dr. Zádori Anita - Semmelweis Egyetem Doktori Iskola

A környezet hatása embrionális neuroektodermális 

őssejtek fejlődésére: implantációs vizsgálatok egy 

idegi őssejtvonallal 

Doktori értekezés 

dr. Zádori Anita 

Semmelweis Egyetem 

Szentágothai János Idegtudományi Doktori Iskola 

Témavezető: Dr. Madarász Emília tudományos tanácsadó, az MTA doktora 

Hivatalos bírálók: Dr. Komoly Sámuel egyetemi tanár, az MTA doktora 

Dr. Sasvári Mária egyetemi tanár, az MTA doktora 

Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Bereczki Dániel egyetemi tanár, az MTA doktora 

Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Nagy M. György, egyetemi tanár, az MTA doktora 

Dr. Tárnok Krisztián, egyetemi adjunktus, PhD 

Budapest 

2010

Tartalomjegyzék 

Tartalomjegyzék ......................................................................................................................... 2 

Rövidítések ................................................................................................................................. 4 

Bevezetés .................................................................................................................................... 6 

A felnőttkori neurogenezis és idegi őssejtek ........................................................................... 6 

Sejtvesztéssel járó központi idegrendszeri betegségek gyógyítási lehetőségei ..................... 20 

Az oxigén szerepe az agyi mikrokörnyezetben és hatásai az őssejtek 

elköteleződésére.................................................................................................................. 21 

A sejtbeültetés terápiás hatásai központi idegrendszeri kórképekben ................................ 23 

Az NE-4C neuroektodermális őssejtvonal és alklónjai ......................................................... 29 

Célkitűzések ............................................................................................................................. 33 

Módszerek ................................................................................................................................ 34 

A. Sejtes kísérletek ............................................................................................................... 34 

Az NE-4C idegi őssejtvonal és alklónjai ............................................................................ 34 

Implantált, agyszövetben növekedő GFP-4C sejtek izolálása a gazdaszövetből ............... 34 

Primer asztroglia tenyészetek ............................................................................................. 35 

Glióma- és glioblasztómavonalak ...................................................................................... 35 

A sejtvonalak fenntartása.................................................................................................... 36 

Az őssejtek in vitro neuronális indukciója retinsavval ....................................................... 36 

Az őssejtek in vitro neuronális indukciója asztroglia ko-kultúrában ................................. 36 

A sejtek által termelt szolubilis faktorok vizsgálata ........................................................... 37 

A sejtek hipoxiás kezelése .................................................................................................. 37 

A sejt-aggregáció vizsgálatai .............................................................................................. 38 

A sejtproliferáció mérése .................................................................................................... 38 

Kromoszómaszám-meghatározás ....................................................................................... 39 

Életképesség-mérés ............................................................................................................ 39 

RT-PCR .............................................................................................................................. 40 

B. Állatkísérletek .................................................................................................................. 41 

Felhasznált állatfajok és törzsek ......................................................................................... 41 

Altatás ................................................................................................................................. 41 

Fagyasztásos lézió .............................................................................................................. 41 

Sejtbeültetés ........................................................................................................................ 42 

Hiperbárikus oxigén terápia alkalmazása ........................................................................... 42 

Viselkedésvizsgálatok ........................................................................................................ 44 

C. A preparátumok feldolgozása .......................................................................................... 45 

Fixálás, metszés .................................................................................................................. 45 

TUNEL-reakció .................................................................................................................. 46 

Immuncitokémiai festések .................................................................................................. 46 

Mikroszkópos kiértékelés ................................................................................................... 48 

Statisztikai próbák .............................................................................................................. 48 

2

Eredmények .............................................................................................................................. 49 

I. NE-4C sejtek „sorsa” intakt és sérült felnőtt agyi környezetben ....................................... 49 

I.1 NE-4C sejtek fagyasztással sértett agykérgi területeken............................................... 49 

I.2 Az NE-4C sejtek kölcsönhatása tumorsejtekkel .......................................................... 57 

II. In vitro előindukált GFP-4C sejtek „sorsa” intakt és sértett agyi környezetben .............. 65 

III. Változó oxigén-ellátottság hatásai az NE-4C sejtekre .................................................... 70 

III.1 Az NE-4C őssejtek „viselkedése” hipoxiás környezetben ......................................... 70 

III.2 Az NE-4C őssejtek intracerebralis „sorsa” magas in vivo oxigén tenzió mellett ...... 78 

Megbeszélés.............................................................................................................................. 87 

Következtetések ........................................................................................................................ 99 

Összefoglalás .......................................................................................................................... 101 

Summary ................................................................................................................................. 102 

Irodalomjegyzék ..................................................................................................................... 103 

Saját publikációk jegyzéke ..................................................................................................... 126 

Köszönetnyilvánítás ............................................................................................................... 127 

3

Rövidítések 

ATCC – American Type Culture 

Collection 

AVE – anterior viszcerális entoderma 

BDNF – agyi neurotrófikus faktor, 

brain derived neurotrophic factor 

blbp – brain lipid-binding protein 

BMP – csont morfogén fehérje, bone 

morphogenetic protein 

Br – egérkoponyán Bregma és 

szaggitális varrat metszéspontja 

BrdU – 5-bromo-3‟-deoxiuridin 

c-myc – celluláris proto-onkogén 

CD133 – őssejt marker, cluster of 

differentiation 133 

CNTF – sugártestizom neurotrófikus 

faktor, ciliary neurotrophic factor 

CSPG – kondroitin-szulfát proteoglikán, 

chondroitin sulfate proteoglycan 

DMEM – Dulbecco‟s Modified Eagle‟s 

Medium 

ECM – extracelluláris mátrix 

EDTA – etiléndiamin-tetraecetsav 

EGF – epidermális növekedési faktor, 

epidermal growth factor 

EGL – external germinal/granule layer: 

kisagyi külső germinatív réteg 

ES – embrionális őssejt, embryonic 

stem cell 

EZ – ependimális zóna 

FACS – fluorszcens jel aktivált 

sejtválogatás, fluorescent activated 

cell sorting 

FCS – fötális borjúsavó, foetal calf 

serum 

FGF – fibroblaszt növekedési faktor, 

fibroblast growth factor 

GABA – gamma-amino vajsav, gammaaminobutyric 

acid 

GCL – granuláris sejtréteg, granule cell 

layer 

GD – gyrus dentatus 

GDNF – glia sejtvonal eredetű 

neurotrófikus faktor, glial cell linederived 

neurotrophic factor 

4 

GFAP – gliális fibrilláris savas fehérje, 

glial fibrillary acidic protein 

(e)GFP – (felerősített) zöld fluoreszcens 

fehérje, (enhanced) green fluorescent 

protein 

GFP-RC – agyból „visszatenyésztett” 

GFP-4C sejtvonal, GFP-Recultured 

HBO(T) – túlnyomásos oxigén 

(kezelés), hyperbaric oxygen 

(therapy) 

hc – hippocampus 

HE – hematoxilin-eozin 

HIF – hipoxia (által) indukálható faktor, 

hypoxia-inducible factor 

hnf-4 – hepatocita nukleáris faktor-4 

gén 

HPRT – hipoxantin-guanin 

foszforibozil-transzferáz, 

hypoxanthine-guanine 

phosphoribosyl transferase 

HSPG – heparán-szulfát proteoglikán, 

heparan sulfate proteoglycan 

ICP – intracraniális nyomás, intracranial 

pressure 

IFN – interferon 

IL – interleukin 

iPSC – indukált pluripotens őssejt, 

induced pluripotent stem cell 

KM – kondícionált médium 

lacZ – béta-galaktozidáz enzim génje 

LIF – leukémia inhibítoros faktor, 

leukemia inhibitory factor 

MAG – myelin-asszociált glikoprotein, 

MEM – minimum essential medium 

(tápoldat) 

MHC – major hisztokompatibilitási 

komplex 

MTT – 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 

2,5-diphenyl tetrazolium bromid 

NBOT – normobaric oxygen therapy, 

normál nyomású oxigénkezelés 

NeuN – idegsejtspecifikus 

sejtmagfehérje, Neuronal nuclei 

NF – neurofilament

NG-2 – oligodendroglia prekurzor 

sejtek által termelt kondroitin-szulfát 

proteoglikán 

NGF – idegnövekedési faktor, nerve 

growth factor 

ngn-2 – neurogenin-2 gén 

Nogo – neurit kinövést gátló fehérje, 

neurit outgrowth inhibitory protein 

NSE – neuron specifikus enoláz 

NT – neurotrofin 

Nurr-1 – sejtmagi receptorhoz 

kapcsolódó fehérje 1, nuclear 

receptor-related protein 1 

Oct-4 – octamer 4, transzkripciós faktor 

OD – optikai denzitás 

Olig2 – oligodendrocita vonal 

transzkripciós faktor 2, 

Oligodendrocyte lineage transcription 

factor 2 

OMGp – oligodendrocita myelin 

glikoprotein, oligodendrocyte myelin 

glycoprotein 

p53 – sejtciklus-szabályozó fehérje 

PBS – foszfát pufferelt sóoldat, 

phosphate buffered saline 

PC12 – phaeochromocytoma sejtvonal 

PEDF – pigment-epitélium eredetű 

faktor, pigment epithelium-derived 

factor 

PFA – paraformaldehid 

PLAP – placentális alkalikus foszfatáz, 

placental alkaline phosphatase 

PSA-NCAM – polisziálsavas neurális 

sejtadhéziós molekula, polysialic acid 

neural cell adhesion molecule 

5 

RA – retinsav, retinoic acid 

RG – radiális glia 

RMS – rosztrális migrációs ösvény, 

rostral migratory stream 

ROS – reaktív oxigéngyökök, reactive 

oxygen species 

SEZ – szubependimális zóna 

SGZ/SGL –szubgranuláris zóna, 

subgranular zone/layer 

Shh – Sonic hedgehog, szekretált 

morfogén fehérje 

Sox – Sry-related HMG box (gén / 

traszkripciós faktor) 

SSEA – állapot-specifikus embrionális 

antigén, stage-specific embryonic 

antigen 

SV40 – Simian Vacuolating Virus 40 

SVZ – szubventriculáris zóna, 

subventricular zone 

TGF – transzformáló növekedési faktor, 

transforming growth factor 

TNF – tumor nekrózis faktor, tumor 

necrosis factor 

TUNEL – Terminal deoxynucleotidyl 

Transferase Biotin-dUTP Nick End 

Labeling 

VEGF – érendotél növekedési faktor, 

vascular endothelial growth factor 

VZ – ventrikuláris zóna 

Wnt – szekretált morfogén-család / 

kódoló gének

Bevezetés 

A felnőttkori neurogenezis és idegi őssejtek 

Számos központi idegrendszeri kórkép létezik, amelyek maradandó károsodással, romló 

életminőséggel járnak. A kórképek mögött eltérő pathofiziológiai állapotok állnak, 

amelyekről egyre többet tudunk, de a gyógyításuk a legritkább esetben megoldott. 

Egyéb szervek, szervrendszerek kóros állapotaival ellentétben a központi idegrendszer 

sérüléseinek, betegségeinek gyógyítása azért jelent különösen nagy kihívást, mert a 

központi idegrendszer minimális regenerációs képességénél fogva a nagyobb definitív 

károsodásokat helyrehozni nem képes. Új idegsejtek a károsodásokat követően igen kis 

számban képződnek, új funkcionális hálózatok pedig csak ritkán szerveződnek. 

Az idegtudomány meghatározó Ramon y Cajal-i dogmája, miszerint a felnőtt központi 

idegrendszerben idegsejtképzés és érdemi regeneráció nincs, egészen az 1980-as évekig 

tartotta magát. Cajal „Degeneration and Regeneration in the Nervous System‟ c. 

könyvének mondatai szerint (1928) „a fejlődés lezárultával az axon- és 

dendritnövekedés és regeneráció forrásai végérvényesen elapadnak. A felnőtt agyi 

idegpályák végleges, megváltoztathatatlan, rögzített struktúrák. Minden elpusztulhat, de 

semmi sem születhet újjá.” Kortársait megelőzve, szerény eszköztárral Cajal a központi 

és perifériás idegrendszeri degeneráció, és -regeneráció tárgykörében kulcsfontosságú 

felismeréseket tett (1. ábra). 

1. ábra Illusztráció Ramon y Cajal anyanyelvén 1913-ban, angolul 1928-ban megjelent könyvéből. 

Cajal az idegsérülést követő regenerációs folyamatokat több aspektusból részletesen megvizsgálta 

(Lobato 2008). Az ábrákon különböző körülmények között végzett idegátmetszést követő 

axonnövekedési folyamatok láthatók. 

Az 1900-as években történtek az első kísérletek, amelyek igazolták, hogy a felnőtt 

központi idegszövetben új sejtek születnek. Évtizedekig a [ 3 H]-timidin beépülés 

6

technikájával bizonyították az új sejtek létrejöttét az agy több régiójában (Allen 1912), 

de ezek identitását nem tudták megállapítani. Az 1960-as években Altman és 

munkatársai – autoradiográfiás és hisztológiai módszerekkel - több tanulmányban 

kimutatták rágcsáló hippocampusban, anterior előagyban és bulbus olfactoriusban új - 

idegsejteknek vélt- sejtek képződését (Altman és Das 1965). Az ‟70-es és ‟80-as 

években Kaplan és társainak elektronmikroszkópos vizsgálatai megerősítették, hogy a 

keletkező sejtek között neuron morfológiájú, szinaptikus bemenetekkel, idegi 

sejtnyúlványokkal rendelkező idegsejtek vannak mind a bulbus olfactoriusban, mind a 

hippocampus gyrus dentatusában (Kaplan és Hinds 1977). 

A neuron-specifikus immuncitokémiai festések hiánya, a pusztán morfológiai 

kritériumok alapján történő sejttipizálás miatt ezeket az eredményeket nem fogadták el 

széles körben. 

Nottebohm és munkatársai a ‟80-as években leírták, hogy felnőtt hím kanárimadarakban 

hormonális kezelés hatására illetve szezonális jelleggel is aktiválódnak neurogén 

folyamatok, amelyek a madarak dallamtanulását segítik. Az új idegsejtek a felső 

hangképző centrumba épülnek be, funkcionálisan aktívak, szezonálisan elpusztuló 

idegsejteket helyettesítenek (Goldman és Nottebohm 1983, Kirn és mtsai 1994). 

Az ezt követő intenzív kutatómunka, új technikák (éretlen és érett idegsejteket azonosító 

immunjelölések; BrdU-technika) alkalmazásával megerősítette a felnőtt neurogenezis 

tényét, emlős (rágcsáló, főemlős és humán) agyi mintákon (Cameron és mtsai 1993, 

Gould és mtsai 1999a, Eriksson és mtsai 1998). Pontosan feltérképezték a felnőtt 

agyban zajló neurogenezis régióit, a képződő idegi progenitorok vándorlási útvonalait, 

végső elhelyezkedésüket, a kialakuló új neuronok típusait. 

Az idegi őssejtek, mint minden őssejt, önmegújításra és önmaguktól eltérő utódsejt 

létrehozására is képesek. Ezt szimmetrikus és aszimmetrikus osztódás révén érik el. 

Míg szimmetrikus mitózis esetén két identikus utódsejt keletkezik, aszimmetrikus 

osztódásnál a keletkező sejtek eltérőek, az egyik őssejt, a másik elköteleződő, a 

differenciálódás útjára lépő utódsejt. Osztódás során meghatározó tényező a sejtek – a 

központi idegrendszerben a neuroepitheliális őssejtek/radiális gliasejtek - apico-basalis 

polarizáltsága. Osztódási síktól függően az utódsejtekben eltérő lehet bizonyos 

kulcsfontosságú citoplazmatikus faktorok és membránkomponensek eloszlása, ebből 

következik a sejtek eltérő génexpressziós mintázata és gyökeresen eltérő sorsa 

7

aszimmetrikus osztódás esetén. Az osztódási folyamatok szabályozó tényezői között 

felismerték a mitotikus orsó orientációjának fontosságát, illetve az ún. SNARE 

(szolubilis N-ethylmaleimide-érzékeny fúziós fehérjéhez kötődő protein receptor) 

integráns membránproteinek fontos szerepét, amelyek a citokinezis során történő 

plazmamembrán-fúziót szabályozzák (Götz és Huttner 2005). A szabályozó folyamatok 

azonban részletekbe menően még nem ismertek. Az őssejtek osztódóképességüket 

megőrzik az egyed élete során. Az osztódások közt eltelt idő jelentősen változhat az 

osztódás G0-G1 fázisainak hosszúságától függően. Az őssejtek különböző típusai két 

vagy több sejttípus létrehozására képesek. Ettől függően nevezzük őket omni- vagy 

totipotensnek, pluripotensnek, multipotensnek vagy bipotensnek. Az omnipotens 

őssejtek az embrió morula stádiumát jellemzik, a szedercsírából izolált sejtek képesek 

az egész embriót extraembrionális függelékekkel együtt létrehozni. A pluripotens 

embrionális őssejtek az embrió hólyagcsíra stádiumából, a belső sejtcsomóból (inner 

cell mass) izolálhatók. Megfelelő körülmények között mindhárom csíralemez sejtjeit 

létrehozhatják sejtkultúrában, illetve élőlénybe visszaültetve. Szaporításuk és 

fenntartásuk viszonylag egyszerű. Használatukat korlátozza, hogy komoly etikai 

kérdéseket vet fel az embrionális őssejtvonalak létesítése, különös tekintettel a humán 

vonalakra. Az embrió fejlődése során az őssejtek fejlődési potenciálja fokozatosan 

szűkül. Kialakulnak a magzati, majd posztnatális multipotens szöveti őssejtek, 

amelyekről ma azt tartjuk, hogy elsősorban a gazdaszövet sejttípusainak létrehozására 

képesek. A fejlődő, majd kifejlett organizmus különböző szerveinek körülírt részein, 

vagy elszórva rejtőznek. Izolálásuk, kultúrában való fenntartásuk általában az 

embrionális őssejtekénél bonyolultabb feladat, néhány típus azonban viszonylag 

egyszerűen hozzáférhető (pl. hemopoetikus őssejtek). A kifejlett élőlény szöveti 

plaszticitásának alapját képezik. Speciális körülmények között képesek lehetnek más 

szövetek sejttípusainak létrehozására is. Az őssejtek utódsejtjeinek nevezéktanát nem 

használják konzekvensen. Az őssejtekből kialakuló sokszorozó, gyorsan osztódó 

sejtpopulációt progenitorsejteknek, az ezekből kifejlődő posztmitotikus, már 

elköteleződő sejteket prekurzoroknak nevezem dolgozatomban (2. ábra). 

8

2. ábra Az őssejtek leszármazási sora 

A központi idegrendszer sejtjeinek eredete; a germinatív zónák 

Az idegrendszer fejlődése az embrió gasztrulációjával egyidőben kezdődik el. 

Gasztruláció során az addig két sejtrétegű (epi- és hypoblast) embriópajzsban a sejtek 

egy része az embrió középvonalában a két réteg közé vándorol, így az embriópajzs 

három rétegűvé válik (ekto-, meso- és entoderma) és kialakul a hosszanti 

elhelyezkedésű primitív csík. A primitív csík elülső végén lévő Hensen-csomó 

organizátor régióként szerepel a fejlődés során, akárcsak az embrió elülső szélén 

kialakuló anterior viszcerális entoderma (AVE). A kettő között az epiblaszt velőlemezzé 

alakul. A mélybe vándorló sejtek a középvonalban létrehozzák a gerinchúrt (dorzális 

középvonali mezoderma), a gerinchúr felett húzódó primitív neuroektodermában pedig 

megkezdődik az idegi árok, majd az idegcső kialakulása. A neuruláció „default- 

folyamat”, azaz abban az esetben megy végbe, ha az organizátor régiókban felszabaduló 

morfogének (activin, BMP) gátló hatása nem érvényesül. A morfogének jelenléte térben 

és időben is pontosan szabályozza a neuruláció folyamatát. A pre-neurális (gli, zic, 

sox2) gének az AVE FGF-8 termelése következtében már a primitív ideglemez 

kialakulásakor aktiválódnak. 

A neuroektoderma a neuruláció során megvastagszik, hengerhámmá alakul. A sejtek 

gyors osztódásával kialakul az idegi árok, amely a későbbiekben velőcsővé záródik. A 

velőcsőből fejlődik ki a központi idegrendszer szinte minden sejtje, míg a cső két 

oldalán maradó vékony neuroektoderma csíkokból (velőlécek) alakulnak ki a perifériás 

idegrendszer alkotóelemei. A velőcső bazális, aláris- és tetőlemezében eltérő 

9

morfogének (elsősorban Shh, Wnt) hatásai érvényesülnek a mezo- és epidermális 

ektodermától, valamint az organizátorként működő fenéklemeztől (notoplate) való 

távolság függvényében. Ennek megfelelően a velőcső különböző ventro-dorzális 

pozícióban elhelyezkedő sejtjei különböző későbbi sejt-fenotípusok kialakítására 

„szakosodnak”. A velőcső antero-posterior tagolódásával alakulnak ki az elsődleges 

agyhólyagok, a prosencephalon, a mesencephalon és a rhomboencephalon. 

Az embrionális fejlődés során a velőcső üreget határoló sejtrétegének neuroepitheliális 

sejtjei alakítják ki a központi idegrendszer primer germinatív zónáját, a ventrikuláris 

zónát (VZ). A primer germinatív réteg embrionális idegi őssejtjei neuroektodermális 

sejtsorsra kötelezettek, aszimmetrikus és szimmetrikus mitózisra képesek. A korai 

embrionális fejlődés során, utódsejtjeik osztódóképességüket elvesztő, az üregi 

felszíntől eltávolodó posztmitotikus idegi prekurzor sejtekké, majd neuronokká 

alakulnak. A prenatális egyedfejlődés során a zónából korán kivándorló idegsejt- 

előalakok nagy sejttestű, hosszú nyúlvánnyal bíró idegsejteket (nagy vetítő neuronokat), 

a később kilépő idegsejt-előalakok egyre kisebb sejttestű, rövidebb nyúlványú 

neuronokat (kis vetítő idegsejteket, majd interneuronokat) képeznek. 

Pasko Rakic a ‟70-es években leírta az ún. radiális gliasejtek (RG) jelenlétét a 

ventrikuláris zónában (1971). Ez a sejttípus a neuroepitheliális őssejtek egy jellegzetes 

funkcionális állapota lehet, amelyre jellemző, hogy belőle a primer neurogenezis 

folyamán sokszorozó progenitorsejteken át, vagy közvetlenül prekurzorokat kialakítva 

idegsejtek és később asztoglia- és oligodendroglia-sejtek is fejlődnek. A radiális 

gliasejtek a velőcső kamrai és piális felszíne között hidat képezve segítik az idegsejt- 

előalakok vándorlását a kamrafelszín felől a piális felszín felé (radiális migráció). A 

radiális gliasejtjek leszármazottai azonban a szekunder germinatív réteg szöveti őssejtjei 

is [3. ábra](Merkle és mtsai 2004). 

10

3. ábra A neuroepitheliális őssejtek ontogenetikus fejlődése Alvarez-Buylla és mtsai (2001) 

alapján módosítva 

A primer germinatív réteg fokozatosan (a brachiális régiótól előre és hátrafelé is 

meghatározott késéssel) az agykamrákat határoló kuboid epitheliális határsejtjekké, ún. 

ependimasejtekké alakul át, idegsejtképző aktivitását elveszíti. Az előagyhólyagok 

ventromediális és ventrolaterális részén elhelyezkedő gangliondombok mentén az 

ependima-sejtréteg alatt másodlagos germinatív régió, a szubventrikuláris zóna (SVZ) 

alakul ki, amelynek őssejtjei felnőtt agyban is az idegsejtképzés egyik forrását jelentik. 

A felnőtt korban is folyamatosan sejteket képző szubventrikuláris zóna az előagyi 

oldalsó agykamrák striatummal határos területén található (4. ábra). Sérülés hatására 

azonban a teljes kamrafal hosszában történhet sejtképződés az ependimaréteg mentén 

végighúzódó; potenciális germinatív zónában (1. táblázat). 

11 

4. ábra A szubventrikuláris 

zóna lokalizációja rágcsálóagy 

frontális metszetének sematikus 

ábráján. Chiasson és mtsai 

(1999) alapján módosítva. Ctx: 

agykéreg, cc: corpus callosum, 

LV: oldalkamra, str: striatum, 

sep: septum.

A felnőtt szubventrikuláris zónában található őssejtek gliális fibrilláris savas fehérjét 

(GFAP-t) expresszáló, gliaszerű sejtek (Doetsch és mtsai 1999). Belőlük sokszorozó 

progenitorok, posztmitotikus idegsejt prekurzorok, vagy gliális sejtalakok alakulhatnak 

ki. Az eddigi vizsgálatok tanúságai alapján a felnőtt központi idegrendszerben 

elsősorban gátló interneuronokat, a szaglógumó pótlandó idegsejtjeit, asztrogliasejteket 

és oligodendroglia prekurzorokat képezhetnek. 

Neurogén régióként, ún. harmadlagos germinatív zónaként írták le (Altman és Bayer 

1990a, b) a hippocampus gyrus dentatusának szubgranuláris zónáját (SGZ). Emellett a 

kisagy területén azonosítottak egy peri- és korai posztnatális időszakban jelenlévő külső 

germinatív réteget (külső granuláris réteg, EGL) (Fujita 1967), amelyet a rhomboid árok 

negyedik agykamrával szomszédos részéből tangencionális vándorlással a felszínre 

növő progenitorsejtek alkotnak, és amelyből a kisagyi szemcsesejtek származnak. Ponti 

és kutatótársai (2008) szerint nyulakban pubertás- és felnőttkorban is megfigyelhető a 

kisagyban idegi progenitorsejt-képzés, amelynek forrása korai időszakban a külső 

granuláris rétegből létrejövő szubpiális réteg, később pedig feltehetően a kisagy 

molekuláris rétege. Egyes szerzők (Gould és mtsai 1999b, Zhao és mtsai 2003) a 

célterületekhez közeli szubependimális területekről származó új neuronok beépülését 

leírták mind az emlős substantia nigra-ban, mind a neocortex asszociációs kérgi 

régiójában; ezek az eredmények azonban megerősítésre várnak. 

1. táblázat (13. oldal) Neurogenezis központi idegrendszeri károsodásokban 

Rövidítések: Hvt. – hivatkozások, nv – nem vizsgálták, LPS – lipopoliszacharid, 6-OH dopamin - 6hidroxi-dopamin, 

MPTP - 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, G93A-SOD1 - glicinalanin 

szubsztitúció a citoszolban lévő Cu, Zn-szuperoxid diszmutázban, APP – amiloid prekurzor 

protein, il – ipsilateralis, SVZ – szubventrikuláris zóna, SGZ – szubgranuláris zóna, RMS – 

rosztrális migrációs ösvény, bulb. olf. – szaglógumó, cc – corpus callosum, SEZ – szubependimális 

zóna, EZ – ependimális zóna, hc – hippocampus, fá – fehérállomány, GCL – granuláris sejtréteg, GD 

– gyrus dentatus, régióspec. – régióspecifikus. 

Az irodalmi adatok szerint nem egyértelmű, vagy nem kellőképpen bizonyított adatokat kérdőjelesen 

tüntettük fel. 

Hivatkozások: [1] Arvidsson és mtsai 2002; [2] Arvidsson és mtsai 2001; [3] Jin és mtsai 2001; [4] 

Jin és mtsai 2003; [5] Jiang és mtsai 2001; [6] Yamashita és mtsai 2006; [7] Gu és mtsai 2000; [8] 

Magavi és mtsai 2000; [9] Jin és mtsai 2006; [10] Grimaldi és Rossi 2006; [11] Picard-Riera és 

mtsai 2002; [12] Ekdahl és mtsai 2003; [13] Ke és mtsai 2006; [14] Rice és mtsai 2003; [15] Urrea 

és mtsai 2007; [16] Sun és mtsai 2007; [17] Chi és mtsai 2006; [18] Curtis és mtsai 2003; [19] Jin és 

mtsai 2004a; [20] Jin és mtsai 2004b; [21] Sharp és mtsai 2002; [22] Schmidt és Reymann 2002; 

[23] Parent és mtsai 2002; [24] Parent és mtsai 1997; [25] Aponso és mtsai 2008; [26] Baker és 

mtsai 2004; [27] Mao és mtsai 2001; [28] Freundlieb és mtsai 2006. 

12

A károsodás típusa Faj Detektált sejtproliferáció Neurogenezis A sejtvándorlás iránya Differenciálódás Hvt. 

Fokális tranziens agyi ischaemia 

(a. cerebri media elzárás) 

patkány 

il SVZ il SVZ il striatum régióspec. érett neuron [1] 

SGZ SGZ GCL érett neuron [2] 

dominánsan il SGZ, rostralis SVZ SGZ, rostralis SVZ nv éretlen neuron [3], [4] 

rostralis SVZ, stroke penumbra rostralis SVZ il striatum, cortex éretlen és érett neuron [4] 

sérült cortex (sérült cortex?) nv érett neuron [5] 

egér SVZ SVZ il striatum régióspec. érett neuron [6] 

Fototrombotikus stroke patkány sérült cortex (sérült cortex?) nv érett neuron [7] 

Célzott agykérgi apoptózis egér SVZ, cortex SVZ, (cortex?) il cortex régióspec. érett neuron [8] 

Ischaemia-s stroke humán cortex nv nv éretlen és érett neuron [9] 

Purkinje sejt degeneráció 

(cerebellum toxikus lézió) 

Kísérletes autoimmun 

encephalomyelitis 

patkány kisagyban nem detektálható [10] 

egér SVZ, RMS, OB, cc, striatum SVZ 

13 

Bulb. olf., striatum, cc, 

fimbria 

érett neuron, asztocita, 

oligodendroglia 

LPS-indukált agykérgi gyulladás patkány SGZ-ben csökken [12] 

Gerincvelő-sérülés 

(thoracolumbalis kompresszió) 

Agyi trauma ("fluid percussion 

injury") 

Amyotrophia-s lateral sclerosis 

egér gerincvelő EZ 

patkány 

egér (G93A-SOD1 

mutáns) 

gerincvelő hátsó szarv 

(a sérülés felé) 

[11] 

érett neuronok [13] 

SGZ, SEZ a sérülés alatt nv érett neuron in situ [14] 

SVZ, cortex, hc, fá (SVZ, SGZ?) GCL, cortex, fá 

érett neuron, asztocita, 

oligodendroglia 

SGZ SGZ GD régióspec. érett neuron [16] 

gerincvelő EZ 

gerincvelő hátsó, majd 

elülső szarva felé 

érett neuron 

[17] 

Huntington-kór humán n. caudatus környéki SEZ nv érett neuron in situ [18] 

Alzheimer-kór 

humán 

egér (APP-mutáns) 

hc 

SGZ-GD, SVZ 

SGZ 

SGZ, SVZ 

SGZ, GCL, CA1 

nv 

érett neuron 

éretlen neuron in situ 

[19], 

[20] 

Globális agyi ischaemia (kétoldali 

a. carotis communis leszorítás) 

Status epilepticus (pilokarpinindukált) 

Parkinson-kór (6-OH dopamin 

lézió) 

Parkinson-kór (MPTP-lézió) 

gerbil SGZ SGZ 

GCL 

régióspec. érett neuron, 

asztrocita 

[21] 

hc CA1 érett neuron [22] 

patkány 

SVZ, RMS 

SGZ 

SVZ 

SGZ 

RMS, bulb. olf. 

GCL és ectopiás 

éretlen neuron 

érett neuron 

[23] 

[24] 

patkány SVZ, sérült striatum sérült striatum asztrocita [25] 

SVZ-ben csökken [26] 

egér 

striatum, substantia nigra nv "in loco" 

asztocita, kevés érett 

neuron 

[27] 

makákó SVZ-ben csökken [28] 

[15]

Felnőttkori idegsejtképzés és vándorlás a germinatív rétegekben 

A szubventrikuláris zóna (SVZ) 

A felnőtt emlősök szubventrikuláris zónájában a kamrafalat alkotó ependimasejt-réteg 

(E-sejtek) alatt több sejttípust különböztettek meg (Doetsch és mtsai 1997). Leírtak 

megnyúlt alakú, egy-két nyúlvánnyal rendelkező, a sejt hossztengelye mentén rendezett 

mikrotubulusokkal bíró, csoportokba rendeződő A-sejteket, GFAP-t expresszáló, 

asztroglia jellegű, sok nyúlvánnyal rendelkező B-sejteket, valamint kerekded, nagy 

sejtmagvú, mitotikusan igen aktív C-sejteket. Funkcionálisan az A-sejteket migráló 

neuroblasztként, a B-sejteket őssejtként, a C-sejteket pedig gyorsan proliferáló, 

sokszorozó progenitorsejtként azonosították (5. ábra). 

A megfigyelések szerint a B-sejtek határfelületet képeznek a migráló neuroblasztok és 

az ependimasejtek, valamint a neuroblasztok és a striatum között. Nélkülözhetetlenek a 

neuroblasztok túléléséhez, a migrációjukhoz szükséges faktorok termeléséhez, és a 

megfelelő szöveti környezet fenntartásához. Néhány SVZ őssejt a radiális gliasejtekhez 

és a neuroepitheliális őssejtekhez hasonlóan az agykamrával kontaktust képez; ciliumot 

bocsát a cerebrospinalis térbe (Alvarez-Buylla és mtsai 2001). Rágcsálókban a 

prekurzorsejtek/neuroblasztok jellegzetes alakot öltve (A-sejtek) a szubventrikuláris 

zónából szigorúan meghatározott vándorlási útvonalon, az ún. rostralis migrációs 

ösvényen (RMS), a B-sejtek által képzett csőszerű struktúrában vándorolnak (5. ábra, 6. 

ábra). 

14 

5. ábra A szubventrikuláris zóna 

elhelyezkedése és sejttípusai 

rágcsálóagy frontális metszetének 

sematikus ábráján (Alvarez-Buylla 

2002). Az oldalkamra (LV) 

ependymarétege (E) alatt 

elhelyezkedő őssejtek (B) képezik a 

sokszorozó progenitorsejteket (C), 

majd a vándorló neuroblasztokat 

(A), amelyek GFAP-pozitív sejtek 

által alkotott „csőben” láncmigrációt 

végeznek.

Céljukhoz, a szaglógumóhoz eljutva, granuláris és periglomeruláris interneuronokat 

képeznek (Alvarez-Buylla és mtsai 2002). A vándorlás gyökeresen eltér az embrionális 

központi idegrendszerben megfigyelt radiális és tangencionális migrációtól. A 

másodlagos germinatív réteg neuroblasztjai láncmigrációval jutnak el rendeltetési 

helyükre. A szigetelő asztocitaburkon belül homológ kölcsönhatásokat létesítő A-sejtek 

egymás felületén elcsúszva haladnak. A vándorlás segítésében nagy szerepe van a 

poliszialinizált NCAM (PSA-NCAM) és 1-integrinek, valamint az Eph/ephrin-receptor 

és a neuregulin/ErbB4 által közvetített adhéziós/szignalizációs folyamatoknak 

(Rousselot és mtsai 1995, Jacques és mtsai 1998, Conover és mtsai 2000, Ghashghaei és 

mtsai 2006). 

A felnőtt szekunder germinatív zóna őssejtjeinek azonosítását több kutatócsoport tűzte 

ki célul a ‟90-es évek végén. Feladatuk azért sem volt egyszerű, mert kizárólagosan 

specifikus őssejt-marker máig sincs a birtokunkban. Az őssejteket az in vitro 

proliferatív potenciállal rendelkező ependima- és szubependimasejtek között keresték 

(Johansson és mtsai 1999, Doetsch és mtsai 1999, Chiasson és mtsai 1999). A 

meggyőzőbb bizonyítékok azt támasztották alá, hogy a felnőtt őssejtek a 

szubventrikuláris zóna GFAP-t expresszáló, asztroglia jellegű sejtjei között keresendők 

(Doetsch és mtsai 1999, Chiasson és mtsai 1999). További vizsgálatok alapján kialakult 

a vélemény, hogy a radiális gliasejtek, amelyek idegsejtek és gliasejtek képződésének is 

forrásai voltak, valamint idegsejtek vándorlását is segítették, posztnatálisan átalakulnak 

az SVZ GFAP-immunpozitív őssejtjeivé (Merkle és mtsai 2004). 

Rágcsálókban a szubventrikuláris zónából kivándorló idegsejt-előalakok a szaglógumó 

cserélődő neuronjainak helyettesítésében, a környezeti szagingerekhez való 

alkalmazkodásban, a szaglási memória kifejlődésében játszanak szerepet. Ennek szerepe 

15 

6. ábra A szubventrikuláris zónából a 

rosztrális migrációs ösvényen keresztül 

a szaglógumóba vándorló sejtek 

útvonala a rágcsálóagyban (Alvarez- 

Buylla 2002). OB: szaglógumó, RMS: 

rosztrális migrációs ösvény, cc: corpus 

callosum, LV: oldalkamra, NC: 

neocortex, CB: kisagy, vörös jelölés: 

vándorlási útvonal.

emberek esetén alárendelt, de sejtképzés a humán agyban is zajlik (Bédard és Parent 

2004). Jelentőségének felderítésén sok kutatócsoport dolgozik. 

A szubgranuláris zóna (SGZ) 

A felnőtt emlősagy hippocampusának gyrus dentatusában új neuronok keletkezését már 

a ‟90-es évek első felében megfigyelték (Cameron és mtsai 1993). A gyrus dentatus 

szubgranuláris zónáját harmadlagos germinatív zónaként azonosították (Altman és 

Bayer 1990a, b). Szerkezetében (7. ábra) hasonlóságok és eltérések is tapasztalhatók a 

szubventrikuláris zónához képest. B-típusú, GFAP-pozitív, az SVZ-hez hasonlóan 

őssejtként azonosított, nyúlványos sejtekből D-típusú sokszorozó sejtek, majd G-típusú 

posztmitotikus szemcsesejt-előalakok fejlődnek (Seri és mtsai 2001, Alvarez-Buylla és 

mtsai 2002). A gyrus dentatus őssejtjei a szubventrikuláris zóna őssejtjeivel szemben a 

kamrafali régiótól jóval messzebb helyezkednek el. A granuláris zóna alapján ülő 

sejttestükből rövid tangencionális és hosszú, radiális irányú nyúlványokat bocsátanak ki, 

utóbbiak egészen a molekuláris rétegig nyúlnak. A nyúlványok segítséget nyújtanak a 

réteg basalis része felől elvándorló sokszorozó progenitoroknak és neuroblasztoknak. 

