017, 44.
Feitelson, J., Payne, J., Kim, L., 1992, Bacillus thuringiensis : insects and beyond. BioTechnology 10, 271-275.
Finkelman, F.D., Shea-Donohue, T., Goldhill, J., Sullivan, C.A., Morris, S.C., Madden, K.B., Gause, W.C.,
Urban, J.F., Jr., 1997, Cytokine regulation of host defense against parasitic gastrointestinal nematodes:
lessons from studies with rodent models. Annu Rev Immunol 15, 505-533.
Finkelman, F.D., Wynn, T.A., Donaldson, D.D., Urban, J.F., 1999, The role of IL-13 in helminth-induced
inflammation and protective immunity against nematode infections. Curr Opin Immunol 11, 420-426.
Fradelizi, D., Theze, J., 1998, Cytokines : médiateurs de la réponse immunitaire et de la réaction inflammatoire.
Annales de l'Institut Pasteur 2, 95-106.
François, D., Brunel, J.C., Bibé, B., Poivey, J.P., Gaillard, A., Weisbecker, J.L., Rives, L., 1998, Sélection de la
race ovine INRA 401 sur la reproduction et les aptitudes maternelles : résultats en domaine
expérimental et en fermes. Ren. Rech. Ruminants 5, 141-143.
Frandji, P., Oskeritzian, C., Cacaraci, F., Lapeyre, J., Peronet, R., David, B., Guillet, J.G., Mecheri, S., 1993,
Antigen-dependent stimulation by bone marrow-derived mast cells of MHC class II-restricted T cell
hybridoma. J Immunol 151, 6318-6328.
Frenkel, M.J., Dopheide, T.A., Wagland, B.M., Ward, C.W., 1992, The isolation, characterization and cloning of
a globin-like, host-protective antigen from the excretory-secretory products of Trichostrongylus
colubriformis. Mol Biochem Parasitol 50, 27-36.
Gamble, H.R., Zajac, A.M., 1992, Resistance of St. Croix lambs to Haemonchus contortus in experimentally and
naturally acquired infections. Vet Parasitol 41, 211-225.
Garcia-Zepeda, E.A., Rothenberg, M.E., Ownbey, R.T., Celestin, J., Leder, P., Luster, A.D., 1996, Human
eotaxin is a specific chemoattractant for eosinophil cells and provides a new mechanism to explain
tissue eosinophilia. Nat Med 2, 449-456.
Gauly, M., Kraus, M., Vervelde, L., van Leeuwen, M.A., Erhardt, G., 2002, Estimating genetic differences in
natural resistance in Rhon and Merinoland sheep following experimental Haemonchus contortus
infection. Vet Parasitol 106, 55-67.
Gause, W.C., Urban, J.F., Jr., Stadecker, M.J., 2003, The immune response to parasitic helminths: insights from
murine models. Trends Immunol 24, 269-277.
Geary, T.G., Sangster, N.C., Thompson, D.P., 1999, Frontiers in anthelmintic pharmacology. Vet Parasitol 84,
275-295.
Geary, T.G., Thompson, D.P., 2003, Development of antiparasitic drugs in the 21st century. Vet Parasitol 115,
167-184.
218

Références bibliographiques
Gibbons, L.M., 1979, Revision of the genus Haemonchus Cobb, 1898 (Nematoda, Trichostrongylidae). Syst
Parasitol 1, 3-24.
Gill, H.S., 1991, Genetic control of acquired resistance to haemonchosis in Merino lambs. Parasite Immunol 13,
617-628.
Gill, H.S., Gray, G.D., Watson, D.L., Husband, A.J., 1993, Isotype-specific antibody responses to Haemonchus
contortus in genetically resistant sheep. Parasite Immunol 15, 61-67.
Gill, H.S., Husband, A.J., Watson, D.L., Gray, G.D., 1994, Antibody-containing cells in the abomasal mucosa of
sheep with genetic resistance to Haemonchus contortus. Res Vet Sci 56, 41-47.
Gill, H.S., Altmann, K., Cross, M.L., Husband, A.J., 2000, Induction of T helper 1- and T helper 2-type immune
responses during Haemonchus contortus infection in sheep. Immunology 99, 458-463.
Goffinet, B., Beckmann, J., Boichard, D., Causse, M., Charcosset, A., Chevalet, C., Christophe, C., Colleau, J.J.,
Demenais, F., Durel, C.E., Elsen, J.M., Foulley, J.L., Gallais, A., Götz, K., Hospital, F., Kremer, A.,
Lorieux, M., Lefort-Buson, M., Le Roy, P., Loisel, P., Mangin, B., Maurice, A., Perrier, X., Pons, O.,
Rebaï, A., Rodolphe, F., San Cristobal, M., Vu Tien Khang, J., 1994, Méthodes mathématiques pour
l'étude des gènes contrôlant des caractères quantitatifs. Genet Sel Evol 26, 95-105.
Goldsby, R.A., Kindt, T.J., Osborne, B.A., 2003, Immunologie - Le cours de Janis Kuby. Dunod, Paris, 660 p.
Gouy de Bellocq, J., Ferte, H., Depaquit, J., Justine, J.L., Tillier, A., Durette-Desset, M.C., 2001, Phylogeny of
the Trichostrongylina (Nematoda) inferred from 28S rDNA sequences. Mol Phylogenet Evol 19, 430-
442.
Gray, G.D., Barger, I.A., Le Jambre, L.F., Douch, P.G., 1992, Parasitological and immunological responses of
genetically resistant Merino sheep on pastures contaminated with parasitic nematodes. Int J Parasitol
22, 417-425.
Gregg, P., Dineen, J.K., Rothwell, T.L.W., Kelly, J.D., 1978, The effect of age on the response of sheep to
vaccination with irradiated Trichostrongylus colubriformis larvae. Vet Parasitol 4, 35-48.
Grencis, R.K., Entwistle, G.M., 1997, Production of an interferon-gamma homologue by an intestinal nematode:
functionally significant or interesting artefact? Parasitology 115 Suppl, S101-106.
Gruner, L., 1991, Breeding for helminthic resistance in sheep and goats. In : Breeding for disease resistance in
farm animals. Eds R.F.E. Axford et J.B. Owen, CAB International, Wallingford, UK, 187-200 pp.
Gruner, L., Aumont, G., Getachew, T., Brunel, J.C., Pery, C., Cognie, Y., Guerin, Y., 2003, Experimental
infection of Black Belly and INRA 401 straight and crossbred sheep with trichostrongyle nematode
parasites. Vet Parasitol 116, 239-249.
Hagel, I., Lynch, N.R., Perez, M., Di Prisco, M.C., Lopez, R., Rojas, E., 1993, Modulation of the allergic
reactivity of slum children by helminthic infection. Parasite Immunol 15, 311-315.
Haile, A., Tembely, S., Anindo, D.O., Mukasa-Mugerwa, E., Rege, J.E.O., Yami, A., Baker, R.L., 2002, Effects
of breed and dietary protein supplementation on the responses to gastrointestinal nematode infections in
Ethiopian sheep. Small Ruminant Research 44, 247-261.
Hamaguchi, Y., Kanakura, Y., Fujita, J., Takeda, S., Nakano, T., Tarui, S., Honjo, T., Kitamura, Y., 1987,
Interleukin 4 as an essential factor for in vitro clonal growth of murine connective tissue-type mast
cells. J Exp Med 165, 268-273.
Harrison, G.B., Pulford, H.D., Gatehouse, T.K., Shaw, R.J., Pfeffer, A., Shoemaker, C.B., 1999, Studies on the
role of mucus and mucosal hypersensitivity reactions during rejection of Trichostrongylus colubriformis
from the intestine of immune sheep using an experimental challenge model. Int J Parasitol 29, 459-468.
219