Az újonnan kialakuló szemcsesejtek ingerlő és gátló neuronok posztszinaptikus 

célpontjai és axonjaikat a CA3 és hilaris régióba bocsátva maguk is célsejteket (hilaris 

interneuronok, CA3 piramissejtek, mohasejtek) innerválnak (Toni és mtsai 2008). 

Az újonnan beépülő hippokampális idegsejtek az élőlények tanulási- és 

memóriafunkcióiban játszhatnak fontos szerepet. 

16

A neurogén környezet jellemzői 

A felnőtt agy szubventrikuláris és szubgranuláris/granuláris zónáját, a rosztrális 

migrációs ösvényt és a szaglógumót „neurogén régióknak” tartják. Ezek a régiók 

támogathatják a felnőtt őssejtek élethosszig tartó proliferációját (SVZ, SGZ), illetve a 

sejtvándorlás és elköteleződés folyamatait, sőt, nemritkán, a kívülről bejuttatott ős- és 

progenitorsejtek túlélését és régióspecifikus differenciálódási folyamatait is. Ettől eltérő 

régiókban („nem-neurogén területek”) az endogén sejtek körében neurogenezis nem 

zajlik, és az exogén őssejtek korlátozott túlélése, legfeljebb glia-irányú 

differenciálódása jellemző (Gage és mtsai 1995a, Suhonen és mtsai 1996). Az ennek 

hátterében álló tényezők még csak kis részben ismertek. A sejtsorsok kialakulásában 

együtt érvényesülnek az intrinszik genetikai programok és a környezet sejtre ható, 

térben és időben rendezett jelzései (Doetsch 2003, Riquelme és mtsai 2008). A 

17 

7. ábra A szubgranuláris zóna 

elhelyezkedése és sejttípusai 

rágcsálóagy frontális 

metszetének sematikus rajzán 

(Alvarez-Buylla és mtsai 2002 

[A], Gage 2000 alapján 

módosítva [B]). 

A: A szubgranuláris zóna 

őssejtjei (B) sokszorozó 

progenitorsejteket (D), majd 

posztmitotikus szemcsesejtelőalakokat 

(G) képeznek. 

B: A hippocampus ábrázolása 

frontális metszet sémáján. 

B‟: A B ábrából kinagyított 

ábrán a szubgranuláris zónában 

történő sejt-proliferáció (1.), 

granuláris rétegbe vándorlás 

(2.) és szemcsesejtté való 

differenciálódás (3.) lépéseit 

kísérhetjük figyelemmel.

germinatív zónákban a helyi ependimasejtek, asztrociták és endotélsejtek 

elengedhetetlen részesei a jelző- és szabályozó folyamatoknak. A mikrokörnyezet 

sajátos szerkezetű lamina basalissal és extracelluláris mátrixszal (ECM) bír (kollagén- 

1, laminin, CSPG, HSPG), amely részese a szignalizációs folyamatoknak, hiszen a 

sejtproliferációhoz és differenciálódáshoz elengedhetetlen növekedési faktorokat, 

citokineket tárolja, kompartmentalizálja. Emellett letapadástól függő sejtek számára 

adhéziós felületet biztosít (Riquelme 2008). A lokális asztrociták által termelt 

szabályozó molekulák (Shh, Wnt, BMP-antagonisták), növekedési faktorok (EGF, 

bFGF, TGF-alfa, CNTF, BDNF, NT-3/4) fontos regulátorai a sejtgenezis és 

differenciálódás folyamatainak (Jiao és Chen 2008, Lie és mtsai 2005, Hirabayashi és 

mtsai 2004, Lim és mtsai 2000). Ezek lokális koncentrációja az egyedfejlődés során 

dinamikusan változik. Emellett számos neurotranszmitter, neuromodulátor (dopamin, 

GABA, glutaminsav, serotonin, noradrenalin, NO, endokannabinoidok) gyakorol hatást 

az SVZ és SGZ sejtproliferációjának mértékére, a neuronális migrációra és 

differenciálódásra (Riquelme és mtsai 2008, Hill és mtsai 2006, Goncalves és mtsai 

2008). A depolarizáló és az intracelluláris kalciumszintet befolyásoló hatások 

összessége igen fontos tényező a sejtek proliferációja, túlélése, integrálódása 

szempontjából (Cameron és mtsai 1995, Herberth és mtsai 2002). Különböző 

hormonális hatások fiziológiás koncentráció-tartományban is befolyásolhatják a 

neurogenezis és agyi regeneráció folyamatait. A glükokortikoidok szinjének emelkedése 

(stresszhatás, depresszív zavarok esetén) feltehetően csökkenti a szubgranuláris és 

szubventrikuláris zónában folyó neurogenezist (Lennington és mtsai 2003, Lau és mtsai 

2007). Rágcsálókban tett megfigyelések alapján, a női nemi ciklus különböző 

szakaszaiban, a változó ösztrogénszint és a terhességgel és szüléssel együttjáró 

prolaktinszint változás is befolyásolja a szekunder germinatív régiók neurogenezisét Az 

emelkedő ösztrogénszint az szubgranuláris zóna, az emelkedő prolaktinszint az 

szubventrikuláris zóna neurogenezisét növeli (Lennington és mtsai 2003). 

A neurogenezis és annak határai kóros központi idegrendszeri állapotokban 

A normál egyedben zajló szubventrikuláris és szubgranuláris neurogenezis mellett, 

pathológiás állapotokban, a központi idegrendszer teljes hosszában kiváltható 

sejtképzés a szubependimális rétegben. Többféle agyi kórállapotban figyelték meg a 

18

sejtproliferáció-fokozódás mellett az idegi prekurzorok agyi vándorlását. 

Régióspecifikus differenciálódást és integrálódást ritkábban tapasztaltak (1. táblázat). 

A megfigyelt sejtképzési és regenerációs folyamatok nem elég hatékonyak ahhoz, hogy 

nagyobb agyi elváltozásokat rendbehozzanak. A sérült neuronok nagyobb része 

elpusztul, csak kicsiny töredéke képes regenerálódni, az axonburjánzás pedig nem képes 

helyreállítani a károsodott idegi hálózatok funkcióját. A kellő mértékű sejtproliferációt, 

illetve parenchymális sejt- és axonregenerációt számos agyi mikrokörnyezeti tényező 

akadályozza. Ezek összesége a felnőtt emlősagy legtöbb területén a neurogén 

mikrokörnyezettől jelentősen eltér, az ős- és progenitorsejtek szaporodásához, 

vándorlásához, differenciálódásához nem biztosít megfelelő feltételeket. Ebben a 

környezetben 

� az újonnan képződő sejtek túlnyomórészt a glia sejt-fenotípus irányába 

fejlődnek, 

� a képződő idegsejtek száma igen alacsony, típusa korlátozott, életideje 

túlnyomórészt igen rövid, 

� az irányított axonnövekedést és szinapszis-képzést sok tényező gátolja. 

A felnőtt emlősagy regenerációs képtelenségét részben az magyarázza, hogy a neurogén 

program gátlódik. A parenchymában megtalálható progenitorsejtek 

oligodendrogliasejteket és asztrocitákat képeznek (Levine és mtsai 2001), károsodás 

esetén a gliaheg képzésében játszanak szerepet. Az idegsejtek képződésének gátlását 

sérült felnőtt agykérgi környezetben részben az Olig2 transzkripciós faktor 

működésének tulajdonítják (Buffo és mtsai 2005). A felnőtt központi idegrendszer 

neurogenezisének és progenitor-proliferációjának szabályozói közé tartoznak a BMP, 

Shh és Wnt szignalizációs útvonalak. Ezek együttes működése a felnőtt emlős központi 

idegrendszerben gliogén irányba tereli a sejtek fejlődését. 

A felnőtt agyban a károsodást követően legtöbbször mikroglia-aktiváció jön létre 

(Dheen és mtsai 2007). A bevándorló makrofág- és aktiválódó mikroglia sejtek a 

törmeléket eltakarítják, antigént prezentálnak, citokineket termelnek, immunkompetens 

sejteket vonzanak a sérült területre, gyulladásos reakciót keltenek, asztrocitasejteket 

aktiválnak. Hatásuk az idegsejteket károsítja (reaktív oxigéngyökök, nitrogén-monoxid, 

glutamát felszabadulása), de bizonyos esetekben (neurotrofikus faktorok termelése) a 

túlélésüket segítheti is. A sérülést követően a reaktívvá váló asztrociták körülhatárolják 

19

a károsodás régióját, „gliaheget” alakítanak ki (Fitch és Silver 2008). Ez speciális 

mikrokörnyezetet jelent, amelynek része a módosult, axonok be- és átlépését 

megakadályozó extracelluláris mátrix (ECM). Ennek gátló komponensei az asztrociták 

és oligodendroglia prekurzorok által termelt kondroitin-szulfát proteoglikánok 

(neurocan, versican, phosphacan, NG-2 [Liu és mtsai 2006b]). Bár korábban a reaktív 

glia kialakulását és működését az idegsejt-túlélés szempontjából egyöntetűen károsnak 

ítélték, mára nyilvánvalóvá vált, hogy a „reaktív gliózis” a glia-meninx-, glia-ér- 

kapcsolatok (vér-agy gát) újraformázását végzi, a sejthiányos területeket fokozatosan 

benépesíti, mérsékli a neuronok tápanyaghiányát, stablizálja a pH-t, csökkenti az 

excitotoxicitást és a szabadgyökök által kiváltott károsodást. Emellett neurotrofikus 

faktorokat, adhéziós molekulákat, ECM-komponenseket termel. 

Az idegi hálózatok regenerációját nehézíti, hogy az ECM-összetétel és a sejtadhéziós 

molekulák megoszlása (NCAM, N-cadherin, L1-adhéziós molekula, integrinek, PSA- 

NCAM, laminin, fibronectin), valamint a szekretált növekedési faktorok, neurotrofinok 

mennyisége a felnőtt emlős agyban jelentősen eltér a fejlődő és perifériás 

idegrendszerétől (Szente és Toldi, 1999, Skaper 2005, Buss és mtsai 2007, Kromer és 

Cornbrooks 1987, Lykissas és mtsai 2007). Az irányított axonnövekedést és 

regenerációt a kifejlett központi idegrendszerben myelin-eredetű gátlószerek (Nogo, 

OMGp, MAG) és kemorepulzív szignálmolekulák (ephrinek, semaphorinok, netrinek, 

„repulsive guidance” molekulák) is gátolják (Liu és mtsai 2006b, Mueller és mtsai 

2006). A környezet exitotoxikus neurotranszmitterei, reaktív oxidáló szabadgyökök 

(reactive oxygen species; ROS), gyakori oxigén-, energia és tápanyaghiánya, 

következményes pH-eltolódása, nem megfelelő depolarizációs hatásai miatt, az újonnan 

képződő idegsejt-előalakok nagy része hamar elpusztul, illetve a károsodott idegsejtek 

elenyésző számban tudnak regenerálódni. 

Sejtvesztéssel járó központi idegrendszeri betegségek gyógyítási lehetőségei 

A sejtvesztéssel járó agyi károsodások gyógyításában az elvesztett sejtek pótlására két 

módszer is kínálkozik: az endogén „őssejt-raktárból” történő sejtmobilizáció és a külső 

forrásból származó, potenciálisan idegsejtté fejlődő sejtek bevitele a sérült területre. Az 

utóbbi évtizedek vizsgálatai azt mutatják, hogy mindkét esetben szükség van a felnőtt 

20

agyi környezet módosítására, a permisszív, a neurogén régiókhoz hasonló „niche” 

megteremtésére. 

Az agyi környezet szignáljai a beültetett és endogén ős- és progenitorsejtek sorsát 

alapvetően meghatározzák. Azonos forrásból származó és azonos elkötelezettségi fokon 

álló beültetett sejtek is teljesen eltérően viselkedhetnek a környezeti tényezők eltérései 

következtében. A kísérleti egyed kora, a befogadó agy állapota (a sérülés természete, a 

gyulladás foka, a sérült terület nagysága, elhelyezkedése) kulcsfontosságú tényezők az 

endogén őssejtek és a beültetett sejtek szempontjából is (Magavi és mtsai 2000, Ekdahl 

és mtsai 2003, Demeter és mtsai 2004, 2005, Agoston és mtsai 2007). Implantált sejtek 

esetén meghatározó lehet a beültetés pontos helye (Modo és mtsai 2002, Jin és mtsai 

2005). 

Az oxigén szerepe az agyi mikrokörnyezetben és hatásai az őssejtek elköteleződésére 

A szöveti oxigén tenzió az agyi mikrokörnyezet fontos tényezője és az őssejtek és 

„leszármazottaik” sorsának fontos szabályozója. A környezet módosításának egyik 

lehetősége a helyi oxigén tenzió megváltoztatása. 

Az in vitro akalmazott hipoxiás kezelés (különböző hipoxiás gáz-keverékek 

alkalmazása) hat a sejtek proliferációjára, az apoptózis mértékére, befolyásolja a sejtek 

túlélését, differenciálódási útvonalát és hatással van a különböző képződő érett 

sejttípusok arányára (Studer és mtsai 2000, Morrison és mtsai 2000, Chen és mtsai 

2007, Pistollato és mtsai 2007, Horie és mtsai 2007, Zhang és mtsai 2006-2007). A 

hipoxia több sejtszintű hatását a hipoxia-indukálható faktorok (HIF-ek) működésén 

keresztül érvényesíti. A HIF-ek transzkripciós faktorként működnek, és több mint 100, 

metabolikus folyamatra, túlélésre, motilitásra, angiogenezisre és más funkciókra ható 

gén működését szabályozzák. Gustaffson és munkatársai (2005) felismerték, hogy 

miogén és idegi differenciálódási folyamatokban a hipoxia, a HIF közreműködésével, a 

Notch-jelátviteli út segítségével fenntartja az elkötelezetlen ős- és progenitorsejt- 

állapotot. A hipoxia a Wnt- és Oct-4 molekuláris útvonalakon keresztül is hatást 

gyakorol az őssejt-funkciókra (Kaidi és mtsai 2007, Covello és mtsai 2006). Azonban a 

változó oxigén tenziók hatásai a differenciálódás különböző fokán álló 

sejtpopulációkban, részleteiben, nem ismertek. 

21

Sokkal kevesebb kísérlet fogalkozott ezidáig a hiperoxia hatásainak sejtkultúrákban 

vagy állatmodellekben való vizsgálatával. Az eredmények azt mutatják, hogy a 

hiperoxia az ischaemiás szívizomban hat a szöveti „remodelling” folyamatokra és 

befolyásolja a sejtdifferenciációt (Sen és mtsai 2006). PC12 adrenális sejtek 

tenyészeteiben a magas O2-tenzió a neuronális fenotípus kialakulásához vezet (Katoh és 

mtsai 1997, 1999). Koraszülött bronchopulmonalis dysplasia és retinopathia állat- 

modelljeiben (Das és mtsai 2004, Uno és mtsai 2007), a hiperoxia befolyásolja a 

sejtciklust, a sejtdifferenciációt, a sejtvándorlást és érfejlődést. 

A hiperbárikus oxigénkezelés 

A normobárikus és hiperbárikus oxigénterápiát már évtizedekkel ezelőtt javasolták 

neuroprotektív adjuváns kezelésként. Vizsgálatok során a hiperbárikus terápiát találták 

hatékonyabbnak (Beynon és mtsai 2007). 

Normál körülmények között az oxigén 97.5%-a hemoglobinhoz kötve, míg 2.5%-a a 

plazmában oldott állapotban szállítódik a véráramban. Hiperbárikus oxigénterápia 

(HBOT) során a terápiás kamrában a nyomást megnövelik (~2-3 atm), és a betegek 

100%-os oxigént lélegeznek be arcmaszkon keresztül. A parciális oxigéntenzió és 

nyomás emelkedésével a plazmában oldott - és szövetekhez szállítódó - oxigén 

mennyisége jelentősen megnő a vérben, így a korábban oxigénhiányos szövetek a 

definitív károsodás (pl. érelzáródás) ellenére is elegendő oxigénellátást kaphatnak, s így 

további károsodástól menthetjük meg őket. A hiperbárikus hiperoxia hatásos módszer 

lehet a reverzibilisen károsodott agyszövet (pl. stroke penumbra) megmentésére. A 

HBOT képes a stroke penumbra oxigénszintjét az ischaemia előtti szinthez közeli 

értékre visszahozni. Szignifikánsan csökkenti az infarktus területét és javítja a 

funkcionális állapotot (Veltkamp és mtsai 2000, Schabitz és mtsai 2004). A kísérletes 

ischaemia-s és agyi traumás modelleken végzett tanulmányok szerint a HBOT kedvező 

hatásának hátterében az agyödéma mértékének csökkenése, a vér-agy gát károsodásának 

mérséklődése (Veltkamp és mtsai 2005), az ICP és a mikrocirkuláció változása (Niklas 

és mtsai 2004, Kohshi és mtsai 1991), a gyulladásos folyamatok mérséklődése 

(Vlodavsky és mtsai 2006) és az apoptózis csökkenése (Li és mtsai 2005a, Liu és mtsai 

2006a) áll. 

22

A központi idegrendszeri kórállapotokat legtöbbször bizonyos mértékű szöveti hipoxia 

kíséri. A hipoxia ellensúlyozása (pl. hiperbárikus oxigénkezeléssel) tehát agyi 

károsodásokban lehetőséget adhat a primer sérülés regenerációjának segítésére és a 

másodlagos károsodás (sejtpusztulás) folyamatainak megállítására. Emellett feltehetően 

az agyba kívülről bejuttatott őssejtek elköteleződési folyamataira is hatással van. 

A sejtbeültetés terápiás hatásai központi idegrendszeri kórképekben 

Sejtbevitellel történő terápiás próbálkozások léteznek, amióta laboratóriumi 

körülmények között előűállítottak olyan sejtvonalakat, amelyek elméletileg segíthetnek 

központi idegrendszeri betegségek gyógyításában. 

A sejtimplantációk terápiás hatását a beültetett sejtek agyi környezettel való komplex 

együttes működése eredményezi. A beültetett sejtek potenciáljuktól függően – 

elméletileg - helyettesíthetik az agy elpusztult sejtjeit (ideg-, oligodendroglia-, 

asztrogliasejtek). Az implantált őssejtek neurotrofikus faktorokat szekretálhatnak 

és/vagy azok intracerebralis szekrécióját segíthetik (Qu és mtsai 2007, Mahmood és 

mtsai 2004), sejt-sejt kontaktus útján gén-, protein transzfert végezhetnek (Leng és 

mtsai 2008), angiogenezist indukálhatnak (Chen és mtsai 2003), befolyásolhatják az 

immunválaszt és gyulladásos folyamatokat (Aggarwal és Pittenger 2005). Parakrin 

hatásaik, diffúzibilis faktoraik révén kedvezőbbé alakíthatják a mikrokörnyezetetet. 

Emellett maguk is igénylik a „megengedő mikrokörnyezetet” ahhoz, hogy a károsodott 

agyterületen túléljenek, illetve csak kontrollált mértékben szaporodjanak. 

A beültetésre kerülő sejtek forrásai 

A beültetésre szánt sejtek forrásai igen sokfélék lehetnek. Alapvető követelmény, hogy 

nagy számban, azonos minőségben álljanak rendelkezésre, laboratóriumi körülmények 

között fenntarthatók, szaporíthatók, szükség szerint genetikailag módosíthatók 

legyenek, illetve – ha sejtpótlási célzattal ültetjük be őket - specifikus differenciálódási 

potenciállal rendelkezzenek. A korai idegrendszeri sejtpótlásos kísérletek során magzati 

korú állatok agyi szövetblokkjait emelték ki, majd ültették be pathológiás agyi 

környezetbe (Perlow és mtsai 1979). Az igény a hiányzó sejttípusok szelektívebb 

pótlására, a sejtek finomabb kiválogatására hamar megfogalmazódott. A ‟70-es, ‟80-as 

években létrehozták az első, korai egérembrió belső sejtcsomójából izolált, pluripotens 

embrionális őssejt (ES)-vonalat (Martin 1981, Evans és Kaufman 1981) és 

23

teratokarcinómából származó pluripotens embrionális carcinoma vonalakat (Martin és 

Evans 1975, Robertson 1987). Az embrionális őssejt- és karcinóma vonalak 

sejtkultúrában fenntarthatóknak bizonyultak, állatkísérletekben beültetés céljára 

használhatók voltak. Széles potenciáljuknak köszönhetően belőlük in vitro és in vivo 

mindhárom csíralemez sejtjei kifejlődhettek, de a tumorképződés veszélye is fennállt 

(Erdő és mtsai 2003, Riess és mtsai 2007). Rágcsáló-eredetű fötális és embrionális 

őssejtek regeneratív kapacitását sok betegségmodellben vizsgálták a kutatók. Etikai 

megfontolások miatt azonban az embrionális és fötális humán őssejtek csak 

korlátozottan állnak rendelkezésre. 

A későbbiekben a technikai fejlődés lehetővé tette az embrionális-fötális agy számos 

területéről történő őssejt és progenitorsejt izolálást, majd rövidebb-hosszabb in vitro 

fenntartás után annak modellállatba való implantációját (Shin és mtsai 2000, Demeter és 

mtsai 2004, Kelly és mtsai 2004, Hicks és mtsai 2009). Később mind a felnőtt agy 

szekunder germinatív régióiból, mind a nem-neurogén régiókból sikerült izolálni 

multipotens, aktiválható, önmegújító tulajdonsággal rendelkező ős- és 

progenitorsejteket (Gage és mtsai 1995b, Palmer és mtsai 1995, 1999, Shihabuddin és 

mtsai 1997, Weiss és mtsai 1996, Tropepe és mtsai 2000). A központi idegrendszerből 

izolált sejteket közvetlenül izoláció után, vagy változó idejű sejtkultúrában való 

fenntartás után ültetik be. 

Az agyból izolált, nem klónozott sejt-preparátumok hátránya, hogy igen heterogének; 

bennük a korai, el nem kötelezett idegi őssejtek mellett differenciált neuronok, 

asztrociták, fejlődő oligodendroglia sejtek, endothel- és meningeális sejtek is találhatók. 

A reicipiens szervezetben a fejlődő graft sejtek sorsa, fejlődése, pontos differenciálódási 

útja igen nehezen követhető. 

Ahhoz, hogy a sejtek tartós in vitro fenntartása és pontosabb karakterizálása, valamint 

homogén, nagy számú sejtpopulációk beültetése lehetséges legyen, egy-sejt eredetű, 

geno –és fenotípusosan azonos őssejt-populációkat hoztak létre laboratóriumi 

körülmények között (Martinez-Serrano és Björklund, 1997, Schlett és Madarász 1997). 

Ezek jól szaporíthatók, önmegújítók, pontos differenciáltsági fokuk beültetés előtt 

ellenőrizhető, a szöveti környezettől függően differenciált sejtté alakulhatnak, szükség 

esetén géntermék bevitelére is alkalmassá tehetők. Mivel a megfelelő mértékű és tartós 

laboratóriumi szaporíthatóság érdekében általában valamilyen sejciklusban történő 

24

módosításra, vagyis immortalizálásra szorulnak, e sejtvonalak kizárólag 

modellkísérletekben használhatók, humán alkalmazásuk a tumorigenezis veszélye miatt 

nem jön szóba. Immortalizáció létrejöhet egy onkogén mesterséges bevitelével (c-myc, 

SV40 T-antigén) és spontán is. 

Sejtpótlásra nem kizárólag pluripotens őssejteket és idegrendszerből izolált sejteket 

használtak fel. Már a korai kutatások alkalmaztak más szervrendszerekből származó 

szövetblokkokat / sejteket. A Parkinson-modellekben és betegeknél is alkalmazott 

mellékvesevelőből származó graftok autotranszplatációjával próbálták helyreállítani a 

dopaminerg rendszer működési zavarát (Herrera-Marschitz és mtsai 1984, Backlund és 

mtsai 1985). Ezzel egyrészt a fötális szövetgraftokat érintő etikai problémák, másrészt 

az immunológiai reakciók voltak elkerülhetőek. 

Mivel a felnőtt szervezet egyik könnyen hozzáférhető és etikai problémát fel nem vető 

őssejt-raktára a hemopoetikus rendszer, hamar felmerült, hogy őssejtjeit optimális 

forrásként lehetne használni, amennyiben képesek lennének más szervrendszerek sejtjeit 

helyettesíteni. Csontvelő-transzplantációkat követő vizsgálatok (Eglitis és Mezey 1997, 

Mezey és mtsai 2003) gyorsan tisztázták, hogy a szisztémás keringésbe került 

hemopoetikus őssejtek utódsejtjei több más szövetféleség mellett az agyban is 

megtalálhatók, és érett idegszöveti sejtekre (mikroglia, makroglia és idegsejt) jellemző 

markereket expresszálnak. A vizsgálatok során férfi donortól csontvelőt kapott 

nőbetegek agyában mutattak ki Y-kromoszómát hordozó sejteket. A leírt jelenséget 

bizonyos kutatócsoportok a hemopoetikus őssejtek nagyfokú plaszticitásával, 

„transzdifferenciációs képességével” magyarázzák, mások az említett jelenségek 

hátterében bizonyos kutatócsoportok által leírt sejtfúzión (Vassilopoulos és Russell 

2003), valamint a magzat és anya közötti mikrokimérizmuson (Tan és mtsai 2005) 

alapuló jelenségeket sejtenek. A hemopetikus; köldökzsinórvér- és csontvelő-eredetű 

őssejtek felhasználhatóságát illetően jelenleg is sok vita és intenzív kutatás zajlik. 

Az implantálható sejtek azonosítása, genetikai módosítása és intracerebrális sorsának 

követése 

A felnőtt központi idegrendszerből történő őssejt-izoláció egyik nehézsége, hogy 

univerzális, vagy idegi őssejtekre specifikus marker nem létezik. Az őssejtek szelekciója 

történhet marker molekula-kombinációk (nestin, SSEA-1, CD133) és lektinkötési 

25

jellegzetességek segítségével, amelyek együttesen nagy valószínűséggel jellemzik az 

őssejt-állapotot (Rietze és mtsai 2001, Capela és Temple 2002, Uchida és mtsai 2000). 

Lehetséges a szekunder germinatív régió környéki terület sebészi disszekciója, majd az 

ebből származó sokszínű, disszociáltatott „sejtkeverék” specifikus mitogének melletti 

tenyésztése és karakterizálása a neurális őssejtek kinyerésére. Kísérleti körülmények 

között (transzfektált sejtek vagy transzgenikus állatok felhasználásával), az idegi 

progenitorok specifikus promóterei (pl. mushashi, nestin) által meghajtott riportergének 

expressziója alapján történő sejtválogatása is lehetséges (Roy és mtsai 2000, Sawamoto 

és mtsai 2001). 

A felhasznált sejtvonalak befogadó szöveten belüli, in vivo azonosítására ún. 

markergéneket lehet bejuttani genetikai módosítással (transzfekció) a laboratóriumban 

fenntartott sejtvonalak sejtjeibe. A markergének előidézhetik mikroszkópos technikával 

azonosítható fluoreszkáló fehérjék (pl. zöld fluoreszcens fehérje [GFP]) megjelenését, 

vagy látható csapadékot képező/lumineszcenciát kiváltó új enzim termelődését 

(galaktozidáz lacZ, hőrezisztens placentáris alkalikus fosztatáz, luciferáz) a sejten belül. 

Hasonló technikával terápiás célú géntermékek termelődését is előidézhetjük a 

sejtvonalban. Ezek lehetnek 

� idegi növekedési faktorok, neurotrofinok (NGF, BDNF, NT-3), amelyek az 

idegsejtek túlélését segítik (Martinez-Serrano és mtsai 1995, Grider és mtsai 2005) 

� enzimek (tirozin-hidroxiláz, béta-glükuronidáz, béta-hexózaminidáz), amelyek 

hiányzó enzimeket pótolnak, vagy neurotranszmitter-hiányt mérsékelhetnek (Lundberg 

és mtsai 1996, Snyder és mtsai 1995, Lacorazza és mtsai 1996) 

� géntermékek (Nurr-1), amelyek a célzott differenciálódást segítik elő (Lindvall 

és mtsai 2004) 

� citokinek (LIF, TNF-alfa, IFN-gamma, IL-12), amelyek regenerációt segítő 

(Blesch és mtsai 1999) vagy tumorellenes hatást gyakorolhatnak (Ehtesham és mtsai 

2002a, b) 

A terápiás és markergének expressziója néhány osztódás után lecsökkenhet, eltűnhet, ha 

a gén a genomnak olyan részére épül be, amely az érett sejtben már nem íródik át. 

26

Sejtimplantációt érintő problémák és lehetőségek 

Az igen sok korábbi implantációs kísérlet tanulságai alapján elmondható, hogy a terápia 

kapcsán fellépő fő problémák a következők: 

a sejtek 

nagy része elpusztul néhány héten belül, 

alig, vagy nem a megfelelő irányba differenciálódnak, funkcionálisan nem 

integrálódnak az agyszövetben, 

tumort képeznek, 

immunválaszt váltanak ki, kilökődnek, gyulladásos reakciót provokálnak, 

azonosíthatatlanná válnak, „eltűnnek”, 

nem termelik a szükséges enzimet, neurotranszmittert, 

a megfelelő mennyiségben történő kinyerése etikai vagy technikai problémába 

ütközik, 

használata humán klinikai próbákban nem lehetséges az alkalmazott 

vírusvektor vagy immortalizáció miatt. 

A nehézségek leküzdésére több megoldási lehetőség kínálkozik. Az őssejtek in vitro 

tenyésztésével és elődifferenciáltatásával kapcsolatos vizsgálatok segíthetnek abban, 

hogy viszonylag nagyszámú, a kívánt fejlődési stádiumban lévő sejtcsoportot juttassunk 

be az agyba. A sejtek implantáció előtti szelektálása (felszíni antigének és 

promóter/enhancer alapján) lehetővé teszi homogén sejtpopulációk beültetését. Az 

immunológiai nehézségek és az etikai akadályok kiküszöbölésében segíthet az autológ 

hemopoetikus őssejtek használata. A sejtvonalak genetikai módosításakor alkalmazott 

nem-virális génbejuttatási módszerekkel (Dieterlen és mtsai 2009), illetve a sejtvonalak 

sejtciklusába történő beavatkozások elkerülésével lehetnének a sejtes terápiák 

biztonságosabbak, juthatnának közelebb a humán használhatósághoz. A sejtforrások 

jelentős bővítését jelenthetik az embrionális és fötális őssejtek kiváltására létrehozott 

indukált pluripotens őssejt-vonalak (iPSC; Takahashi és Yamanaka 2006). 

A megfelelő implantálható sejtforrások feltárása mellett, a recipiens agyi környezet 

molekuláris hátterének alaposabb megismerése, permisszívvé tétele jelentene ugrásszerű 

előrelépést a terápiás sejtbeültetések terén. 

27

Az idegszöveti implantációk immunológiai hátteréről 

Az utóbbi évtizedek kutatásai alapján némiképp módosult az a nézet, amely szerint a 

központi idegrendszer immunprivilegizált hely (Barker és Widner 2004). Mára tudjuk, 

hogy antigén-prezentáló sejtek jelen lehetnek az agyban, ha a rezidens mikroglia és a 

perivaszkuláris sejtek aktiválódnak, valamint gyulladás-mediátorok hatására perifériás 

makrofág/monocyta elemek vándorolnak az agyszövetbe. A vér-agy gát szigetelő és 

immunfolyamatokat „kivédő” hatása nem teljes, hiszen bizonyos károsodásoknál, sőt a 

parenchymába (vagy azon át) történő implantáció esetén is sérül a vér-agy gát. Emellett 

aktivált immunsejtek a vér-agy gát fizikai sérülése nélkül is átléphetnek rajta. A 

központi idegrendszer ugyan endotéllel bélelt nyirokereket nem tartalmaz, a 

nyirokelvezetést azonban bizonyos fokig a perivaszkuláris terek biztosítják, bizonyos 

jelzőanyagok kimutathatóan a nyaki nyirokcsomókba kerülnek az agyból. 

Az agyba bejuttatott szövetblokk/sejtcsoport tartós túlélése több immunológiai 

tényezőtől is függ. Alapvetően a donor és befogadó immunogén epitópjainak (pl. MHC 

antigének) egyezésén / eltérésén múlik, hogy a bejuttatott sejteket/szövetdarabokat a 

gazdaszervezet sajátként vagy idegenként ismeri fel. Az idegenként azonosított graftok 

ellen a befogadó szervezet védekező immunreakciót indít, és ennek eredményeképpen 

bekövetkezhet a transzplantátum/implantátum kilökődése. Autológ transzplantáció 

esetén a donor és recipiens megegyezik, syngén átültetés esetén pedig genetikailag 

azonosak. Allogén transzplantáció esetén a donor és recipiens azonos fajba, xenogén 

átültetés esetén különböző fajba tartozik. A xenotranszplantációk esetén legnagyobb a 

rejekció (kilökődés) veszélye, amely ilyen esetben függ a filogenetikai különbségtől. A 

graft túlélése függ az implantáció helyétől, a graft típusától és a recipiens életkorától. 

Sejtszuszpenziók nagyobb eséllyel élnek túl, mint erezett szövetblokkok. Fiatal 

szervezetbe került graftok jobb túlélést mutatnak, mint idős befogadóba bejuttatottak. 

Embrionális korban az idegen sejtekkel szemben immuntolerancia alakulhat ki, így ún. 

kiméra-állapot jöhet létre, amelyben a saját és idegen sejtek egyaránt jelen vannak a 

szervezetben (Sir Frank Burnet és Peter Medawar, Nobel-díj, 1960). 

A sejtterápiás módszerek terjedésével az őssejtek és progenitorok immunogén 

epitópjainak vizsgálata is elkezdődött. Humán embrionális őssejteken kevés MHC I 

mutatható ki, míg MHC II expressziót nem tudtak detektálni rajtuk. A „natural killer” 

(természetes ölő-) limfociták ligandumai vagy hiányoztak, vagy igen alacsony 

28

mennyiségben voltak megtalálhatóak az ES-sejteken és differenciált utódsejtjeiken 

(Drukker és mtsai 2002). Humán idegi őssejteken és progenitorsejteken az MHC- 

expresszió szintén igen alacsony, IFN és TNF kezeléssel azonban növelhető volt 

(Johansson és mtsai 2008). A viszonylag kevés adat alapján, feltehetően, az embrionális 

őssejtek és leszármazottaik csökkent citotoxikus T-sejt, illetve természetes ölősejt- 

aktiválódást indukálnak, és az eltérő sejtaktivációs és citokinhatások révén az 

immunológiai védekező mechanizmusok kevéssé károsítjak őket. 

Több idegrendszeri sejtimplantációs kísérletben ültettek be eltérő fajból származó 

sejteket. Ennek előnye lehet a könnyű sejt-követhetőség, a xenogén környezet okozta 

módosult viselkedés (nyúlványnövekedés, axonális útkeresés) megfigyelhetősége 

(Isacson és Deacon 1996), vagy a beültetésre szánt graft könnyebb hozzáférhetősége pl 

más élőlényből kiemelt vagy in vitro kialakított szerv-, szövet-modulok (pl. 

szívbillentyű) implantációja (Vesely 2005) esetén. 

Xenogén és allogén transzplantációk esetén – amennyiben hosszú megfigyelési időre 

van szükség - a kilökődés farmakológiai gátlása mindenképpen szóba jön. Erre többféle 

immunszuppresszív gyógyszer és azok kombinációi is alkalmazhatóak. Az 

immunszuppresszív kezelés - súlyos szisztémás mellékhatásaikból adódóan - a 

kísérletek eredményeit is befolyásolhatja. A sejtbeültetések kapcsán jelentkező 

immunológiai problémák kiküszöbölését jelenthetné az autológ hemopoetikus (pl. 

csontvelő-, köldökzsinórvér-eredetű) őssejtekkel történő kezelés, amely több 

idegrendszeri betegségtípusban és azok modelljében áll intenzív vizsgálat alatt. 

Jelen vizsgálataink során egérből származó, laboratóriumban fenntartott 

neuroektodermális őssejteket ültettünk allogén módon egerek agyi régióiba. Viszonylag 

rövid megfigyelési időt alkalmaztunk a sejtek követésére. Immunszuppresszív terápiát 

nem alkalmaztunk, hogy a beültetett sejt és gazdaszövet „teljes egymásra hatását” 

megfigyelhessük. Mivel egyes adatok szerint bizonyos őssejtek allogén transzplantációk 

esetén tumorképződést okoztak (Erdő és mtsai 2003), sejtjeink tumorképző kapacitását 

szoros figyelemmel kísértük. 

Az NE-4C neuroektodermális őssejtvonal és alklónjai 

Munkánk során az NE-4C neuroektodermális őssejtvonal feno- és genotípusosan 

megegyező sejtjeivel hajtottunk végre implantációs kísérleteket. Segítségükkel egy 

29

homogén, in vitro jól karakterizált sejtcsoport sorsát tanulmányozhattuk agyi 

környezetben, többféle módszerrel módosított körülmények között. 

A laboratóriumunkban kifejlesztett és az ATCC törzsgyűjteménybe bekerült NE-4C 

idegi őssejtvonal (CRL-2925, 2926) p53-deficiens, 9 napos egérembrió 

előagyhólyagjából származó, neuroektodermális sejtvonal (8/A ábra). 

A 

NE-4C 

PLAP-4C GFP-4C 

8. ábra A: Az NE-4C idegi őssejtvonal sejtjei tenyészetben. Fáziskontraszt mikroszkópos kép. B: Az 

NE-4C sejtvonal placentáris hőrezisztens alkalikus foszfatázt expresszáló alklónjának (PLAP-4C) 

sejtjei tenyészetben. Fénymikroszkópos kép. C: Az NE-4C sejtvonal zöld fluoreszcens fehérjét 

expresszáló alklónjának (GFP-4C) sejtjei tenyészetben. Fluoreszcens mikroszkópia. Mérce: 20 m. 