Références bibliographiques
Hartmann, S., Lucius, R., 2003, Modulation of host immune responses by nematode cystatins. Int J Parasitol 33,
1291-1302.
Haslam, S.M., Coles, G.C., Munn, E.A., Smith, T.S., Smith, H.F., Morris, H.R., Dell, A., 1996, Haemonchus
contortus glycoproteins contain N-linked oligosaccharides with novel highly fucosylated core
structures. J Biol Chem 271, 30561-30570.
Hawley, J.H., Martzen, M.R., Peanasky, R.J., 1994, Proteinase inhibitors in Ascarida. Parasitol Today 10, 308-
313.
Hesse, M., Piccirillo, C.A., Belkaid, Y., Prufer, J., Mentink-Kane, M., Leusink, M., Cheever, A.W., Shevach,
E.M., Wynn, T.A., 2004, The pathogenesis of schistosomiasis is controlled by cooperating IL-10producing
innate effector and regulatory T cells. J Immunol 172, 3157-3166.
Hohenhaus, M.A., Outteridge, P.M., 1995, The immunogenetics of resistance to Trichostrongylus colubriformis
and Haemonchus contortus parasites in sheep. Br Vet J 151, 119-140.
Hokke, C.H., Yazdanbakhsh, M., 2005, Schistosome glycans and innate immunity. Parasite Immunol 27, 257-
264.
Hoste, H., Huby, F., Mallet, S., 1997, Strongyloses gastro-intestinales des ruminants : conséquences
physiopathologiques et mécanismes pathgéniques. Point Vétérinaire, Numéro Spécial "Parasitologie des
Ruminants" 28, 53-59.
Hsieh, G.C., Loukas, A., Wahl, A.M., Bhatia, M., Wang, Y., Williamson, A.L., Kehn, K.W., Maruyama, H.,
Hotez, P.J., Leitenberg, D., Bethony, J., Constant, S.L., 2004, A secreted protein from the human
hookworm Necator americanus binds selectively to NK cells and induces IFN-gamma production. J
Immunol 173, 2699-2704.
Hultner, L., Moeller, J., Schmitt, E., Jager, G., Reisbach, G., Ring, J., Dormer, P., 1989, Thiol-sensitive mast cell
lines derived from mouse bone marrow respond to a mast cell growth-enhancing activity different from
both IL-3 and IL-4. J Immunol 142, 3440-3446.
Humbert, J.F., Cabaret, J., 1995, Use of random amplified polymorphic DNA for identification of ruminant
trichostrongylid nematodes. Parasitol Res 81, 1-5.
Huntley, J.F., Newlands, G., Miller, H.R., 1984, The isolation and characterization of globule leucocytes: their
derivation from mucosal mast cells in parasitized sheep. Parasite Immunol 6, 371-390.
Huntley, J.F., Gibson, S., Brown, D., Smith, W.D., Jackson, F., Miller, H.R., 1987, Systemic release of a mast
cell proteinase following nematode infections in sheep. Parasite Immunol 9, 603-614.
Huntley, J.F., Newlands, G.F., Jackson, F., Miller, H.R., 1992, The influence of challenge dose, duration of
immunity, or steroid treatment on mucosal mast cells and on the distribution of sheep mast cell
proteinase in Haemonchus-infected sheep. Parasite Immunol 14, 429-440.
Huntley, J.F., Schallig, H.D., Kooyman, F.N., Mackellar, A., Jackson, F., Smith, W.D., 1998, IgE antibody
during infection with the ovine abomasal nematode, Teladorsagia circumcincta: primary and secondary
responses in serum and gastric lymph of sheep. Parasite Immunol 20, 565-571.
Iraqi, F.A., Behnke, J.M., Menge, D.M., Lowe, A.M., Teale, A.J., Gibson, J.P., Baker, L.R., Wakelin, D.R.,
2003, Chromosomal regions controlling resistance to gastro-intestinal nematode infections in mice.
Mamm Genome 14, 184-191.
Ishikawa, N., Wakelin, D., Mahida, Y.R., 1997, Role of T helper 2 cells in intestinal goblet cell hyperplasia in
mice infected with Trichinella spiralis. Gastroenterology 113, 542-549.
Jackson, F., 1993, Anthelmintic resistance--the state of play. Br Vet J 149, 123-138.
220

Références bibliographiques
Jackson, F., 2000, Options for the sustainable control of gastrointestinal nematode infections in goat production
systems in Europe. 7th International Conference on Goats, Tours Mai 2000, 789-791.
Jackson, J.A., Turner, J.D., Rentoul, L., Faulkner, H., Behnke, J.M., Hoyle, M., Grencis, R.K., Else, K.J.,
Kamgno, J., Boussinesq, M., Bradley, J.E., 2004, T helper cell type 2 responsiveness predicts future
susceptibility to gastrointestinal nematodes in humans. J Infect Dis 190, 1804-1811.
Jackson, J.A., Turner, J.D., Kamal, M., Wright, V., Bickle, Q., Else, K.J., Ramsan, M., Bradley, J.E., 2005,
Gastrointestinal nematode infection is associated with variation in innate immune responsiveness.
Microbes Infect.
Jacquiet, P., Cabaret, J., Cheikh, D., Thiam, E., 1997, Identification of Haemonchus species in domestic
ruminants based on morphometrics of spicules. Parasitol Res 83, 82-86.
Janeway, C.A., Jr., 2001a, How the immune system works to protect the host from infection: a personal view.
Proc Natl Acad Sci U S A 98, 7461-7468.
Janeway, C.A., Jr., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M., 2001b, Immunobiology : The immune system in
health and disease, 5th edition Edition. Garland Publishing, New York, 732 p.
Janeway, C.A., Jr., Medzhitov, R., 2002, Innate immune recognition. Annu Rev Immunol 20, 197-216.
Jasmer, D.P., Perryman, L.E., Conder, G.A., Crow, S., McGuire, T., 1993, Protective immunity to Haemonchus
contortus induced by immunoaffinity isolated antigens that share a phylogenetically conserved
carbohydrate gut surface epitope. J Immunol 151, 5450-5460.
Jenkins, M.K., Pardoll, D.M., Mizuguchi, J., Quill, H., Schwartz, R.H., 1987, T-cell unresponsiveness in vivo
and in vitro: fine specificity of induction and molecular characterization of the unresponsive state.
Immunol Rev 95, 113-135.
Jeschke, P., Harder, A., Schindler, M., Etzel, W., 2005, Cyclohexadepsipeptides (CHDPs) with improved
anthelmintical efficacy against the gastrointestinal nematode (Haemonchus contortus) in sheep.
Parasitol Res 97 Suppl 1, S17-21.
Johansson, C., Kelsall, B.L., 2005, Phenotype and function of intestinal dendritic cells. Semin Immunol 17, 284-
294.
Johnson, D.R., Sales, J., Matthews, J.B., 2005, Local cytokine responses in Dictyocaulus viviparus infection. Vet
Parasitol 128, 309-318.
Jones, W.T., Mangan, J.L., 1977, Complexes of the condensed tannins of Sainfoin (Onobrychis viciifolia Scop.)
with fraction 1 leaf protein and with submaxillary mucoprotein and their reversal by polyethylene
glycol and pH. J Sci Food Agric 28, 126-136.
Kabagambe, E.K., Barras, S.R., Li, Y., Pena, M.T., Smith, W.D., Miller, J.E., 2000, Attempts to control
haemonchosis in grazing ewes by vaccination with gut membrane proteins of the parasite. Vet Parasitol
92, 15-23.
Kassai, T., Sreter, T., 1992, Genetic aspects of host resistance to helminthic infections. Reseach and Reviews in
Parasitology 52, 67-75.
Kelly, J.D., Hall, C.A., 1979, Resistance of animal helminths to anthelmintics. Adv Pharmacol Chemother 16,
89-128.
Kerboeuf, D., Hubert, J., 1985, Benzimidazole resistance in field strains of nematodes from goats in France. Vet
Rec 116, 133.
Kerboeuf, D., Aycardi, J., 1999, Unexpected increased thiabendazole tolerance in Haemonchus contortus
resistant to anthelmintics by modulation of glutathione activity. Parasitol Res 85, 713-718.
221