Egy sejt-eredetű klón, azaz sejtjei geno- és fenotípusosan azonosak. Munkatársaink a 

sejtvonal részletes jellemzését elvégezték (Schlett és Madarász 1997, Schlett és mtsai 

1997, Herberth és mtsai 2002, Jelitai és mtsai 2002, Tárnok és mtsai 2002, Környei és 

mtsai 2005, Varga és mtsai 2008), tanulmányaik alapján elmondható, hogy az NE-4C 

sejtek sejtkultúrában, megfelelő körülmények között korlátlanul proliferálnak, 

önmegújító képességgel bírnak. Retinsavas kezelés vagy asztroglia sejtekkel való 

együtt-tenyésztés eredményeképpen elköteleződésük reprodukálható módon megindul 

az idegsejt és asztroglia fenotípus irányába (9. ábra). 

Indukálatlan 

őssejtek 

10 -6 -10 -8 M RA 

Sokszorozó 

progenitorok 

Apoptózis 

Aggregáció 

B 

Idegi prekurzorok 

Kivándorlás 

9. ábra Az NE-4C sejtvonal differenciálódási rendje in vitro retinsavas indukciót követően. RA: 

(all-transz) retinsav. 

30 

C 

Érő idegsejtek 

Érő asztrogliasejtek 

Aljzatsejtek, 

progenitorok 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 

Indukciós napok

Az idegi differenciálódás folyamatainak in vitro tanulmányozása mellett munkatársaink 

az NE-4C őssejtvonalból markergénnel jelölt al-vonalakat hoztak létre, hogy a sejteket 

in vivo modellkísérletek során az agyszöveten belül is követni tudjuk (Demeter és mtsai 

2004). A zöld fluoreszcens fehérjét (GFP) és placentáris hőrezisztens alkalikus 

foszfatázt (PLAP) expresszáló alklónok (8/B, 8/C, 10. ábra) az eredeti sejtvonal 

tuljadonságait megtartották. 

A 

RA0-2, fix. 6 

10. ábra A GFP-4C sejtek differenciálódása retinsav hatására. A: A GFP-4C sejtek 48 órás 

retinsavas (RA) indukciót (0-2. nap) követően III-tubulin pozitív idegsejteket képeznek 

tenyészetben az indukció kezdetétől számított 6. napra (fix. 6: fixálás a 6. napon). Zöld: GFPfluoreszcencia, 

vörös: III-tubulin immunreaktivitás. B: A GFP-4C sejtek 48 órás retinsavas 

indukciót (0-2. nap) követően GFAP-pozitív asztrocitákat képeznek tenyészetben az indukció 

kezdetétől számított 12. napra. Kék: Hoechst magfestés, vörös: GFAP immunreaktivitás. 

Fluoreszcens mikroszkópos képek. Mérce: 20 m. 

Implantációs vizsgálatok az NE-4C őssejtekkel 

GFP / III-tubulin B 

Hoechst / GFAP 

Kollégáink az NE-4C jelölt alklónjaival implantációs kísérleteket végeztek különböző 

életkorú befogadó állatokon. A sejtsorsot illetően jelentős különbségeket tapasztaltak, 

amikor a GFP-4C/PLAP-4C sejteket embrionális, újszülött, illetve felnőtt befogadó 

állatokba ültették be. A jelölt idegi őssejtek korai embrionális csirke előagyhólyagjába 

implantálva („csirke-egér kiméra”) hetekig túléltek, kisebb sejtaggregátumot képeztek a 

befogadó szövetben és ezt elhagyva az agyi parenchymában vándorolni tudtak. Az 

aggregátumon belül és azon kívül is idegsejteket képeztek. Több idegsejt képződött a 

befogadó agyszövethez közelebbi graft területeken, ami jelezheti a befogadó szövet 

diffúzibilis faktorainak fontos szerepét a beültetett sejtek elköteleződésében. A 

technikailag jóval nehezebb embrionális egéragyba történő implantáció során a 

sikeresen elvégezhető műtét és fixálás időpontja között a kifejlett idegsejtek 

31 

RA0-2, fix. 12

keletkezéséhez kevés volt az idő, ezért a beültetett sejtek sorsáról csak korlátozott 

mennyiségű információra tudtak szert tenni (Demeter és mtsai 2004). 

Újszülött egér oldalkamrájába juttatva az idegi őssejtek tartós túlélést és fokozott 

proliferációt mutattak. Az újszülött agyi környezet nem instruálta a sejteket 

nagymértékű differenciálódásra, idegsejt és asztroglia fenotípusú sejt csak elvétve 

keletkezett belőlük. A nagymértékű sejtosztódás azonban gyakran vezetett tumorszerű 

képletek kialakulásához (Demeter és mtsai 2004). Felnőtt egér striatumba és 

oldalkamrába történt GFP-4C és PLAP-4C implantációt követően a bejuttatott őssejtek 

legtöbbje maximum 6 hétig élt túl. A sejtek az agykamra falához tapadtak, vagy a 

szöveti környezettől élesen elváló striatalis sejtaggregátumot képeztek, és csak a 

fehérállomány közeli rostkötegei (corpus callosum) mentén voltak képesek kismértékű 

vándorlásra. Az agykamra falában a szekunder germinatív régió neurogén 

mikrokörnyezetét elérő néhány őssejt azonban több mint 6 hetes túlélést mutatott. A 

felnőtt agyi környezeti hatások csupán elvétve váltottak ki asztroglia, még ritkábban 

idegi differenciálódást a bevitt sejteken. A GFP-4C sejtek a felnőtt agyi környezetben 

integrálódásra nem voltak képesek (Demeter és mtsai 2004, 2005). 

32

Célkitűzések 

Munkám során azt vizsgáltam, hogy a szöveti környezet változtatása milyen hatást 

gyakorol a kívülről agyba juttatott idegi őssejtek sorsára. Ehhez geno- és fenotípusosan 

azonos, NE-4C neuroektodermális őssejteket ültettem be különböző élettani állapotú 

egerek előagykérgébe. 

Az alábbi kérdésekre kerestem választ: 

Milyen hatásokkal lehet a felnőtt agyi környezetet alkalmassá tenni multipotens 

idegi őssejtek befogadására és az őssejteket az agyi beilleszkedésre? 

I. Befolyásolja-e a sérült agyi környezet a beültetett őssejtek sorsát az intakt agyban 

tapasztaltakhoz képest? 

II. Milyen kölcsönhatások alakulhatnak az őssejtek és tumorsejtek között, in vitro és 

in vivo körülmények között? 

III. Befolyásolja-e az in vivo agyi környezetben történő sejtfejlődést, ha beültetés előtt 

az őssejteket, in vitro differenciáltatással, idegszöveti fejlődésre „elkötelezzük”? 

IV. Milyen szerepet játszik az őssejtek túlélésében, szaporodásában, idegi 

elköteleződési folyamataiban az oxigén-tenzió változása? 

33

Módszerek 

A. Sejtes kísérletek 

Az NE-4C idegi őssejtvonal és alklónjai 

Munkáim során őssejtként a 9 napos, p53 mutáns (p53 -/-) egérembrió 

előagyhólyagjából származó immortalizált, egy-sejt eredetű neuroektodermális 

sejtvonalat, az NE-4C-t és annak alklónjait használtam [ATTC: CRL-2925, 2926] 

(Schlett és Madarász, 1997). A PLAP-4C az NE-4C sejtvonal placentáris hőrezisztens 

alkalikus foszfatázt konstitutívan expresszáló alklónja, amelyet dr. Herberth Balázs 

munkatársunk készített el, a GFP-4C pedig egy zöld fluoreszcens fehérjét konstitutívan 

kifejező alklón, amelyet munkatársaink Dr. Duda Ernő (MTA-SZBK Biokémiai Intézet) 

segítségével állítottak elő. Az alklónok neomycin rezisztenciagént hordoznak. A 

fluoreszcencia intenzitás megtartása érdekében a GFP-4C sejtvonal sejteit két hetes 400 

g/ml-os geneticin (G-418; Sigma-Aldrich) kezeléssel, vagy fluoreszcens 

sejtválogatással (FACS Vantage; BD) készítettük elő a kísérletekre. A GFP-vel jelölt 

alklón fixált sejtjeit fluoreszcens mikroszkópos technikával azonosítottuk. A PLAP-4C 

sejteket a placentáris hőrezisztens alkalikus foszfatáz által katalizált hisztokémiai 

reakció segítségével tettük láthatóvá. A fixált sejteket alkalikus foszfatáz előhívó 

pufferoldatba helyeztük, majd magas hőmérsékleten (65°C) 30 percig inkubáltuk. Ezen 

a hőmérsékleten a placentáris alkalikus foszfatáz enzim nem inaktiválódik, szemben 

más, endogén foszfatázokkal. Az enzim szubsztrátjait, az NBT-t (nitro blue tetrazolium, 

250 g/ml; Promega) és a BCIP-et (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate, 125 g/ml; 

Promega) hígítva az oldathoz adtuk, majd fénytől védve 10-15 perces előhívást 

végeztünk. Az enzimreakciót foszfát pufferelt sóoldatban (PBS) oldott EDTA-val 

(etiléndiamin-tetraecetsav, 0,1 M, Sigma-Aldrich) állítottuk le. 

Implantált, agyszövetben növekedő GFP-4C sejtek izolálása a gazda-szövetből 

A GFP-4C sejteket kb. 2 hónapos agyi túlélést követően több agyból visszanyertük 

(„visszatenyésztettük”). Összesen 5 db, fagyasztásos sértésen és sejtbeültetésen átesett 

állatot (az állatkísérletek részletes leírását ld. B fejezetben) túlaltattunk (250 mg/kg 

ketamin [CP-Pharma HmbH]; 50 mg/kg xylazin [Alfasan International BV]), majd a 

korábban lézionált és implantált agykérgi területet steril körülmények között 

34

kimetszettük. A kiemelt szövetet feldaraboltuk, majd tripszines kezeléssel (0,05% v/v 

PBS-ben) disszociáltattuk, a nagyobb szövetdarabokat centrifugálással (800 g, 5-8 perc) 

eltávolítottuk, majd a felülúszóban lévő sejtszuszpenziót 10% FCS-MEM 

tápfolyadékban 24-es lyukú szövettenyésztő tálcákba ültettük. A neomicin-rezisztens 

GFP-4C sejteket geneticin kezeléssel válogattuk ki, majd fluoreszcens mikroszkópiával 

azonosítottuk. A “visszatenyésztett” GFP-4C (GFP-RC), és retinsavval előindukált 

GFP-4C (RA-GFP-RC) sejteket további vizsgálatokra fenntartottuk. 

Primer asztroglia tenyészetek 

Asztroglia tenyészeteket újszülött vagy posztnatális 1, 2 napos (P0-P2) vad típusú CD1 

és transzgenikus, humán GFAP promóter kontrollja alatt felerősített zöld fluoreszcens 

fehérjét (eGFP) expresszáló (hGFAP-eGFP) egerek előagyszövetéből készítettünk 

Környei és munkatársai (2005) módszere szerint. A koponyacsontok eltávolítása után 

steril körülmények között kiemeltük az agyat. Az agyhártyákat óvatosan eltávolítottuk, 

majd az előagy-szövetet feldaraboltuk. A szövetdarabkákat tripszines (0,05% v/v PBS- 

ben) emésztést követően 10% fötális borjúsavót (FCS, Gibco, Invitrogen), 4 mM 

glutamint (Sigma-Aldrich) és 40 g/ml gentamycint (Chinoin Rt., Sanofi-Aventis) 

tartalmazó Minimum Essential Medium (MEM; Sigma-Aldrich) oldatban Pasteur- 

pipettával trituráltuk. Az egyedi sejtekre disszociáltatott szuszpenziót poli-L-lizinnel 

(Sigma-Aldrich) bevont 90 mm-es átmérőjű Petri-csészékbe ültettük ki 3-5x10 5 sejt/cm 2 

sűrűségben. Ko-kultúrás kísérletek előtt az asztrociták mitotikus aktivitását 1 napos 10 

M-os citozin-arabinozid kezeléssel gátoltuk. 

Glióma- és glioblasztómavonalak 

Az őssejt-tumorsejt kölcsönhatásokat vizsgáló munkáinkban felhasználtunk egér 

eredetű immortalizált LL-gliasejteket (Dr. Latzkovits László - Kísérletes Sebészeti 

Intézet ajándéka), egér eredetű GL261 glioblasztóma sejteket (Ausman és mtsai 1970, 

Désaknai és mtsai 2003, Szatmári és mtsai 2006) [Dr. Sáfrány Géza - OSSKI ajándéka], 

patkányból eredetű C6-gliómasejteket (ATCC No.: CCL-107) [Benda és mtsai 1968], 

illetve U87 humán asztroglióma sejteket (ATCC No.: HTB-14) [Ponten és Macintyre, 

1968]. 

35

A sejtvonalak fenntartása 

Az NE-4C, GFP-4C, PLAP-4C, GFP-RC („visszatenyésztett” GFP-4C) és RA-GFP-RC 

(retinsavval indukáltan beültetett, majd visszatenyésztett GFP-4C) sejtvonalakat, 

valamint a primer asztroglia és LL-gliasejteket poli-L-lizinnel kezelt műanyag felületen, 

a GL261, C6 és U87-sejtvonalakat kezeletlen műanyag felületeken növesztettük 90 

mm-es Petri-csészékben. Tápoldatként 5% fötális borjúsavót, 4 mM glutamint, 40 g/ml 

gentamycint és 2,5 g/ml amphotericin B-t (Sigma-Aldrich) tartalmazó Minimum 

Essential Medium tápoldatot (FCS-MEM) használtunk. A tenyészeteket 37 °C-on, 5 % 

CO2-ot és telített vízgőzt tartalmazó gáztérben tartottuk. A sejtkultúrákon hetente 

kétszer végeztünk tápcserét. Rendszeres átültetések (foszfát pufferelt sóoldatban oldott 

0,05%-os (v/v) tripszines „passzálás”) segítségével, a sejtsűrűséget a tenyészetekben ún. 

szemi-konfluens (felületet nem teljesen beborító) szinten tartottuk. 

Az őssejtek in vitro neuronális indukciója retinsavval 

Az idegsejt irányú differenciálódást az NE-4C sejtvonalnak és alklónjainak, valamint 

agyból visszatenyésztett klónjainak szemi-konfluens tenyészeteiben a tápoldathoz adott 

10 -6 -10 -8 végkoncentrációjú, tápoldatban oldott all-transz-retinsav (RA) (Sigma- 

Aldrich) segítségével indítottunk el. A retinsavas kezelést poli-L-lizinnel bevont 96- és 

24-lyukú tenyésztőedényekben, illetve 60 mm-es Petri-csészékben végeztük, különböző 

sejtkoncentrációk mellett (0,1-4 x 10 5 sejt/cm 2 ). A 24-lyukú tenyésztőedényekbe 12 mm 

átmérőjű üveglemezeket helyeztünk, erre ültettük ki a sejteket. 48 órás RA-kezelést 

követően a tápfolyadékot FCS-MEM-re cseréltük. 

Az őssejtek in vitro neuronális indukciója asztroglia ko-kultúrában 

A GFP-4C sejtek idegszöveti differenciálódásának megindításához asztroglia sejtekkel 

közös folyadéktérben való együtt-tenyésztést (nem-kontakt ko-kultúra) is alkalmaztunk 

(Környei, 2005). A ko-kultúrákban a GFP-4C őssejtek és P1 asztrogliasejtek közvetlen 

(kontakt) kölcsönhatásokat nem létesíthettek egymással. 90 mm-es Petri-csészékben 

növesztett, konfluens asztroglia sejtrétegben sejtmentes területeket hoztunk létre és 

ezeken szilikonzsír segítségével rögzítettük a GFP-4C sejteket hordozó 22 vagy 12 mm- 

es, poli-L-lizinnel bevont tenyésztő lemezeket (11. ábra). 

36

11. ábra Primer egér asztrociták és GFP-4C idegi őssejtek nem kontakt ko-kultúrájának 

vázlatos képe. 

Az asztoglia-GFP-4C ko-kultúrában a sejtek 4 napig éltek együtt, szérummentes 

(DMEM / F12 : 1/1 nutriens médiummal, glutaminnal, gentamycinnel, ITS-sel [inzulin, 

transzferrin, szelénium]) dúsított tápoldatban. Az üveglemezeket a kívánt időben 

eltávolítottuk a Petri-csészéből, majd az indukált GFP-4C sejteket („AG-GFP-4C”) 

implantációra, vagy immuncitokémiai vizsgálatokra használtuk. 

A sejtek által termelt szolubilis faktorok vizsgálata 

Az NE-4C sejteket, a primer asztrogliasejteket, az LL-glia, a C6-glióma, az U87 glióma 

és a GL261 glioblasztóma sejteket 24 óráin át inkubáltuk friss, szérummentes 

tápoldatban (definiált médium; Neurobasal-B27; Gibco-BRL Life Technologies) 37 C 

hőmérsékleten, 5% CO2 mellett. A sejtek által 24 óran át „kondicionált” médiumot 1:1 

arányban friss definiált médiummal kevertük, és más sejtk tenyészeteihez adva 

vizsgáltuk a sejtproliferacióra gyakorolt hatását. 

A sejtek hipoxiás kezelése 

GFP-4C 

Indukálatlan, illetve az indukció 0., 2., 4., 6., 8. napján lévő sejttenyészeteket 6, 12 vagy 

48 órára hipoxiás kamrába (Billups-Rothenberg, Modular Incubator Chamber) 

helyeztük. A kamrát alacsony O2-tartalmú gázkeverékkel (1%O2, 5% CO2, 94% N2) 

töltöttük fel. A 96-lyukú tenyésztő tálcákon növesztett hipoxia-kezelt, illetve kontroll 

sejttenyészeteken mértük a sejtek életképességét, 24-lyukú tenyésztőedényben 

növesztett sejteken elemeztük a sejtösszetétel (immuncitokémiai vizsgálatok) és a 

sejtpusztulás változásait (TUNEL-reakció), valamint a sejtproliferációt ([ 3 H]-timidin), 

illetve a 60 mm-es Petri-csészében kezelt sejttenyészetekből RNS-t izoláltunk a 

génexpressziós változások vizsgálataira. 

Primer egér asztrocita 

37 

GFP-4C

A sejt-aggregáció vizsgálatai 

GFP-4C, NE-4C, primer GFP-jelölt asztrocita, LL-glia, glióma- és 

glioblasztómavonalak tenyészeteit 0,05 v/v % tripszint tartalmazó PBS-sel felvettük a 

tenyésztő aljzatról, majd szérumos tápoldattal (5 % FCS-MEM) 100 sejt/ l sejtsűrűségű 

szuszpenziókat állítottunk elő. Egy vizsgálandó fluoreszcens jelzést hordozó és nem- 

fluoreszcens sejt-pár szuszpenzióit 1:1 arányban kevertünk. A sejt-elegyből 5-5 db 20 

l-es cseppet raktunk egy 35 mm átmérőjű Petri-csésze tetejének belső felszínére, 

amelyek átfordításkor a csésze tetejéről lefelé “lógtak”. A függőcseppek alá PBS-t 

helyeztünk és 12-72 óráig 37 °C-on, 5% CO2 mellett tartottuk fenn a cseppeket. A 

létrejött „kiméra aggregátumokat” 4% paraformaldehiddel (PFA, TAAB Laboratories 

Equipment Ltd.) 30 percig fixáltuk, óvatosan lecentrifugáltuk (800 g, 5 perc), 

bisbenzimidet tartalmazó Mowiolban (Calbiochem, EMD Chemicals) felvettük és emelt 

szélű tárgylemezre helyeztük. Lefedés után fluoreszcens mikroszkóp segítségével 

analizáltuk a zölden fluoreszkáló GFP-tartalmú sejtek és a kék magfestést mutató összes 

sejt viszonyát, az egyes sejttípusok keveredését/szegregációját. 

A sejtproliferáció mérése 

Az NE-4C és alklónjai, valamint a különböző tumorsejtvonalak proliferációjának 

mértékét [ 3 H]-timidin inkorporáció mérésével határoztuk meg. A tenyészetek 

tápoldatához 4 órára 1μCi/ml végkoncentrációjú [ 3 H]-timidint (Izinta) adtunk. Az 

inkubációs idő elteltével a tenyészeteket PBS-sel mostuk, majd a sejteket 0,6 ml 

nátrium-hidroxid (0,1 N) oldattal feltártuk és ultrahanggal szonikáltuk. A 

felszuszpendált sejtanyag 0,4 ml-ét 2 ml szcintillációs koktéllal (Ultima Gold) 

elegyítettük, majd Wallac 1409 szcintillációs számlálóban mértük a minták [ 3 H]- 

timidint tartalmát. (A beütésszámot [DPM] mintánként 120 sec ideig „számláltuk”). A 

sejtanyagot tartalmazó oldat 0,02 ml-ét 0,08 ml (5x higított) Bradford reagenssel 

(Biorad) kevertük össze, és a színreakció 570 nm teszt- és 690 nm referencia 

hullámhosszakon való mérésével (ELISA reader [Dynatech MR5000]) meghatároztuk a 

fehérjetartalmat (Bradford 1976). Minden mérést 4 azonosan kezelt tenyészetből 

származó mintán hajtottuk végre. A DPM értékeket és a fehérjetartalmat átszámoltuk a 

teljes minta-térfogatra, majd minden minta esetén megadtuk az egységnyi fehérjére 

korrigált, effektív szcintillációs beütésszámot (DPM/ g fehérje). A minimálisan 4 

38

párhuzamos mérésből nyert adatokból átlagot és szórást számoltunk. A különböző 

kezelt tenyészetek közötti eltérések szignifikanciáját egy- és több szempontos variancia- 

analízissel és Student-féle T-teszttel ellenőriztük. 

Kromoszómaszám-meghatározás 

A sejttenyészetet egy napra 10%-os FCS-MEM tápoldatba helyeztük. A következő 

napon 90 perces kolhicin-kezelést (0,5 g/ml; Sigma-Aldrich) végeztünk a sejtosztódás 

leállítására. A sejteket tripszines kezeléssel (0,05 v/v % PBS-ben) az aljzatról 

felszabadítottuk, és fugacsőbe helyeztük. Egy fugacsőbe 10 5 db sejt került 500 l 5%-os 

FCS-MEM tápoldatban. A médiumhoz cseppenként 1 ml hipotóniás (0,56 %) kálium- 

klorid (KCl) oldatot, majd 2x0,5 ml desztillált vizet adtunk. A hipotonizálás során 

(összesen 10 perc) a sejteket 37 °C-on (5% CO2) inkubáltuk. Ezt követően a sejtes 

oldatot 12 percig centrifugáltuk (1500 g). A sejt-csapadékhoz, cseppenként 4 ml frissen 

készített, 4 °C-os ecetsav-metanol 1:3 elegyet (fixáló) adtunk, állandó enyhe rázás 

mellett, majd 30 percig termosztátban tartottuk. A folyamatot (centrifugálás-fixálás- 

szuszpendálás-inkubáció) háromszor megismételtük. Végül a sejteket 0,5 ml fixálóban 

felvettük. Az oldatot zsírtalanított, száraz tárgylemezekre cseppentettük, cseppjeit 

hagytuk szétfutni a lemezeken. Száradás után 4%-os Giemsa oldattal (Fluka, Sigma- 

Aldrich) festettük (5 perc). A festett minta száradása után Depex-szel (Electron 

Microscopy Sciences) fedtük le a lemezeket. A láthatóvá vált kromoszómákat 

fénymikroszkópban számoltuk. A különböző sejttípusok kromoszómaszámának 

eltéréseit statisztikai próbákkal ellenőriztük (variancia-analízis, Student-féle T-teszt). 

Életképesség-mérés 

A sejtkultúrák „életképességének” meghatározására MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 

2,5-diphenyl tetrazolium bromid) (Sigma-Aldrich) (Mosmann 1983) és AlamarBlue TM 

(Biosource) (Ahmed 1994) redukciós tesztet alkalmaztunk. 

Az MTT teszt előtt a vizsgált sejteket poli-L-lizinnel bevont 96-os tenyésztő edénybe 

helyeztük 10 4 sejt/lyuk koncentrációban lyukanként 50 l 5%-os FCS-MEM 

tápfolyadékba. Letapadás után 10 l MTT-t adtunk a tápfolyadékhoz és a tenyésztő 

edényt 1 óráig 37°C-on, 5% CO2 mellett inkubáltuk. A kialakuló kék formazán 

kristályokat a sejtekkel együtt 120 l savas izopropil-alkoholban (0,08 N) oldottuk fel. 

39

Az AlamarBlue TM teszt előtt a vizsgált sejteket poli-L-lizinnel bevont 96-os tenyésztő 

edénybe helyeztük 10 4 sejt/lyuk koncentrációban 100 l 5%-os FCS-MEM 

tápfolyadékba. Latapadás után 10% (v/v) AlamarBlue TM reagenst adtunk a táphoz. 

A viabilitásra mindkét vizsgálat esetén a mért optikai denzitás (OD) értékekből 

következtettünk. Az OD-t mindkét eljárás esetében 540 vagy 570 nm teszt- és 600, 630 

vagy 655 nm referencia-hullámhosszon mértük (Biorad Microplate Reader és Dynatech 

MR5000 készülék). A mérések 6-16 parallel lyukból történtek, legalább 4 független 

kísérletben. 

RT-PCR 

A GFP-4C és GFP-RC sejttenyészetekből Tri-Reagens (Sigma-Aldrich) segítségével 

teljes RNS-mintát nyertünk és tisztítottunk ki. A genomiális DNS szennyeződést 

DNase-I kezeléssel (Fermentas) távolítottuk el. Az izolált RNS-t RNase/DNase-mentes 

vízben 0.3 mg/ml koncentrációban oldottuk fel és -70 °C-on tároltuk. Mintánként 3 g 

tisztított RNS-t felhasználva szintetizáltunk cDNS-t a “RevertAid TM First Strand cDNA 

Synthesis Kit” (Fermentas) segítségével. A neurogenin2 (ngn2), mash-1, math-2, nanog, 

sox2, blbp, GFAP, brachyury, hnf4, flk1, actin, hprt transzkriptumok specifikus 

szekvenciáinak kereséséhez a 2. táblázatban felsorolt primer párokat használtuk. A 

polimeráz láncreakciót Techne TC-512 géppel végeztük, Quiagen Hot Star Taq DNA- 

polimeráz használata mellett. A felszaporított termékeket etídium bromidot tartalmazó 

1%-os agaróz gélen futtattuk és UV átvilágítással vizualizáltuk. 

2. táblázat Az RT-PCR vizsgálathoz használt primer-párok 

Gének Primer-párok 

actin 5‟ agctgagagggaaatcgtgc 3‟ 5‟ gatggaggggccggactcat 3‟ 

blbp 5‟ aagacccgagttcctccagt 3‟ 5‟ atgccttttcataacagcga 3‟ 

brachyury 5‟ tccaggtgctatattgcc 3‟ 5‟ tgctgcctgtgagtcataac 3‟ 

flk1 (VGFR2) 5‟ cacctggcactctccaccttc 3‟ 5‟ gatttcatcccactaccgaaag 3‟ 

GFAP 5‟ gactatcgccgccaactgc 3‟ 5‟ cgtccttgtgctcctgcttc 3‟ 

hnf4 5‟ cttccttcttcatgccag 3‟ 5‟ acagtccccatctgaag 3‟ 

hprt 5‟ cacaggactagaacacctgc3‟ 5‟gctggtgaaaaggacctct3‟ 

math2 5‟tgagaatggcttgtccagaagg3‟ 5‟tggtagggtgggtagaatgtgg3‟ 

nanog 5‟ gcgcattttagcaccccaca 3‟ 5‟ gttctaagtcctaggtttgc 3‟ 

ngn2 5‟aagaggactatggcgtgtgg3‟ 5‟atgaagcaatcctccctcct3‟ 

sox2 5‟ gccctgcagtacaactccat 3‟ 5‟ acccctcccaattctcttgt 3‟ 

40

B. Állatkísérletek 

Az állatkísérletek végzését az MTA KOKI Állatkísérleti Etikai Bizottsága 

jóváhagyásával, a Fővárosi Élelmiszer és Állategészségügyi Ellenőrző Állomás 

hivatalos engedélyének (2291/003/Főv/2006; érvényesség: 2011. december 7.) 

birtokában végeztük. Az állatok kezelése, műtét utáni gondozása megfelelt az 

Állatvédelmi Törvény előírásainak. 

Felhasznált állatfajok és törzsek 

Implantációs kísérleteinkben az MTA-KOKI és az Országos Pszichiátriai és 

Neurológiai Intézet állatállományából származó felnőtt NMRI, CD1, C57BL egereket, 

sejtizolációhoz az MTA-KOKI állatházából származó újszülött (P0-P2) CD1 és 

transzgenikus hGFAP-eGFP egereket használtunk. 

Altatás 

A műtét előtt a felnőtt egerek testsúlyát lemértük. A kb. 20-30 gramm testsúlyú egereket 

xylazin (25 mg/kg) és ketamin (125 mg/kg) intraperitoneális injekciójával altattuk el. 

Az altatás mélységét többször ellenőriztük, szükség esetén kisebb kiegészítő dózist 

alkalmaztunk az altatószerekből. Az újszülött állatokat zárt dobozban, szárazjégre 

helyezett papírvattára raktuk, és 2-4 perc elteltével műtöttük. 

Fagyasztásos lézió 

Az alvó állatokat sztereotaxiás készülékben (Stoelting Co., Lab Standard) rögzítettük. A 

fejbőrt a sutura sagittalis felett a középvonalban 1 cm hosszan felvágtuk, majd a 

koponyacsontot a tervezett beavatkozás helyének megfelelő ponton, egy 1,6 mm 

átmérőjű fúróval átlyukasztottuk. Agykérgi fagyasztásos sértés létrehozásához a kívánt 

agyi régió felett, a dura materhez egy rézből készült, fertőtlenített fagyasztórúd 1.4 mm 

átmérőjű, lapos felszínét érintettük hozzá (a középpont koordinátái: Br: -0.7 mm, L:2.3 

mm). A készüléket porított szárazjég és aceton keverékével (-60 o C) hűtöttük le és 

tartottuk hidegen műtét alatt. A fémrúd 30 másodpercig maradt a kemény agyhártya 

felszínén. A beavatkozás után a területet óvatosan tisztítottuk, fertőtlenítettük, a bőrt 

zártuk. A bakteriális fertőzések megelőzése érdekében gentamycinnel (1μg/ml) átitatott 

papírvattával tisztítottuk meg a seb környékét. Az állatokat a műtét alatt és azt követően 

41

melegítettük, ébredésüket felügyeltük, majd ≤5-ös csoportokban 36 x 20 cm–es 

ketrecekbe helyeztük. „Ad libitum” táplálásban, és napi ellenőrzésben részesültek. A 

fagyasztás napját 0. napként jelöltük meg (D0). 

Sejtbeültetés 

Az alkalmazott sejtvonalak sejtjeit 0,05 %-os tripszin- vagy 1 mM EDTA-tartalmú PBS 

oldattal kezeltük, ezután szérumos tápoldattal a tenyésztő edény aljáról felszedtük. A 

sejteket Bürker-kamrában megszámláltuk, lecentrifugáltuk (800 g, 5-8 perc), majd a 

kívánt sűrűségben (10 4 -10 5 sejt/ l) PBS-be vagy 1 mM EDTA-t tartalmazó PBS-be 

vettük fel őket közvetlenül az implantáció előtt. A beavatkozásig szobahőmérsékleten 

vagy 4°C-on tároltuk őket. Beültetés előtt óvatosan felszuszpendáltuk, majd 10 l-es 

Hamilton-fecskendőbe szívtuk fel a sejtes oldatot (Hamilton, Whittier). A fecskendőt a 

sztereotaxiás berendezés célzókészülékéhez rögzítettük. A sztereotaxiás készülékben 

rögzített állatok fejbőrét a sutura sagittalis felett, a középvonalban 1 cm hosszan 

felvágtuk, majd a koponyacsontot a tervezett beavatkozás helyének megfelelően 

óvatosan átfúrtuk. A fecskendőt a kívánt koordinátának megfelelően az agyszövetbe 

mélyesztettük, majd a sejtes oldat 1-1,5 l-ét lassan (0,5 l/perc) befecskendeztük. A 

beadás után a fecskendőt 90 másodpercig nem mozdítottuk, majd óvatosan 

visszahúztuk. Beavatkozás után a területet tisztítottuk, fertőtlenítettük, a bőrt zártuk. A 

bakteriális fertőzések megelőzése érdekében gentamycinnel (1μg/ml) átitatott 

papírvattával tisztítottuk meg a seb környékét. Az állatokat melegítettük, ébredésüket 

felügyeltük. Munkáinkban a sejteket a 3. táblázatban található koordináták szerint 

implantáltuk. A beültetés végeztével a sejtszuszpenziók maradékából sejteket ültettünk 

ki 96-os és 24-es tenyésztőedénybe, hogy ellenőrizzük túlélésüket, életképességüket és 

in vitro idegi irányú fejlődésüket. 

Hiperbárikus oxigén terápia alkalmazása 

A hiperbárikus oxigén terápiát (HBO) a budapesti Hiperbár Centrum 

együttműködésével (dr. Gőbl Anna és mtsai) végeztük. A kezelés során a vizsgált 

állatok magas (2.5 ATA) nyomáson közel 100 %-os oxigént lélegeztek be napi 90 

percben, hét napon át, a fagyasztásos sérülés napjától (D0-D6) vagy a sejtimplantáció 

napjától (D7-D13) kezdve. Kontrollként, fagyasztásos sérülésben és/vagy 

42

sejtimplantációban nem részesülő állatcsoportokon is végeztünk hiperbárikus 

oxigénkezelést. 

3. táblázat Az állatkísérletek adatai 

Egér 

törzs; 

állatszám 

NMRI, 

CD1, 

C57BL 

34 db 

NMRI 

42 db 

CD1 

12 db 

NMRI 

30 db 

C57BL 

10 db 

C57BL 

10 db 

CD1 

11 db 

NMRI 

16 db 

NMRI 

6 db 

NMRI 

15 db 

NMRI 

14 db 

NMRI 

27 db 

Műtéti beavatkozás 

GFP-4C, PLAP-4C, 

GFP-RC 

implantáció 

Implantáció helye 

(mm) 

Br -0.1, L 3.2, V 1.4 

Br -0.1, L 1.2, V 2.0 

Br 0,0, L 1,6, V 2,5 

Br 0,0, L 2,6, V 2,5 

Br 0,0 L 1,1 V 2,0 

Fagyasztásos lézió Br -0,7, L 2,3 

majd GFP-4C és 

GFP-RC implantáció 

RA-GFP-4C/ 

AG-GFP-4C 

implantáció 

Br -0.1, L 3.2, V 1.4 


majd RA-GFP-4C/ 

AG-GFP-4C 

implantáció 

43 

Implantált 

sejtek száma 

(db) 

1,5x10 4 -10 5 

10 5 

Túlélési idő 

7, 14, 21 nap, 

1, 2 hónap 

14, 21, 30, 

60-62 nap 

Br -0.1, L 1.2, V 2.0 5x10 4 7, 21 nap 

Br -0.1, L 2.5, V 2.0 

5x10 4 

GL261 implantáció Br 0,0, L 1,6 V 2,5 10 4 

GL261 implantáció Br 0,0, L 1,6, V 2,5 

majd PLAP-4C 

implantáció 

GL261 és PLAP-4C 

ko-implantáció 

Br 0,0, L 2,6, V 2,5/ 

Br 0,0 L 1,1 V 2,0 

Br 0,0, L 1,6, V 2,5 


majd GFP-4C 

implantáció 

Br -0.1, L 3.2, V 1.4 

majd HBO kezelés - 

GFP-4C implantáció Br -0.1, L 3.2, V 1.4 




10 4 

2.5x10 4 

GL261: 1.5x10 4 

PLAP-4C: 1.5x10 4 

5x10 4 -10 5 

Fagyasztásos lézió Br -0,7, L 2,3 - 

10 5 

- 

7 nap, 1, 2 

hónap 

3, 7, 10, 14 

nap 

7, 14 nap 

3, 7, 11, 14 

nap 

14, 21 nap, 

2 hónap 

14 nap, 

2 hónap 

7, 14, 42 nap, 

2 hónap 

7, 14, 42 nap, 

2 hónap 

Viselkedés-kontroll - - -

Viselkedésvizsgálatok 

A szenzorimotoros és koordinációs működések felmérésére a fagyasztásos sértés, 

sejtbeültetés, hiperbárikus oxigénterápiás kezelések után különböző időpontokban 

viselkedésteszteket végeztünk (Metz és Schwab 2004, Aronowski és mtsai 1996, 

Connor és mtsai 1999 alapján módosítva). A teszteket a beavatkozások előtt és kontroll 

állatokon is elvégeztük a “bázisparaméterek” felmérésére és kontroll adatok nyerésére. 

A műtött és kontroll állatcsoportokban a viselkedés-vizsgálatot a beavatkozást követő 

1., 4., 7., 14., 30. és 60. napon végeztünk. 

„Sticky tape” teszt 

A teszt azt vizsgálja, hogy mennyi idő alatt veszi észre és távolítja el az állat a talpára 

ragasztott 0,8 cm x 0,8 cm-es ragasztószalagot. A ragasztószalag egyik hátsó végtagra 

való felhelyezése után, az állatokat maximum 4 percig figyeltük. A vizsgálatot, a jelzett 

posztoperatív időpontokban, mindkét hátsó végtagon elvégeztük. A kísérletekben 

időpontonként 3-12 állat szerepelt. A szalag eltávolításához szükséges időt az érintett és 

ép oldalon minden csoportban külön átlagoltuk, meghatároztuk a szórás értékét és 

variancia-analízissel vizsgáltuk az állatcsoportok közötti eltérések szignifikanciáját. 