Références bibliographiques
Khan, W.I., Abe, T., Ishikawa, N., Nawa, Y., Yoshimura, K., 1995, Reduced amount of intestinal mucus by
treatment with anti-CD4 antibody interferes with the spontaneous cure of Nippostrongylus brasiliensisinfection
in mice. Parasite Immunol 17, 485-491.
Khan, W.I., Collins, S.M., 2004, Immune-mediated alteration in gut physiology and its role in host defence in
nematode infection. Parasite Immunol 26, 319-326.
Kishimoto, T., Akira, S., Narazaki, M., Taga, T., 1995, Interleukin-6 family of cytokines and gp130. Blood 86,
1243-1254.
Kita, H., Ohnishi, T., Okubo, Y., Weiler, D., Abrams, J.S., Gleich, G.J., 1991, Granulocyte/macrophage colonystimulating
factor and interleukin 3 release from human peripheral blood eosinophils and neutrophils. J
Exp Med 174, 745-748.
Klion, A.D., Nutman, T.B., 2004, The role of eosinophils in host defense against helminth parasites. J Allergy
Clin Immunol 113, 30-37.
Kloosterman, A., Albers, G.A., Van den Brink, R., 1978, Counting eggs in utero of individual female worms.
Vet Parasitol 4, 353-368.
Knox, D.P., Smith, S.K., Smith, W.D., 1999, Immunization with an affinity purified protein extract from the
adult parasite protects lambs against infection with Haemonchus contortus. Parasite Immunol 21, 201-
210.
Knox, D.P., Redmond, D.L., Newlands, G.F., Skuce, P.J., Pettit, D., Smith, W.D., 2003, The nature and
prospects for gut membrane proteins as vaccine candidates for Haemonchus contortus and other
ruminant trichostrongyloids. Int J Parasitol 33, 1129-1137.
Kohler, P., 2001, The biochemical basis of anthelmintic action and resistance. Int J Parasitol 31, 336-345.
Koninkx, J.F., Mirck, M.H., Hendriks, H.G., Mouwen, J.M., van Dijk, J.E., 1988, Nippostrongylus brasiliensis:
histochemical changes in the composition of mucins in goblet cells during infection in rats. Exp
Parasitol 65, 84-90.
Konnai, S., Usui, T., Ohashi, K., Onuma, M., 2003, The rapid quantitative analysis of bovine cytokine genes by
real-time RT-PCR. Vet Microbiol 94, 283-294.
Kooyman, F.N., Van Kooten, P.J., Huntley, J.F., MacKellar, A., Cornelissen, A.W., Schallig, H.D., 1997,
Production of a monoclonal antibody specific for ovine immunoglobulin E and its application to
monitor serum IgE responses to Haemonchus contortus infection. Parasitology 114 ( Pt 4), 395-406.
Kotze, A.C., O'Grady, J., Gough, J.M., Pearson, R., Bagnall, N.H., Kemp, D.H., Akhurst, R.J., 2005, Toxicity of
Bacillus thuringiensis to parasitic and free-living life-stages of nematode parasites of livestock. Int J
Parasitol.
Kourilsky, P., Truffa-Bachi, P., 2001, Cytokine fields and the polarization of the immune response. Trends
Immunol 22, 502-509.
Lacey, E., 1988, The role of the cytoskeletal protein, tubulin, in the mode of action and mechanism of drug
resistance to benzimidazoles. Int J Parasitol 18, 885-936.
Lanusse, C.E., Prichard, R.K., 1993, Relationship between pharmacological properties and clinical efficacy of
ruminant anthelmintics. Vet Parasitol 49, 123-158.
Le Roy, P., Elsen, J.M., 2000, Principes de l'utilisation des marqueurs génétiques pour la détection des gènes
influençant les caractères quantitatifs. INRA Productions Animales Numéro Hors-Série "Génétique
moléculaire : principes et application aux productions animales, 211-215.
Lebart, L., Morineau, A., Piron, M., 1995, Statistique exploratoire multidimensionnelle. Dunod Ed., 439 p.
222

Références bibliographiques
Lee, T.D., Wakelin, D., 1982, The use of host strain variation to assess the significance of mucosal mast cells in
the spontaneous cure response of mice to the nematode Trichuris muris. Int Arch Allergy Appl
Immunol 67, 302-305.
Lee, D.H., Machii, J., Ohba, M., 2002, High frequency of Bacillus thuringiensis in feces of herbivorous animals
maintained in a zoological garden in Japan. Appl Entomol Zool 37, 509-516.
Liu, Y., Janeway, C.A., Jr., 1990, Interferon gamma plays a critical role in induced cell death of effector T cell: a
possible third mechanism of self-tolerance. J Exp Med 172, 1735-1739.
Liu, Y., Janeway, C.A., Jr., 1991, Microbial induction of co-stimulatory activity for CD4 T-cell growth. Int
Immunol 3, 323-332.
Liu, Y., Janeway, C.A., Jr., 1992, Cells that present both specific ligand and costimulatory activity are the most
efficient inducers of clonal expansion of normal CD4 T cells. Proc Natl Acad Sci U S A 89, 3845-3849.
Loke, P., MacDonald, A.S., Robb, A., Maizels, R.M., Allen, J.E., 2000, Alternatively activated macrophages
induced by nematode infection inhibit proliferation via cell-to-cell contact. Eur J Immunol 30, 2669-
2678.
Loke, P., Nair, M.G., Parkinson, J., Guiliano, D., Blaxter, M., Allen, J.E., 2002, IL-4 dependent alternativelyactivated
macrophages have a distinctive in vivo gene expression phenotype. BMC Immunol 3, 7.
Loukas, A., Prociv, P., 2001, Immune responses in hookworm infections. Clin Microbiol Rev 14, 689-703, table
of contents.
Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., Randall, R.J., 1951, Protein measurement with the Folin phenol
reagent. J Biol Chem 193, 265-275.
Lumaret, J.P., Errouissi, F., 2002, Use of anthelmintics in herbivores and evaluation of risks for the non target
fauna of pastures. Vet Res 33, 547-562.
MacDonald, A.S., Araujo, M.I., Pearce, E.J., 2002, Immunology of parasitic helminth infections. Infect Immun
70, 427-433.
Madden, K.B., Urban, J.F., Jr., Ziltener, H.J., Schrader, J.W., Finkelman, F.D., Katona, I.M., 1991, Antibodies to
IL-3 and IL-4 suppress helminth-induced intestinal mastocytosis. J Immunol 147, 1387-1391.
Mahieu, M., Aumont, G., Alexandre, G., 1997, Elevage intensif des ovins tropicaux à la Martinique. INRA
Productions Animales 10, 21-32.
Maizels, R.M., Yazdanbakhsh, M., 2003, Immune regulation by helminth parasites: cellular and molecular
mechanisms. Nat Rev Immunol 3, 733-744.
Maizels, R.M., Balic, A., Gomez-Escobar, N., Nair, M., Taylor, M.D., Allen, J.E., 2004, Helminth parasites-masters
of regulation. Immunol Rev 201, 89-116.
Maizels, R.M., 2005, Infections and allergy - helminths, hygiene and host immune regulation. Curr Opin
Immunol 17, 656-661.
Manjili, M.H., France, M.P., Sangster, N.C., Rothwell, T.L., 1998, Quantitative and qualitative changes in
intestinal goblet cells during primary infection of Trichostrongylus colubriformis high and low
responder guinea pigs. Int J Parasitol 28, 761-765.
Marley, C.L., Cook, R., Keatinge, R., Barrett, J., Lampkin, N.H., 2003, The effect of birdsfoot trefoil (Lotus
corniculatus) and chicory (Cichorium intybus) on parasite intensities and performance of lambs
naturally infected with helminth parasites. Vet Parasitol 112, 147-155.
Martin, R.J., 1993, Neuromuscular transmission in nematode parasites and antinematodal drug action. Pharmacol
Ther 58, 13-50.
223

Martin, R.J., 1997, Modes of action of anthelmintic drugs. Vet J 154, 11-34.
Références bibliographiques
McClure, S.J., Emery, D.L., Bendixsen, T., Davey, R.J., 1998, Attempts to generate immunity against
Trichostrongylus colubriformis and Haemonchus contortus in young lambs by vaccination with viable
parasites. Int J Parasitol 28, 739-746.
McInnes, C.J., Logan, M., Redmond, J., Entrican, G., Baird, G.D., 1990, The molecular cloning of the ovine
gamma-interferon cDNA using the polymerase chain reaction. Nucleic Acids Res 18, 4012.
McKay, D.M., Bienenstock, J., 1994, The interaction between mast cells and nerves in the gastrointestinal tract.
Immunol Today 15, 533-538.
McKenzie, G.J., Fallon, P.G., Emson, C.L., Grencis, R.K., McKenzie, A.N., 1999, Simultaneous disruption of
interleukin (IL)-4 and IL-13 defines individual roles in T helper cell type 2-mediated responses. J Exp
Med 189, 1565-1572.
Medzhitov, R., Janeway, C.A., Jr., 1998, Innate immune recognition and control of adaptive immune responses.
Semin Immunol 10, 351-353.
Meeusen, E.N., Balic, A., 2000, Do eosinophils have a role in the killing of helminth parasites? Parasitol Today
16, 95-101.
Mendoza-De Gives, P., Vazquez-Prats, V.M., 1994, Reduction of Haemonchus contortus infective larvae by
three nematophagous fungi in sheep faecal cultures. Vet Parasitol 55, 197-203.
Menge, D.M., Behnke, J.M., Lowe, A., Gibson, J.P., Iraqi, F.A., Baker, R.L., Wakelin, D., 2003, Mapping of
chromosomal regions influencing immunological responses to gastrointestinal nematode infections in
mice. Parasite Immunol 25, 341-349.
Michel, J.F., 1969, Some observations on the worm burdens of calves infected daily with Ostertagia ostertagi.
Parasitology 59, 575-595.
Miller, H.R., Jackson, F., Newlands, G., Appleyard, W.T., 1983, Immune exclusion, a mechanism of protection
against the ovine nematode Haemonchus contortus. Res Vet Sci 35, 357-363.
Miller, H.R., 1984, The protective mucosal response against gastrointestinal nematodes in ruminants and
laboratory animals. Vet Immunol Immunopathol 6, 167-259.
Miller, H.R., 1987, Gastrointestinal mucus, a medium for survival and for elimination of parasitic nematodes and
protozoa. Parasitology 94 Suppl, S77-100.
Miller, H.R., 1996a, Prospects for the immunological control of ruminant gastrointestinal nematodes: natural
immunity, can it be harnessed? Int J Parasitol 26, 801-811.
Miller, H.R., 1996b, Mucosal mast cells and the allergic response against nematode parasites. Vet Immunol
Immunopathol 54, 331-336.
Miller, J.E., Bahirathan, M., Lemarie, S.L., Hembry, F.G., Kearney, M.T., Barras, S.R., 1998, Epidemiology of
gastrointestinal nematode parasitism in Suffolk and Gulf Coast Native sheep with special emphasis on
relative susceptibility to Haemonchus contortus infection. Vet Parasitol 74, 55-74.
Milstone, A.M., Harrison, L.M., Bungiro, R.D., Kuzmic, P., Cappello, M., 2000, A broad spectrum Kunitz type
serine protease inhibitor secreted by the hookworm Ancylostoma ceylanicum. J Biol Chem 275, 29391-
29399.
Min, B.R., Hart, S.P., 2002, Tannins for suppression of internal parasites. J Anim Science 81, 102-109.
Moncada, D.M., Kammanadiminti, S.J., Chadee, K., 2003, Mucin and Toll-like receptors in host defense against
intestinal parasites. Trends Parasitol 19, 305-311.
224

Références bibliographiques
Montagne, A., Grepinet, O., Peloille, M., Lantier, F., Lalmanach, A.C., 2001, Quantification of ovine cytokine
gene expression by a competitive RT-PCR method. J Immunol Methods 253, 83-93.
Moreno, C.R., Gruner, L., Scala, A., Mura, L., Schibler, L., Amigues, Y., Sechi, T., Jacquiet, P., Francois, D.,
Sechi, S., Roig, A., Casu, S., Barillet, F., Brunel, J.C., Bouix, J., Carta, A., Rupp, R., 2006, QTL for
resistance to internal parasites in two designs based on natural and experimental conditions of infection.
Proceedings of the 8th World Congress on Genetics Applied to Livestock Production.
Morris, C.A., Watson, T.A., Bisset, S.A., Vlassoff, A., Douch, P.G., 1995, Breeding for resistance to infectious
diseases in small ruminants, In: G.D. Gray, R.R.W.a.B.T.E. (Ed.) ACIAR.Canberra, p. 53.
Mosmann, T.R., Cherwinski, H., Bond, M.W., Giedlin, M.A., Coffman, R.L., 1986, Two types of murine helper
T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J
Immunol 136, 2348-2357.
Mosmann, T.R., Coffman, R.L., 1989, TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to
different functional properties. Annu Rev Immunol 7, 145-173.
Mowat, A.M., 2003, Anatomical basis of tolerance and immunity to intestinal antigens. Nat Rev Immunol 3,
331-341.
Mugambi, J.M., Bain, R.K., Wanyangu, S.W., Ihiga, M.A., Duncan, J.L., Murray, M., Stear, M.J., 1997,
Resistance of four sheep breeds to natural and subsequent artificial Haemonchus contortus infection.
Vet Parasitol 69, 265-273.
Munn, E.A., Greenwood, C.A., Coadwell, W.J., 1987, Vaccination of young lambs by means of a protein
fraction extracted from adult Haemonchus contortus. Parasitology 94 ( Pt 2), 385-397.
Munn, E.A., Smith, T.S., Smith, H., James, F.M., Smith, F.C., Andrews, S.J., 1997, Vaccination against
Haemonchus contortus with denatured forms of the protective antigen H11. Parasite Immunol 19, 243-
248.
Murray, M., Miller, H.R., Jarrett, W.F., 1968, The globule leukocyte and its derivation from the subepithelial
mast cell. Lab Invest 19, 222-234.
Naves, M., Alexandre, G., Leimbacher, F., Mandonnet, N., Menendez-Buxadera, A., 2001, Les ruminants
domestiques de la Caraïbe : le point sur les ressources génétiques et leur exploitation. INRA
Productions Animales 14, 181-192.
Newlands, G.F., Miller, H.R., Jackson, F., 1990, Immune exclusion of Haemonchus contortus larvae in the
sheep: effects on gastric mucin of immunization, larval challenge and treatment with dexamethasone. J
Comp Pathol 102, 433-442.
Newlands, G.F., Skuce, P.J., Knox, D.P., Smith, S.K., Smith, W.D., 1999, Cloning and characterization of a
beta-galactoside-binding protein (galectin) from the gut of the gastrointestinal nematode parasite
Haemonchus contortus. Parasitology 119 ( Pt 5), 483-490.
Newton, S.E., Munn, E.A., 1999, The development of vaccines against gastrointestinal nematode parasites,
particularly Haemonchus contortus. Parasitol Today 15, 116-122.
Newton, S.E., Meeusen, E.N., 2003, Progress and new technologies for developing vaccines against
gastrointestinal nematode parasites of sheep. Parasite Immunol 25, 283-296.
Niezen, J.H., Waghorn, T.S., Raufautk, K., Robertson, H.A., McFarlane, R.G., 1994, Lamb weight gain and
faecal egg count when grazing one of seven herbages and dosed with larvae for six weeks. Proceed
New Zealand Soc Animal Prod 54, 15-18.
225