“Tight rope” teszt 

Az állatok mellső lábait egy vízszintesen kifeszített, 120 cm hosszú, 4 mm átmérőjű 

madzagra helyeztük. 2 percig figyeltük, hogy az egyes állatok fel tudnak-e kapaszkodni 

és ki tudnak-e mászni a madzagon az azt tartó függőleges oszlopig. Minden állatot 3x 

teszteltünk. Az értékelésre a 4. táblázatban látható pontrendszert alkottuk meg. 

4. táblázat Tight rope pontrendszer 

7 pont

A kapott pontszámot minden csoportban átlagoltuk, meghatároztuk a szórás értékét és 

variancia-analízissel vizsgáltuk a csoportok közötti eltérések szignifikanciáját. 

Mellső végtag aszimmetria teszt 

Az állatokat 15 cm magas, 10 cm átmérőjű átlátszó műanyag hengerbe helyeztük. A 

henger felderítésekor az állatok hátsó végtagjaikra nehezedve mellső végtagjaikat a 

henger falának támasztották. A felderítő viselkedést videokamerával 3-5 perc hosszan 

rögzítettük, majd a mellső végtagok használatát, a végtagpreferenciát, az esetleges 

paresist, plégiát elemeztük. Az értékelésre az 5. táblázatban látható pontrendszert 

alkottuk meg. 

5. táblázat Mellső végtagi aszimmetria teszt pontrendszer 

4 pont Szimmetrikus 

3 pont Enyhén aszimmetrikus 

2 pont Mérsékelten aszimmetrikus 

1 pont Súlyosan aszmmetrikus 

(forog a hengerben) 

0 pont Hemiplegia 

45 

mellső végtagmozgások 

A kapott pontszámot minden csoportban átlagoltuk, meghatároztuk a szórás értékét és 

variancia-analízissel vizsgáltuk a csoportok közötti eltérések szignifikanciáját. 

C. A preparátumok feldolgozása 

Fixálás, metszés 

Az állatokat mély altatásban, szíven át perfundáltuk. A bal szívkamrán át PBS-t, majd 

4% PFA-t áramoltattuk át perfúzor segítségével. Az agyat a koponyaüregből 

eltávolítottuk, majd 4% PFA-val utófixáltuk egy napon át. Ezt követően nátrium-azidot 

(0,1%) tartalmazó 25%-os glükózoldatban legalább 1 napos krioprotekciót végeztünk. 

Fagyasztó szánkamikrotom segítségével az agyakból 30 m vastagságú úszó 

metszeteket készítettünk. Hat-tíz párhuzamos metszetsorozat készült minden agyról, 

amelyeket különböző immuncitokémiai vizsgálatokban használtunk fel. A festéseket 

szabadon úszó metszeteken, vagy tárgylemezre rögzített metszetek esetén, csepp- 

festéssel végeztük. A tenyésztőedényekben, üveglemezeken növesztett sejttenyészeteket

PBS-sel átöblítettük, majd 4 %-os paraformaldehiddel 20 percig szobahőmérsékleten 

fixáltuk. Hif-1 festés esetén a mosást és fixálást is 4 °C-on végeztük. A tenyészeteket 

ezután háromszor PBS-sel mostuk. 

TUNEL-reakció 

A tenyészetekben és agymetszetekben az apoptotikus-(nekrotikus) sejtek detektálására 

TUNEL reakciót alkalmaztunk (TMR Red, Roche). Az eljárás alkalmazása során az 

apoptózisban gyakori DNS törések szabad 3‟ végeihez a TdT (terminális 

deoxinukleotidil-transzferáz) enzim jelölt nukleotidokat kapcsol, amelyek 

fluoreszcenciája alapján, a 3‟ végek felszaporodása detektálható. 

Immuncitokémiai festések 

Az úszó metszeteket PBS-ben oldott 0.5%-os Triton X-100 detergenssel (Calbiochem, 

EMD Chemicals) 5-10 percig, az üveglemezen lévő tenyészeteket 0.1% Triton X-100 

detergenssel 10 percig permeabilizáltuk. Az aspecifikus antigén-kötés elkerülésére a 

metszeteket és sejttenyészeteket 1-2 %-os borjú szérum albumint (BSA) tartalmazó PBS 

vagy 5%-os FCS-PBS oldattal 90 percig szobahőmérsékleten kezeltük. 

Permeabilizálásnál és/vagy blokkolásnál kivételt képezett 

1. az SSEA-1 sejtfelszíni antigén festése, ahol nem volt szükség permeabilizálásra, 

2. a NeuN magi festés, ahol erős permeabilizálásra volt szükség, tehát a Triton X-et 

0,1-0,5%-ban először a blokkolóban oldva 90 percig, majd az első réteg 

ellenanyaggal együtt blokkolóban oldva 0,1 % koncentrációban egy éjszakán át 

alkalmaztuk, 

3. a Hif-1 magi festés, ahol 0,5%-os Triton X-100 vagy 1%-os NP-40 (nonylphenyl 

polyethylene glycol, Calbiochem, EMD Chemicals) detergenssel 20 perces 

permeabilizálást végeztünk. 

A 0,1 % nátrium-azid tartalmú blokkolóban oldott első réteg ellenanyag (6. táblázat) 

oldatában egy éjszakán át 4 o C-on inkubáltuk a metszeteket/tenyészeteket. A második 

réteg ellenanyagot 0,1 % nátrium-azid tartalmú blokkolóban, vagy (peroxidáz enzim 

használata esetén) azidmentes PBS-ben hígítottuk fel, és 90 percig alkalmaztuk 

szobahőmérsékleten. Második réteg ellenanyagként biotinnal vagy Texas Red-del, 

illetve Alexa 594-gyel konjugált anti-egér vagy anti-nyúl IgG-t vagy IgM-t használtunk 

46

(6. táblázat). Amennyiben a második réteg IgG- / IgM-biotin volt, az immuncitokémiai 

reakció során harmadik réteget is használtunk [avidin-Alexa488; avidin-Alexa594 

(1/1000; Molecular Probes, Invitrogen), avidin-Texas Red (1/500; Vector Laboratories) 

fluoreszcens konjugátumokat vagy avidin-peroxidáz enzimet (1/1000; Sigma-Aldrich)]. 

A harmadik réteget 0.1%-os nátrium-azidos, vagy (peroxidáz enzim használata esetén) 

azidmentes PBS-ben higítottuk, metszeteinket/tenyészeteinket a harmadik réteg 

oldatában 60 percig inkubáltuk. A rétegek között 3x5-10 perces mosást végeztünk 

blokkolóval vagy PBS-sel. Peroxidáz enzim használatakor az enzimhez a 0.55 mg/ml 

3,3'-diamino-benzidint (DAB, Sigma-Aldrich) adtunk 0.1%-os hidrogén-peroxid 

jelenlétében. A barna csapadék megjelenésekor 0.1%-os nátrium-aziddal gátoltuk az 

enzimet. A peroxidáz-reakció eredményét fénymikroszkóppal, a fluoreszcens 

konjugátumokkal történő festés eredményét fluoreszcens mikroszkópos technikával 

értékeltük. 

6. táblázat Kísérleteinkben használt első és második réteg ellenanyagok 

Antitest 

Specificitás Típus 

47 

Gyártó Hígítás 

III-tubulin Egér monoklonális IgG1 Exbio 1 / 1000 

Neu-N Egér monoklonális IgG1 Chemicon, Millipore 1 / 1000 

Neurofilament- 

L 

Egér monoklonális IgG1 Sigma-Aldrich 1 / 1000 

NSE Poliklonális nyúl szérum Polysciences 1 / 1000 

GFAP Egér monoklonális IgG1 Sigma-Aldrich 1 / 2000 

GFAP 

Nyúl poliklonális 

immunglobulin 

Dako 1 / 250 

Hif-1 Egér monoklonális IgG(2b) Novus Biologicals 1 / 1000 

SSEA-1 Egér monoklonális IgM DSHB 1 / 1000 

Nestin Egér monoklonális IgG1 Chemicon, Millipore 1 / 1000 

Egér IgG1 Ló poliklonális IgG biotin Vector Lab. 1 / 1000 

Nyúl IgG 

Kecske poliklonális IgG - Texas 

Red 

Nyúl IgG Csirke IgG - Alexa 594 

Egér IgM Kecske IgM biotin 

Jackson 

Immunoresearch 

Molecular Probes, 

Invitrogen 

Jackson 

Immunoresearch 

1 / 100 

1 / 500 

1 / 1000

Mikroszkópos kiértékelés 

A fagyasztott metszeteket közvetlenül krioprotekció után vagy immuncitokémiai festést 

követően tárgylemezekre húztuk fel, majd a lemezeket 10 g/ml bisbenzimidet 

(Hoechst 33258, Sigma-Aldrich) tartalmazó Mowiol fedőanyaggal (Calbiochem, EMD 

Chemicals) fedtük le. A lemezen fixált és festett sejttenyészeteket desztillált vizes 

öblítést követően tárgylemezre cseppentett Mowiol-Bisbenzimidre (10 l) fordítottuk 

úgy, hogy a sejtek a tárgylemez és a tenyésztő lemez között helyezkedtek el. A 

kiértékelés és fotózás ApoTome technikával felszerelt Zeiss Axiovert 200M és Nikon 

Eclipse TS100 mikroszkóp segítségével történt. 

Sejtszámolás: 4-4 párhuzamos tenyészet 10-10 látóteréből készített felvétel alapján 

Image J program segítségével leszámoltam az összes sejt (Hoechst) és a specifikusan 

jelölt sejtek számát, majd ez alapján kiszámoltam a specifikus sejtek hozzávetőleges 

átlagos százalékos előfordulási arányát a tenyészetben. 

Sejtek által elfoglalt intracerebralis térfogat mérése: Sorozatmetszeteken mértük meg a 

GFP-4C sejtek által elfoglalt térfogatot, majd az adatokból a metszetvastagság (30μm) 

és köztes metszetek számának ismeretében kiszámoltuk a közelítő sejttérfogat- 

értékeket. A számításokat 3-5 agy feldolgozásával ismételtük; a csoportok eltéréseit 

statisztikai próbákkal vizsgáltuk. 

Mitózis-számlálás: Hoechst magfestéssel megjelölt agymetszeteken 6-6 reprezentatív 

területet választottunk ki a repopulált poszt-léziós zónából. Minden agyról 

sorozatfelvételeket készítettünk a metszet teljes vastagságában (Zeiss Axiovert, 

Apotome technika). A teljes, sejtek által lefedett területet Image J program segítségével 

határoztuk meg. Az egységnyi, sejtek által elfoglalt területre eső metafázisos 

kromoszómákat tartalmazó sejtek számát meghatároztuk, a csoportok eltéréseit 

statisztikai próbákkal vizsgáltuk. 

Statisztikai próbák 

A minták közötti eltéréseket egy- és többszempontos variancia analízissel (ANOVA), és 

Student-féle T-teszttel értékeltük. 0,05

Eredmények 

I. NE-4C sejtek „sorsa” intakt és sérült felnőtt agyi környezetben 

A laboratóriumunkban korábban nyert adatok szerint, míg az NE-4C idegi őssejtek 

integrálódnak az embrionális agyszövetbe, túlélésüket és szöveti fejlődésüket a kifejlett 

agyszövet nem támogatja. Mivel a szövetgenezis és regeneráció sok lépése hasonlóan 

zajlik, felvetődött a kérdés, vajon a felnőtt sérült agyszövetben túlélnek és vándorolnak- 

e illetve idegszövetté differenciálódnak-e ugyanezen idegi őssejtek. 

I.1 NE-4C sejtek fagyasztással sértett agykérgi területeken 

Kezdeti munkám során megvizsgáltam a zöld fluoreszcens fehérjét expresszáló GFP-4C 

idegi őssejtek viselkedését „intakt” és fagyasztásos lézión átesett modellállatok 

agyában. 

A fagyasztásos sértést felnőtt egerek (n=42 db) előagykérgében idéztünk elő, Klatzo 

(1958) és Murakami (1999) metódusa alapján. Ennek előnye, hogy reprodukálható 

méretű károsodást eredményez. A fagyasztással elölt „magi régióban” gyors 

sejtpusztulás (nekrózis-apoptózis) indul meg, míg a távolabbi, mélyebb kérgi területen 

(„széli zóna”) késleltetett apoptotikus folyamatok zajlanak. A fagyasztórúd méretétől, 

hőmérsékletétől és a fagyasztás időtartamától függően a magi és széli régió kiterjedése 

változtatható. 

Az általunk alkalmazott fagyasztásos beavatkozás 1,7 ( 0,4) mm átmérőjű félgömb 

alakú sérült területet eredményezett az agykéregben, amelynek középponti koordinátáit 

az alábbiakban határoztuk meg: Br: -0,7; L 2,3 mm. A műtét napját nulladik napként 

(D0) jelöltük. A fagyasztásos beavatkozást követő hetedik napon (D7) a sértett és 

kontroll állatok agykérgi régiójába GFP-4C idegi őssejteket ültettünk. Az időpont 

kiválasztásánál döntő szempont volt, hogy kivárjuk a vazogén agyödéma lecsengését 

(Murakami 1999). Az implantáció helyét és a beültetett sejtek számát előzetes 

vizsgálatok alapján úgy válaszottuk meg, hogy az agykérgi sérülés fénymikroszkóposan 

azonosítható nekrotikus határzónájától 1 mm-re lateralisan (Br:-0,1; L: 3,2; V: 1,4 mm), 

a sértés széli zónájába kerüljön a bejuttatandó 10 5 db GFP-4C sejt (12 / A, B. ábra). 

49

Fagyasztásos lézió 

Kp: Br -0.7, L 2.3 

A 

D0 

www.mbl.org 

Br 0.0 

Sejtbeültetés, (sejtvándorlás) 

Br -0.1, L 3.2, V 1.4 

12. ábra A: Agykérgi fagyasztásos sérülés és GFP-4C sejtbeültetés vázlatos képe a beavatkozások 

koordinátáival. B: Fáziskontraszt mikroszkópos kép az agykérgi sértés és implantáció területét mutató 

metszetről a fagyasztás utáni 14. napon. Világoskék betűk, kiemelés és nyilak: fagyasztás; zöld betűk, 

kiemelés és nyilak: sejtbeültetés és sejtvándorlás. Mérce: 1 mm. 

A kontroll állatok implantációja azonos koordináták szerint történt. A beültetéshez 

fluoreszcencia intenzitás alapján (FACS) válogattuk ki a legerősebb fluoreszcenciát 

mutató GFP-4C sejteket. Az implantált sejtek túlélését, differenciálódását, vándorlását, 

proliferációját a kísérlet kezdetétől számított 14., 21., 30. és 60. napon vizsgáltuk. A 

beültetett sejteket fagyasztott metszeteken GFP-fluoreszcenciájuk alapján azonosítottuk. 

Idegsejt és asztroglia irányú differenciálódásukat III-tubulin-, NeuN- és GFAP- 

immunreakciók segítségével vizsgáltunk. 

A fagyasztást követő 14.-29. túlélési napon megvizsgált állatok közül a sértett agykérgű 

állatokban ~64%-ban, míg a kontroll állatokban csupán ~24%-ban találtunk élő GFP-4C 

sejteket. A 30.-60. túlélési napon vizsgált sértett és kontroll állatcsoportok között a 

különbség tovább nőtt. Míg a sértett agykérgű állatok ~71%-ában jelen voltak a 

beültetett sejtek, illetve azok leszármazottai, egyetlen ép agykérgű állatban sem 

találtunk túlélő implantált sejtet (7. táblázat). 

D7 

Nekrotikus mag 

Peri-nekrotikus 

széli zóna 

7. táblázat A GFP-4C sejtek túlélése sértett agykérgű és kontroll állatok agyában 

Élő GFP-4C sejteket hordozó állatok százalékos aránya 

Túlélési idő Sértett agykérgű Kontroll 

D14-29 63,6% (22/14)* 23,8% (21/5) 

D30-60 70,6% (17/12) 0% (10/0) 

*zárójelben: összes kezelt állat/élő GFP-4C sejtet hordozó állat az adott napon 

50 

B 

D14

Ép állatokban - a korábbi kísérletek eredményevel egybecsengően - az implantált GFP- 

4C sejtek az agykéregben kis aggregátumokat alkottak. A beültetés helyétől jelentős 

távolságra nem vándoroltak. A 60. napra nyom nélkül eltűntek a befogadó agyakból. 

Sérült agykérgű állatokban a túlélő GFP-4C sejtek által elfoglalt térfogat az agyban 3- 

4-szeresére nőtt a megfigyelés 8 hete alatt. A GFP-4C sejtek által elfoglalt területek 

átlaga a 14. napra 1,03 mm 3 , az 53. poszt-implantációs napra (a kísérlet kezdetétől 

számított 60. nap) 3,63 mm 3 térfogatot ért el (13. ábra). 

A GFP-4C sejtek által elfoglalt térfogat 

az agyban (mm3) 

5 

4 

3 

2 

1 

0 

0 10 20 30 40 50 60 

Beültetés utáni napok 

Az első két posztimplantációs héten a sérülés magi zónájában kevés élő –gazda vagy 

implantált- sejtalakot találtunk. A nagyrészt elhalt magi régió a hisztológiai feldolgozás 

során esetenként az agyból kiesett, a további vizsgálat számára elveszett. GFP-4C 

őssejtek a lézió széli zónájában éltek túl, és a kérgestest rostkötegei mentén is 

vándoroltak (14. ábra). 

D14 

A 

D14 

Magi régió 

Perinekrotikus 

széli zóna 

GFP / GFAP 

14. ábra A: Túlélő implantált GFP-4C sejtek (zöld) a sérülés széli régiójában gliotikus zónával körülvéve 

(GFAP: vörös). (Sárga festődés a magi régióban: elpusztult sejtek maradványai.) Mérce: 60 m B: GFP- 

4C sejtek (zöld nyilak) a sérülés széli zónájában és vándorló GFP-4C sejtek a corpus callosumban (cc). 

Str: striatum, ctx: cortex. Mérce: 300 m. Fluoreszcens (A) és fáziskontraszt (B) mikroszkópos képek. 

* 

51 

B 

D14 

ctx 

13. ábra GFP-4C sejtkolóniák 

térfogata lézionált ( ) és ép (■) 

felnőtt agyban a beültetés utáni 

különböző időpontokban. Az 

átlag és szórás értékeket 4-5 

állat adataiból számoltuk 

minden időpontban. A 

csoportok közötti eltéréseket 

többszempontos varianciaanalízissel 

értékeltük *: p

A szürkeállományban nem találtunk egyedi, vándorló GFP-4C sejtet. Oldalkamrában 

túlélő GFP-4C sejtcsoportot több állatban azonosítottunk. Egy héttel a beültetés után a 

bejuttatott sejtek SSEA-1 őssejt markert hordoztak (15. ábra). 

D7 

SSEA-1 immunreaktív sejteket azonban találtunk a GFP-t nem expresszáló sejtek között 

is. Bár nem zárható ki, hogy a beültetett sejtek egy részében a GFP-szint a 

detektálhatóság alá csökkent, fel kell tételeznünk, hogy a lézionált / implantált területen 

a gazda szövet differenciálatlan sejtjei is felszaporodtak. A sérülés széli zónájában 

erősen GFAP-pozitív gliotikus határzóna képződött, amely a túlélő őssejteket is 

körbefonta. A GFAP-immunreaktív asztrociták között előfordultak beültetett őssejt- 

eredetű sejtek is (16. ábra). 

A GFP 

D14 

C 

str 

SSEA-1 

vl 

Hoechst 

B 

D 

15. ábra Az oldalkamrában túlélő GFP-4C 

sejtcsoport sejtjei felszínükön hordozták az 

SSEA-1 őssejt-antigént. Fluoreszcens 

mikroszkópos felvételek. 14. kísérleti nap. 

SSEA-1-immuncitokémia, vörös (str: striatum, 

vl: oldalkamra) Mérce: 25 m 

16. ábra A széli zónában a 14. napon GFAP-pozitív, asztrocitává alakult GFP-4C sejtek (fehér nyilak) is 

jelen voltak. Fluoreszcens konfokális mikroszkópos felvétel. (A: GFP, zöld, B: GFAP, vörös, C: Hoechst 

magfestés, kék, D: egymásra vetített hármas fluoreszcens kép) Mérce: 10 m 

52 

GFAP 

Hoechst / GFP / GFAP

Hosszabb túlélés (5-8 hét) során a poszt-nekrotikus magi részt és az azt körülölelő 

penumbrát is sejtek népesítették be (17. ábra). 

A 

17. ábra A GFP-4C sejtek (fehér nyíl) a második kísérleti hónapra (60. nap) az agykérgi sérülés magi és 

széli régióját is benépesítették. A sérült terület határán lévő gliotikus zónát nem lépték át az ép szövet 

felé. Fluoreszcens mikroszkópos képek. (A: Hoechst magfestés, kék, B: GFP-fluoreszcencia, zöld, C: 

GFAP-immunpozitivitás, vörös) Ctx: agykéreg, cc: corpus callosum, vl: oldalkamra. Mérce: 500 m 

A GFP-4C sejtekkel benépesített területen sok gazda- és GFP-4C-eredetű asztrocitát 

azonosítottunk. A „benépesített” régió egy gliotikus határral élesen elvált az intakt 

szövettől. A GFP-4C sejtek az ép parenchymába nem vándoroltak be. Növekvő, 

nyúlványos sejteket tartalmazó csoportjaikon belül csak egy-egy olyan sejtet észleltünk, 

amely idegsejtre rendelkező morfológiát mutatott és ( III-tubulin) idegsejt-markert is 

expresszált (18. ábra). A GFP-4C utódsejtek túlnyomó többsége azonban idegsejt- 

irányú differenciálódást nem mutattott (19. ábra). 

A GFP B III-tubulin 

D60 

cc 

vl 

Hoechst 

ctx 

D60 

B GFP 

vl 

18. ábra A GFP-4C sejtek között a 60. napon csupán egy-egy III-tubulin pozitív idegsejtet találtunk. 

Fluoreszcens konfokális mikroszkópos felvétel. (A: GFP fluoreszcencia, zöld, B: III-tubulin 

immunpozitivitás, vörös, C: kettős pozitivitás, sárga) Mérce: 20 m. 

53 

C 

ctx ctx 

cc cc 

C 

vl 

GFAP 

GFP / III-tubulin

A GFP B* 

B 

D60 

ctx 

19. ábra A beültetett őssejtek (zöld) NeuN idegsejtmarker-pozitivitást nem mutattak. Fluoreszcens 

mikroszkópos képek. D60: 60. kísérleti nap. Ctx: agykéreg. A: GFP fluoreszcencia, zöld, B: NeuN 

immunpozitivitás, vörös, C: egymásra vetített kettős kép. Mérce: 100 m. 

Implantációs kísérleteink megmutatták, hogy a felnőtt, előzetesen nem sértett 

agykéreg szöveti környezete az őssejtek hosszútávú túlélését, elköteleződését, szövet- 

specifikus integrációját nem támogatja. Ezzel szemben a felnőtt, sérült cortex 

környezete hosszútávú túlélésüket, a sejthiányos szöveti tér benépesítésében való 

részvételüket segíti, gliogenezisüket nem gátolja, azonban idegsejt-irányú 

elköteleződésüket nem segíti elő. 

ctx ctx 

Az ép és sérült agykéregben tapasztalt eltérő őssejt-viselkedést okozhatja az eltérő 

szöveti környezet (a sértés hatására megváltozott ECM, adhéziós molekulák, sejtes 

elemek, növekedési faktorok, stb.). Előfordulhat azonban, hogy az eltérő környezet a 

beültetett sejtklón sejtjei közül szelektálja az adott körülmények között leggyorsabban 

szaporodó „mutánsokat”, és ezzel a sejtpopuláció intrinszik tulajdonságai változtak 

meg. Utóbbi tényező vizsgálatára a lézió környéki agykérgi részt több modellállat 

agyából (n=3) 53 napi poszt-implantációs időszak után kimetszettük és egysejtes 

szuszpenziókra disszociáltattuk. A GFP-4C sejteket a szuszpenziókban azonosítottuk, a 

„visszatenyésztett” klónokat GFP-RC-ként jelöltük. A GFP-RC sejteket az “anyaklón” 

sejtjeivel összehasonlítottuk. A visszatenyésztett sejtek morfológiája minden esetben a 

GFP-4C klónnal azonos volt (20/ A ábra). A visszatenyésztett sejtek retinsavas indukció 

hatására az anyaklónhoz hasonlóan ideg- és gliasejtekké fejlődtek (20/B, C ábra). A 

sejtek 40%-a képezett immunhisztológiai módszerrel azonosítható idegsejteket a kezelés 

5.-7. napjára. A sejtelköteleződés folyamata az NE-4C- és GFP-4C-elköteleződés 

korábban leírt karakterisztikájának megfelelt (Schlett 1997). Proliferációs rátájuk, 

ciklusidejük és kromoszómaszámuk az anyaklónnal azonosnak bizonyult (21. ábra). 

54 

C 

NeuN GFP / NeuN

A 

20. ábra A: A GFP-RC sejtklón tenyészetben az „anyaklónnal” megegyező morfológiát mutatott. 

Fáziskontraszt mikroszkópos kép. B: A retinsavas indukció 7. napjára a GFP-RC tenyészetben a GFP-4Chez 

hasonló arányban jelentek meg III-tubulin pozitív idegsejtek (barna). Fénymikroszkópos kép. C: A 

retinsavas indukció 14. napjára a GFP-RC tenyészetben a GFP-4C-hez hasonló arányban jelentek meg 

GFAP-pozitív asztrociták (vörös). Fluoreszcens mikroszkópos kép. RA0-2: 48 órás retinsavas kezelés a 

kísérlet 0.-2. napján, fix.: fixálás időpontja (nap). Mérce: 25 m 

Életképesség 

A 

B 

Kromoszómaszám 

0,6 

0,4 

0,2 

0 

0 10 20 30 40 50 60 70 

80 

60 

40 

20 

0 

Idő (óra) [kiültetés után] 

B III-tubulin C 

GFAP 

RA0-2, fix. 7 RA0-2, fix. 14 

GFP-4C GFP-RC 

Sejtklónok 

21. ábra B: A GFP-4C és GFP-RC sejtklónok kromoszómaszámlálása 

azonos értéket mutatott (egyszempontos varianciaanalízis, 

p=0.186. C, D: A GFP-4C sejtek (C) és GFP-RC sejtek 

(D) kromoszóma-készlete. Fénymikroszkópos kép. Mérce: 10 

m. 

55 

20. ábra B: A GFP-4C ( ) és 

GFP-RC (■) sejtklónok in vitro 

MTT- (oxidoredukciós) 

eljárással történő életképességvizsgálata 

azonos proliferációs 

rátát és ciklusidőt mutatott. Az y 

tengelyen szereplő életképességértékeket 

(módszert illetősen ld. 

Módszerek fejezetet) 4 független 

mérés adataiból nyertük. Az 

elvégzett statisztikai próbák a 

minták között releváns 

különbséget nem igazoltak. 

C 

D

Összehasonlító RT-PCR elemzések nem jeleztek különbséget a GFP-4C és GFP-RC 

sejtek génexpressziós profilja között (22/ A ábra). A visszatenyésztett sejtek sem 

indukálatlan, sem indukált állapotban nem expresszálták az entoderma-specifikus (hnf4, 

flk1) géneket. Az indukálatlan állapotban jellemző brachyury-expesszió az idegi irányú 

differenciálódás beindulása után mindkét (GFP-4C, GFP-RC) preparátumban megszűnt, 

míg a ngn2 (neurogenin2) pro-neurális gén a neuronképzés időszakában (a retinsavas 

kezelés kezdetétől számított 7. napon) expresszálódott. 

21. ábra A: A GFP-4C és GFP-RC sejtklónok génexpressziós profiljai között RT-PCR vizsgálattal 

eltérést nem találtunk. RA : indukálatlan tenyészetek, RA 0-2: a kísérlet 0-2. napján 48 órás retinsavas 

kezelést kapott tenyészetek. Mintavétel az indukált tenyészetekből a 7. napon történt. -: negatív kontroll 

[RNS-mentes minta], +: pozitív kontroll [15 napos teljes egér embrió teljes RNS-minta]). 

B: A GFP-RC sejtek a GFP-4C sejtekhez hasonlóan intakt agyi környezetben néhány héten belül 

nyomtalanul eltűnnek (fehér nyíl: a GFP-RC beültetés helye az agykéregben). Fluoreszcens mikroszkópos 

kép. D21: 21. kísérleti nap. Ctx: agykéreg, cc: corpus callosum, vl: oldalkamra. Mérce: 500 m 

In vivo viselkedésük összehasonlítására a GFP-RC-t és GFP-4C-t is felnőtt egerek (n=3) 

sértetlen agykérgébe ültettük a korábbi koordináták szerint. A GFP-RC sejtek, 

hasonlóan az “anyaklónhoz” rövid ideig éltek túl az agyi környezetben, nem 

integrálódtak, és a 6. hétre nyomtalanul eltűntek az agyból (22/ B ábra). 

Sejt-visszatenyésztés révén nyert adataink azt bizonyítják, hogy a GFP-4C sejtek eltérő 

viselkedése sérült agykérgi környezetben nem a sejtek klonális tulajdonságainak 

megváltozása révén következett be. A tapasztalt változásokat az eltérő szöveti 

környezet váltotta ki. 

56 

cc 

vl 

ctx

I.2 Az NE-4C sejtek kölcsönhatása tumorsejtekkel 

Az őssejtek és a tumorsejtek sejtfelszíni molekulái, illetve az igényelt ECM-kötött és 

diffúzibilis faktorok között jelentős hasonlóság mutatható ki. Bizonyos tumorok által 

termelt speciális ECM és diffúzibilis faktorok (kemokinek, citokinek, őssejt-faktor) az 

őssejtek tumor-irányú tropizmusát elősegítik (Ziu és mtsai 2006, Xu és Zhu 2007). 

Egyes őssejtekől bebizonyították, hogy képesek agytumorokba bevándorolni, tehát 

elméletileg alkalmasak lehetnek arra, hogy a tumoros szövetbe juttassanak 

sejtszaporodást gátló, apoptózist indukáló hatóanyagokat (infektált terápiás gének 

expresszióján keresztül) [Aboody 2000, Benedetti 2000, Ehtesham 2002a,b]. 

A neoplasztikus szövet agyi környezete sok tekintetben eltér a normál szöveti 

körülményektől, így érdemes volt megvizsgálni, hogy ebben a környezetben, illetve a 

tumor belsejében képesek-e vándorolni a kívülről bevitt őssejtek. Munkáink során 

tanulmányoztuk, hogy az NE-4C idegi őssejtek in vitro képesek-e kölcsönhatásokat 

kialakítani különböző típusú idegszöveti tumorsejtekkel. Ezek alapján választottuk ki in 

vivo kísérleteinkhez a megfelelő tumorsejttípust. Kísérleteinkhez C6 patkány glióma 

(Benda és mtsai 1968), GL261 egér eredetű glioblasztóma (Ausman és mtsai 1970, 

Désaknai és mtsai 2003, Szatmári és mtsai 2006), spontán immortalizált egér glia (LL- 

glia, Dr. Latzkovits Lászlótól), és U87 humán asztroglióma (Ponten és Macintyre, 1968) 

sejtvonalakat használtunk. 

I.2.1 Kontakt kölcsönhatások vizsgálata függőcsepp-módszerrel 

A tumor-célzásra való alkalmazáshoz alapfeltétel, hogy az őssejtek és tumorsejtek 

egymással keveredni tudjanak, adhéziós sajátosságaik megengedjék kontakt- 

kölcsönhatások létesítését. A különféle tumorsejtek és NE-4C őssejtek közötti sejt-sejt 

kölcsönhatások tanulmányozására közvetlen kontaktus kialakítására alkalmas 

függőcsepp-módszert alkalmaztunk (Wobus és mtsai 2002). A módszer megmutatja, 

hogy az adhezív felület hiányában egymáshoz tapadó, egymással kölcsönhatásokat 

létesítő sejtek csak a saját sejttípusukkal, vagy a tumorsejtekkel elkeveredve találhatók- 

e a sejtaggregátumokban. Amennyiben az összekevert őssejtek és tumorsejtek/primer 

gliasejtek egymással nem tudnak kölcsönhatást teremteni, vagy a kölcsönhatás gyenge, 

57

az aggregátumban a kétféle sejttípus szegregál („sorting out”) (Steinberg 1963). Az 

egymással erős kölcsönhatásokat kialakító sejttípusok sejtjei elkeverednek. 

A kísérlet során 10 3 db NE-4C/GFP-4C sejtet és 10 3 db GL261 vagy U87 vagy C6 

tumorsejtet, mesenchymális őssejtet vagy GFP-vel jelölt primer egér asztrocitát 

egymással összekevertünk, majd 72 órán át közös függőcseppben tenyésztettük. Az 

elkeveredést/szegregációt a függőcseppek fixálását követően fluoreszcens mikroszkópos 

technikával vizsgáltuk. 

A GFP-4C sejtek vizsgálatainkban elkülönültek a primer asztrogliasejtektől és a C6 

patkány glióma, U87 humán glióma és az LL-immortalizált egér gliasejtektől. Ezzel 

szemben egyenletesen elkeveredtek a GL261 egér glioblasztómasejtekkel és egér 

mesenchymális őssejtekkel (8. táblázat). A GFP-vel jelölt primer asztrogliasejtek 

minden gliómasejt-típussal elkeveredtek, míg az NE-4C sejtektől szegregáltak (8. 

táblázat, 23. ábra). A GFP-4C őssejtek tehát kizárólag a GL261 glioblasztóma 

tumortípussal tudtak sejt-sejt kölcsönhatásokat létesíteni, azaz sejtfelszíni 

kölcsönhatásaik nem gátolták a kétféle sejt „együttélését”. 

8. táblázat Az NE-4C/GFP-4C őssejtek és a hGFAP-eGFP asztrogliasejtek sejt-sejt 

kölcsönhatásai glióma- és egyéb sejttípusokkal 

GFP-4C hGFAP-eGFP primer asztroglia 

C6 glióma Szegregáció Keveredés 

LL-glia Szegregáció Keveredés 

GL261 glioblasztóma Keveredés Keveredés 

U87 glióma Szegregáció Keveredés 

Mesenchymális őssejt Keveredés - 

NE-4C - Szegregáció 

I.2.2 Szolubilis kölcsönhatások in vitro vizsgálata 

Mivel az őssejtek és tumorsejtek „együttélése” folyamán mind az ős-, mind a 

tumorsejtek által termelt szolubilis faktorok előidézhetik a másik sejttípus 

proliferációjának változását, amely nem kívánt eredményt adhat (őssejt-tumor, 

tumorprogresszió), megvizsgáltuk, hogy az NE-4C őssejtek és egyes tumorsejtek 

kondícionált médiumai hogyan hatnak a sejtek proliferációjára. Ehhez NE-4C, 

különböző tumor és primer egér asztrocita sejteket szérummentes tápoldatban 

növesztettünk 24 órán át, majd a sejtek médiumba bocsátott faktorait tartalmazó 

„kondícionált médiumokat” (KMNE-4C, KMASZTRO, KMC6, KMGL261, KMU87) használtunk 

58

fel az eltérő sejtek kezelésére. A proliferáció mértékét [ 3 H]-timidin inkorporációs teszt 

segítségével becsültük meg. Eredményeink szerint az NE-4C őssejtek proliferációját 

sem a primer asztrocita, sem a tumorsejtek kondícionált médiuma nem befolyásolta 

számottevően (24. ábra). Az NE-4C sejtek kondícionált médiuma viszont a C6-glióma 

és a primer asztrogliasejtek proliferációját szignifikánsan növelte, míg az U87 humán 

glióma és GL261 glioblasztóma sejtek proliferációjára nem gyakorolt szignifikáns 

hatást (25. ábra). Az őssejtek tehát nem használhatók C6-glióma sejtekkel végzett 

kísérletekben, mert azok proliferációját fokozzák, tumorprogressziót okozhatnak. 

A 

A’ 

A’’ 

GFP-4C és 

GL261 

glioblasztóma 

GFP 

Hoechst 

GFP / Hoechst 

HGFAP-eGFP primer 

glia és GL261 

glioblasztóma 

B 

B’ 

B’’ 

22. ábra Sejtkölcsönhatások vizsgálata kiméra-aggregációs módszerrel. 

A-A”: A GFP-4C őssejtek és a GL261 glioblasztóma sejtek összekeverednek a függőcseppben. B-B”: A 

hGFAP-eGFP primer asztrogliasejtek a GL261 glioblasztóma sejtekkel összekeverednek a 

függőcseppben. C-C”: Az NE-4C őssejtek és a hGFAP-eGFP primer asztrogliasejtek szegregálnak az 

aggregátumokon belül. Fluoreszcens mikroszkópos képek. A, B, C: GFP-fluoreszcencia, zöld, A‟, B‟, C‟: 

Hoechst magfestés, kék, A”, B”, C”: egymásra vetített kettős kép. Mérce: 25 m. 

59 

C 

C’ 

C’’ 

HGFAP-eGFP 

primer glia és 

NE-4C

Relatív [3H]-timidin beépülés a 

kontroll százalékában 

160 

140 

120 

100 

80 

60 

40 

20 

0 

Asztrocita GL261 C6 U87 

kondicionált médiuma az NE-4C sejteken 

23. ábra Az asztrocita és glióma kondicionált médiummal történő 1 napos kezelés az NE-4C sejtek 

relatív [ 3 H]-timidin beépülésére (azaz a sejtek proliferációjára) szignifikáns hatást nem fejt ki. 5 

kísérletsorozat 4-4 párhuzamos tenyészetéből származó átlag- és szórásértékek. A DPM/ g fehérje 

értékek átlagát 100%-nak vettük, ehhez viszonyítva adtuk meg a relatív [ 3 H]-timidin beépülés értékét és 

szórását. Kontrollként friss definiált médiummal kezelt azonos típusú sejtek (n=5) szerepeltek, ezek 

szórás határértékeit a szaggatott vonalak jelzik. A csoportok timidin beépülésének eltérését csoportonként 

egyszempontos variancia-analízissel vizsgáltuk, p=0,503. 

Relatív [3H]-timidin beépülés a 

kontroll százalékában 

160 

140 

120 

100 

80 

60 

40 

20 

0 

* 

Asztrocita GL261 C6 U87 

sejtek az NE-4C kondícionált médiummal kezelve 

24. ábra Az NE-4C sejtek kondicionált médiumával történő 1 napos kezelés a primer asztrocitákon és 

C6-glióma sejteken szignifikáns [ 3 H]-timidin beépülés-növekedést váltott ki, azaz proliferációjuk 

fokozódott. Az egyéb vizsgált sejtekre az NE-4C kondicionált médiumnak nem volt szignifikáns hatása. 8 

kísérletsorozat 4-4 párhuzamos tenyészetéből származó átlag- és szórásértékek. Kontrollként friss 

definiált médiummal kezelt azonos típusú sejtek (n=5) szerepeltek, ezek szórás határértékeit a szaggatott 

vonalak jelzik. A DPM/ g fehérje értékek átlagát 100%-nak vettük, ehhez viszonyítva adtuk meg a relatív 

[ 3 H]-timidin beépülés értékét és szórását. A csoportok timidin beépülésének eltérését csoportonként 

egyszempontos variancia-analízissel vizsgáltam, *: p

I.2.3 A GL261 tumorsejtek és az NE-4C őssejtek kölcsönhatásainak in vivo vizsgálata 

Az in vitro eredmények alapján tehát az NE-4C sejtek a GL261 glioblasztóma tumorok 

célzására alkalmazhatók lehetnek, mert velük sejtszintű kölcsönhatásokat képesek 

kialakítani, emellett az NE-4C és GL261 sejtek egymás proliferációját nem növelik. In 

vivo vizsgálatainkban ezért az NE-4C sejtek alklónjait és GL261 glioblasztóma 

tumorsejteket alkalmaztunk. Állatmodell-kísérletekben tanulmányoztuk, hogy az 

implantált őssejtek túlélését befolyásolja-e a tumoros sejtek jelenléte az agyban, 

valamint, hogy az NE-4C őssejtvonal sejtjei alkalmasak lehetnek-e „tumorcélzásra”. 

In vivo a GL261 glioblasztóma sejtek igen agresszív, gyorsan növekedő tumort 

képeznek az agyban (26. ábra). 

A 

D10 

B 

D14 

A 3-4 hetet meghaladó túlélés érdekében viszonylag kisszámú tumorsejt implantációját 

végeztük el egerek előagyi régiójába. Két eltérő kísérleti modellt alkalmaztunk: 

előzetesen „létrehozott” GL261 tumor mellé ültettünk be (az NE-4C PLAP-4C 

alklónjából származó) őssejteket, illetve PLAP-4C és GL261 sejteket összekeverve 

implantáltunk. 

HE / GFAP 

A’ 

C 

CI 

D10 

Nucl. ret. th. 

61 

vl 

Th 

25. ábra A GL261 tumorsejtek által 

elfoglalt térfogat növekedése az 

agyban. Hematoxilin-eozin 

(rózsaszín/lila) és GFAP- (barna) 

festés. Fénymikroszkópos képek. A 

sötétkék nyilak és szaggatott sötétkék 

vonallal körülrajzolt területek a GL261 

tumort mutatják. Th: thalamus, Th RT: 

Nucleus reticularis thalami, CI: 

capsula interna. 

A-A‟: A GFAP-vel festődő GL261 

glioblasztómasejtek az oldalkamra (vl) 

szögletében a 10. poszt-implantációs 

napon. A‟: az A ábra kinagyított, 

GL261 sejteket ábrázoló része. Mérce: 

A: 1 mm, A‟: 150 m 

B: A 14. poszt-implantációs napra a 

GL261 tumor térfogata nagymértékben 

nőtt az agyban. Mérce: 1 mm. C: A 

GL261 tumor invazívan terjeszkedik 

az agyi parenchymában. Mérce: 150 

m

A tumor-növekedés mértékét előkísérletek (n=10) során becsültük meg. Ennek 

eredményei alapján végeztük el első in vivo vizsgálatainkat. Ennek során felnőtt, ép 

C57BL egerek (n=10) előagyába 10 4 db GL261 tumorsejtet implantáltunk (Br: 0,0; L: 

1,6; V: 2,5 mm), majd 2,5x10 4 PLAP-4C őssejtet ültettünk be a tumor mellé (Br: 0,0; L: 

2,6; V: 2,5 mm), vagy az oldalkamrába (Br: 0,0; L: 1,1; V: 2,0) az első beavatkozástól 

számított harmadik napon. Az állatokat 7 és 14 napos túlélést követően vizsgáltuk. A 

tumorsejtek a befogadó agyak 80%-ában voltak jelen, egyenlő arányban különböző 

túlélési idők esetén. A PLAP-4C sejteket 7 napos túlélést követően a befogadó agyak 

80%-ában találtuk meg, míg 14 napos túlélés esetén PLAP-4C sejtet egy agyban sem 

azonosítottunk (9. táblázat). 

9. táblázat A PLAP-4C idegi őssejtek és GL261 glioblasztóma sejtek 

túlélése először GL261, majd PLAP-4C sejtimplantációban részesült 

állatok agyában 

Élő beültetett sejteket hordozó állatok százalékos aránya 

Túlélési idő GL261-et hordozó PLAP-4C-t hordozó 

D7 80% (5/4)* 80% (5/4) 

D14 80% (5/4) 0% (5/0) 

* zárójelben: összes kezelt állat/élő beültetett sejtet hordozó állat az adott napon 

A megtalált őssejtek a tumor közelében, de attól elkülönülten helyezkedtek el (27. ábra). 

A A’ ctx HE / PLAP 

ctx 

fi 

26. ábra A-A‟: 10 nappal a GL261 és 7 nappal a PLAP-4C sejtek implantációját követően mindkét 

sejttípus megtalálható az agyban, de a PLAP-4C sejtek (lila nyilak) nem keverednek a GL261 

glioblasztómasejtekkel (szaggatott sötétkék vonallal körberajzolva) és nem mutatnak a tumorsejtek felé 

irányuló vándorlási hajlamot. Hematoxilin-eozin és PLAP-jelölés. Szürkeárnyalatos és színes 

fénymikroszkópos képek. (fi: fimbria hippocmapi, hc: hippocampus, ctx: cortex) A‟: A ábra kinagyított 

része. Mérce: A: 500 m, A‟: 250 m 

62 

hc 

fi 

hc

Nem volt jele annak, hogy a tumorsejtek jelenléte az őssejtek vándorlását fokozta volna, 

vagy az őssejteket a tumor felé irányította volna. A PLAP-4C sejtek az ép agyban már 

látott korlátozott, rostkötegek mentén történő migrációs hajlamot mutatták. A tumoros 

agyakban a PLAP-4C sejtek túlélése megrövidült az intakt felnőtt agyban tapasztalthoz 

képest. Feltehetően a GL261 tumor az őssejtek túlélését és vándorlását segítő 

kemotaktikus anyagokat nem termelt. 

GL261 glioblasztóma és PLAP-4C sejtek együttes implantációját is elvégeztük CD1 

felnőtt egerek (n=11) striatalis régiójába (Br: 0,0, L: 1,6, V:2,5). A tumorsejteket 1 és 2 

hetes túlélés esetén is megtaláltuk minden befogadó agyban. A PLAP-4C őssejteket 1 

hetes túlélésnél az állatok 100%-ában, 2 hetes túlélésnél pedig az állatok 80%-ában 

azonosítottuk (10. táblázat). 

10. táblázat A PLAP-4C idegi őssejtek és GL261 glioblasztóma sejtek 

túlélése a GL261- és PLAP-4C ko-implantációban részesült állatok 

agyában 


Túlélési idő GL261-et hordozó PLAP-4C-t hordozó 

D7 100% (6/6)* 100% (6/6) 

D14 100% (5/5) 80% (5/4) 

D0: sejtbeültetés napja, * zárójelben: összes kezelt állat/élő beültetett sejtet hordozó 

állat az adott napon. 

A hisztológiai feldolgozás megmutatta, hogy a tumor-őssejt aggregátumok fokozatosan 

növekedtek a befogadó agyban, ezen belül a PLAP-4C sejtek aránya csökkent (28 ábra). 

A 

D3 

str 

ctx 

cc 

27. ábra A GL261-PLAP-4C sejtaggregátum a beültetés utáni 3. (A) és 14. napon (B). A tumorsejtek 

aránya szemmel láthatóan nőtt a PLAP-4C sejtekhez képest. Fáziskontraszt mikroszkópos képek a PLAP 

előhívás után. A PLAP-4C sejtek sötét foltokként jelennek meg (nyilak). Mérce: 500 m. (ctx: cortex, cc: 

corpus callosum, str: striatum) 

63 

B 

D14 

str 

ctx 

cc

Míg a tumorsejtek az ép parenchymába invazívan behatoltak (29/ A ábra), az őssejtek 

erre nem mutattak képességet. Egy-egy őssejt a környező agyi parenchyma felé 

nyúlványt bocsátott (29/ A‟ ábra). A tumorsejtek között fennmaradó PLAP-4C sejtek 

túlélése hosszabb volt, mint a tumorral közvetlen kapcsolatban nem lévő PLAP-4C 

sejteké. Az agykamrákban jelenlévő tumor-őssejt aggregátumokból az őssejtek nem 

tudtak kilépni a környező szövetbe, vagy tartósan túlélni az SVZ-ben (29/ B, C ábra). 

A 

cc 

B 

ctx 

vl 

D14 

cfv 

D7 

cc 

vl 

str 

A’ 

C 

vl 

GFAP / PLAP 

Tumorsejtekkel és őssejtekkel végzett munkáink megmutatták, hogy az NE-4C 

őssejtek sejt-sejt kölcsönhatásokat tudnak létesíteni egyes tumorsejtekkel (GL261 

glioblasztóma). Az őssejtek által termelt faktorok bizonyos tumorsejttípusok 

proliferációját serkenteni képesek (C6-glióma, LL-glia), alkalmazásuk tehát a 

tumorprogresszió veszélyével is járhat. Agyi környezetben a GL261 glioblasztóma 

sejtek jelenléte a PLAP-4C őssejtek túlélését megengedi, de olyan kemotaktikus 

faktorokat nem (vagy nem elégséges mennyiségben) termel, amelyek segítenék az 

őssejtek tumorsejt-célzását, vagyis az őssejtek tumorhoz vándorlását. 

E 

64 

28. ábra A: A PLAP-4C és GL261 

sejtek egymással keverve 

helyezkedtek el a striatum területén 

fejlődő tumorban (pontozott vonal) az 

implantációt követő 14. napon. A 

GL261 sejtek invazívan terjeszkedtek, 

míg a PLAP-4C sejtek (lila) egy-egy 

nyúlványt (lila nyilak) bocsátottak a 

szomszédos agyi parenchyma felé. 

Mérce: 100 m A‟ ábra: az A ábra 

kinagyított része. Mérce: 25 m 

B: A PLAP-4C és GL261 sejtek a 

kamrafalhoz tapadó 

sejtaggregátumokat (fekete pontozott 

vonallal körberajzolva) képeztek. 

Mérce: 250 m. 

C: A kamrafali kevert sejtcsoportokból 

a PLAP-4C sejtek (lila nyilak) az ép 

szövetbe nem vándoroltak ki. Mérce: 

30 m. 

GFAP (barna) immuncitokémiai és 

PLAP (lila) hisztokémiai festés. Ctx: 

cortex, cc: corpus callosum, str: 

striatum, vl: oldalkamra, E: 

ependymaréteg, cfv: commissura 

fornicis ventralis.

II. In vitro előindukált GFP-4C sejtek „sorsa” intakt és sértett agyi környezetben 

Mivel adataink bizonyították, hogy a GFP-4C sejtek a felnőtt agyi környezetben igen 

kevéssé, vagy egyáltalán nem fejlődnek idegsejtekké, felvetődött a kérdés, hogy milyen 

idegi sejtfejlődési állapot teheti alkalmassá az NE-4C sejteket az intracerebralis túlélésre 

és integrációra. 

A GFP-4C sejteket két - laborunkban kidolgozott - módszerrel késztettem in vitro idegi 

fejlődésre. A GFP-4C tenyészeteken 48 órás retinsavas indukciót végeztem, az eképpen 

indukált sejteket RA-GFP-4C-nek neveztem. A másik indukciós módszer abból állt, 

hogy a GFP-4C sejteket perinatális (P0-P2) egér asztrocitákkal együtt tenyésztettem 

(„nem-kontakt ko-kultúra”, 11. ábra). Utóbbi sejteket AG-GFP-4C-ként jelöltem. 

Kontroll lemezeken végzett immuncitokémiai vizsgálat segítségével megállapítottam, 

hogy a sejtek elköteleződése megindult a kezelés hatására. 

A kétfajta indukció kezdetétől számított 4. napon a sejteket tenyésztőedényükből 

szuszpenzióba vettem fel. Az előindukált őssejteket felnőtt, előzetesen nem kezelt CD1- 

egerek (n=12) kamraközeli striatalis/oldalkamrai régióiba (Br -0,1, L 1,2, V 2,0) 

juttattam be (5x10 4 sejt/állat). Egy és három hetes túlélést követően értékeltem a sejtek 

sorsát a befogadó agyak hisztológiai - immuncitokémiai vizsgálataival (GFAP, NeuN, 

III-tubulin-festés). 

A beültetett retinsavval indukált GFP-4C sejtek túlélése az agyban igen csekély mértékű 

volt; a vizsgálat állatok csupán 33%-ában találtunk élő, zölden fluoreszkáló RA-GFP- 

4C sejtet 1 hetes túlélés, 0%-ában 3 hetes túlélés esetén. Az asztroglia ko-kultúrában 

indukált GFP-4C sejtek 1 és 3 hetes túlélés után minden állatban megtalálhatók voltak 

(11. táblázat). 

11. táblázat Az előindukált GFP-4C sejtek túlélése a befogadó állatok agyában 


Túlélési idő RA-GFP-4C AG-GFP-4C 

D7 33% (3/1)* 100% (3/3) 

D21 0% (3/0) 100% (3/3) 

* zárójelben: összes kezelt állat/élő beültetett sejtet hordozó állat az adott napon 

A sejteket az oldalkamra környéki striatalis régióban, az oldalkamrákban, a 

hippocampus közvetlen környezetében, illetve a corpus callosum rostkötegei mentén 

65

találtuk meg. Az oldalkamrában lévő sejtaggregátum irányából a fehérállományi 

rostkötegek mentén a hippocampus felé igyekvő elnyúlt sejtalakokat is megfigyeltünk 

(30. ábra). 

D21 

A GFP A’ 

hc 

29. ábra A: Túlélő AG-GFP-4C sejtek (fehér nyilak) az oldalkamra szegletében a hippocampus 

környezetében. A sejtek a hippocampust (hc) megközelítik. Cc: corpus callosum, vl: oldalkamra, Mérce: 

75 m A‟: Az A ábra kinagyított része. Migráló AG-GFP-4C (fehér nyilak) sejtalakokat mutat. Zöld 

fluoreszcencia: GFP. Mérce: 30 m. 

A nyúlványos, differenciáltnak tűnő sejtalakok azonban idegi markereket nem 

expresszáltak, azaz nem voltak idegsejtnek tekinthetők. 

A következő lépésben felnőtt, előzetesen fagyasztással (Br -0,7, L 2,3) sértett felnőtt, 

NMRI egerek (n=30 db) lézió közeli agyi régiójába (Br -0,1, L 2,5, V 1,8) juttattam be 

5x10 4 , előzetesen retinsavas, vagy asztroglia-indukcióban részesített GFP-4C sejtet. A 

beültetés az indukció kezdetétől számított 4. napon történt. A tenyészeteken végzett 

kontroll immuncitokémiai eljárás azt mutatta, hogy az idegi indukció folyamatai 

megindultak a sejteken. A sérült agyi környezetben az előindukált sejtek nagy arányban 

túléltek. 1 hetes túlélési idő esetén csaknem minden állatban azonosítottunk élő GFP-4C 

sejtet; RA-GFP-4C sejtet az implantált állatok 80%-ában, míg AG-GFP-4C sejtet 

100%-ukban találtunk. 1 hónapos túlélési idő után RA-GFP-4C sejtek az állatok 50%- 

ában, míg AG-GFP-4C sejtek 100%-ukban voltak kimutathatók. 2 hónapos túlélési idő 

mellett ez az asztroglia ko-kultúrában indukált sejteknél 66%-ra csökkent, míg a 

retinsavval indukált sejteknél 50% maradt (12. táblázat). 

cc 

vl 

66

12. táblázat Előindukált GFP-4C sejtek túlélése fagyasztásos beavatkozáson átesett 

állatok agyában 

Túlélési idő Élő beültetett sejteket hordozó állatok százalékos aránya 

RA-GFP-4C AG-GFP-4C 

D7 80% (5/4)* 100% (5/5) 

D30 50% (4/2) 100% (5/5) 

D60 50% (6/3) 66% (3/2) 

D0: fagyasztás napja, * zárójelben: összes kezelt állat/élő beültetett sejtet hordozó állat 

az adott napon. 

A túlélő GFP-4C sejtek között a 30. naptól szórványosan asztrocitává alakult, GFAP- 

pozitív sejteket észleltünk (31. ábra), azonban GFP-4C eredetű idegsejteket nem 

találtunk. 

A GFP B GFAP C 

GFP / GFAP 

D30 

30. ábra Az agykérgi sérült területen elhelyezkedő, asztrocitává alakult GFP-4C sejtek (fehér nyilak). 

Fluoreszcens konfokális mikroszkópos felvétel. A: GFP-fluoreszcencia, zöld, B: GFAPimmunpozitivitás, 

vörös, C: egymásra vetített kettős pozitivitás, sárga) Mérce: 10 m 

2 hónapos túlélési idő mellett a befogadó agyakban esetenként, nem invazívan 

terjeszkedő, de mérete alapján tumorosnak tekinthető sejtszaporulatot észleltünk. Ez a 

jelenség a kétféleképpen indukált csoportban azonos arányban (33%) fordult elő. A 

tumorosnak tűnő térfoglalások vizsgálata sokszínű szöveti képet tárt fel. Az RA-GFP- 

4C és AG-GFP-4C sejtcsoportokon belül differenciált, nyúlványos sejteket tartalmazó 

és teljesen differenciálatlannak tűnő sejtgócokat találtunk (32. ábra). GFP-4C-eredetű 

asztrocitákat 60 napos túlélést követően is detektáltunk a mintákban. 

67

A Hoechst / GFP B 

D60 

A hagymahéjszerűen rétegzett gócokon belül jobbára a külső héjakon észleltünk GFP- 

pozitivitást és – részben gazda-, részben implantátum-eredetű - asztrocitákat (33. ábra). 

32. ábra A-B: Proliferáló, hagymahéj-szerkezetű gócok a sérült, majd sejtekkel újra benépesített területen 

hosszú túlélési idő (60 nap) mellett. Fluoreszcens mikroszkópia. (Kék: Hoechst magfestés, zöld: GFP 

fluoreszcencia, vörös: GFAP immunpozitivitás, egymásra vetített képek) Mérce: A: 50 m, B: 40 m. 

Felmerült a lehetősége annak, hogy a beültetett előindukált őssejtek a gócok közepén 

fluoreszcenciájukat elveszítve gyorsan szaporodó csoportokat alkottak, illetve, hogy az 

őssejtek által létesített kölcsönhatások és az általuk termelt szolubilis faktorok a 

befogadó szervezet sejtjei közül egyes sejteket gyors proliferációra késztettek. 

A retinsavval előindukált GFP-4C sejtek “visszatenyésztése” a befogadó agyból 

Hosszú (2 hónapos) túlélés után a modellállatok agyából (n=2) a retinsavval előindukált 

GFP-4C sejteket izoláltuk és újra jellemeztük. Az előindukált sejtekből származó RA- 

GFP-RC klón az anyaklónhoz képest gyorsabban osztódott. A sejtek alakja 

megváltozott; szorosan illeszkedő, köbös epithél alakú, gyakran kettős/többes magvú 

sejtekké váltak (34/ A ábra), GFP-pozitivitásuk csökkent. Retinsavas indukció hatására 

a sejtek nem aggregáltak és a 7. napra mindössze 1-2%-uk differenciálódott neuronná. 

68 

GFP 

A Hoechst / GFP / GFAP B 

Hoechst / GFP 

D60 

31. ábra A: Egyedi, nyúlványos, 

differenciált fenotípusú AG- 

GFP-4C sejtek (zöld). B: 

Differenciálatlan AG-GFP-4C 

sejtgóc. D60: 60 napos túlélés. 

Fluoreszcens mikroszkópos 

képek. (Kék: Hoechst magfestés) 

A: egymásra vetített kettős 

fluoreszcens kép. Mérce: 20 m.

(34/ B ábra). Tehát a retinsavval előindukált GFP-4C sejtekből a befogadó 

környezetben szelektálódtak az anyaklónhoz képest megváltozott sejtféleségek. 

A 

33. ábra A: A hosszú (2 hónapos) intracerebrális túlélést követően agyból „visszatenyésztett” RA-GFP- 

4C sejtek (RA-GFP-RC) fenotípusa megváltozott. Kettős/többes magvú sejtek a tenyészetben gyakran 

előfordultak (sötétkék nyilak). Fáziskontraszt felvétel egy indukálatlan RA-GFP-RC tenyészetről. B: 

Retinsavas indukció hatására az indukció 7. napjára igen alacsony számban képeztek idegsejteket (barna: 

III-tubulin) a GFP-4C sejtvonalakhoz képest. RA0-2: 48 órás retinsavas kezelés a kísérlet 0.-2. napján, 

fix.: fixálás időpontja (nap). Fénymikroszkópos felvétel. Mérce: 20 m 

Összefoglalva megállapítható, hogy az előindukált GFP-4C sejtek az agy szöveti 

környezetében asztrocita irányban tudtak differenciálódni, azonban idegsejtté nem 

alakultak. Az alkalmazott előindukciós eljárások nem javították a GFP-4C sejtek 

agyszöveti integrációját. További in vitro indukciós eljárások kidolgozása szükséges 

ahhoz, hogy a felnőtt agyba idegsejt-pótlásra alkalmas sejtalakokat juttathassunk. A 

hosszú túlélési idő után mindkét előindukált sejt esetén képződtek szórványosan 

tumor-jellegű struktúrák. A beültetett sejtek in loco sajátság-változásai az 

őssejtterápia egyik legfontosabb veszélyére, a tumorképződés lehetőségére hívják fel a 

figyelmet. 

69 

B 

RA0-2, fix. 7 

III-tubulin

III. Változó oxigén-ellátottság hatásai az NE-4C sejtekre 

Mivel az indukálatlan vagy in vitro előindukált GFP-4C idegi őssejtek beültetésével 

nem értünk el szöveti integrációt, a befogadó környezetet próbáltuk olyan irányba 

befolyásolni, hogy az kedvező hatást gyakoroljon a beültetett őssejtekre. 

Az oxigéntenzió változása alapjaiban befolyásolja a sejtek túlélését, szaporodását és 

elköteleződési folyamatait is. Vizsgálataimban a környezet oxigén tenziójának 

változtatásaival próbáltam befolyásolni -in vitro és in vivo- az idegi őssejtek sorsát. 

III.1 Az NE-4C őssejtek „viselkedése” hipoxiás környezetben 

In vitro modellkísérleteket folytattam hipoxiás kamra segítségével. A hipoxiás 

kamrába 1% O2, 5% CO2, 94% N2-t tartalmazó gázkeveréket juttattam. A kamrában, az 

alacsony (1% tf) oxigénkoncentrációtól eltekintve, a GFP-4C sejtek az előzőekben már 

bemutatott feltételek mellett nőttek. 

Az őssejteket indukálatlan állapotban és a retinsavas indukció különböző stádiumaiban 

(proliferáló progenitorok, idegi prekurzorok, fejlődő neuronok időszakai) helyeztem a 

hipoxiás kamrába 6, 12, vagy 48 órára. 

A tenyészetek kiültetésének napját 0. napként jelöltem. A retinsavas kezelést (mindig a 

0.-2. napig tartott) RA0-2-vel jelöltem. A tenyészetek hipoxiás kezelésének 

idejét/időtartamát H-val jelöltem, és a 0. naphoz viszonyítva adtam meg (pl. H6, H6-8). 

A tenyészetek fixálásának idejét szintén a 0. naphoz viszonyítva adtam meg (pl. fix. 6). 

A különböző differenciációs állapotban különböző időtartamú hipoxiás kezelésen átesett 

tenyészetek életképességét, sejtproliferációját, apoptózis-arányát, neuronképzését és 

génexpressziós változásait a normoxiás környezetben tartott kontroll tenyészetekéhez 

hasonlítottam. Megvizsgáltam a tenyészetekben a HIF-1 jelenlétét is. 

48 órás hipoxiás kezelést követően mind az indukálatlan, mind az indukált 

tenyészetekben jelentősen fokozódott a HIF-1 immunpozitivitás a normoxiás 

kontrollhoz képest (35. ábra). A HIF-1 -változás tehát alkalmas volt arra, hogy a 

hipoxiás kezelés „megtörténtét” jelezze. 

70

A 

Nox 

Hipox 

HIF-1 

34. ábra 48 órás hipoxiás kezelés (Hipox) hatására a GFP-4C sejttenyészetekben a normoxiás (Nox) 

kontrollhoz képest fokozott HIF-1 immunpozitivitás jelent meg. A, B: Indukálatlan vagy a retinsavasan 

indukált normoxiás tenyészetek HIF-1 festődése (kontroll). C, D: Parallel hipoxiás tenyészetek HIF- 

festődése. Fluoreszcens mikroszkópos képek. HIF-1 immunpozitivitás: vörös. Mérce: 40 m. A képeken 

a retinsavas kezelés (RA), hipoxia (H) és fixálás (fix.) időpontja/időtartama napokban van feltüntetve. 

A sejtek életképességét AlamarBlue oxidoredukciós vizsgálat segítségével határoztam 

meg. Míg a különböző indukciós fázisban 6-12 órás hipoxiával kezelt tenyészetek 

életképessége a normoxiás eredményektől szignifikánsan nem tért el, a 48 órás hipoxiás 

kezelés jelentékeny változásokat okozott az elköteleződő tenyészetek esetében. A korai 

indukciós fázis (0-2. nap) sejtjeinek életképessége szignifikánsan megnőtt, míg az idegi 

fejlődésben „elkötelezettebb” (2-4. nap, 4-6. nap, 6-8. nap) sejtek életképessége 

szignifikánsan lecsökkent a hipoxiás kezelés hatására (36/ A ábra). A nem indukált 

őssejtek viabilitására ezzel ellentétben a hipoxia nem gyakorolt hatást. 

RA 

C D 

RA , H0-2 

A sejtproliferációban bekövetkező változásokat [ 3 H]-timidin beépülés mérésével 

vizsgáltam 48 órás hipoxiát követően. A beépített radioaktív timidin fehérjetartalomra 

normalizált [DPM/fehérje] értékei azt mutatták, hogy az indukálatlan őssejtek és az 

indukció korai stádiumaiban lévő tenyészetek (2. nap, 4. nap) hipoxiás és normoxiás 

körülmények között azonos mértékű sejtproliferációt mutatnak. Az idegi fejlődésben 

„elkötelezettebb” sejteket tartalmazó tenyészetekben (6. nap, 8. nap) azonban a hipoxia 

a proliferációs rátát szignifikánsan csökkentette a normoxiás társtenyészetekhez képest 

(36/ B ábra). A neuronális fejlődés retinsavas indukciója során a sejtproliferáció az 

idegsejt-érés előrehaladtával normoxiás körülmények mellett is csökken. A hipoxia a 

71 

B 

RA 0-2 fix. 6 

RA 0-2, H 4-6, fix. 6

sejtproliferáció mértékét azonban a normoxiás kontrollhoz képest is jelentősen 

csökkentette. 

A tenyészetekben a sejthalál mértékét TUNEL-reakció segítségével becsültem meg. 

Alacsony oxigén tenzió következtében mind a retinsavas indukción átesett, mind a nem- 

indukált GFP-4C tenyészetek apoptózis-(nekrózis) aránya jelentősen nőtt. A TUNEL- 

pozitív sejtek aránya legszembeszökőbben a retinsavas indukció első két napján, az 

idegi elköteleződés elején nőtt meg a hipoxiás kezelés hatására (36/ C ábra). 

Az életképesség és sejtproliferáció vizsgálatai azt mutatták, hogy a GFP-4C idegi 

őssejtek és a belőlük differenciálódó utódsejtek – differenciációs állapotuktól függően - 

eltérően reagálnak az alacsony oxigén-tenzióra. Míg az elkötelezetlen és a fejlődés korai 

stádiumában lévő sejtek életképességét és szaporodását a hipoxia nem csökkentette, az 

idegi fejlődés előrehaladottabb stádiumaiban 48 órás hipoxiás kezelés mindkét 

sejtfunkcióban mérhető csökkenést okozott. A hipoxiás kezelés az apoptotikus 

sejtalakok jelenlétét növelte a tenyészetekben. 

35. ábra A GFP-4C sejtek „viselkedése” hipoxiás kezelést követően 

A: A tenyészetek életképessége a normoxiás kontrolltenyészetek százalékában (100%: fekete vonal) 48 

órás hipoxiát követően. A számítások 5 független kísérlet során nyert 6-10 parallel minta adataiból 

történtek. Szaggatott fekete vonalak: normoxiás adatok szórásátlagai. 

B: Normoxiás tenyészetek és különböző idegi indukciós stádiumban (0-2., 2-4., 4-6., 6-8. nap) 48 órás 

hipoxiával kezelt tenyészetek [ 3 H]-timidin inkorporációjának [DPM/ g fehérje] összehasonlítása (n=4). 

Normoxiás minták: �, hipoxiás minták: �. 

C: TUNEL-pozitív apoptotikus-(nekrotikus) sejtek aránya a tenyészetekben 48 órás hipoxiás kezelést 

követően indukálatlan, az indukció 2. és 8. napján lévő tenyészetekben. 40 látótérből történt sejtszámlálás 

minden kezelési csoportban. Normoxiás minták: �, hipoxiás minták: �. 

RAØ: indukálatlan tenyészetek, RA0-2: a kiültetést követően a 0-2. napon retinsavval indukált 

tenyészetek. Átlagok és szórások az ábrákon feltüntetve. Statisztika: A, B: ANOVA, C: Student T-teszt, 

*: p

TUNEL-pozitív sejtek aránya [%] 

A 

B 140 RA 

C 

Relatív életképesség [%] 

DPM/fehérje arány 

120 

100 

80 

60 

40 

20 

0 

120 

100 

80 

60 

40 

20 

0 

% 

140 

120 

100 

80 

60 

40 

20 

0 

RA RA0-2 

** 

0-2 0-2 2-4 4-6 6-8 

Hipoxiás kezelés ideje [napok] 

0-2 0-2 2-4 4-6 6-8 


73 

* ** 

** 

RA0-2 

* 

* ** 

RA RA0-2 

** 

** * 

0-2 0-2 6-8 


**

A következőkben azt vizsgáltuk, hogy befolyásolja-e az alacsony oxigén-tenzió a 

neuron-fenotípus kialakulását, és ha igen, az idegsejt-fejlődés melyik stádiuma a 

legérzékenyebb a hipoxiára. A hipoxia idegi elköteleződésre és az idegi prekurzorok és 

neuronok túlélésére kifejtett hatását 6, 12 és 48 órás hipoxiás kezelések mellett 

tanulmányoztam. Az érett idegsejteket III-tubulin-festés után morfológiai kritériumok 

alapján, illetve NeuN-immuncitokémia segítségével mutattam ki az érett idegsejteket 

tartalmazó 6.– 8. napos, differenciált tenyészetekben. Az elkötelezetlen tenyészeteken 

alkalmazott hipoxiás kezelés után, a 8. napon megközelítőleg ugyanannyi neuront 

találtunk, mint a normoxiás kontrollmintákban, tehát az őssejt stádiumban végrehajtott 

hipoxia nem gyakorolt számottevő hatást a tenyészetekben később spontán, retinsavas 

indukció nélkül kifejlődő idegsejtek mennyiségére (az összes sejtnek

A Hoechst / III-tubulin 

B 

Normoxia 

Hipoxia 

C RA0-2 

NeuN pozitív sejtek aránya [%] 

III tubulin pozitív sejtek aránya [%] 

120 

100 

RA0-2, D fix. 6 

RA RA0-2 

200 

180 

160 

140 

120 

100 

36. ábra A, B: A retinsavas indukció 6. napján alkalmazott 12 órás hipoxiás kezelés a neuronszám 

jelentős csökkenését okozta a tenyészetekben. Az összes sejtmag (DAPI, kék) és a III-tubulin neuronok 

(vörös) normoxiás (A) és hipoxiával kezelt (B) tenyészetekben. Fluoreszcens mikroszkópos képek. 

Mérce: 30 m. C: Az idegsejtek aránya [%] a 8. indukciós napon (D8) 6 órás hipoxiával kezelt 

tenyészetekben a normoxiás kontroll (100%: fekete vonal) százalékában. Szaggatott fekete vonalak: 

normoxiás minták szórása. D: A NeuN-pozitív idegsejtek aránya [%] a 8. indukciós napon különböző 

indukciós fázisokban (0-2, 2-4, 4-6, 6-8 napon) alkalmazott 48 órás hipoxiás kezelést követően a 

normoxiás minták százalékában. 100% (fekete vonal): normoxiás párhuzamos tenyészetek neuronaránya. 

Szaggatott fekete vonalak: normoxiás minták szórása. C, D: minden kísérleti csoport 10-10 látóteréből 

számolt adatok. Statisztika: ANOVA, **: p

A nanog őssejt-gén expressziója a hipoxiás kezelés hatására nem változott, a sox2 

őssejt-specifikus gén kifejeződése viszont az összes hipoxiás mintában megnőtt a 

normoxiás kontrollmintákhoz képest (38. ábra). 

HPRT 

nanog 

B 

A 

HPRT 

sox2 

37. ábra A nanog (A) és sox2 (B) őssejtgének expressziója indukálatlan (RAØ; kiültetés 2. napján) és 

retinsav-indukált (RA0-2; az indukció 8. napján), normoxiás (N) és hipoxiával kezelt (H) tenyészetekben. 

HPRT: nukleinsav mennyiség kontrollja. 

A proneurális, neuron- és glia-specifikus gének kifejeződését különböző időpontokban 

végzett hipoxiás kezelést követően, az indukció 8. napján lévő, érett sejteket tartalmazó 

tenyészetekben vizsgáltam meg. 

A neurogenin2 mRNS mennyisége a normoxiás kultúrákban az idegi indukció 

különböző időszakaiban eltérő; az aggregációs fázisban (az indukció 2. napja) jelenik 

meg, a fő neurogén fázisban (3-5. nap) akkumulálódik, és az idegi érés időszaka alatt (6. 

naptól) szintje csökken. 

N0-2 H0-2 N6-8 H6-8 

RA 

RA RA0-2 

RA0-2 

H0-2 H0-2 H2-4 H4-6 H6-8 N0-8 

A proneurális neurogenin2 (ngn2) és neuron-specifikus math2 gén expressziója hipoxiás 

kezelés hatására csökkent. Az elkötelezett idegi prekurzorok időszakában (a 2-4. vagy 

4-6. napon) hipoxiával kezelt tenyészetek ngn2 génkifejeződése szignifikánsan 

alacsonyabb volt, mint a normoxiás kontroll kultúráké. A neuron-specifikus math2 gén 

expressziója a neurogenezis kezdetén (2-4. nap) alkalmazott hipoxia esetén csökkent, 

míg az idegsejtképzés idején (a 4-6. és 6-8. napon) alkalmazott hipoxiás kezelés esetén 

szinte teljesen megszűnt a tenyészetekben (39. ábra). 

A blbp korai gliális gén expressziója a különböző indukciós időszakokban hipoxián 

átesett tenyészetekben a kontrollhoz képest nem változott. A GFAP gliális gén 

76

expressziója a vizsgált időszakban sem a normoxiás, sem a hipoxiás kultúrákban nem 

indult meg (39. ábra). 

A 

HPRT 

ngn2 

RA 

N0-2 H0-2 N2-4 H2-4 N4-6 H4-6 

B RA 

RA0-2 

HPRT 

math2 

blbp 

GFAP 

38. ábra Az elkötelezett idegi prekurzorok időszakában (2-4., 4-6. nap) alkalmazott hipoxiás kezelés (H) 

a proneurális ngn2 gén expresszióját csökkentette a normoxiás körülményekhez képest (N) (A). Az 

idegsejtképzés időszakában (4-6., 6-8. nap) alkalmazott hipoxiás kezelés a neuron-specifikus math2 gén 

kifejeződését igen jelentősen csökkentette (B). A korai gliális gén, blbp expressziója nem változott a 

tenyészetekben hypoxia hatására, míg az asztrogliára jellemző GFAP a vizsgált időszak alatt nem jelent 

meg a kultúrákban (B). Teljes RNS minták gyűjtése a hipoxiát követően (A) és az indukció 8. napján (B) 

történt. HPRT: nukleinsav mennyiség kontrollja. RAØ: indukálatlan, RA0-2: retinsav-indukált 

tenyészetek. 

A hipoxiás kezelés tehát az őssejt-gének kifejeződésében nem okozott csökkenést, míg a 

proneurális és neurális gének expressziójának csökkenéséhez vezetett. A korai és érett 

gliális génkifejeződés nem változott a normoxiás mintákhoz képest. 

Vizsgálataink alapján, az alacsony oxigéntenzió lényeges változásokhoz vezetett az 

őssejtek in vitro viselkedésében. Míg az elkötelezetlen őssejt-stádiumban nem volt 

különbség a hipoxiás kezelésen átesett és a normoxiás körülmények között lévő 

őssejtek életképessége és sejtproliferációs rátája között, az idegi sejtfejlődés 

előrehaladottabb stádiumaiban (4-6., 6-8. indukciós napokon) alkalmazott 48 órás 

hipoxiás kezelés mindkét sejtfunkcióban jelentős csökkenést okozott. 