Références bibliographiques
Niezen, J.H., Waghorn, T.S., Charleston, W.A., Waghorn, G.C., 1995, Growth and gastrointestinal nematode
parasitism in lambs grazing either lucerne (Medicago sativa) or sulla (Hedysarum coronarium) which
contains condensed tannins. J Agric Science 125, 281-289.
Niezen, J.H., Robertson, H.A., Waghorn, G.C., Charleston, W.A., 1998a, Production, faecal egg counts and
worm burdens of ewe lambs which grazed six contrasting forages. Vet Parasitol 80, 15-27.
Niezen, J.H., Waghorn, G.C., Charleston, W.A., 1998b, Establishment and fecundity of Ostertagia circumcincta
and Trichostrongylus colubriformis in lambs fed lotus (Lotus pedunculatus) or perennial ryegrass. Vet
Parasitol 78, 13-21.
Niezen, J.H., Waghorn, G.C., Graham, T., Carter, J.L., Leathwick, D.M., 2002, The effect of diet fed to lambs on
subsequent development of Trichostrongylus colubriformis larvae in vitro and on pasture. Vet Parasitol
105, 269-283.
O'Donnell, I.J., Dineen, J.K., Wagland, B.M., Letho, S., Werkmeister, J.A., Ward, C.W., 1989a, A novel hostprotective
antigen from Trichostrongylus colubriformis. Int J Parasitol 19, 327-335.
O'Donnell, I.J., Dineen, J.K., Wagland, B.M., Letho, S., Dopheide, T.A., Grant, W.N., Ward, C.W., 1989b,
Characterization of the major immunogen in the excretory-secretory products of exsheathed third-stage
larvae of Trichostrongylus colubriformis. Int J Parasitol 19, 793-802.
Onah, D.N., Nawa, Y., 2000, Mucosal immunity against parasitic gastrointestinal nematodes. Korean J Parasitol
38, 209-236.
Outteridge, P.M., Windon, R.G., Dineen, J.K., 1985, An association between a lymphocyte antigen in sheep and
the response to vaccination against the parasite Trichostrongylus colubriformis. Int J Parasitol 15, 121-
127.
Outteridge, P.M., Windon, R.G., Dineen, J.K., Smith, E.F., 1986, The relationship between ovine lymphocyte
antigens and faecal egg count of sheep selected for responsiveness to vaccination against
Trichostrongylus colubriformis. Int J Parasitol 16, 369-374.
Outteridge, P.M., Windon, R.G., Dineen, J.K., 1988, An ovine lymphocyte antigen marker for acquired
resistance to Trichostrongylus colubriformis. Int J Parasitol 18, 853-858.
Owen, R.L., 1994, M cells--entryways of opportunity for enteropathogens. J Exp Med 180, 7-9.
Paterson, S., Wilson, K., Pemberton, J.M., 1998, Major histocompatibility complex variation associated with
juvenile survival and parasite resistance in a large unmanaged ungulate population. Proc Natl Acad Sci
U S A 95, 3714-3719.
Paterson, K.A., McEwan, J.C., Dodds, K.G., Morris, C.A., Crawford, A.M., 2001, Fine mapping a locus
affecting host resistance to internal parasites in sheep. Proceedings of the Association for Advancement
in Animal Breeding and Genetics, Queenstown, New-Zeland 13, 91-94.
Paul, W.E., Seder, R.A., 1994, Lymphocyte responses and cytokines. Cell 76, 241-251.
Pennock, J.L., Behnke, J.M., Bickle, Q.D., Devaney, E., Grencis, R.K., Isaac, R.E., Joshua, G.W., Selkirk, M.E.,
Zhang, Y., Meyer, D.J., 1998, Rapid purification and characterization of L-dopachrome-methyl ester
tautomerase (macrophage-migration-inhibitory factor) from Trichinella spiralis, Trichuris muris and
Brugia pahangi. Biochem J 335 ( Pt 3), 495-498.
Pernthaner, A., Vlassoff, A., Douch, P.G., Maass, D.R., 1997, Cytokine mRNA and IFN-g production in
nematode resistant and susceptible line lambs artificially infected with gastro-intestinal nematodes.
Acta Parasitologica 42, 55-61.
Pernthaner, A., Cole, S.A., Morrison, L., Hein, W.R., 2005, Increased expression of interleukin-5 (IL-5), IL-13,
and tumor necrosis factor alpha genes in intestinal lymph cells of sheep selected for enhanced resistance
to nematodes during infection with Trichostrongylus colubriformis. Infect Immun 73, 2175-2183.
226

Références bibliographiques
Pfeffer, A., Douch, P.G., Shaw, R.J., Gatehouse, T.K., Rabel, B., Green, R.S., Shirer, C.L., Jonas, W.E., Bisset,
S., 1996, Sequential cellular and humoral responses in the abomasal mucosa and blood of Romney
sheep dosed with Trichostrongylus axei. Int J Parasitol 26, 765-773.
Piper, L.R., 1987, Genetic variation in resistance to internal parasites, In: McGuirk, B.J. (Ed.) Merino
Improvement Program In Australia, Australian Wool Corporation.Sydney, pp. 351-363.
Poppi, D.P., Sykes, A.R., Dynes, R.A., 1990, The effect of endoparasitism on host nutrition - the implications for
nutrient manipulation. Proceed New Zealand Soc Animal Prod 50, 237-243.
Prichard, R.K., 1973, The fumarate reductase reaction of Haemonchus contortus and the mode of action of some
anthelmintics. Int J Parasitol 3, 409-417.
Prichard, R.K., 1990, Anthelmintic resistance in nematodes: extent, recent understanding and future directions
for control and research. Int J Parasitol 20, 515-523.
Pritchard, D.I., Quinnell, R.J., Walsh, E.A., 1995, Immunity in humans to Necator americanus: IgE, parasite
weight and fecundity. Parasite Immunol 17, 71-75.
Prichard, R., 2001, Genetic variability following selection of Haemonchus contortus with anthelmintics. Trends
Parasitol 17, 445-453.
Quinnell, R.J., 2003, Genetics of susceptibility to human helminth infection. Int J Parasitol 33, 1219-1231.
Quinnell, R.J., Pritchard, D.I., Raiko, A., Brown, A.P., Shaw, M.A., 2004, Immune responses in human
necatoriasis: association between interleukin-5 responses and resistance to reinfection. J Infect Dis 190,
430-438.
Radhakrishnan, C.V., Bradley, R.E., Sr., Loggins, P.E., 1972, Host responses of worm-free Florida native and
Rambouillet lambs experimentally infected with Haemonchus contortus. Am J Vet Res 33, 817-823.
Rainbird, M.A., Macmillan, D., Meeusen, E.N., 1998, Eosinophil-mediated killing of Haemonchus contortus
larvae: effect of eosinophil activation and role of antibody, complement and interleukin-5. Parasite
Immunol 20, 93-103.
Ramos-Vara, J.A., Miller, M.A., Lopez, E., Prats, N., Brevik, L., 1994, Reactivity of polyclonal human CD3
antiserum in lymphoid tissues of cattle, sheep, goats, rats and mice. Am J Vet Res 55, 63-66.
Raynaud, J.P., 1970, Etude de l'efficacité d'une technique de coproscopie quantitative pour le diagnostic de
routine et le contrôle des infestations parasitaires des bovins, équins et porcins. Ann Parasitol Hum
Comp 45, 321-342.
Rhoads, M.L., Fetterer, R.H., Hill, D.E., Urban, J.F., Jr., 2000, Trichuris suis: a secretory chymotrypsin/elastase
inhibitor with potential as an immunomodulator. Exp Parasitol 95, 36-44.
Roberts, F.H.S., Turner, H.N., Mckervett, M., 1954, On the specific distinctness of the ovine and bovine strains
of Haemonchus contortus (Rudolphi) Cobb (Nematoda: Trichostrongylidae). Aust J Zool 2, 275-295.
Robertson, H.A., Niezen, J.H., Waghorn, G.C., Charleston, W.A., Jinlong, M., 1995, The effect of six herbages
on liveweight gain, wool growth and faecal egg count of parasitized ewe lambs. Proceed New Zealand
Soc Animal Prod 55, 199-201.
Romagnani, S., 1997, The Th1/Th2 paradigm. Immunol Today 18, 263-266.
Romjali, E., Pandey, V.S., Batubara, A., Gatenby, R.M., Verhulst, A., 1996, Comparison of resistance of four
genotypes of rams to experimental infection with Haemonchus contortus. Vet Parasitol 65, 127-137.
Rothwell, T.L., 1989, Immune expulsion of parasitic nematodes from the alimentary tract. Int J Parasitol 19,
139-168.
227