Különböző elkötelezettségű tenyészetek idegsejt-képzése hipoxiás kezelés hatására 

eltérően változott. Az őssejt-tenyészetek spontán differenciációs képességére az 

alacsony O2-tenzió nem gyakorolt hatást. Az elköteleződés útjára lépett (indukálódó) 

tenyészetekben azonban az (elköteleződés korai vagy késői szakában) alkalmazott 

77 

RA0-2 

H0-2 H0-2 H2-4 H4-6 H6-8 N0-8 

H0-2 H0-2 H2-4 H4-6 H6-8 N0-8

hipoxia csökkentette a neuronszámot a normoxiás kontrollhoz képest. Ennek 

hátterében a proneurális és neurális gének expressziójának hipoxia okozta 

csökkenését is bizonyítottuk. 

A hipoxia, tehát, az in vitro idegsejt-fejlődést gátolja és a differenciálatlan 

ős/progenitor-sejtállapot fennmaradásának kedvez. 

III.2 Az NE-4C őssejtek intracerebralis „sorsa” magas in vivo oxigén tenzió mellett 

Miután az in vitro adatok megmutatták, hogy az alacsony oxigén tenzió az idegi 

őssejtek idegsejt irányú differenciálódását gátolja, a felnőtt egéragyba beültetett őssejtek 

szöveti integrációját az oxigén tenzió növelésével kívántam segíteni. 

Ennek kivitelezését hiperbárikus oxigénterápia alkalmazásával oldottuk meg. A 

kísérletekhez szükséges berendezést és szakmai segítséget Dr. Gőbl Anna és 

munkatársai biztosították a budapesti Baromedical Hiperbár Centrumban. 

A kísérletekbe bevont, felnőtt, NMRI egereket a táblázatban feltüntetett kísérleti 

csoportokba osztottuk (13. táblázat). 

13. táblázat A kísérletek során felhasznált állatok száma és 

kísérleti csoportjaik 

78 

Kísérleti állatok száma 

Műtéti beavatkozás Normoxia HBO 

Fagyasztásos agykérgi lézió 14 15 

Sejtbeültetés 31* 6 

Lézió+beültetés 8 16 

*ebben a csoportban felhasználtam a korábbi normoxiás 

körülmények között végzett sejtbeültetési eredmények adatait 

Az agykérgi fagyasztásos léziót és sejtimplantációt a korábbi kísérletekkel megegyező 

módon végeztük. (A lézió koordinátái: Br -0.7 mm, L 2.3 mm, az implantáció helye: Br 

-0.1 mm, L 3.2 mm, V 1.4 mm) A fagyasztásos lézió napját 0. napként jelöltem (D0). 

Az állatokat a sejtimplantáció (D7) után 7 alkalommal (D7-D13) napi 90 perces 

hiperbár oxigén terápiában (2.5 ATA, közel 100% O2) részesítettem.

III.2.1 Az implantált állatok viselkedésvizsgálata 

Az agykérgi sérülés és sejtbeültetés után a beavatkozásokat követő 1-4-7-14-30-60. 

napokon megvizsgáltuk, hogy jelentkeznek-e változások az állatok viselkedésében. 

Mivel a lézió és a beültetés minden esetben csak a jobb oldali agykérget érintette, 

elsősorban azt vizsgáltuk, hogy a jobb és bal oldali izomerőben és 

mozgáskoordinációban mutatkozik-e eltérés. A bilaterális aszimmetria-vizsgálat 

(„sticky tape” teszt) során az állatok jobb vagy bal hátsó végtagjára ragadt tapasz 

eltávolításának idejét mértük. A mellső végtagi aszimmetria teszt során az állatokat 

átlátszó hengerbe helyeztük, és a henger falára való felkapaszkodás közben figyeltük 

mozgásukat. A „tight rope” teszt során pedig az állatokat mellső végtagjaikkal egy 

kötélre helyeztük és kötélre való sikeres felkapaszkodásukat, az oldalsó 

felfüggesztéshez történő kimászásukat (vagy kötélről való leesésüket) értékeltük. 

Az agykérgi fagyasztásos sértés csak átmeneti neurológiai eltéréseket eredményezett a 

kísérleti állatokban. A sérült egerek a bilaterális aszimmetria teszt során szignifikánsan, 

a mellső végtagi aszimmetria teszt és „tight rope” teszt során tendenciájában rosszabb 

teljesítményt értek el a kontroll állatokhoz képest az első, léziót követő napon. A 

különbségek 3 napon belül teljesen megszűntek. Az implantált állatok hiperbárikus 

oxigénkezelését követően szignifikánsan jobb teljesítményt nyújtottak a bilaterális 

aszimmetria tesztben az 5. és 14. sejtbeültetés utáni vizsgálati napon (107±48 sec, 

64±29 sec) a beültetésben részesült, de HBO-val nem kezelt kontrollhoz képest 

(194±55 sec, 189±63 sec). A későbbi időpontokban (a 23. és 53. posztimplantációs 

napon, vagyis 17 és 47 nappal HBO-kezelés befejezését követően) végzett 

viselkedéstesztek szignifikáns eltérést nem tártak fel a kísérleti csoportok között. A 

sértett agykérgű, sejtbeültetésben nem részesült állatok HBO-val kezelt és nem kezelt 

csoportjai között eltérést nem találtunk. Az eltérések értékeléséhez egy- és 

többszempontos, valamint ismételt méréses variancia-analízist és poszt-hoc tesztet 

használtunk. 

III.2.2 A különböző kezeléseken átesett állatok agyának hisztológiai vizsgálata 

2 hetes, 1 és 2 hónapos túlélést követően vizsgáltam meg a GFP-4C sejtek túlélését, 

vándorlását, differenciálódását a módosított agyi környezetben hisztológiai, 

immuncitokémiai módszerekkel tanulmányoztam. 

79

Elsőként megvizsgáltam, hogy az egyes kísérleti csoportokban milyen gyakorisággal 

fordulnak elő élő implantált sejteket hordozó állatok különböző posztimplantációs 

időszakokban. A léziót és sejtbeültetést követő HBOT mellett rövid túlélés esetén az 

állatok 100%-ában találtunk élő GFP-4C sejtet, míg HBOT nélkül ez az arány ~64% 

volt. A HBO-val kezelt állatcsoportban hosszú túlélés mellett is nagyobb arányban 

találtunk élő GFP-4C sejteket, mint a kontroll állatok agyában (~88 vs. ~71 %). 

Ugyanakkor a lézió nélkül sejtimplantációban részesített állatokban a GFP-4C sejtek 

túlélése erősen korlátozott volt. Hiperbárikus terápia mellett a rövidtávú túlélési arány 

javult (~24%-ről ~66%-ra), de hosszútávon a GFP-4C sejtek nem éltek túl az intakt 

befogadó állatok agykérgében (14. táblázat). 

14. táblázat Élő GFP-4C sejteket hordozó állatok százalékos aránya a fagyasztásos 

beavatkozáson, sejtimplantáción és hiperbárikus terápián átesett, illetve kontroll befogadó 

állatok között 

Élő GFP-4C sejteket hordozó állatok százalékos aránya 

Sérült agykérgű Intakt agykérgű 

Túlélési idő HBOT HBOT 

D14-29 63.6% (22/14)* 100% (8/8) 23,8% (21/5)* 66% (3/2) 

D30-60 70.6% (17/12)* 87,5% (8/7) 0% (10/0)* 0% (3/0) 

*ezekben a csoportokban felhasználtam a korábbi normoxiás körülmények között végzett 

sejtbeültetési eredmények adatait is. Zárójelben: összes kezelt állat/élő beültetett sejtet hordozó 

állat az adott napon 

Ezt követően az implantált sejtek lokalizációját, térfogatát, elköteleződését vizsgáltam. 

Hideglézióval sértett, majd hiperbárikus terápiával kezelt állatok többségében (85%) az 

agykéregbe beültetett GFP-4C sejtek túlélték az implantációt követő 2 hetet. Míg a 

beültetett sejtek nagy része az implantáció helye, azaz a lézió széle mentén maradt, 

néhány egyedi GFP-4C sejtet a striatum, az oldalkamrák és a corpus callosum területén 

is találtunk. A nekrotikus magrégió azonban nem tartalmazott élő beültetett sejteket. 

Szemben az intakt agyba ültetett sejtekkel a lézionált kéregben – HBO kezelés mellett 

vagy anélkül - 2 hónapos túlélést követően is jelentős mennyiségű beültetett sejtet, 

illetve azok utódsejtjeit láttuk. 

Hosszú túlélési idő esetén (≥ D60) a GFP-4C sejtek benépesítették a poszt-nekrotikus 

régiót és a lézió határzónáját is, és egyes állatokban az oldalkamrában is megjelentek 

80

(40/ A ábra). A lézionált terület határán gliotikus zóna alakult ki, amelyben a befogadó 

agy asztrogliasejtjei mellett asztrogliává alakult GFP-4C sejtek is jelen voltak. A poszt- 

léziós hely és ép szövet határán a GFP-4C és befogadó agyi sejtek szoros kapcsolatot 

létesítettek (40/ B ábra). A GFP-4C sejtek az ép idegszöveti parenchymába nem 

vándoroltak be. 

A 

ctx 

D60 

39. ábra A: A poszt-léziós zónát és az azonos oldali oldalkamrát benépesítő GFP-4C sejtek 60 napi 

túlélés után, hiperbárikus oxigénnel kezelt modellállat agyában. Zöld: GFP-fluoreszcencia. Fehér 

pontozott jelölés: az agyban túlélő GFP-4C sejtcsoportok. Ctx: agykéreg, vl: oldalkamra, str: striatum. 

B: A beültetett GFP-4C sejtek (zöld) és a befogadó NSE (neuron specifikus enoláz, vörös) pozitív 

idegsejtjei egymás szoros közelségében. Fluoreszcens mikroszkópos képek. Mérce: A: 500 m, B: 30 

m. 

A GFP-4C sejtek által elfoglalt intracerebrális térfogat az első sejtbeültetést követő 

időszakban (D7-D21) nőtt. Az hidegléziót elszenvedett, de sejtbeültetésben nem 

részesült állatokban a gazdasejtek a beültetett sejtekhez hasonlóan a lézió széli 

zónájában és a poszt-léziós területen nagy számban gyülekeztek. A jelenséget az igen 

sűrű sejtmag-jelölés (Hoechst-pozitivitás) jól felismerhetővé tette (41/ A, B ábra). A 

hiperbárikus oxigénkezelés hatására a sérülést benépesítő gazdasejtek térfogata a 

kezelést közvetlenül követő időszakban (D14) szignifikánsan kisebb volt, mint a kezelés 

nélküli csoportban. A kezelés végét követő későbbi időpontokban (D30-) ez a 

sejtakkumulációt gátló hatás már nem érvényesült (41/ C ábra). 

Ezzel szemben a hiperbárikus oxigénterápia a beültetett GFP-4C sejtek össztérfogatának 

növekedését hosszan meggátolta. A hiperbárikus kezelésen átesett állatokban a 

beültetett sejtek össztérfogatának növekedése a beültetést követő 2 héten belül megállt. 

A 60. kezelési napon a GFP-4C sejtek össztérfogata a HBO-kezelt csoportban 

szignifikánsan alacsonyabb volt (pD60=0,048; ANOVA), mint a HBO-terápiában nem 

részesült csoportban (15. táblázat). 

vl 

str 

GFP 

B 

81 

GFP / NSE

RA0-2, fix. 6 

D14 

B 

D14 

HBO 

HBO 

Hoechst 

C * 

Repopuláló sejtek 

össztérfogata [mm3] 

40. ábra A HBO-kezelés nélkül a lézió területén sűrű magfestés (kék, Hoechst) jelzi a gyülekező 

gazdasejteket sejtbeültetésben nem részesült állatokban (A). HBO-kezelés mellett a gazdasejtakkumuláció 

elenyésző mértékű (B). (14. kísérleti nap.) Mérce: 500 m. C: A 14. napon a sérülést 

benépesítő gazdasejtek össztérfogata szignifikánsan kisebb volt a HBO-kezelt (■), mint a kezeletlen (■) 

állatokban. A különbség a HBOT-kezeléstől számított későbbi időpontokban (D30, D60) megszűnt. D: A 

TUNEL-pozitív sejtek aránya a 14. napon alacsonyabb volt a HBO-kezelt egerek (■) agykérgi sérült 

területén, mint a HBO-kezelésben nem részesült kontrollcsoportban (■). A TUNEL-pozitív sejtek 

előfordulása az összes sejt között DNase I-kezelt pozitív kontroll (100%, fekete vonal) százalékában van 

megadva. Az átlagok és szórások 4-4 azonosan kezelt állat adataiból származnak, (*): p

A kisebb repopuláló saját- és beültetett sejttömeg adódhat a hiperbárikus terápia 

sejtproliferációt visszaszorító, vagy sejtpusztulást indukáló hatásából. A következő 

vizsgálatokban ezért a sejtproliferációt, illetve a sejthalál mértékét becsültük meg a 

mintákban. 

A sejtproliferáció mértékének meghatározása technikailag nehéz volt a sérült és 

sejtekkel benépesített terület nagy mikroszkópos háttere miatt. Az egységnyi, sejtek 

által lefedett területre eső mitózisszámot becsültük meg a sérült agykérgi területeken 

sejtbeültetésben nem részesült állatokban. A hiperbárikus terápiában részesült állatok 

agyában kevesebb (2.2±2.7 mitózis/area) mitotikus gazdasejt-alakot találtunk a léziós 

zónában, mint a kontroll állatokban (4.8±3.1)(Student T-teszt:* p

Mint azt korábbi tanulmányainkban láttuk, a beültetett és gazdasejtek 2 hónapos 

intracerebralis túlélési idő után benépesítették a poszt-léziós zónát. Ebben a HBO- 

kezelés változást nem okozott. Ezzel szemben a repopuláló sejtcsoportosulás sejtes 

összetételében, a sejtek elköteleződésében a hiperbárikus oxigénterápia mélyreható 

változásokhoz vezetett. 

Míg a sejtbeültetésben nem részesült állatokban HBO-kezelés nélkül a sérülést 

benépesítő gazdasejtek között sporadikusan megfigyelhetők voltak SSEA-1 

őssejtmarkert hordozó sejtek, HBO-kezelés mellett SSEA-1 pozitív sejtek nem voltak 

jelen ugyanezen a területen (43/ A, B ábra). Sejtbeültetésen átesett állatok agykérgében 

jelen lévő SSEA-1 pozitív sejtek nagy része GFP-4C-eredetű volt, és HBO-kezelés 

mellett és anélkül is megtalálhatók voltak a poszt-léziós zónában (43/ C ábra). 

Az adatok azt mutatják, hogy az oxigenálás a beültetett differenciálatlan, SSEA-1 pozitív 

sejtek túlélését nem akadályozza meg, de meggátolja az SSEA-1-pozitív ős-/ 

progenitorsejtek megjelenését a sérült területen. 

A léziós zóna körüli határterületen és a lézióban GFP-4C-eredetű és gazdasejt-eredetű 

asztrociták is megfigyelhetőek voltak egymás közvetlen közelében, HBO-kezeléstől 

függetlenül (44. ábra). 

Míg a GFP-4C sejtek idegi irányú differenciációs folyamatait a sérült agyi környezet 

nem támogatta, hiperbárikus oxigénterápia mellett a beültetett őssejtekből sporadikusan 

III -tubulin- and neuron specifikus enoláz (NSE) immunreaktív idegsejtek képződtek 

(45. ábra). Az idegsejtek többsége a graft és az agykérgi parenchyma között 

helyezkedett el. Ez arra utalhat, hogy az oxigenálás neuronképzés szempontjából 

permisszívvé teheti a környezetet, de a beültetett ős-/progenitorsejtek idegsejt-irányú 

differenciálódásához elengedhetetlenek a regenerálódó parenchymából származó 

faktorok is. 

Összefoglalva megállapítható, hogy a hiperbárikus oxigénterápia alkalmazása 

lényeges változásokat idéz elő mind az agyba bejuttatott, mind a gazda-eredetű sejtek 

viselkedésében. A HBOT csökkenti a sérülést benépesítő sejtek apoptózisát, 

visszafogja az endogén és exogén eredetű differenciálatlan sejtek akkumulációját, és 

megengedőbb környezetet teremt az idegi irányú elköteleződés folyamatai számára. 

84

A Hoechst A’ 

ctx ctx 

B B’ 

C 

ctx ctx 

ctx 

cc 

vl 

C’ C” 

42. ábra A 30. napon a sejtbeültetésben nem részesült állatokban (A-A”) SSEA-1 pozitív (fehér nyilak) 

differenciálatlan sejtek voltak jelen a lézionált területeken. HBO-terápiát követően SSEA-1 pozitív 

sejteket nem találtunk a parallel állatcsoportokban (B-B”). Sejtbeültetésben részesült állatokban (C-C”) 

SSEA-1 pozitív sejtek HBO-terápia mellett és anélkül is fellelhetők voltak a sértett területeken. Kék: 

DAPI, vörös: SSEA-1, ctx: agykéreg; cc: corpus callosum; vl: oldalkamra. Mérce: A, A‟, B, B‟: 60 m, 

C‟-C”: 30 m, A”, B”: 20 m, C: 500 m. 

43. ábra GFAP pozitív, asztocitává alakult GFP-4C sejt (fehér nyíl) a sérülés környéki zónában, nem 

GFP-4C eredetű asztrociták között, hiperbárikus oxigénkezelést követően, a 60. napon. Fluoreszcens 

mikroszkópos képek. A: GFP-fluoreszcencia, zöld. B: GFAP immuncitokémia, vörös. C: kettős, 

egymásra vetített kettős fluoreszcens kép. Mérce: 20 m. 

85 

SSEA-1 

A GFP B GFAP C 

GFP / GFAP 

D60 

A” 

B”

A 

D60 

GFP 

B III-tubulin E 

C 

GFP / III-tubulin 

44. ábra A-C: III-tubulin pozitív, idegsejtté alakult GFP-4C sejtek (fehér nyilak) a sérülés környéki 

zónában hiperbárikus oxigénkezelést követően (60. nap). A: GFP-fluoreszcencia, zöld. B: III-tubulin 

immuncitokémia, vörös. C: kettős fluoreszcens kép. Mérce: 40 m. 

D-F: NSE-pozitív, idegsejtté alakult GFP-4C sejtek (fehér nyilak) a striatum közelében hiperbárikus 

oxigénkezelést követően (60. nap). Fluoreszcens mikroszkópos képek. A: GFP-fluoreszcencia, zöld. B: 

NSE immuncitokémia, vörös. C: kettős fluoreszcens kép. Str: striatum. Mérce: 25 m. 

86 

D 

D60 

F 

str 

str 

str 

GFP 

NSE 

GFP / NSE

Megbeszélés 

Teoretikusan a széles fejlődési potenciállal rendelkező, idegsejteket és oligodendroglia 

sejteket is képezni tudó őssejtek sokféle központi idegrendszeri betegségben 

nyerhetnének felhasználást. Az agyba bejuttatott őssejtek alkalmasak lehetnek arra, 

hogy helyettesítsék az agy elpusztult sejttípusait, benépesítsék az elhalt területeket. 

Létfontosságú neurotrofikus faktorok szekréciójára, immunmodulációra, angiogenezis 

indukálására, a gyulladás befolyásolására is képesek (Qu és mtsai 2007, Mahmood és 

mtsai 2004, Chen és mtsai 2003, Aggarwal és Pittenger 2005). Jelenlétük az agyi 

környezetet jelentősen megváltoztathatja, optimális esetben kedvezőbbé alakíthatja a 

regenerációs folyamatok számára. Előzetesen genetikailag módosított őssejtek 

beültetésével egyes – extracelluláris térben aktív – enzimek végzetes hiánya 

mérsékelhető vagy kivédhető, vagy elődifferenciáltatott őssejtek bevitelével agyi 

neurotranszmitter-hiányok enyhíthetők. Számos központi idegrendszeri betegség 

modelljében végeztek már őssejt-beültetéses kísérleteket, sőt, néhány kórkép esetén 

humán sejtbeültetéses klinikai vizsgálatok is történtek (16. táblázat). 

Noha a betegség-modellekbe történő sejtbeültetések bíztató részeredményekkel jártak 

(az őssejtek egy részének idegsejtté alakulása, reinnerváció, javuló neurotranszmitter- 

szintek, esetenként funkcionális javulás), egyelőre az őssejtterápia egyetlen 

idegrendszeri kórkép esetén sem jutott abba a fázisba, hogy a klinikai 

gyakorlatban biztonsággal alkalmazható lenne. A laboratóriumi körülmények között 

jól jellemzett ős- és progenitorsejt-típusok viselkedése a komplex agyi környezetben 

egyelőre biztonsággal nem jósolható. Az idegsejtet képezni tudó sejtek implantációja 

komoly veszélyeket is hordoz. Idegszöveti integráció és funkcionális javulás helyett, a 

bevitt sejtek pusztulása gyulladásos folyamatokat indukálhat. Ennél is nagyobb veszély, 

hogy a differenciálatlan őssejtek kontrollálatlan növekedése folytán tumorok alakulnak, 

vagy szövetidegen heg-szerű szigetek képződnek. A sejtek elköteleződését meghatározó 

folyamatok összetevőinek alaposabb ismerete elengedhetetlen előfeltétele a jövőbeni 

sikeres sejtterápiáknak. 

16. táblázat (88. oldal) Sejtimplantációs vizsgálatok központi idegrendszeri kórállapotokban 

87

Betegség Kórélettani alapja Beültetett sejt/szövetblokk típusa A sejtterápia célja Hivatkozás 

Parkinson-kór 

Ischaemia-s stroke 

A nigrostriatalis dopaminerg 

neuronok puszulása 

Agyi érelzáródás 

Huntington-kór Huntingtin génmutáció 

következtében a striatum közepes, 

tüskés neuronjainak pusztulása 

Amyotrophia-s lateral 

sclerosis 

Demyelinizációs 

betegségek 

Agykérgi, agytörzsi, gerincvelői 

motoneuron-degeneráció 

Oligodendroglia myelin károsodás, 

idegi ingerületátvitel károsodása 

fötális középagyi graft 

mellékvesevelő graft dopaminerg transzmisszió [2] 

humán fötális neuron pótlása 

[3] 

embrionális őssejt [1], [4] 

fötális agyi szövetgraft, felnőtt idegi őssejt, 

köldökzsinórvér-őssejt, csontvelői stromasejt, 

neuroepitheliális őssejt 

fötális striatalis szövetgraft, embrionális 

őssejt, csontvelői őssejt, idegi progenitor sejt 

fötális motoneuron 

88 

idegsejt-pótlás, idegi hálózatok 

regenerációja 

idegsejt-pótlás, idegi hálózatok 

regenerációja 

köldökzsinórvér-őssejt [1], [5] 

GDNF-szekretáló idegi progenitor sejt és 

mesenchymális őssejt 

[6], [7] 

mesenchymális őssejt 

idegi őssejt 

motoneuronok helyettesítése, 

idegi hálózatok regenerációja 

[8] 

[9] 

hemopoetikus őssejt [10] 

immortalizált fötális gerincvelői progenitorsejt [11], [12] 

embrionális őssejt-eredetű motoneuron [12], [13] 

oligodendrocita prekurzor 

[14] 

felnőtt idegi őssejt remyelinizáció 

[15] 

Mucopolysaccharidosis-ok genetikailag módosított idegi őssejt 

[17], [18] 

Lizoszomális enzimműködési zavar enzimpótlás 

genetikailag módosított hemopoetikus őssejt [19], [20] 

Alzheimer-kór Béta-amiloid plakkok és 

neurofibrillumok megjelenésével 

járó neurodegeneratív betegség 

Gerincvelő-sérülés 

Agyi trauma 

Gerincvelői pályarendszerek 

megszakadása 

Agyi sérülés és másodlagos 

elváltozások következtében 

jelentkező sejtpusztulás 

genetikailag módosított, NGF-termelő sejt 

genetikailag módosított, acetil-kolint 

szekretáló fibroblaszt 

idegi őssejt, Schwann-sejt, autológ makrofág 

hemopoetikus és csontvelői őssejt, 

embrionális őssejtek, sejtes áthidalás 

('scaffold'), "olfactory ensheating cell" 

kolinerg transzmisszió 

helyreállítása, idegsejt-pótlás 

sejtpótlás, parakrin hatások, 

axonregeneráció segítése, 

immunmoduláció, folytonossági 

hiány megszüntetése 

[1] 

[1] 

[1] 

[1] 

[16] 

[21], [22] 

[23] 

[24], [25] 

növekedési faktor-termelő sejtes áthidalás [26] 

sejtes áthidalás (idegi őssejttel) 

[27] 

köldökzsinórvér-őssejt 

hemopoetikus és csontvelői őssejt 

parakrin hatások, sejtpótlás, 

folytonossági hiány 

megszüntetése 

[28] 

[29], [30] 

fötális idegi őssejt [31] 

[25]

16. táblázat Rövidítések: rev.: összefoglaló cikk, review, GDNF: glia sejtvonal eredetű neurotrófikus 

faktor, glial cell line-derived neurotrophic factor, NGF: idegnövekedési faktor, nerve growth factor 

Hivatkozások: [1] Lindvall és mtsai 2004 rev.; [2] Backlund és mtsai 1985; [3] Lindvall és mtsai 1989; 

[4] Björklund és mtsai 2002; [5] Garbuzova-Davis és mtsai 2008; [6] Suzuki és mtsai 2007; [7] Suzuki és 

mtsai 2008; [8] Zhao és mtsai 2007; [9] Corti és mtsai 2007; [10] Appel és mtsai 2008; [11] Roy és mtsai 

2004; [12] Goldman és Windrem 2006 rev.; [13] Li és mtsai 2005b; [14] Windrem és mtsai 2004; [15] 

Pluchino és mtsai 2003; [16] Pluchino és mtsai 2004 rev.; [17] Snyder és mtsai 1995; [18] Lacorazza és 

mtsai 1996; [19] Pastores 2008 rev.; [20] Cartier és Aubourg 2008; [21] Kordower és mtsai 1994; [22] 

Blesch és Tuszynski 2004 rev.; [23] Fisher és mtsai 1993 rev.; [24] Rossignol és mtsai 2007 rev.; [25] 

Samadikuchaksaraei 2007 rev.; [26] Lu és Tuszynski 2008 rev.; [27] Tate és mtsai 2002; [28] Lu és mtsai 

2002; [29] Lu és mtsai 2001; [30] Qu és mtsai 2008; [31] Gao és mtsai 2006 

Vizsgálataim során tanulmányoztam, hogy a befogadó agyi környezet módosításai 

és az őssejtek in vitro előzetes indukciója milyen hatással bír az idegi őssejtek 

intracerebrális sorsára, idegi irányú differenciálódására. 

Sejtbeültetéshez az NE-4C neuroektodermális őssejtvonalat és annak jelölt, agyon 

belül könnyen detektálható alklónjait (GFP-4C, PLAP-4C) használtam. A p53- 

deficiens, 9 napos egérembrió előagyhólyagjából származó NE-4C klón, egyetlen sejt 

feno- és genotípusosan azonos utódsejtjeit tartalmazó, neuroektodermális sejtvonal 

(Schlett és Madarász 1997, Schlett és mtsai 1997). A homogén sejt-preparátum előnye, 

hogy egy jól definiált sejt-stádiumból kindulva, megbízhatóan vizsgálható, hogy in vitro 

vagy in vivo, milyen irányba és milyen mértékben differenciálódnak a sejtek. 

Az NE-4C sejtek idegi elköteleződése többféle módon elindítható, és kiszámíthatóan, 

ismert „menetrend” szerint zajlik (Környei és mtsai 2005, Schlett és Madarász 1997, 

Schlett és mtsai 1997). A sejtek az in vitro differenciálódás bármely stádiumában 

implantálhatók, és ezzel út nyílik az adott agyterületi integrációra legalkalmasabb 

idegsejt-fejlődési állapot kiválasztására. 

Az NE-4C sejtvonal terápiás humán beavatkozásokra nem alkalmas: egér sejtek, 

amelyek p53-deficienciájuk révén immortalizáltak. A p53-hiány azonban nem 

akadályozza meg, hogy a sejtek kilépjenek a sejtciklusból és elkötelezett, 

posztmitotikus utódsejteket alakítsanak ki. A sejtvonal az in vitro idegi sejtfejlődés 

vizsgálatai mellett, alkalmasnak bizonyult modell-állatokon végzett implantációs 

kísérletek (Demeter és mtsai 2004, 2005, Ágoston és mtsai 2007) folytatására. 

89

Saját kísérleteim során in vitro és in vivo is vizsgáltam az idegi őssejtek kölcsönhatásait 

ép és kóros idegszöveti sejtekkel és tanulmányoztam a megváltozott oxigén-tenzióra 

adott válaszreakcióikat. Az NE-4C sejteket elkötelezetlen őssejt-állapotban és - 

előindukciót követően - elkötelezett idegi prekurzorsejtekként ültettük be különböző 

pathofiziológiás állapotú felnőtt modellállatok agyába. Megfigyeltük az őssejtek és 

utódsejtjek túlélését, differenciálódását, apoptózisát, integrációs képességét különböző 

túlélési időt követően. Emellett a sejtek agyban elfogalt méretét, szöveti invázióra való 

hajlamát, tumorsejtekkel való kölcsönhatásait is behatóan tanulmányoztuk, hogy az 

őssejtek esetleges tumorigén hatásáról adatot nyerjünk. 

A károsodott agyi környezet modellezésének egyik elterjedt módja az agyi ischaemia 

létrehozása agyi artériák tranziens vagy permanens leszorításával/elzárásával. Mivel az 

ischaemia-s stroke az egyik leggyakoribb halállal vagy hosszú távú életminőség- 

romlással járó humán kórállapot, molekuláris-biokémiai folyamatainak pontos 

megértését és a betegség gyógyítását modellkísérletek sokasága célozza meg. Az agyi 

artériák leszorítása, vagy filamentummal történő okklúziója patkány és gerbil 

modellekben jó hatásfokkal elvégezhető. 

Egerekben az érhálózat kis mérete és ellátási varianciája miatt azonban más modellek, 

többek között a hidegléziós (fagyasztásos) (Klatzo és mtsai 1958, Murakami és mtsai 

1999) vagy a fototrombotikus modell (Kim és mtsai 2000) alkalmazása terjedt el. A 

fagyasztásos lézió előnye az alacsony mortalitás, a jó reprodukálhatóság és a 

szabályozható méretű, felszíni sérülés, amelynek kiterjedése az agykéregre 

korlátozható. Ugyanakkor, a fagyasztásos lézió szövettani és (részben) biokémiai 

következményei hasonlóak az érelzáródás esetén tapasztaltakhoz. A vér-agy gát sérül, 

hipoperfúzió és hipoxia alakul ki, és mindezek következtében a helyi metabolizmus és 

az energia-ellátás zavart szenved, szabadgyök-okozta károsodások lépnek fel (Steinbach 

és mtsai 1999, Weinzierl és mtsai 2002, Plesnila és mtsai 2003, Zhuang és mtsai 1992). 

Pár órán belül, egy döntően nekrotikus magi régió és 1-2 napon belül egy részben 

károsodott, sok apoptotikus sejtet is tartalmazó „penumbra zóna” (késleltetett, 

másodlagos károsodás) alakul ki (Murakami és mtsai 1999, Steinbach és mtsai 1999). 

Munkáink során az egér-eredetű modell-sejtvonalunkat allogén módon, egér 

befogadóba ültettük be, így idegrendszeri sértésként a fagyasztásos modell 

alkalmazása mellett döntöttünk. A gazdaszövet immunszuppresszió nélküli, teljes 

90

eakcióját vizsgáltuk. A hideglézió számottevő perioperatív halálozással nem járt, és a 

viselkedés-tesztek alapján, a modellállatokban csak átmeneti, néhány nap alatt teljesen 

elmúló neurológiai tüneteket okozott. 

A károsodott agykérgi környezet a beültetett GFP-4C őssejtek túlélését megnyújtotta. 

Míg a beültetett idegi őssejtek az intakt agyból 6 héten belül eltűntek, a sértett agyban 8 

hétnél, azaz a vizsgálati időszaknál hosszabb túlélésre voltak képesek. A GFP-4C sejtek 

szaporodása a sértett agyi környezetben - a sejtaggregátum méretnövekedéséből 

számított érték alapján – lassabb volt, mint az indukálatlan tenyészetekben. A 

sejtnövekedés mértéke ugyanakkor, meghaladta a neuronális irányba differenciálódó 

sejtek in vitro szaporodásának ütemét. Az in vitro differenciálódás megindulását 

ugyanis az jelzi, hogy az indukált tenyészetek sejtjeinek átlagosan 40%-a megáll az 

osztódásban (Schlett és Madarász 1997). A lézió-közeli területre beültetett GFP-4C 

sejtek segítettek az elhalt terület benépesítésében, szórványosan asztrocitákat képeztek, 

de neuronná nem fejlődtek. A sejtek visszatenyésztését követő in vitro vizsgálatok 

tisztázták, hogy a sejtek klonális tulajdonságai nem változtak. Az ép és a lézionált 

agyban tapasztalt eltérő viselkedésüket a megváltozott környezeti feltételek 

magyarázhatják. A sértett agyi környezet, nem gátolja az elkötelezetlen sejtek 

osztódását és az asztroglia-képződést, de nem segíti, vagy éppenséggel gátolja a neuron- 

irányú elköteleződést. 

Saját eredményeink összhangban vannak azokkal az irodalomi adatokkal, amelyek 

szerint bizonyos szöveti károsodások megváltoztatják a központi idegrendszer endogén 

sejtképző folyamatait és az implantált sejtek „sorsát”. Különböző pathológiás 

folyamatok hatására a neurogén területeken fokozódhat/csökkenhet az endogén őssejtek 

szaporodása, és egyes agyterületeken megfigyelhető az endogén prekurzorok 

bevándorlása, érése, beépülése (1. táblázat). A Macklis és munkatársai által 1993-2000 

között kialakított sértési modell - amely gyulladás nélkül, apoptotikusan károsít 

meghatározott sejtrétegeket – segítette az endogén neurogenezist, prekurzor-migrációt, 

agykérgi régióspecifikus differenciációt (Magavi és mtsai 2000), és a beültetett 

progenitor sejtek letelepedését, differenciációját és integrációját is (Macklis 1993, 

Sheen és Macklis, 1995, Snyder és mtsai 1997, Shin és mtsai 2000, Fricker-Gates és 

mtsai 2002). 

91

Az endogén/beültetett sejt-eredetű neurogenezis mértékét alapvetően megszabja, hogy a 

befogadó környezet mennyire „permisszív”; azaz hogyan működik együtt a 

proliferáló/differenciálódó sejtekkel. Ez függ attól, hogy 

� milyen típusú sérülés érte (nekrotikus/apoptotikus elhalás) 

� a gyulladásos kaszkád beindult-e, milyen fokú a gyulladás 

� milyen fokú a gliózis, hegképződés 

� van-e nagy kiterjedésű, nehezen áthidalható szövethiány 

� milyen a neurotrofikus faktorok helyi koncentrációja 

� az őssejtek és leszármazottaik által elérhető-e a sérülés területe 

Ischaemia-s inzultust követően EGF és FGF-2 intraventrikuláris beadása fokozta az 

endogén progenitor-proliferációt és vándorlást, valamint a hippocampalis neurogenezist 

(Nakatomi és mtsai 2002). BDNF és neurotrofinok lokális adásával vagy vírus vektorral 

való génbejuttatás segítségével elért lokális termelésével, több károsodási modellben is 

részleges javulást értek el (Namiki és mtsai 2000, Grider és mtsai 2005). Az agyban 

indukált gyulladásos folyamatok endogén neurogenezist károsan befolyásoló hatásairól 

és a gyulladásgátlás ezt ellensúlyozó szerepéről is készültek tanulmányok (Ekdahl és 

mtsai 2003, Monje és mtsai 2003). A folyamatosan növekvő adatmennyiség ellnére, ma 

még távolról sem tisztázott, hogy egy-egy agyi régióban milyen növekedési, illetve 

gyulladást serkentő/gátló faktorok segítik vagy gátolják a lokális regeneratív 

folyamatokat, és messze nem ismertek azok a koncentráció-arányok, amelyek segíthetik 

az idegi őssejt-genezist, vagy lokális sejtdifferenciálódást. 

Az agykérgi fagyasztásos sértés alkalmazása a GFP-4C őssejtek túlélését lehetővé tette, 

azonban idegi irányú elköteleződésüket nem segítette. Ezért következő kísérleteinkben a 

GFP-4C őssejteket a beültetés előtt, in vitro, idegi differenciálódásra késztettük. A 

differenciálódást asztrocitákkal való együtt-tenyésztéssel vagy retinsavas kezeléssel 

indítottuk el. Az asztrocita ko-kultúrákban elköteleződő progenitor sejtek rövidtávon 

nagyobb arányban éltek túl az intakt agyban, mint a retinsavval előindukáltak. A 

jelenség magyarázatára további kísérletekkel kell meghatároznunk, hogy milyen 

asztrocita-eredetű faktorok segíthetik az őssejtek intracerebrális túlélését. 

Elvárásainkkal ellentétben, az előindukált, idegi prekurzorokban gazdag GFP-4C 

sejt-együttesből sem keletkezett jelentős számú idegsejt az agyi környezetben. Az 

92

idegsejt-prekurzorok valószínűleg elpusztultak a befogadó környezetben, és a sejtekből 

csupán asztrociták alakultak ki. Ugyanakkor, az idegszöveti irányba nem 

differenciálódó sejtek túléltek és szaporodtak. Hosszú túlélési idő mellett néhány 

esetben észleltünk nem invazívan terjeszkedő, de mérete alapján tumorosnak vélhető 

sejtaggregátumot a gazdaszöveten belül. A sejtek differenciáltsági fokának 

megváltoztatása tehát, önmagában, nem volt elégséges arra, hogy a felnőtt 

agyszövet nem permisszív sajátosságát „legyőzze”, a beültetett sejtek 

idegsejtképzését lehetővé tegye. Úgy tűnik, a sérült agyi mikrokörnyezetből hiányoznak 

azok a faktorok, amelyek lehetővé teszik (megindítják/fenntartják) az idegsejt-fejlődést. 

A hosszú (~2 hónap) intracerebrális túlélés során, egyes GFP-4C sejtek jelentős 

sejtbiológiai változást szenvedtek: az expandáló aggregátumokból izolált és újra- 

tenyésztett sejtek, in vitro is gyorsan szaporodó, morfológiailag megváltozott fenotípust 

mutattak. Ezek a tények az őssejt-terápia egyik legfontosabb veszélyére, a 

tumorigenezisre hívják fel a figyelmet. 

Tumorképződést sok laboratóriumban, különböző őssejtekkel végzett kísérlet kapcsán 

észleltek (Erdő és mtsai 2003, Riess és mtsai 2007, Amariglio és mtsai 2009). Ez a 

kockázat abból adódik, hogy az őssejtek széles fejlődési potenciállal bírnak, önmegújító 

képességgel rendelkeznek, korlátlanul szaporodhatnak, és hosszan fennmaradhatnak a 

szervezetben. Számos, a tumorsejtekhez hasonló tulajdonságuk van (Kopper és Hajdú 

2004), amely segíti a sejtek fennmaradását, szaporodását. Ilyen a fokozott telomeráz- 

aktivitás, a sejtciklus-szabályozás és mitózis-indukció néhány jellegzetessége, az 

apoptózis útvonal gátlása, és egyes jellegzetes, sejtproliferációt, szöveti elköteleződést 

szabályozó szignalizációs folyamatok (Notch, Wnt, Shh-jelátvitel). Az őssejtek 

viszonylag hosszú életideje alatt elszenvedett mutációk a fent említett mechanizmusok 

kisebb változásai útján tumorképződéshez vezethetnek (Preston és mtsai 2003). A 

tumorok bizonyos elképzelések szerint hibásan működő ős- vagy progenitorsejtekből 

származnak, és erre bizonyos vérképző rendszeri tumorok példával is szolgálnak 

(Kopper és Hajdú 2004). Központi idegrendszeri daganatokból sikerült önmegújító, 

CD133-pozitív, multipotens sejteket („tumor-őssejt”) izolálni, amelyek tenyészetben 

megfelelő körülmények között ideg- és gliasejtekre jellemző markereket is 

expresszáltak (Singh és mtsai 2003). Bizonyos típusú idegi őssejtek esetén 

megfigyelték, hogy érbe-juttatás vagy lokális beadás esetén képesek voltak tumorokhoz 

93

vándorolni, abban szétszóródtak. Az ilyen őssejtek terápiás anti-tumor gén-bevitelre 

lehetnek képesek (Aboody és mtsai 2000, Benedetti és mtsai 2000, Ehtesham és mtsai 

2002a,b). Ez is megerősíti, hogy - legalábbis bizonyos típusú - őssejtek könnyen lépnek 

kontaktusba tumorsejtekkel, tehát sejtfelszíni molekuláik, az általuk preferált ECM- és 

diffúzibilis faktorok nem állnak távol egymástól. 

Az őssejtek-tumorsejtek kapcsolatainak kérdései további kísérletekre indítottak; 

tanulmányozni kezdtük az NE-4C idegi őssejtek tumorsejtekkel való 

kölcsönhatásait. A sejtadhéziós eltérések és hasonlóságok jelezhetik, hogy hasonló 

idegszöveti áreákban várható-e a bejuttatott sejtek „megtelepedése”, túlélése, és egyben 

azt is megmutatja, hogy valóban használhatók-e egyes idegi őssejtek tumorok 

„célzására”, azaz antitumor hatóanyagok célbajuttatására. A humorális kölcsönhatások 

ugyanakkor megmutatják, hogy termelnek-e az ős/progenitor, illetve tumor sejtek 

egymás szaporodására / differenciálódására ható autokrin/parakrin faktorokat. 

Kiméra-aggregációs kísérleti eredményeink jelezték, hogy az NE-4C őssejtek csak 

bizonyos tumorsejtekkel képesek kontakt kapcsolatokat létesíteni. Az adatok 

egyértelműen jelezték, hogy egységes őssejt – tumorsejt adhéziós preferenciáról nem 

lehet beszélni. 

A szolubilis kölcsönhatások tanulmányozása fényt derített arra, hogy az NE-4C őssejtek 

bizonyos tumorsejtek (C6-glióma) proliferációját fokozó hatóanyagokat bocsátanak a 

folyadékkörnyezetbe. Bár nem minden vizsgált tumoros sejtvonal esetén tapasztaltuk az 

őssejtek tumor-szaporodást fokozó hatását, az eredmények alátámasztják azokat a 

félelmeket, amelyek az őssejt-beültetések tumor-képződést elősegítő hatásaira 

hívják fel a figyelmet. Ugyanakkor, az általunk vizsgált tumorsejtek egyike sem 

termelt olyan természetű vagy olyan mennyiségű faktort, amely az NE-4C őssejtek 

szaporodását befolyásolta volna. 

Miután az őssejtekkel való együtttenyésztés nem befolyásolta a GL261 glioblasztóma 

sejtek proliferációját, továbbá a két sejtféleség egymással jól keveredett, kísérletet 

tettünk GL261 glioblasztóma tumorok NE-4C őssejtekkel való „célzására”. 

Az NE-4C őssejtek az egéragyban előidézett GL261 tumorban és annak közvetlen 

közelében túléltek ugyan, de a tumorsejtek szaporodása sokszorosan meghaladta az 

őssejtek proliferációját. A tumor feltételezett kemotaktikus hatása nem segítette a 

94

tumortól távolabbra (500-1000 m) beültetett őssejtek célzott vándorlását, az agyi 

parenchymán való átjutását. Adataink azt mutatják, hogy 

csak nagyon meghatározott őssejt – tumorsejt „párok” esetén vethető fel az 

őssejttel való „tumor-célzás” gondolata, és 

ilyen esetben is kérdéses, hogy az ép agyszövet őssejtek migrációját gátló 

hatásait a tumor közelsége enyhíteni tudja-e. 

Közös tényező az őssejtek és tumorsejtek „viselkedésében”, hogy igen jól tűrik a 

hipoxiás környezetet. Hipoxiás (mikro)környezetű régiók léteznek a normálisan fejlődő 

embrióban, és az egészséges felnőtt szervezetben (pl. csontvelő) is. A központi 

idegrendszer és más szervek kórállapotaiban hipoxiás szövetterületek gyakran 

előfordulnak (agyi ischaemia, gyulladásos folyamatok, tumorok). A változó szöveti 

oxigén tenzió a hipoxia-indukált faktor (HIF) és egyéb molekuláris szignálok útján 

szabályozza az embrionális morfogenezist (szív- és érfejlődés, haemopoesis, placenta-, 

csont-, zsírfejlődés) és nemcsak engedi túlélni a környezetben jelenlévő őssejteket, de 

elköteleződésüket is szabályozza (Simon és Keith 2008). A tumoros folyamatokat 

kísérő hipoxia a hipoxia-indukált faktorok stabilizálódásán keresztül metabolikus 

alkalmazkodáshoz, érújdonképződéshez, és a sejtek proliferatív-differenciálódási útját 

befolyásoló szignálok megváltozásához vezet (Keith és Simon 2007). 

Eredményeink – más őssejtekről nyert irodalmi adatokkal egybehangzóan - igazolták, 

hogy az NE-4C idegi őssejtek jelentős sejtélettani változás (életképesség, 

sejtproliferáció, spontán differenciálódás terén) nélkül elviselik a hosszantartó (48 

óra), súlyos ([O2] = 1 %) hipoxiát. A hipoxiás környezet azonban jelentős sejtsors- 

módosító hatást gyakorolt az idegsejt fejlődés irányába elköteleződő sejtekre. A 

differenciálódásra indukált tenyészetekben az elkötelezettség szinte bármely fázisában 

alkalmazott hipoxiás kezelés szignifikánsan csökkentette neuronná fejlődő sejtek 

számát. A hipoxia szignifikánsan csökkentette a proneurális és neurális gének 

expresszióját. Eredményeink alapján tehát, a hipoxiás környezet a differenciálatlan 

őssejek működésében nem okoz zavart, míg az idegi elköteleződés fázisaiban lévő 

sejtek differenciációs folyamatait gátolja. 

95

Az in vitro eredmények alapján feltételeztük, hogy az agykérgi sérülés hipoxiás 

környezete – bár sokkal komplexebb rendszerben – hasonlóképpen megengedi az 

őssejtek szaporodását, túlélését, de károsítja a differenciációs folyamatokat és így, a 

neuronképzést. Ezért megvizsgáltuk, hogy a hipoxiás állapot (részleges) korrekciója 

hiperbárikus oxigénterápiás kezeléssel (HBOT) megváltoztatja-e az őssejtek 

agyszöveten belüli sorsát, idegszöveti elköteleződését, és befolyásolja-e a sérült szövet 

regenerációját. A hiperbárikus oxigénterápia önmagában neuroprotektív hatással is 

bírhat, hiszen kivédheti a hipoperfúzió következtében kialakuló súlyos hipoxiát, és ezzel 

megelőzheti, mérsékelheti a szekunder károsodás kialakulását. A hiperbárikus terápia 

előnyös hatásait különböző agyi károsodások modelljeiben számos cikk taglalja 

(Matchett és mtsai 2009 [review]). Jelen munkánk célja nem a hiperbárikus terápia agyi 

„lézióméret-csökkentő” hatásának felmérése volt, hanem a beültetett sejtek oxigén- 

érzékenységét kívántuk vizsgálni. 

Az általunk alkalmazott rövid - egy héten át naponta alkalmazott - HBO-kezelés 

figyelemre méltó változásokat okozott mind a beültetett őssejtek, mind a 

gazdaszövet sejtjeinek sorsában. 

A HBO-kezelés a sérülés területén a saját, repopuláló sejtek akkumulációját 

visszaszorította, a saját, SSEA-1 pozitív progenitorsejtek megjelenését 

megakadályozta. 

A HBO-kezelés a sérült területen mért apoptózist (a beültetett és gazdasejtek 

között) mérsékelte, az osztódó sejtalakok arányát csökkentette. 

Beültetett (GFP-4C) őssejt-eredetű idegsejteket csupán HBO-val kezelt állatokban 

találtunk. 

Várakozásainknak megfelelően tehát, a HBO-terápia az idegsejt-irányú 

differenciálódás folyamatai számára megengedő környezetet teremtett, az 

elköteleződő sejtek túlélését nem gátolta. 

Az a megfigyelés, hogy a hipoxiás agyban az elkötelezetlen sejtek növekedése 

nagyobb mértékű, mint a HBO-kezelt állatok agyában, bár fontos adatnak látszik, 

további, közvetlen igazolást igényel. Az intracerebrális sejtproliferáció mérése (pl. 

BrdU- vagy [ 3 H]-timidin beépülés meghatározásával) laboratóriumunk közvetlen, 

jelenlegi feladata. A hipoxiás környezet hatása magyarázatot adhat a sejtbeültetés 

96

következtében szórványosan megfigyelt tumorképződésre az előzetesen sértett 

agyakban. 

Ugyanakkor a HBOT sejtproliferációt feltételezhetően csökkentő hatása még nem 

jelenti a potenciális tumorigenezis kiküszöbölését, hiszen a fennmaradó őssejt-sajátságú 

sejtek nem pusztulnak el alkalmazásakor. 

A HBOT hatásainak felmérése a sértett, sejtbeültetésben részesített és kontroll 

állatcsoportokban, illetve a HBOT idegi sejtdifferenciálódást segítő hatásainak elemzése 

is további kísérleteket igényel. Tisztázásra vár, hogy hosszabb időtartamú, vagy más 

időszakban történő alkalmazás mellett, milyen mértékű idegsejt-képzésre késztethetők 

az implantált sejtek. A HBO-kezelés feltételezhető káros mellékhatásai azonban 

ugyancsak komoly vizsgálatokat igényelnek. Vannak adatok a HBOT in vitro és in vivo 

genotoxikus hatásáról (Rothfuss és mtsai 1999, Speit és mtsai 2000, 2002, Eken és 

mtsai 2005), továbbá arról, hogy a HBOT sem az agyi erek lipid peroxidációs profilját, 

sem az agyi ischaemia során létrejövő c-fos proto-onkogén indukcióját nem befolyásolja 

számottevően (Shabitz és mtsai 2004). A sejtekben jelentkező oxidatív károsodások 

mértékéről és a szervezet adaptív válaszreakcióiól egyelőre nem egybehangzóak és 

meglehetősen hiányosak az eredmények (Rothfuss és mtsai 1998, Speit és mtsai 2000, 

2002, Eken és mtsai 2005, Korkmaz és mtsai 2008). 

Tisztában vagyunk azzal, hogy a sejtbeültetések utáni sikeres idegszöveti integráció, az 

idegi hálózatalkotás az oxigén-ellátottság mellett igen sok élettani / bioelektomos 

tényezőtől függ. A differenciálódás és az idegszövetbe való végső beilleszkedés 

aktivitásfüggő folyamat (Ben-Ari és mtsai 1989). A felnőtt ép agyban a fiatal, 

beilleszkedésre képes idegsejt-prekurzorok kis eséllyel kapnak megfelelő ritmusú és 

amplitúdójú stimulust, ami a működő ideghálózatokba való beépülés, vagy új hálózatok 

kialakulásának kulcsa lenne. Új idegsejtek beépülése és túlélése a felnőtt agy 

hippocampus gyrus dentatus régiójában, illetve a szaglógumóban lehetséges. Ezekben a 

folyamatosan átépülő hálózatokban ható stimulusok leírása a fejlődés-neurobiológia 

egyik legizgalmasabb kutatási területe. Idegsejt-integráció és túlélés kizárólag akkor 

valósul meg, ha megfelelő időzítéssel, megfelelő paraméterű inger-mintázat van jelen 

(Kee és mtsai 2007, Tashiro és mtsai 2007, Petreanu és Alvarez-Buylla 2002). Ezeket a 

folyamatokat „az idegsejt-pótlás nyelvére lefordítani” nem egyszerű. Valószínűleg a 

jövőben a gerincvelői és agyi sejtpótlásokat olyan komplex rehabilitációnak kellene 

97

követnie, amely a megfelelő kémiai környezet, O2-tenzió biztosításával, elektromos 

ingerléssel, gyógytornával, motoros, vegetatív és érzőkvalitások serkentésével lehetővé 

teszi az agyi idegpályák regenerációját vagy új pályák képződését. Az idegszöveti 

integráció idegélettani paramétereinek vizsgálata a közeljövő fejlődés- 

neurobiológiájának és az idegi sejtterápiák kidolgozásának alapvető feladata. 

Munkám során bizonyítottam, hogy a multipotens őssejtek csak megfelelő állapotú 

agyban, adekvát környezeti szignálok hatására válhatnak elkötelezett 

(ideg)sejtekké, integrálódhatnak a befogadó agyszövetbe. Az idegsejt-prekurzorok, 

képződő idegsejtek integrációja az agyszövetbe komplex idegrendszeri 

együttműködést igényel. Más környezeti feltételek kellenek a differenciálatlan 

őssejtek fennmaradásához, szaporodásához, egészen más körülmények 

szükségesek a posztmitotikus idegsejt-előalakok idegi hálózatokba való 

integrációjához. A jövőbeni hatékony és biztonságos őssejtterápiák kialakításához 

rendkívül fontos, hogy minél részletesebben megismerjük az agyi mikrokörnyezet 

különféle fejlettségű sejtekre gyakorolt hatásait, további adatokat nyerjünk arról, 

hogy a különböző környezeti tényezők változtatása miképpen hat az endogén 

őssejtképzésre és a beültetett őssejtek túlélésére, elköteleződésére, integrációjára. 

98

Következtetések 

Munkánk során választ kerestük a kérdésre, hogy hogyan befolyásolja az agyba 

beültetett széles potenciálú, idegsejtet is képezni tudó őssejtek sorsát az agyi szöveti 

környezete. Megkíséreltük az agyi környezet módosításával és az őssejtek 

előkészítésével a sejtbeültetés eredményességét javítani, a sejteket idegi fenotípus 

irányába történő elköteleződésre, illetve integrációra segíteni. 

Az NE-4C geno- és fenotipikusan azonos neuroektodermális őssejtekkel és alklónjaival 

végzett implantációs kísérleteink megmutatták, hogy a felnőtt, előzetesen nem sértett 

agykéreg szöveti környezete az őssejtek hosszútávú túlélését, elköteleződését, szövet- 

specifikus integrációját nem támogatja. Ezzel szemben a felnőtt, sérült cortex 

környezete hosszútávú túlélésüket, a sejthiányos szöveti tér benépesítésében való 

részvételüket segíti, gliogenezisüket nem gátolja, azonban idegsejt-irányú 

elköteleződésüket nem segíti elő. Sejt-visszatenyésztés révén nyert adataink azt 

bizonyítják, hogy a sejtek sérült környezetben tapasztalt eltérő viselkedését nem 

klonális tulajdonságaiknak megváltozása, hanem az eltérő szöveti környezet okozza. 

Tumorsejtekkel és őssejtekkel végzett munkáink megmutatták, hogy az NE-4C őssejtek 

csak bizonyos tumorsejttípusokkal (GL261 glioblasztóma) képesek sejt-sejt kapcsolatot 

kialakítani, és hogy egyes tumorok (C6 glióma) proliferációját az őssejtek által termelt 

parakrin faktorok serkentik, alkalmazásuk tehát a tumorprogresszió veszélyét 

hordozhatja. Agyi környezetben a GL261 tumorsejtek jelenléte az idegi őssejtek túlélését 

ugyan megengedi, de olyan kemotaktikus faktorokat nem (vagy nem elégséges 

mennyiségben) termel, amelyek segítenék az őssejtek tumorsejt-célzását, vagyis az 

őssejtek tumorhoz vándorlását. 

Az idegi indukció útján elindított őssejtek agyba ültetése tisztázta, hogy az in vitro 

indukció nem elégséges a sejtek agyszöveti integrációjának előkészítéséhez, emellett 

felhívták a figyelmet az őssejtekből történő tumorigenezis veszélyére. 

Vizsgálataink alapján a hipoxiás kezelés az elkötelezetlen őssejtek életképességét, 

sejtproliferációját és spontán differenciálódását nem befolyásolja, azonban az idegi 

sejtfejlődés előrehaladottabb stádiumaiban alkalmazott alacsony O2-tenzió nemcsak az 

életképességet és sejtproliferációt, hanem az idegsejt-képzés folyamatait is károsítotja. 

99

Az egyes agyi kóros állapotokban jelentkező hipoperfúzió és hipoxia ellensúlyozására 

alkalmazott hiperbárikus oxigénterápiával lényeges változásokat idéztünk elő mind az 

agyba bejuttatott, mind a gazda-eredetű sejtek viselkedésében. A HBOT csökkentette a 

sérülést benépesítő sejtek apoptózisát, visszafogta az endogén és exogén sejtek 

akkumulációját és megengedőbb környezetet teremtett az idegi irányú elköteleződés 

folyamatai számára. 

Munkánk során bizonyítottuk, hogy az agy szöveti környezete alapvetően megszabja a 

beültetett idegi őssejtek viselkedését. A multipotens őssejtek csak megfelelő állapotú 

agyban, adekvát környezeti szignálok hatására válhatnak elkötelezett (ideg)sejtekké, 

integrálódhatnak a befogadó agyszövetbe. Más környezeti feltételek kellenek a 

differenciálatlan őssejtek fennmaradásához, szaporodásához, mint az elköteleződő és 

posztmitotikus idegsejt-előalakok túléléséhez, idegi hálózatokba való integrációjához. 

100

Összefoglalás 

Az NE-4C neuroektodermális őssejtekkel és (GFP-4C, PLAP-4C) alklónjaival végzett 

implantációs vizsgálatok megmutatták, hogy az agy szöveti környezetének aktuális 

állapota alapvetően meghatározza a beültetett idegi őssejtek sorsát. 

� Az indukálatlan őssejtek intakt felnőtt agyszövetben rövid ideig élnek, nem 

integrálódnak. Az előzetesen sértett agykérgi környezetben a beültetett őssejtek 

túlélése megnyúlik, közreműködnek a sérült terület benépesítésében, de 

számottevő idegsejtképzést nem mutatnak (Zádori, Ágoston és mtsai 2007, 

Neuropathol Appl Neurobiol. 2007 Oct;33(5):510-22). 

� Az NE-4C őssejtek csak meghatározott tumorok megközelítésére lehetnek 

alkalmasak. (Demeter és mtsai 2005, Neurosci Res. 2005 53(3):331-42). 

� Az őssejtek fejlődésének in vitro megindítása, önmagában nem elégséges ahhoz, 

hogy a beültetett prekurzorsejtekből idegsejtek fejlődjenek az agyban. 

� Az alacsony O2-tenziójú in vitro közegben az őssejtek –látszólag - zavartalanul 

nőnek, míg az idegi elköteleződés különböző fázisaiban lévő progenitorok 

fejlődési potenciálja megváltozik, idegsejt-képzésük csökken (*). 

� A szövetkárosodás helyén jelentkező hipoxia csökkenti az idegsejt-képződést. A 

szöveti hipoxia ellensúlyozására alkalmazott hiperbárikus oxigénkezelés az 

intracerebralis sejtproliferációt és apoptózist visszaszorítja, az idegsejtképzés 

lehetőségét javítja (*). (*: Zádori és mtsai 2010, kézirat benyújtva). 

Kísérleteinkkel bizonyítottuk, hogy a befogadó agy szöveti környezete meghatározó az 

implantált idegi őssejtek viselkedésére nézve. A sejtek elköteleződésének in vitro 

megindítása nem elégséges segítség a megfelelő agyszöveti idegi differenciálódás 

elindításához, az agyi környezetben tett egyes módosítások azonban segíthetik az 

őssejtek túlélését és idegsejtté alakulását. In vitro és in vivo vizsgálataink megmutatták, 

hogy a környezet oxigén tenziója igen lényeges vezérlő körülmény az őssejtek sorsát 

tekintve. További munkáinkkal szeretnénk több adatot nyerni a hiperbárikus terápia 

sejtproliferációra gyakorolt hatásairól, és szeretnénk megtalálni azt az in vitro elérhető 

differenciációs állapotot, amely a leginkább biztosítja a beültetett sejtek idegszöveti 

integrációját. 

101

Summary 

Data obtained from in vitro and in vivo studies on NE-4C neuroectodermal stem cells 

and on sub-clones expressing histological markers demonstrated that the intracerebral 

fate of implanted neural stem cells is governed by the actual state of the host 

environment. 

� Non-induced stem cells do not survive in, and can not integrate into the intact 

adult brain parenchyma. In contrast, implanted stem cells survive for long (>60 days) 

time in damaged brain cortices and can repopulate lesioned zones. The implanted 

neural stem cells, however, do not differentiate to neurons either in lesioned or in 

intact adult brain (Zádori, Ágoston et al., Neuropathol Appl Neurobiol. 2007 

Oct;33(5):510-22). 

� NE-4C neural stem cells can survive inside of some glioma-type neoplastic 

tissues, but can not „find” the tumors inside the brain indicating that the investigated 

tumours do not produce (enough) chemotactic signals to attract stem cells (Demeter 

et al., Neurosci Res. 2005 53(3):331-42). 

� Neural precursors at early stages of in vitro induced neuronal differentiation did 

not show improved tissue-integration or in situ neuron formation in comparison to 

non-committed stem cells. 

� In vitro, non-induced stem cells grow readily at low (1%) oxygen concentration 

and, apparently, are not damaged by hypoxia. Committed neural precursors, on the 

other hand, display increased sensitivity to hypoxia. At defined stages of neural 

differentiation, low O2-tension reduces the rates of neuron-production, markedly (*). 

� The hypoxic environment in lesioned cortices seems to inhibit local neuron- 

production, but does not prevent the proliferation of the implanted stem cells. 

� Hyperbaric oxygen therapy reduces both, the intracerebral cell proliferation and 

apoptosis at the lesion site, and makes the environment more permissive for 

formation of neurons (*). (*: Zádori et al. 2010, submitted) 

Our studies proved, that the fate of implanted neural stem cells is determined by the 

host environment. The intracerebral neuron-formation was not improved by implanting 

committed progenitors at early phase of neural commitment. Among the parameters of 

the host environment, oxygen tension is one of the essential regulators of the stem cell 

fate. 

102

Irodalomjegyzék 

Aboody KS, Brown A, Rainov NG, Bower KA, Liu S, Yang W, Small JE, Herrlinger U, 

Ourednik V, Black PM, Breakefield XO, Snyder EY. Neural stem cells display 

extensive tropism for pathology in adult brain: evidence from intracranial gliomas. 

Proc Natl Acad Sci USA 2000 Nov 7;97(23):12846-51. 

Aggarwal S, Pittenger MF. Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic 

immune cell responses. Blood. 2005 Feb 15;105(4):1815-22. 

Agoston VA, Zádori A, Demeter K, Nagy Z, Madarász E. Different behaviour of 

implanted stem cells in intact and lesioned forebrain cortices. Neuropathol Appl 

Neurobiol. 2007 Oct;33(5):510-22. 

Ahmed SA, Gogal RM Jr, Walsh JE. A new rapid and simple non-radioactive assay to 

monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to 

[3H]thymidine incorporation assay. J Immunol Methods 1994 Apr 15;170(2):211-24 

Allen E. The cessation of mitosis in the central nervous system of the albino rat. J. 

Comp. Neurol. 1912, 22:547-568. 

Altman J, Das GD. Autoradiographic and histological evidence of postnatal 

hippocampal neurogenesis in rats. J Comp Neurol. 1965 Jun;124(3):319-35. 

Altman J, Bayer SA. Migration and distribution of two populations of hippocampal 

granule cell precursors during the perinatal and postnatal periods. J Comp Neurol. 

1990a Nov 15;301(3):365-81. 

Altman J, Bayer SA. Mosaic organization of the hippocampal neuroepithelium and the 

multiple germinal sources of dentate granule cells. J Comp Neurol. 1990b Nov 

15;301(3):325-42. 

Alvarez-Buylla A, García-Verdugo JM, Tramontin AD. A unified hypothesis on the 

lineage of neural stem cells. Nat Rev Neurosci. 2001 Apr;2(4):287-93. Review. 

Alvarez-Buylla A, Seri B, Doetsch F. Identification of neural stem cells in the adult 

vertebrate brain. Brain Res Bull. 2002 Apr;57(6):751-8. Review. 

Amariglio N, Hirshberg A, Scheithauer BW, Cohen Y, Loewenthal R, Trakhtenbrot L, 

Paz N, Koren-Michowitz M, Waldman D, Leider-Trejo L, Toren A, Constantini S, 

Rechavi G. Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in 

an ataxia telangiectasia patient. PLoS Med. 2009 Feb 17;6(2):e29. 

103

Aponso PM, Faull RL, Connor B. Increased progenitor cell proliferation and 

astrogenesis in the partial progressive 6-hydroxydopamine model of Parkinson's 

disease. Neuroscience. 2008 Feb 19;151(4):1142-53. 

Appel SH, Engelhardt JI, Henkel JS, Siklos L, Beers DR, Yen AA, Simpson EP, Luo Y, 

Carrum G, Heslop HE, Brenner MK, Popat U. Hematopoietic stem cell 

transplantation in patients with sporadic amyotrophic lateral sclerosis. Neurology. 

2008 Oct 21;71(17):1326-34. 

Aronowski J, Samways E, Strong R, Rhoades HM, Grotta JC. An alternative method for 

the quantitation of neuronal damage after experimental middle cerebral artery 

occlusion in rats: analysis of behavioral deficit. J Cereb Blood Flow Metab. 1996 

Jul;16(4):705-13. 

Arvidsson A, Kokaia Z, Lindvall O. N-methyl-D-aspartate receptor-mediated increase 

of neurogenesis in adult rat dentate gyrus following stroke. Eur J Neurosci. 2001 

Jul;14(1):10-8. 

Arvidsson A, Collin T, Kirik D, Kokaia Z, Lindvall O. Neuronal replacement from 

endogenous precursors in the adult brain after stroke. Nat Med 2002; 8: 963–70. 

Ausman JI, Shapiro WR, Rall DP. Studies on the chemotherapy of experimental brain 

tumors: development of an experimental model. Cancer Res. 1970, 30(9):2394-400. 

Backlund EO, Granberg PO, Hamberger B, Knutsson E, Mårtensson A, Sedvall G, 

Seiger A, Olson L. Transplantation of adrenal medullary tissue to striatum in 

parkinsonism. First clinical trials. J Neurosurg. 1985 Feb;62(2):169-73. 

Baker SA, Baker KA, Hagg T. Dopaminergic nigrostriatal projections regulate neural 

precursor proliferation in the adult mouse subventricular zone. Eur J Neurosci. 2004 

Jul;20(2):575-9. 

Barker RA, Widner H. Immune problems in central nervous system cell therapy. 

NeuroRx. 2004 Oct;1(4):472-81. Review. 

Ben-Ari Y, Cherubini E, Corradetti R, Gaiarsa JL. Giant synaptic potentials in 

immature rat CA3 hippocampal neurones. J Physiol. 1989 Sep;416:303-25. 

Benda P, Lightbody J, Sato G, Levine L, Sweet W. Differentiated rat glial cell strain in 

tissue culture. Science. 1968, 161(839):370-1. 

Benedetti S, Pirola B, Pollo B, Magrassi L, Bruzzone MG, Rigamonti D, Galli R, Selleri 

S, Di Meco F, De Fraja C, Vescovi A, Cattaneo E, Finocchiaro G. Gene therapy of 

104

experimental brain tumors using neural progenitor cells Nat Med. 2000 Apr,6(4):447- 

50. 

Beynon C, Sun L, Marti HH, Heiland S, Veltkamp R. Delayed hyperbaric oxygenation 

is more effective than early prolonged normobaric hyperoxia in experimental focal 

cerebral ischemia. Neurosci Lett. 2007 Oct 2;425(3):141-5. 

Bédard A, Parent A. Evidence of newly generated neurons in the human olfactory bulb. 

Brain Res Dev Brain Res. 2004 Jul 19;151(1-2):159-68. 

Bjorklund LM, Sánchez-Pernaute R, Chung S, Andersson T, Chen IY, McNaught KS, 

Brownell AL, Jenkins BG, Wahlestedt C, Kim KS, Isacson O. Embryonic stem cells 

develop into functional dopaminergic neurons after transplantation in a Parkinson rat 

model. Proc Natl Acad Sci USA 2002 Feb 19;99(4):2344-9. 

Blesch A, Uy HS, Grill RJ, Cheng JG, Patterson PH, Tuszynski MH. Leukemia 

inhibitory factor augments neurotrophin expression and corticospinal axon growth 

after adult CNS injury. J Neurosci. 1999 May 1;19(9):3556-66. 

Blesch A, Tuszynski MH. Gene therapy and cell transplantation for Alzheimer's disease 

and spinal cord injury. Yonsei Med J. 2004 Jun 30;45 Suppl:28-31. Review. 

Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram 

quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 

1976, 72:248-54. 

Buffo A, Vosko MR, Ertürk D, Hamann GF, Jucker M, Rowitch D, Götz M. Expression 

pattern of the transcription factor Olig2 in response to brain injuries: implications for 

neuronal repair. Proc Natl Acad Sci USA 2005 Dec 13;102(50):18183-8. 

Buss A, Pech K, Kakulas BA, Martin D, Schoenen J, Noth J, Brook GA. Growth- 

modulating molecules are associated with invading Schwann cells and not astrocytes 

in human traumatic spinal cord injury. Brain. 2007 Apr;130(Pt 4):940-53. 

Cameron HA, Woolley CS, McEwen BS, Gould E. Differentiation of newly born 

neurons and glia in the dentate gyrus of the adult rat. Neuroscience. 1993 

Sep;56(2):337-44. 

Cameron HA, McEwen BS, Gould E. Regulation of adult neurogenesis by excitatory 

input and NMDA receptor activation in the dentate gyrus. J Neurosci. 1995 

Jun;15(6):4687-92. 

105

Capela A, Temple S. LeX/ssea-1 is expressed by adult mouse CNS stem cells, 

identifying them as nonependymal. Neuron. 2002 Aug 29;35(5):865-75. 

Cartier N, Aubourg P. Hematopoietic stem cell gene therapy in Hurler syndrome, 

globoid cell leukodystrophy, metachromatic leukodystrophy and X- 

adrenoleukodystrophy. Curr Opin Mol Ther. 2008 Oct;10(5):471-8. Review. 

Chen HL, Pistollato F, Hoeppner DJ, Ni HT, McKay RD, Panchision DM. Oxygen 

tension regulates survival and fate of mouse central nervous system precursors at 

multiple levels. Stem Cells. 2007 Sep;25(9):2291-301. 

Chen J, Zhang ZG, Li Y, Wang L, Xu YX, Gautam SC, Lu M, Zhu Z, Chopp M. 

Intravenous administration of human bone marrow stromal cells induces angiogenesis 

in the ischemic boundary zone after stroke in rats. Circ Res. 2003 Apr 4;92(6):692-9. 

Chi L, Ke Y, Luo C, Li B, Gozal D, Kalyanaraman B, Liu R. Motor neuron 

degeneration promotes neural progenitor cell proliferation, migration, and 

neurogenesis in the spinal cords of amyotrophic lateral sclerosis mice. Stem Cells. 

2006 Jan;24(1):34-43. 

Chiasson BJ, Tropepe V, Morshead CM, van der Kooy D. Adult mammalian forebrain 

ependymal and subependymal cells demonstrate proliferative potential, but only 

subependymal cells have neural stem cell characteristics. J Neurosci 1999;19:4462–71 

Connor B, Kozlowski DA, Schallert T, Tillerson JL, Davidson BL, Bohn MC. 

Differential effects of glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) in the 

striatum and substantia nigra of the aged Parkinsonian rat. Gene Ther. 1999 

Dec;6(12):1936-51. 

Conover JC, Doetsch F, Garcia-Verdugo JM, Gale NW, Yancopoulos GD, Alvarez- 

Buylla A. Disruption of Eph/ephrin signaling affects migration and proliferation in the 

adult subventricular zone. Nat Neurosci. 2000 Nov;3(11):1091-7. 

Corti S, Locatelli F, Papadimitriou D, Del Bo R, Nizzardo M, Nardini M, Donadoni C, 

Salani S, Fortunato F, Strazzer S, Bresolin N, Comi GP. Neural stem cells LewisX+ 

CXCR4+ modify disease progression in an amyotrophic lateral sclerosis model. Brain. 

2007 May;130(Pt 5):1289-305. 

Covello KL, Kehler J, Yu H, Gordan JD, Arsham AM, Hu CJ, Labosky PA, Simon MC, 

Keith B. HIF-2alpha regulates Oct-4: effects of hypoxia on stem cell function, 

embryonic development, and tumor growth. Genes Dev. 2006 Mar 1;20(5):557-70. 

106

Curtis, M. A., Penney, E. B., Pearson, A. G., van Roon- Mom,W. M., Butterworth, N. 

J., Dragunow, M., Connor, B. & Faull, R. L. 2003 Increased cell proliferation and 

neurogenesis in the adult human Huntington‟s disease brain. Proc. Natl Acad. Sci. 

USA 100, 9023–9027. 

Das KC, Ravi D, Holland W. Increased apoptosis and expression of p21 and p53 in 

premature infant baboon model of bronchopulmonary dysplasia. Antioxid Redox 

Signal. 2004 Feb;6(1):109-16. 

Demeter K, Herberth B, Duda E, Domonkos A, Jaffredo T, Herman JP, Madarász E. 

Fate of cloned embryonic neuroectodermal cells implanted into the adult, newborn 

and embryonic forebrain. Exp Neurol. 2004 Aug;188(2):254-67. 

Demeter K, Zádori A, Agoston VA, Madarász E. Studies on the use of NE-4C 

embryonic neuroectodermal stem cells for targeting brain tumour. Neurosci Res. 2005 

Nov;53(3):331-42. 

Désaknai S, Lumniczky K, Esik O, Hamada H, Safrany G. Local tumour irradiation 

enhances the anti-tumour effect of a double-suicide gene therapy system in a murine 

glioma model. J Gene Med. 2003, 5(5):377-85. 

Dheen ST, Kaur C, Ling EA. Microglial activation and its implications in the brain 

diseases. Curr Med Chem. 2007;14(11):1189-97. Review. 

Dieterlen MT, Wegner F, Schwarz SC, Milosevic J, Schneider B, Busch M, Römuss U, 

Brandt A, Storch A, Schwarz J. Non-viral gene transfer by nucleofection allows stable 

gene expression in human neural progenitor cells. J Neurosci Methods. 2009 Mar 

30;178(1):15-23. 

Doetsch F, García-Verdugo JM, Alvarez-Buylla A. Cellular composition and three- 

dimensional organization of the subventricular germinal zone in the adult mammalian 

brain. J Neurosci. 1997 Jul 1;17(13):5046-61. 

Doetsch F, Caillé I, Lim DA, García-Verdugo JM, Alvarez-Buylla A. Subventricular 

zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain. Cell. 1999 Jun 

11;97(6):703-16. 

Doetsch F. A niche for adult neural stem cells. Curr Opin Genet Dev. 2003 

Oct;13(5):543-50. Review. 

107

Drukker M, Katz G, Urbach A, Schuldiner M, Markel G, Itskovitz-Eldor J, Reubinoff 

B, Mandelboim O, Benvenisty N. Characterization of the expression of MHC proteins 

in human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2002 Jul 23;99(15):9864-9. 

Eglitis MA, Mezey E. Hematopoietic cells differentiate into both microglia and 

macroglia in the brains of adult mice. Proc Natl Acad Sci USA 1997 Apr 

15;94(8):4080-5. 

Ehtesham M, Kabos P, Kabosova A, Neuman T, Black KL, Yu JS. The use of 

interleukin 12-secreting neural stem cells for the treatment of intracranial glioma. 

Cancer Res. 2002a Oct 15;62(20):5657-63. 

Ehtesham M, Samoto K, Kabos P, Acosta FL, Gutierrez MA, Black KL, Yu JS. 