Références bibliographiques
Rothwell, T.L., Windon, R.G., Horsburgh, B.A., Anderson, B.H., 1993, Relationship between eosinophilia and
responsiveness to infection with Trichostrongylus colubriformis in sheep. Int J Parasitol 23, 203-211.
Rothwell, J.T., Lacey, E., Sangster, N.C., 2000, The binding of closantel to ovine serum albumin, and
homogenate fractions of Haemonchus contortus. Int J Parasitol 30, 769-775.
Sanderson, C.J., 1992, Interleukin-5, eosinophils, and disease. Blood 79, 3101-3109.
Sangster, N., 1996, Pharmacology of anthelmintic resistance. Parasitology 113 Suppl, S201-216.
Sangster, N.C., 1999, Anthelmintic resistance: past, present and future. Int J Parasitol 29, 115-124; discussion
137-118.
Sansonetti, P.J., 2004, War and peace at mucosal surfaces. Nat Rev Immunol 4, 953-964.
Saulai, M., Cabaret, J., Hostache, G., Mandonnet, N., Aumont, G., 2001, Life-trait evolution of a parasite
strongyle nematode in response to host resistance : an experimental approach using Haemonchus
contortus in Black Belly lambs. Genet Sel Evol 33 (Suppl. 1), S25-S44.
Savin, K.W., Dopheide, T.A., Frenkel, M.J., Wagland, B.M., Grant, W.N., Ward, C.W., 1990, Characterization,
cloning and host-protective activity of a 30-kilodalton glycoprotein secreted by the parasitic stages of
Trichostrongylus colubriformis. Mol Biochem Parasitol 41, 167-176.
Schallig, H.D., van Leeuwen, M.A., Hendrikx, W.M., 1995, Isotype-specific serum antibody responses of sheep
to Haemonchus contortus antigens. Vet Parasitol 56, 149-162.
Schallig, H.D., Van Leeuwen, M.A., 1997, Protective immunity to the blood-feeding nematode Haemonchus
contortus induced by vaccination with parasite low molecular weight antigens. Parasitology 114 ( Pt 3),
293-299.
Schallig, H.D., van Leeuwen, M.A., Cornelissen, A.W., 1997a, Protective immunity induced by vaccination with
two Haemonchus contortus excretory secretory proteins in sheep. Parasite Immunol 19, 447-453.
Schallig, H.D., van Leeuwen, M.A., Verstrepen, B.E., Cornelissen, A.W., 1997b, Molecular characterization and
expression of two putative protective excretory secretory proteins of Haemonchus contortus. Mol
Biochem Parasitol 88, 203-213.
Schallig, H.D., 2000, Immunological responses of sheep to Haemonchus contortus. Parasitology 120 Suppl, S63-
72.
Scheerlinck, J.P., Chaplin, P.J., Wood, P.R., 1998, Ovine cytokines and their role in the immune response. Vet
Res 29, 369-383.
Schnepf, E., Crickmore, N., Van Rie, J., Lereclus, D., Baum, J., Feitelson, J., Zeigler, D.R., Dean, D.H., 1998,
Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins. Microbiol Mol Biol Rev 62, 775-806.
Schwaiger, F.W., Gostomski, D., Stear, M.J., Duncan, J.L., McKellar, Q.A., Epplen, J.T., Buitkamp, J., 1995,
An ovine major histocompatibility complex DRB1 allele is associated with low faecal egg counts
following natural, predominantly Ostertagia circumcincta infection. Int J Parasitol 25, 815-822.
Scrivner, L.H., 1967, Genetic resistance to ostertagiasis and haemonchosis in lambs. J Am Vet Med Assoc 151,
1443-1446.
Seaton, D.S., Jackson, F., Smith, W.D., Angus, K.W., 1989, Development of immunity to incoming
radiolabelled larvae in lambs continuously infected with Ostertagia circumcincta. Res Vet Sci 46, 241-
246.
Seow, H.F., Rothel, J.S., Wood, P.R., 1993, Cloning and sequencing an ovine interleukin-4-encoding cDNA.
Gene 124, 291-293.
228

Références bibliographiques
Sher, A., Pearce, E., Kaye, P., 2003, Shaping the immune response to parasites: role of dendritic cells. Curr Opin
Immunol 15, 421-429.
Siddiqui, Z.A., Mahmood, I., 1996, Biological control of plant parasitic nematodes by funig : a review.
Bioresour Technol 58, 229-239.
Silverman, P.H., Campbell, J.A., 1959, Studies on parasitic worms of sheep in Scotland. I. Embryonic and larval
development of Haemonchus contortus at constant conditions. Parasitology 49, 23-38.
Sinski, E., Bairden, K., Duncan, J.L., Eisler, M.C., Holmes, P.H., McKellar, Q.A., Murray, M., Stear, M.J.,
1995, Local and plasma antibody responses to the parasitic larval stages of the abomasal nematode
Ostertagia circumcincta. Vet Parasitol 59, 107-118.
Skuce, P.J., Redmond, D.L., Liddell, S., Stewart, E.M., Newlands, G.F., Smith, W.D., Knox, D.P., 1999a,
Molecular cloning and characterization of gut-derived cysteine proteinases associated with a host
protective extract from Haemonchus contortus. Parasitology 119 ( Pt 4), 405-412.
Skuce, P.J., Stewart, E.M., Smith, W.D., Knox, D.P., 1999b, Cloning and characterization of glutamate
dehydrogenase (GDH) from the gut of Haemonchus contortus. Parasitology 118 ( Pt 3), 297-304.
Smith, G., 1988, The population biology of the parasitic stages of Haemonchus contortus. Parasitology 96 ( Pt
1), 185-195.
Smith, W.D., Smith, S.K., 1993, Evaluation of aspects of the protection afforded to sheep immunised with a gut
membrane protein of Haemonchus contortus. Res Vet Sci 55, 1-9.
Smith, W.D., Smith, S.K., Murray, J.M., 1994, Protection studies with integral membrane fractions of
Haemonchus contortus. Parasite Immunol 16, 231-241.
Smith, T.S., Graham, M., Munn, E.A., Newton, S.E., Knox, D.P., Coadwell, W.J., McMichael-Phillips, D.,
Smith, H., Smith, W.D., Oliver, J.J., 1997, Cloning and characterization of a microsomal
aminopeptidase from the intestine of the nematode Haemonchus contortus. Biochim Biophys Acta
1338, 295-306.
Smith, S.K., Pettit, D., Newlands, G.F., Redmond, D.L., Skuce, P.J., Knox, D.P., Smith, W.D., 1999, Further
immunization and biochemical studies with a protective antigen complex from the microvillar
membrane of the intestine of Haemonchus contortus. Parasite Immunol 21, 187-199.
Smith, W.D., van Wyk, J.A., van Strijp, M.F., 2001, Preliminary observations on the potential of gut membrane
proteins of Haemonchus contortus as candidate vaccine antigens in sheep on naturally infected pasture.
Vet Parasitol 98, 285-297.
Sonstegard, T.S., Gasbarre, L.C., 2001, Genomic tools to improve parasite resistance. Vet Parasitol 101, 387-
403.
Soulsby, E.J.L., 1982, Helminths, arthropods and protozoa of domesticated animals, 7th Edition, 809 p.
Sreter, T., Kassai, T., Takacs, E., 1994, The heritability and specificity of responsiveness to infection with
Haemonchus contortus in sheep. Int J Parasitol 24, 871-876.
Stankiewicz, M., Pernthaner, A., Cabaj, W., Jonas, W.E., Douch, P.G., Bisset, S.A., Rabel, B., Pfeffer, A.,
Green, R.S., 1995, Immunization of sheep against parasitic nematodes leads to elevated levels of
globule leukocytes in the small intestine lumen. Int J Parasitol 25, 389-394.
Stankiewicz, M., Cabaj, W., Pernthaner, A., Jonas, W., Rabel, B., 1996, Drug-abbreviated infections and
development of immunity against Trichostrongylus colubriformis in sheep. Int J Parasitol 26, 97-103.
Stear, M.J., Bishop, S.C., Doligalska, M., Duncan, J.L., Holmes, P.H., Irvine, J., McCririe, L., McKellar, Q.A.,
Sinski, E., Murray, M., 1995a, Regulation of egg production, worm burden, worm length and worm
229

Références bibliographiques
fecundity by host responses in sheep infected with Ostertagia circumcincta. Parasite Immunol 17, 643-
652.
Stear, M.J., Bairden, K., Duncan, J.L., Murray, M., 1995b, A comparison of the responses to repeated
experimental infections with Haemonchus contortus among Scottish Blackface lambs. Vet Parasitol 60,
69-81.
Stear, M.J., Bairden, K., Bishop, S.C., Buitkamp, J., Epplen, J.T., Gostomski, D., McKellar, Q.A., Schwaiger,
F.W., Wallace, D.S., 1996, An ovine lymphocyte antigen is associated with reduced faecal egg counts
in four-month-old lambs following natural, predominantly Ostertagia circumcincta infection. Int J
Parasitol 26, 423-428.
Stear, M.J., Bairden, K., Duncan, J.L., Holmes, P.H., McKellar, Q.A., Park, M., Strain, S., Murray, M., Bishop,
S.C., Gettinby, G., 1997, How hosts control worms. Nature 389, 27.
Stevens, R.L., Austen, K.F., 1989, Recent advances in the cellular and molecular biology of mast cells. Immunol
Today 10, 381-386.
Stevenson, L.M., Huntley, J.F., Smith, W.D., Jones, D.G., 1994, Local eosinophil- and mast cell-related
responses in abomasal nematode infections of lambs. FEMS Immunol Med Microbiol 8, 167-173.
Summers, R.W., Elliott, D.E., Qadir, K., Urban, J.F., Jr., Thompson, R., Weinstock, J.V., 2003, Trichuris suis
seems to be safe and possibly effective in the treatment of inflammatory bowel disease. Am J
Gastroenterol 98, 2034-2041.
Summers, R.W., Elliott, D.E., Urban, J.F., Jr., Thompson, R., Weinstock, J.V., 2005, Trichuris suis therapy in
Crohn's disease. Gut 54, 87-90.
Svetic, A., Madden, K.B., Zhou, X.D., Lu, P., Katona, I.M., Finkelman, F.D., Urban, J.F., Jr., Gause, W.C.,
1993, A primary intestinal helminthic infection rapidly induces a gut-associated elevation of Th2associated
cytokines and IL-3. J Immunol 150, 3434-3441.
Swan, G.E., 1999, The pharmacology of halogenated salicylanilides and their anthelmintic use in animals. J S
Afr Vet Assoc 70, 61-70.
Tabouret, G., Lacroux, C., Andreoletti, O., Bergeaud, J.P., Hailu-Tolosa, Y., Hoste, H., Prevot, F., Grisez, C.,
Dorchies, P., Jacquiet, P., 2003, Cellular and humoral local immune responses in sheep experimentally
infected with Oestrus ovis (Diptera: Oestridae). Vet Res 34, 231-241.
Takats, C., Schallig, H.D., Van Leeuwen, M.A., Hendrikx, W.M., 1995, Immune responses of sheep to
microdissected parts of Haemonchus contortus. Int J Parasitol 25, 857-860.
Thompson-Snipes, L., Dhar, V., Bond, M.W., Mosmann, T.R., Moore, K.W., Rennick, D.M., 1991, Interleukin
10: a novel stimulatory factor for mast cells and their progenitors. J Exp Med 173, 507-510.
Tosi, M.F., 2005, Innate immune responses to infection. J Allergy Clin Immunol 116, 241-249; quiz 250.
Turner, J.D., Faulkner, H., Kamgno, J., Cormont, F., Van Snick, J., Else, K.J., Grencis, R.K., Behnke, J.M.,
Boussinesq, M., Bradley, J.E., 2003, Th2 cytokines are associated with reduced worm burdens in a
human intestinal helminth infection. J Infect Dis 188, 1768-1775.
Uhlinger, C., Fleming, S., Moncol, D., 1992, Survey for drug-resistant gastrointestinal nematodes in 13
commercial sheep flocks. J Am Vet Med Assoc 201, 77-80.
Urban, J.F., Jr., Katona, I.M., Paul, W.E., Finkelman, F.D., 1991, Interleukin 4 is important in protective
immunity to a gastrointestinal nematode infection in mice. Proc Natl Acad Sci U S A 88, 5513-5517.
Urban, J.F., Jr., Fayer, R., Sullivan, C., Goldhill, J., Shea-Donohue, T., Madden, K., Morris, S.C., Katona, I.,
Gause, W., Ruff, M., Mansfield, L.S., Finkelman, F.D., 1996, Local TH1 and TH2 responses to
230

Références bibliographiques
parasitic infection in the intestine: regulation by IFN-gamma and IL-4. Vet Immunol Immunopathol 54,
337-344.
Urban, J.F., Jr., Noben-Trauth, N., Donaldson, D.D., Madden, K.B., Morris, S.C., Collins, M., Finkelman, F.D.,
1998, IL-13, IL-4Ralpha, and Stat6 are required for the expulsion of the gastrointestinal nematode
parasite Nippostrongylus brasiliensis. Immunity 8, 255-264.
Urban, J.F., Jr., Noben-Trauth, N., Schopf, L., Madden, K.B., Finkelman, F.D., 2001, Cutting edge: IL-4
receptor expression by non-bone marrow-derived cells is required to expel gastrointestinal nematode
parasites. J Immunol 167, 6078-6081.
Urquhart, G.M., Armour, J., Duncan, J.L., Dunn, A.M., Jennings, F.W., 1996, Veterinary parasitology, Second
Edition, 307 p.
Valentine, B.A., McDonough, S.P., 2003, B-cell leukemia in a sheep. Vet Pathol 40, 117-119.
Vallance, B.A., Blennerhassett, P.A., Collins, S.M., 1997, Increased intestinal muscle contractility and worm
expulsion in nematode-infected mice. Am J Physiol 272, G321-327.
van Wyk, J.A., Malan, F.S., Randles, J.L., 1997, How long before resistance makes it impossible to control some
field strains of Haemonchus contortus in South Africa with any of the modern anthelmintics? Vet
Parasitol 70, 111-122.
van Wyk, J.A., Stenson, M.O., Van der Merwe, J.S., Vorster, R.J., Viljoen, P.G., 1999, Anthelmintic resistance
in South Africa: surveys indicate an extremely serious situation in sheep and goat farming.
Onderstepoort J Vet Res 66, 273-284.
Vanimisetti, H.B., Greiner, S.P., Zajac, A.M., Notter, D.R., 2004, Performance of hair sheep composite breeds:
resistance of lambs to Haemonchus contortus. J Anim Sci 82, 595-604.
Veglia, F., 1915, The anatomy and life-history of the Haemonchus contortus (Rud). Report of the director of
Veterinary Research, Department of Agriculture, Union of South Africa, 349-500.
Vervelde, L., Kooyman, F.N., Van Leeuwen, M.A., Schallig, H.D., MacKellar, A., Huntley, J.F., Cornelissen,
A.W., 2001, Age-related protective immunity after vaccination with Haemonchus contortus
excretory/secretory proteins. Parasite Immunol 23, 419-426.
Vlassoff, A., Mckenna, P.B., 1994, Nematode parasites of economic importance in sheep in New Zealand. N
Zeal J Zool 21.
Voehringer, D., Shinkai, K., Locksley, R.M., 2004, Type 2 immunity reflects orchestrated recruitment of cells
committed to IL-4 production. Immunity 20, 267-277.
Wakelin, D., Lloyd, M., 1976, Accelerated expulsion of adult Trichinella spiralis in mice given lymphoid cells
and serum from infected donors. Parasitology 72, 307-315.
Wakelin, D., 1978, Immunity to intestinal parasites. Nature 273, 617-620.
Wakelin, D., 1985, Genetic control of immunity to helminth infections. Parasitol Today 1, 17-23.
Wakelin, D., 1987, Parasite survival and variability in host immune responsiveness. Mammal Rev 17, 135-141.
Wakelin, D., 1988, Helminth infections, In: In Wakelin, D., Blackwell, J.M. (Ed.) Genetics of resistance to
bacterial and parasitic infection. Taylor and Francis, London, pp. 155-224.
Wakelin, D., 1992, Immunogenetic and evolutionary influences on the host-parasite relationship. Dev Comp
Immunol 16, 345-353.
Waller, P.J., Larsen, M., Faedo, M., Hennessy, D.R., 1994, The potential of nematophagous fungi to control the
free-living stages of nematode parasites of sheep: in vitro and in vivo studies. Vet Parasitol 51, 289-299.
231

Waller, P.J., 1997, Anthelmintic resistance. Vet Parasitol 72, 391-405; discussion 405-312.
Références bibliographiques
Waller, P.J., Knox, M.R., Faedo, M., 2001, The potential of nematophagous fungi to control the free-living
stages of nematode parasites of sheep: feeding and block studies with Duddingtonia flagrans. Vet
Parasitol 102, 321-330.
Walsh, G.M., 1999, Advances in the immunobiology of eosinophils and their role in disease. Crit Rev Clin Lab
Sci 36, 453-496.
Wang, C.H., Bell, R.G., 1988, Antibody-mediated in-vivo cytotoxicity to Trichinella spiralis newborn larvae in
immune rats. Parasite Immunol 10, 293-308.
Wanyangu, S.W., Mugambi, J.M., Bain, R.K., Duncan, J.L., Murray, M., Stear, M.J., 1997, Response to
artificial and subsequent natural infection with Haemonchus contortus in red Maasai and Dorper ewes.
Vet Parasitol 69, 275-282.
Weinstock, J.V., Summers, R., Elliott, D.E., 2004, Helminths and harmony. Gut 53, 7-9.
Weller, P.F., 1994, Eosinophils: structure and functions. Curr Opin Immunol 6, 85-90.
Wildblood, L.A., Kerr, K., Clark, D.A., Cameron, A., Turner, D.G., Jones, D.G., 2005, Production of eosinophil
chemoattractant activity by ovine gastrointestinal nematodes. Vet Immunol Immunopathol 107, 57-65.
Willadsen, P., Bird, P., Cobon, G.S., Hungerford, J., 1995, Commercialisation of a recombinant vaccine against
Boophilus microplus. Parasitology 110 Suppl, S43-50.
Williams, D.J., Behnke, J.M., 1983, Host protective antibodies and serum immunoglobulin isotypes in mice
chronically infected or repeatedly immunized with the nematode parasite Nematospiroides dubius.
Immunology 48, 37-47.
Windon, R.G., 1990a, Selective breeding for the control of nematodiasis in sheep. Rev Sci Tech 9, 555-576.
Windon, R.G., 1990b, Genetic control of host responses involved in resistance to gastrointestinal parasites, In:
Owen, J.B., Axford, R. F. E. (Ed.) Breeding for resistance in farm animals.Oxford, pp. 162-186.
Windon, R.G., Gray, G.D., Woolaston, R.R., 1993, Proceedings of the sheep veterinary society. 17, 37.
Windon, R.G., 1996, Genetic control of resistance to helminths in sheep. Vet Immunol Immunopathol 54, 245-
254.
Winter, M.D., Wright, C., Lee, D.L., 1997, The mast cell and eosinophil response of young lambs to a primary
infection with Nematodirus battus. Parasitology 114 ( Pt 2), 189-193.
Wolstenholme, A.J., Fairweather, I., Prichard, R., von Samson-Himmelstjerna, G., Sangster, N.C., 2004, Drug
resistance in veterinary helminths. Trends Parasitol 20, 469-476.
Woolaston, R.R., 1992, Selection of Merino sheep for increased and decreased resistance to Haemonchus
contortus: peri-parturient effects on faecal egg counts. Int J Parasitol 22, 947-953.
Woolaston, R.R., Eady, S.J., 1995, Breeding for resistance to infectious diseases in small ruminants, In: G.D.
Gray, R.R.W.a.B.T.E. (Ed.) ACIAR.Canberra, p. 53.
Woolaston, R.R., Manueli, P., Eady, S.J., Barger, I.A., Le Jambre, L.F., Banks, D.J., Windon, R.G., 1996, The
value of circulating eosinophil count as a selection criteria for resistance of sheep to trichostrongyle
parasites. Int J Parasitol 26, 123-126.
Yazwinski, T.A., Goode, L., Moncol, D.J., Morgan, G.W., Linnerud, A.C., 1979, Parasite resistance in
straightbred and crossbred Barbados Blackbelly sheep. J Anim Sci 49, 919-926.
232

Références bibliographiques
Yazwinski, T.A., Goode, L., Moncol, D.J., Morgan, G.W., Linnerud, A.C., 1980, Haemonchus contortus
resistance in straightbred and crossbred Barbados Blackbelly sheep. J Anim Sci 51, 279-284.
Yoshimoto, T., Paul, W.E., 1994, CD4pos, NK1.1pos T cells promptly produce interleukin 4 in response to in
vivo challenge with anti-CD3. J Exp Med 179, 1285-1295.
Yvore, P., Cabaret, J., Pery, P., 1996, Les maladies parasitaires en élevage : la recherche de nouveaux moyens de
lutte. INRA Productions Animales Hors-Série, 111-117.
Zhao, A., McDermott, J., Urban, J.F., Jr., Gause, W., Madden, K.B., Yeung, K.A., Morris, S.C., Finkelman,
F.D., Shea-Donohue, T., 2003, Dependence of IL-4, IL-13, and nematode-induced alterations in murine
small intestinal smooth muscle contractility on Stat6 and enteric nerves. J Immunol 171, 948-954.
Zhong, S., Dobson, C., 1996, Heligmosomoides polygyrus: resistance in inbred, outbred, and selected mice. Exp
Parasitol 82, 122-131.
Zhou, Y., Bao, S., Rothwell, T.L., Husband, A.J., 1996, Differential expression of interleukin-5 mRNA+ cells
and eosinophils in Nippostrongylus brasiliensis infection in resistant and susceptible strains of mice.
Eur J Immunol 26, 2133-2139.
233

Régulation des populations de Nématodes gastro-intestinaux (Haemonchus contortus et
Trichostrongylus colubriformis) dans deux races ovines, INRA 401 et Barbados Black Belly.
Résumé :
Les Nématodes gastro-intestinaux sont des parasites majeurs en élevage ovin. Actuellement, leur
contrôle repose sur l’utilisation de molécules anthelminthiques. L’extension de résistances à ces
molécules dans les populations de strongles rend urgente la recherche de solutions alternatives comme
la sélection d’animaux résistants. Toutefois, la méconnaissance des mécanismes de la réponse
immunitaire des ovins contre ces strongles reste un obstacle à son développement. La première partie
de nos travaux a démontré une orientation Th2 claire lors d’infestation par Haemonchus contortus et
plus équivoque lors d’infestation par Trichostrongylus colubriformis. Dans un second temps, les
réponses immunes adaptatives de moutons de race sensible (INRA 401) et résistante (Barbados Black
Belly) lors d’infestation par H. contortus ont été comparées. Des différences d’expression des gènes de
l’IL-4, IL-5 et de l’IL-13, et d’éosinophilie sanguine ont été enregistrées entre les deux races.
Mots clés :
Nématodes gastro-intestinaux – Ovins – Haemonchus contortus – Trichostrongylus colubriformis –
Réponse immunitaire – Polarisation Th2 – Résistance génétique.
Regulation of gastro-intestinal nematode populations (Haemonchus contortus and
Trichostrongylus colubriformis) in two ovine breeds, INRA 401 and Barbados Black Belly.
Abstract:
Gastrointestinal nematodes are major parasites of sheep industry. Current control is mainly based on
chemical molecules. Due to the extension of anthelmintic resistance in nematode populations all
around the world, alternative strategies, such as selective breeding of resistant sheep, are now
necessary. Nevertheless, the imprecise knowledge of sheep immune mechanisms towards these
parasites limits their development. The first part of this study demonstrated a clear Th2 polarization of
the sheep immune response to Haemonchus contortus infection. In another hand, the response to
Trichostrongylus colubriformis was more equivocal. In a second time, adaptative immune responses to
H. contortus infection were compared between a susceptible breed (INRA 401) and a resistant one
(Barbados Black Belly). Differences in IL-4, IL-5 and IL-13 gene expressions and blood eosinophilia
were noticed between the two breeds.
Key words :
Gastrointestinal nematodes – Sheep - Haemonchus contortus – Trichostrongylus colubriformis –
Immune response – Th2 polarization – Genetic resistance.