Treatment of intracranial glioma with in situ interferon-gamma and tumor necrosis 

factor-alpha gene transfer. Cancer Gene Ther. 2002b Nov;9(11):925-34. 

Ekdahl CT, Claasen JH, Bonde S, Kokaia Z, Lindvall O. Inflammation is detrimental 

for neurogenesis in adult brain. Proc Natl Acad Sci USA 2003 Nov 

11;100(23):13632-7. 

Eken A, Aydin A, Sayal A, Ustündağ A, Duydu Y, Dündar K. The effects of hyperbaric 

oxygen treatment on oxidative stress and SCE frequencies in humans. Clin Biochem. 

2005 Dec;38(12):1133-7. 

Erdö F, Bührle C, Blunk J, Hoehn M, Xia Y, Fleischmann B, Föcking M, Küstermann 

E, Kolossov E, Hescheler J, Hossmann KA, Trapp T. Host-dependent tumorigenesis 

of embryonic stem cell transplantation in experimental stroke. J Cereb Blood Flow 

Metab. 2003 Jul;23(7):780-5. 

Eriksson PS, Perfilieva E, Björk-Eriksson T, Alborn AM, Nordborg C, Peterson DA, 

Gage FH. Neurogenesis in the adult human hippocampus. Nat Med. 1998 

Nov;4(11):1313-7. 

Evans MJ, Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse 

embryos. Nature. 1981 Jul 9;292(5819):154-6. 

Fisher LJ, Raymon HK, Gage FH. Cells engineered to produce acetylcholine: 

therapeutic potential for Alzheimer's disease. Ann N Y Acad Sci. 1993 Sep 

24;695:278-84. Review. 

Fitch MT, Silver J. CNS injury, glial scars, and inflammation: Inhibitory extracellular 

matrices and regeneration failure. Exp Neurol. 2008 Feb;209(2):294-301. Review. 

108

Freundlieb N, François C, Tandé D, Oertel WH, Hirsch EC, Höglinger GU. 

Dopaminergic substantia nigra neurons project topographically organized to the 

subventricular zone and stimulate precursor cell proliferation in aged primates. J 

Neurosci. 2006 Feb 22;26(8):2321-5. 

Fricker-Gates RA, Shin JJ, Tai CC, Catapano LA, Macklis JD. Late-stage immature 

neocortical neurons reconstruct interhemispheric connections and form synaptic 

contacts with increased efficiency in adult mouse cortex undergoing targeted 

neurodegeneration. J Neurosci. 2002 May 15;22(10):4045-56. 

Fujita S. Quantitative analysis of cell proliferation and differentiation in the cortex of 

the postnatal mouse cerebellum. J Cell Biol. 1967 Feb;32(2):277-87. 

Gage FH, Coates PW, Palmer TD, Kuhn HG, Fisher LJ, Suhonen JO, Peterson DA, 

Suhr ST, Ray J. Survival and differentiation of adult neuronal progenitor cells 

transplanted to the adult brain. Proc Natl Acad Sci USA 1995a Dec 5;92(25):11879- 

83. 

Gage FH, Ray J, Fisher LJ. Isolation, characterization, and use of stem cells from the 

CNS. Annu Rev Neurosci. 1995b;18:159-92. Review. 

Gage FH. Mammalian neural stem cells. Science. 2000 Feb 25;287(5457):1433-8. 

Review. 

Gao J, Prough DS, McAdoo DJ, Grady JJ, Parsley MO, Ma L, Tarensenko YI, Wu P. 

Transplantation of primed human fetal neural stem cells improves cognitive function 

in rats after traumatic brain injury. Exp Neurol. 2006 Oct;201(2):281-92. 

Garbuzova-Davis S, Sanberg CD, Kuzmin-Nichols N, Willing AE, Gemma C, Bickford 

PC, Miller C, Rossi R, Sanberg PR. Human umbilical cord blood treatment in a mouse 

model of ALS: optimization of cell dose. PLoS ONE. 2008 Jun 25;3(6):e2494. 

Ghashghaei HT, Weber J, Pevny L, Schmid R, Schwab MH, Lloyd KC, Eisenstat DD, 

Lai C, Anton ES. The role of neuregulin-ErbB4 interactions on the proliferation and 

organization of cells in the subventricular zone. Proc Natl Acad Sci USA 2006 Feb 

7;103(6):1930-5. 

Goldman SA, Nottebohm F. Neuronal production, migration, and differentiation in a 

vocal control nucleus of the adult female canary brain. Proc Natl Acad Sci USA 1983 

Apr;80(8):2390-4. 

109

Goldman SA, Windrem MS. Cell replacement therapy in neurological disease. Philos 

Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2006 Sep 29;361(1473):1463-75. Review. 

Goncalves MB, Suetterlin P, Yip P, Molina-Holgado F, Walker DJ, Oudin MJ, Zentar 

MP, Pollard S, Yáñez-Muñoz RJ, Williams G, Walsh FS, Pangalos MN, Doherty P. A 

diacylglycerol lipase-CB2 cannabinoid pathway regulates adult subventricular zone 

neurogenesis in an age-dependent manner. Mol Cell Neurosci. 2008 Aug;38(4):526- 

36. 

Gould E, Reeves AJ, Fallah M, Tanapat P, Gross CG, Fuchs E. Hippocampal 

neurogenesis in adult Old World primates. Proc Natl Acad Sci USA 1999a Apr 

27;96(9):5263-7. 

Gould E., Reeves J.A., Graziano S.A.M., Gross G.C. Neurogenesis in the neocortex of 

adult primates 1999b Science Vol. 286. 

Götz M, Huttner WB. The cell biology of neurogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 2005 

Oct;6(10):777-88. Review. 

Grider MH, Mamounas LA, Le W, Shine HD. In situ expression of brain-derived 

neurotrophic factor or neurotrophin-3 promotes sprouting of cortical serotonergic 

axons following a neurotoxic lesion. J Neurosci Res. 2005 Nov 1;82(3):404-12. 

Grimaldi P, Rossi F. Lack of neurogenesis in the adult rat cerebellum after Purkinje cell 

degeneration and growth factor infusion. Eur J Neurosci. 2006 May;23(10):2657-68. 

Gu W, Brannstrom T, Wester P: Cortical neurogenesis in adult rats after reversible 

photothrombotic stroke. J Cereb Blood Flow Metab 2000, 20:1166-1173. 

Gustafsson MV, Zheng X, Pereira T, Gradin K, Jin S, Lundkvist J, Ruas JL, Poellinger 

L, Lendahl U, Bondesson M. Hypoxia requires notch signaling to maintain the 

undifferentiated cell state. Dev Cell. 2005 Nov;9(5):617-28. 

Herberth B, Pataki A, Jelitai M, Schlett K, Deák F, Spät A, Madarász E. Changes of 

KCl sensitivity of proliferating neural progenitors during in vitro neurogenesis. J 

Neurosci Res. 2002 Mar 1;67(5):574-82. 

Herrera-Marschitz M, Strömberg I, Olsson D, Ungerstedt U, Olson L. Adrenal 

medullary implants in the dopamine-denervated rat striatum. II. Acute behavior as a 

function of graft amount and location and its modulation by neuroleptics. Brain Res. 

1984 Apr 9;297(1):53-61. 

110

Hicks AU, Lappalainen RS, Narkilahti S, Suuronen R, Corbett D, Sivenius J, Hovatta 

O, Jolkkonen J. Transplantation of human embryonic stem cell-derived neural 

precursor cells and enriched environment after cortical stroke in rats: cell survival and 

functional recovery. Eur J Neurosci. 2009 Feb;29(3):562-74. 

Hill MN, Kambo JS, Sun JC, Gorzalka BB, Galea LA. Endocannabinoids modulate 

stress-induced suppression of hippocampal cell proliferation and activation of 

defensive behaviours. Eur J Neurosci. 2006 Oct;24(7):1845-9. 

Hirabayashi Y, Itoh Y, Tabata H, Nakajima K, Akiyama T, Masuyama N, Gotoh Y. The 

Wnt/beta-catenin pathway directs neuronal differentiation of cortical neural precursor 

cells. Development. 2004 Jun;131(12):2791-801. 

Horie N, So K, Moriya T, Kitagawa N, Tsutsumi K, Nagata I, Shinohara K. Effects of 

oxygen concentration on the proliferation and differentiation of mouse neural stem 

cells in vitro. Cell Mol Neurobiol. 2008 Sep;28(6):833-45. 

Isacson O, Deacon TW. Specific axon guidance factors persist in the adult brain as 

demonstrated by pig neuroblasts transplanted to the rat. Neuroscience. 1996 

Dec;75(3):827-37. 

Jacques TS, Relvas JB, Nishimura S, Pytela R, Edwards GM, Streuli CH, ffrench- 

Constant C. Neural precursor cell chain migration and division are regulated through 

different beta1 integrins. Development. 1998 Aug;125(16):3167-77. 

Jelitai M, Schlett K, Varju P, Eisel U, Madarász E. Regulated appearance of NMDA 

receptor subunits and channel functions during in vitro neuronal differentiation. J 

Neurobiol. 2002 Apr;51(1):54-65. 

Jiang W, Gu W, Brannstrom T, Rosqvist R, Wester P: Cortical neurogenesis in adult 

rats after transient middle cerebral artery occlusion. Stroke 2001, 32:1201-1207. 

Jiao J, Chen DF. Induction of neurogenesis in nonconventional neurogenic regions of 

the adult central nervous system by niche astrocyte-produced signals. Stem Cells. 

2008 May;26(5):1221-30. 

Jin K, Minami M, Lan JQ, Mao XO, Batteur S, Simon RP, Greenberg DA. 

Neurogenesis in dentate subgranular zone and rostral subventricular zone after focal 

cerebral ischemia in the rat. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 4710–15. 

111

Jin K, Sun Y, Xie L, Peel A, Mao XO, Batteur S, Greenberg DA Directed migration of 

neuronal precursors into the ischemic cerebral cortex and striatum. Mol Cell Neurosci. 

2003 Sep;24(1):171-89. 

Jin, K., Peel, A. L., Mao, X. O., Xie, L., Cottrell, B. A., Henshall, D. C. & Greenberg, 

D. A. 2004a Increased hippocampal neurogenesis in Alzheimer‟s disease. Proc. Natl 

Acad. Sci. USA 101, 343–347. 

Jin, K., Galvan, V., Xie, L., Mao, X. O., Gorostiza, O. F., Bredesen, D. E. & Greenberg, 

D. A. 2004b Enhanced neurogenesis in Alzheimer‟s disease transgenic 

(PDGFAPPSw, Ind) mice. Proc. Natl Acad. Sci. USA 101, 13 363–13 367. 

Jin K, Sun Y, Xie L, Mao XO, Childs J, Peel A, Logvinova A, Banwait S, Greenberg 

DA. Comparison of ischemia-directed migration of neural precursor cells after 

intrastriatal, intraventricular, or intravenous transplantation in the rat. Neurobiol Dis. 

2005 Mar;18(2):366-74. 

Jin K, Wang X, Xie L, Mao XO, Zhu W, Wang Y, Shen J, Mao Y, Banwait S, 

Greenberg DA. Evidence for stroke-induced neurogenesis in the human brain. Proc 

Natl Acad Sci USA 2006 Aug 29;103(35): 13198-202. 

Johansson CB, Momma S, Clarke LD, Risling M, Frisén J. Identification of a neural 

stem cell in the adult mammalian central nervous system. Cell 1999; 96: 25–34 

Johansson S, Price J, Modo M. Effect of inflammatory cytokines on major 

histocompatibility complex expression and differentiation of human neural 

stem/progenitor cells. Stem Cells. 2008 Sep;26(9):2444-54. 

Kaidi A, Williams AC, Paraskeva C. Interaction between beta-catenin and HIF-1 

promotes cellular adaptation to hypoxia. Nat Cell Biol. 2007 Feb;9(2):210-7. 

Kaplan MS, Hinds JW. Neurogenesis in the adult rat: electron microscopic analysis of 

light radioautographs. Science. 1977 Sep 9;197(4308):1092-4. 

Katoh S, Mitsui Y, Kitani K, Suzuki T. Hyperoxia induces the differentiated neuronal 

phenotype of PC12 cells by producing reactive oxygen species. Biochem Biophys Res 

Commun. 1997 Dec 18;241(2):347-51. 

Katoh S, Mitsui Y, Kitani K, Suzuki T. Hyperoxia induces the neuronal differentiated 

phenotype of PC12 cells via a sustained activity of mitogen-activated protein kinase 

induced by Bcl-2. Biochem J. 1999 Mar 1;338 ( Pt 2):465-70. 

112

Ke Y, Chi L, Xu R, Luo C, Gozal D, Liu R. Early response of endogenous adult neural 

progenitor cells to acute spinal cord injury in mice. Stem Cells 2006 Apr;24(4):1011-9 

Kee N, Teixeira CM, Wang AH, Frankland PW. Preferential incorporation of adult- 

generated granule cells into spatial memory networks in the dentate gyrus. Nat 

Neurosci. 2007 Mar;10(3):355-62. 

Keith B, Simon MC. Hypoxia-inducible factors, stem cells, and cancer. Cell. 2007 May 

4;129(3):465-72. Review. 

Kelly S, Bliss TM, Shah AK, Sun GH, Ma M, Foo WC, Masel J, Yenari MA, 

Weissman IL, Uchida N, Palmer T, Steinberg GK. Transplanted human fetal neural 

stem cells survive, migrate, and differentiate in ischemic rat cerebral cortex. Proc Natl 

Acad Sci USA 2004 Aug 10;101(32):11839-44. 

Kim GW, Sugawara T, Chan PH. Involvement of oxidative stress and caspase-3 in 

cortical infarction after photothrombotic ischemia in mice. J Cereb Blood Flow 

Metab. 2000 Dec;20(12):1690-701. 

Kirn J, O'Loughlin B, Kasparian S, Nottebohm F. Cell death and neuronal recruitment 

in the high vocal center of adult male canaries are temporally related to changes in 

song. Proc Natl Acad Sci USA 1994 Aug 16;91(17):7844-8. 

Klatzo I, Piraux A, Laskowski EJ. The relationship between edema, blood–brain barrier 

and tissue elements in a local brain injury. J Neuropathol Exp Neurol 1958; 17: 548– 

64. 

Kohshi K, Yokota A, Konda N, Kinoshita Y, Kajiwara H. Intracranial pressure 

responses during hyperbaric oxygen therapy. Neurol Med Chir (Tokyo) 1991;31:575– 

81. 

Kopper L, Hajdú M. Tumor stem cells. Pathol Oncol Res. 2004;10(2):69-73. Review. 

Kordower JH, Winn SR, Liu YT, Mufson EJ, Sladek JR Jr, Hammang JP, Baetge EE, 

Emerich DF. The aged monkey basal forebrain: rescue and sprouting of axotomized 

basal forebrain neurons after grafts of encapsulated cells secreting human nerve 

growth factor. Proc Natl Acad Sci USA 1994 Nov 8;91(23): 10898-902. 

Korkmaz A, Oter S, Sadir S, Topal T, Uysal B, Ozler M, Ay H, Akin A. Exposure time 

related oxidative action of hyperbaric oxygen in rat brain. Neurochem Res. 2008 

Jan;33(1):160-6. 

113

Környei Z, Szlávik V, Szabó B, Gócza E, Czirók A, Madarász E. Humoral and contact 

interactions in astroglia/stem cell co-cultures in the course of glia-induced 

neurogenesis. Glia. 2005 Feb;49(3):430-44. 

Környei Z, Gócza E, Rühl R, Orsolits B, Vörös E, Szabó B, Vágovits B, Madarász E. 

Astroglia-derived retinoic acid is a key factor in glia-induced neurogenesis. FASEB J. 

2007 Aug;21(10):2496-509. 

Kromer LF, Cornbrooks CJ. Identification of trophic factors and transplanted cellular 

environments that promote CNS axonal regeneration. Ann N Y Acad Sci. 

1987;495:207-24. 

Lacorazza HD, Flax JD, Snyder EY, Jendoubi M. Expression of human beta- 

hexosaminidase alpha-subunit gene (the gene defect of Tay-Sachs disease) in mouse 

brains upon engraftment of transduced progenitor cells. Nat Med 1996 Apr;2(4):424-9 

Lau WM, Qiu G, Helmeste DM, Lee TM, Tang SW, So KF, Tang SW. Corticosteroid 

decreases subventricular zone cell proliferation, which could be reversed by 

paroxetine. Restor Neurol Neurosci. 2007;25(1):17-23. 

Leng S, He J, Fan W, Cheng S, Long D, He H. Bone mesenchymal stem cells for gene 

transfer of NGF to the adult rat brain: rescue the NGFR p75 positive neurons from 

fimbria-fornix lesion-induced degeneration. Neurosci Lett. 2008 Dec 31;448(3):282-7. 

Epub 2008 Oct 10. 

Lennington JB, Yang Z, Conover JC. Neural stem cells and the regulation of adult 

neurogenesis. Reprod Biol Endocrinol. 2003 Nov 13;1:99. Review. 

Levine JM, Reynolds R, Fawcett JW. The oligodendrocyte precursor cell in health and 

disease. Trends Neurosci. 2001 Jan;24(1):39-47. Review. 

Li Y, Zhou C, Calvert JW, Colohan AR, Zhang JH. Multiple effects of hyperbaric 

oxygen on the expression of HIF-1 alpha and apoptotic genes in a global ischemia- 

hypotension rat model. Exp Neurol. 2005a Jan;191(1):198-210. 

Li XJ, Du ZW, Zarnowska ED, Pankratz M, Hansen LO, Pearce RA, Zhang SC. 

Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 

2005b Feb;23(2):215-21. 

Lie DC, Colamarino SA, Song HJ, Désiré L, Mira H, Consiglio A, Lein ES, Jessberger 

S, Lansford H, Dearie AR, Gage FH. Wnt signalling regulates adult hippocampal 

neurogenesis. Nature. 2005 Oct 27;437(7063):1370-5. 

114

Lim DA, Tramontin AD, Trevejo JM, Herrera DG, García-Verdugo JM, Alvarez-Buylla 

A. Noggin antagonizes BMP signaling to create a niche for adult neurogenesis. 

Neuron. 2000 Dec;28(3):713-26. 

Lindvall O, Rehncrona S, Brundin P, Gustavii B, Astedt B, Widner H, Lindholm T, 

Björklund A, Leenders KL, Rothwell JC, et al. Human fetal dopamine neurons grafted 

into the striatum in two patients with severe Parkinson's disease. A detailed account of 

methodology and a 6-month follow-up. Arch Neurol. 1989 Jun;46(6):615-31. 

Lindvall O, Kokaia Z, Martinez-Serrano A. Stem cell therapy for human 

neurodegenerative disorders-how to make it work. Nat Med. 2004 Jul;10 Suppl:S42- 

50. Review. 

Liu Z, Jiao QF, You C, Che YJ, Su FZ. Effect of hyperbaric oxygen on cytochrome C, 

Bcl-2 and Bax expression after experimental traumatic brain injury in rats. Chin J 

Traumatol. 2006a Jun;9(3):168-74. 

Liu BP, Cafferty WB, Budel SO, Strittmatter SM. Extracellular regulators of axonal 

growth in the adult central nervous system. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 

2006b Sep 29;361(1473):1593-610. Review. 

Lobato RD. Historical vignette of Cajal's work "Degeneration and regeneration of the 

nervous system" with a reflection of the author. Neurocirugia (Astur). 2008 

Oct;19(5):456-68. 

Lu D, Li Y, Wang L, Chen J, Mahmood A, Chopp M. Intraarterial administration of 

marrow stromal cells in a rat model of traumatic brain injury. J Neurotrauma. 2001 

Aug;18(8):813-9. 

Lu D, Sanberg PR, Mahmood A, Li Y, Wang L, Sanchez-Ramos J, Chopp M. 

Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces neurological 

deficit in the rat after traumatic brain injury. Cell Transplant. 2002;11(3):275-81. 

Lu P, Tuszynski MH. Growth factors and combinatorial therapies for CNS regeneration. 

Exp Neurol. 2008 Feb;209(2):313-20. Review. 

Lundberg C, Horellou P, Mallet J, Björklund A. Generation of DOPA-producing 

astrocytes by retroviral transduction of the human tyrosine hydroxylase gene: in vitro 

characterization and in vivo effects in the rat Parkinson model. Exp Neurol. 1996 

May;139(1):39-53. 

115

Lykissas MG, Batistatou AK, Charalabopoulos KA, Beris AE. The role of 

neurotrophins in axonal growth, guidance, and regeneration. Curr Neurovasc Res. 

2007 May;4(2):143-51. Review. 

Ma DK, Ming GL, Song H. Glial influences on neural stem cell development: cellular 

niches for adult neurogenesis. Curr Opin Neurobiol. 2005 Oct;15(5):514-20. Review. 

Macklis JD. Transplanted neocortical neurons migrate selectively into regions of 

neuronal degeneration produced by chromophore-targeted laser photolysis. J 

Neurosci. 1993 Sep;13(9):3848-63. 

Magavi SS, Leavitt BR, Macklis JD. Induction of neurogenesis in the neocortex of adult 

mice. Nature. 2000 Jun 22;405(6789):951-5. 

Mahmood A, Lu D, Chopp M. Intravenous administration of marrow stromal cells 

(MSCs) increases the expression of growth factors in rat brain after traumatic brain 

injury. J Neurotrauma. 2004 Jan;21(1):33-9. 

Mao L, Lau YS, Petroske E, Wang JQ. Profound astrogenesis in the striatum of adult 

mice following nigrostriatal dopaminergic lesion by repeated MPTP administration. 

Brain Res Dev Brain Res. 2001 Nov 26;131(1-2):57-65. 

Martin GR, Evans MJ. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: 

formation of embryoid bodies in vitro. Proc Natl Acad Sci USA 1975 

Apr;72(4):1441-5. 

Martin GR. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in 

medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 1981 

Dec;78(12):7634-8. 

Martínez-Serrano A, Lundberg C, Horellou P, Fischer W, Bentlage C, Campbell K, 

McKay RD, Mallet J, Björklund A. CNS-derived neural progenitor cells for gene 

transfer of nerve growth factor to the adult rat brain: complete rescue of axotomized 

cholinergic neurons after transplantation into the septum. J Neurosci. 1995 

Aug;15(8):5668-80. 

Martínez-Serrano A, Björklund A. Immortalized neural progenitor cells for CNS gene 

transfer and repair. Trends Neurosci. 1997 Nov;20(11):530-8. Review. 

Matchett GA, Martin RD, Zhang JH. Hyperbaric oxygen therapy and cerebral ischemia: 

neuroprotective mechanisms. Neurol Res. 2009 Mar;31(2):114-21. Review. 

116

Merkle FT, Tramontin AD, García-Verdugo JM, Alvarez-Buylla A. Radial glia give rise 

to adult neural stem cells in the subventricular zone. Proc Natl Acad Sci USA 2004 

Dec 14;101(50):17528-32. 

Metz GA, Schwab ME. Behavioral characterization in a comprehensive mouse test 

battery reveals motor and sensory impairments in growth-associated protein-43 null 

mutant mice. Neuroscience. 2004;129(3):563-74. 

Mezey E, Key S, Vogelsang G, Szalayova I, Lange GD, Crain B. Transplanted bone 

marrow generates new neurons in human brains. Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 

4;100(3):1364-9. 

Modo M, Stroemer RP, Tang E, Patel S, Hodges H. Effects of implantation site of stem 

cell grafts on behavioral recovery from stroke damage. Stroke. 2002 Sep;33(9):2270-8 

Monje ML, Toda H, Palmer TD. Inflammatory blockade restores adult hippocampal 

neurogenesis. Science. 2003 Dec 5;302(5651):1760-5. 

Morrison SJ, Csete M, Groves AK, Melega W, Wold B, Anderson DJ. Culture in 

reduced levels of oxygen promotes clonogenic sympathoadrenal differentiation by 

isolated neural crest stem cells. J Neurosci. 2000 Oct 1;20(19):7370-6. 

Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to 

proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods 1983; 65: 55–63. 

Mueller BK, Yamashita T, Schaffar G, Mueller R. The role of repulsive guidance 

molecules in the embryonic and adult vertebrate central nervous system. Philos Trans 

R Soc Lond B Biol Sci. 2006 Sep 29;361(1473):1513-29. Review. 

Murakami K, Kondo T, Yang G, Chen SF, Morita-Fujimura Y, Chan PH. Cold injury in 

mice: a model to study mechanisms of brain edema and neuronal apoptosis. Prog 

Neurobiol 1999; 57: 289–99. 

Nakatomi H, Kuriu T, Okabe S, Yamamoto S, Hatano O, Kawahara N, Tamura A, 

Kirino T, Nakafuku M. Regeneration of hippocampal pyramidal neurons after 

ischemic brain injury by recruitment of endogenous neural progenitors. Cell. 2002 

Aug 23;110(4):429-41. 

Namiki J, Kojima A, Tator CH. Effect of brain-derived neurotrophic factor, nerve 

growth factor, and neurotrophin-3 on functional recovery and regeneration after spinal 

cord injury in adult rats. J Neurotrauma. 2000 Dec;17(12):1219-31. 

117

Niklas A, Brock D, Schober R, Schulz A, Schneider D. Continuous measurements of 

cerebral tissue oxygen pressure during hyperbaric oxygenation--HBO effects on brain 

edema and necrosis after severe brain trauma in rabbits. J Neurol Sci. 2004 Apr 

15;219(1-2):77-82. 

Palmer TD, Ray J, Gage FH. FGF-2-responsive neuronal progenitors reside in 

proliferative and quiescent regions of the adult rodent brain. Mol Cell Neurosci. 1995 

Oct;6(5):474-86. 

Palmer TD, Markakis EA, Willhoite AR, Safar F, Gage FH. Fibroblast growth factor-2 

activates a latent neurogenic program in neural stem cells from diverse regions of the 

adult CNS. J Neurosci. 1999 Oct 1;19(19):8487-97. 

Parent JM, Yu TW, Leibowitz RT, Geschwind DH, Sloviter, RS, Lowenstein DH. 

Dentate granule cell neurogenesis is increased by seizures and contributes to aberrant 

network reorganization in the adult rat hippocampus. J. Neurosci. 1997, 17, 3727– 

3738. 

Parent JM, Valentin, VV, Lowenstein DH. Prolonged seizures increase proliferating 

neuroblasts in the adult rat subventricular zone-olfactory bulb pathway. J. Neurosci. 

2002, 22, 3174–3188. 

Pastores GM. Laronidase (Aldurazyme): enzyme replacement therapy for 

mucopolysaccharidosis type I. Expert Opin Biol Ther. 2008 Jul;8(7):1003-9. Review. 

Perlow MJ, Freed WJ, Hoffer BJ, Seiger A, Olson L, Wyatt RJ. Brain grafts reduce 

motor abnormalities produced by destruction of nigrostriatal dopamine system. 

Science. 1979 May 11;204(4393):643-7. 

Petreanu L, Alvarez-Buylla A. Maturation and death of adult-born olfactory bulb 

granule neurons: role of olfaction. J Neurosci. 2002 Jul 15;22(14):6106-13. 

Preston SL, Alison MR, Forbes SJ, Direkze NC, Poulsom R, Wright NA. The new stem 

cell biology: something for everyone. Mol Pathol. 2003 Apr;56(2):86-96. Review. 

Picard-Riera N, Decker L, Delarasse C, Goude K, Nait-Oumesmar B, Liblau R, Pham- 

Dinh D, Evercooren AB. Experimental autoimmune encephalomyelitis mobilizes 

neural progenitors from the subventricular zone to undergo oligodendrogenesis in 

adult mice. Proc Natl Acad Sci USA 2002 Oct 1;99(20):13211-6. 

118

Pistollato F, Chen HL, Schwartz PH, Basso G, Panchision DM. Oxygen tension 

controls the expansion of human CNS precursors and the generation of astrocytes and 

oligodendrocytes. Mol Cell Neurosci. 2007 Jul;35(3):424-35. 

Plesnila N, Friedrich D, Eriskat J, Baethmann A, Stoffel M. Relative cerebral blood 

flow during the secondary expansion of a cortical lesion in rats. Neurosci Lett. 2003 

Jul 17;345(2):85-8. 

Pluchino S, Quattrini A, Brambilla E, Gritti A, Salani G, Dina G, Galli R, Del Carro U, 

Amadio S, Bergami A, Furlan R, Comi G, Vescovi AL, Martino G. Injection of adult 

neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis. Nature. 2003 

Apr 17;422(6933):688-94. 

Pluchino S, Furlan R, Martino G. Cell-based remyelinating therapies in multiple 

sclerosis: evidence from experimental studies. Curr Opin Neurol. 2004 Jun;17(3):247- 

55. Review. 

Ponten J, Macintyre EH. 1968. Long term culture of normal and neoplastic human glia. 

Acta Pathol Microbiol Scand. 74(4):465-86. 

Ponti G, Peretto P, Bonfanti L. Genesis of neuronal and glial progenitors in the 

cerebellar cortex of peripuberal and adult rabbits. PLoS ONE. 2008 Jun 4;3(6):e2366. 

Qu R, Li Y, Gao Q, Shen L, Zhang J, Liu Z, Chen X, Chopp M. Neurotrophic and 

growth factor gene expression profiling of mouse bone marrow stromal cells induced 

by ischemic brain extracts. Neuropathology. 2007 Aug;27(4):355-63. 

Qu C, Mahmood A, Lu D, Goussev A, Xiong Y, Chopp M. Treatment of traumatic 

brain injury in mice with marrow stromal cells. Brain Res. 2008 May 7;1208:234-9. 

Rakic P.Guidance of neurons migrating to the fetal monkey neocortex. Brain Res. 1971 

Oct 29;33(2):471-6. 

Rice AC, Khaldi A, Harvey HB, Salman NJ, White F, Fillmore H, Bullock MR. 

Proliferation and neuronal differentiation of mitotically active cells following 

traumatic brain injury. Exp Neurol. 2003 Oct;183(2):406-17. 

Riess P, Molcanyi M, Bentz K, Maegele M, Simanski C, Carlitscheck C, Schneider A, 

Hescheler J, Bouillon B, Schäfer U, Neugebauer E. Embryonic stem cell 

transplantation after experimental traumatic brain injury dramatically improves 

neurological outcome, but may cause tumors. J Neurotrauma 2007Jan;24(1):216-25. 

119

Rietze RL, Valcanis H, Brooker GF, Thomas T, Voss AK, Bartlett PF. Purification of a 

pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 2001 Aug 

16;412(6848):736-9. 

Riquelme PA, Drapeau E, Doetsch F. Brain micro-ecologies: neural stem cell niches in 

the adult mammalian brain. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008 Jan 

12;363(1489):123-37. Review. 

Robertson, Elizabeth J. Embryo-Derived Stem Cell Lines in Teratocarcinomas And 

Embryonic Stem Cells a Practical Approach. IRL Press, Oxford, 1987, 108-112. 

Rossignol S, Schwab M, Schwartz M, Fehlings MG. Spinal cord injury: time to move? J 

Neurosci. 2007 Oct 31;27(44):11782-92. Review. 

Rothfuss A, Dennog C, Speit G. Adaptive protection against the induction of oxidative 

DNA damage after hyperbaric oxygen treatment. Carcinogenesis. 1998 

Nov;19(11):1913-7. 

Rothfuss A, Stahl W, Radermacher P, Speit G. Evaluation of mutagenic effects of 

hyperbaric oxygen (HBO) in vitro. Environ Mol Mutagen. 1999;34(4):291-6. 

Rousselot P, Lois C, Alvarez-Buylla A. Embryonic (PSA) N-CAM reveals chains of 

migrating neuroblasts between the lateral ventricle and the olfactory bulb of adult 

mice. J Comp Neurol. 1995 Jan 2;351(1):51-61. 

Roy NS, Benraiss A, Wang S, Fraser RA, Goodman R, Couldwell WT, Nedergaard M, 

Kawaguchi A, Okano H, Goldman SA. Promoter-targeted selection and isolation of 

neural progenitor cells from the adult human ventricular zone. J Neurosci Res. 2000 

Feb 1;59(3):321-31. 

Roy NS, Nakano T, Keyoung HM, Windrem M, Rashbaum WK, Alonso ML, Kang J, 

Peng W, Carpenter MK, Lin J, Nedergaard M, Goldman SA. Telomerase 

immortalization of neuronally restricted progenitor cells derived from the human fetal 

spinal cord. Nat Biotechnol. 2004 Mar;22(3):297-305. 

Samadikuchaksaraei A. An overview of tissue engineering approaches for management 

of spinal cord injuries. J Neuroeng Rehabil. 2007 May 14;4:15. Review. 

Sawamoto K, Yamamoto A, Kawaguchi A, Yamaguchi M, Mori K, Goldman SA, 

Okano H. Direct isolation of committed neuronal progenitor cells from transgenic 

mice coexpressing spectrally distinct fluorescent proteins regulated by stage-specific 

neural promoters. J Neurosci Res. 2001 Aug 1;65(3):220-7. 

120

Schäbitz WR, Schade H, Heiland S, Kollmar R, Bardutzky J, Henninger N, Müller H, 

Carl U, Toyokuni S, Sommer C, Schwab S. Neuroprotection by hyperbaric 

oxygenation after experimental focal cerebral ischemia monitored by MRI. Stroke. 

2004 May;35(5):1175-9. 

Schlett K, Herberth B, Madarász E. In vitro pattern formation during neurogenesis in 

neuroectodermal progenitor cells immortalized by p53-deficiency. Int J Dev Neurosci. 

1997 Oct;15(6):795-804. 

Schlett K, Madarász E. Retinoic acid induced neural differentiation in a 

neuroectodermal cell line immortalized by p53 deficiency. J Neurosci Res. 1997 Feb 

15;47(4):405-15. 

Schmidt W, Reymann KG. Proliferating cells differentiate into neurons in the 

hippocampal CA1 region of gerbils after global cerebral ischemia. Neurosci Lett. 

2002 Dec 16;334(3):153-6. 

Sen CK, Khanna S, Roy S. Perceived hyperoxia: oxygen-induced remodeling of the 

reoxygenated heart. Cardiovasc Res. 2006 Jul 15;71(2):280-8. 

Seri B, Garcia-Verdugo JM, McEwen SB, Alvarez-Buylla A. Astrocytes give rise to 

new neurons in the adult mammalian hippocampus. J Neurosci 2001; 21: 7153–60 

Sharp FR, Liu J, Bernabeu R. Neurogenesis following brain ischemia. Brain Res Dev 

Brain Res. 2002 Mar 31;134(1-2):23-30. Review. 

Sheen VL, Macklis JD. Targeted neocortical cell death in adult mice guides migration 

and differentiation of transplanted embryonic neurons. J Neurosci. 1995 

Dec;15(12):8378-92. 

Shihabuddin LS, Ray J, Gage FH. FGF-2 is sufficient to isolate progenitors found in the 

adult mammalian spinal cord. Exp Neurol. 1997 Dec;148(2):577-86. 

Shin JJ, Fricker-Gates RA, Perez FA, Leavitt BR, Zurakowski D, Macklis JD. 

Transplanted neuroblasts differentiate appropriately into projection neurons with 

correct neurotransmitter and receptor phenotype in neocortex undergoing targeted 

projection neuron degeneration. J Neurosci. 2000 Oct 1;20(19):7404-16. 

Simon MC, Keith B. The role of oxygen availability in embryonic development and 

stem cell function. Nat Rev Mol Cell Biol. 2008 Apr;9(4):285-96. Review. 

121

Singh SK, Clarke ID, Terasaki M, Bonn VE, Hawkins C, Squire J, Dirks PB. 

Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Res. 2003 Sep 

15;63(18):5821-8. 

Skaper SD. Neuronal growth-promoting and inhibitory cues in neuroprotection and 

neuroregeneration. Ann N Y Acad Sci. 2005 Aug;1053:376-85. Review. 

Snyder EY, Taylor RM, Wolfe JH. Neural progenitor cell engraftment corrects 

lysosomal storage throughout the MPS VII mouse brain. Nature. 1995 Mar 

23;374(6520):367-70. 

Snyder EY, Yoon C, Flax JD, Macklis JD. Multipotent neural precursors can 

differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic 

degeneration in adult mouse neocortex. Proc Natl Acad Sci USA 1997 Oct 

14;94(21):11663-8. 

Speit G, Dennog C, Eichhorn U, Rothfuss A, Kaina B. Induction of heme oxygenase-1 

and adaptive protection against the induction of DNA damage after hyperbaric oxygen 

treatment. Carcinogenesis. 2000 Oct;21(10):1795-9. 

Speit G, Dennog C, Radermacher P, Rothfuss A. Genotoxicity of hyperbaric oxygen. 

Mutat Res. 2002 Dec;512(2-3):111-9. Review. 

Steinbach JP, Weissenberger J, Aguzzi A. Distinct phases of cryogenic tissue damage in 

the cerebral cortex of wild-type and c-fos deficient mice. Neuropathol Appl 

Neurobiol. 1999 Dec;25(6):468-80. 

Steinberg MS. Reconstruction of tissues by dissociated cells. Some morphogenetic 

tissue movements and the sorting out of embryonic cells may have a common 

explanation. Science. 1963, 141:401-8. 

Studer L, Csete M, Lee SH, Kabbani N, Walikonis J, Wold B, McKay R. Enhanced 

proliferation, survival, and dopaminergic differentiation of CNS precursors in lowered 

oxygen. J Neurosci. 2000 Oct 1;20(19):7377-83. 

Suhonen JO, Peterson DA, Ray J, Gage FH. Differentiation of adult hippocampus- 

derived progenitors into olfactory neurons in vivo. Nature. 1996 Oct 

17;383(6601):624-7. 

Sun D, McGinn MJ, Zhou Z, Harvey HB, Bullock MR, Colello RJ. Anatomical 

integration of newly generated dentate granule neurons following traumatic brain 

122

injury in adult rats and its association to cognitive recovery. Exp Neurol. 2007 

Mar;204(1):264-72. 

Suzuki M, McHugh J, Tork C, Shelley B, Klein SM, Aebischer P, Svendsen CN. GDNF 

secreting human neural progenitor cells protect dying motor neurons, but not their 

projection to muscle, in a rat model of familial ALS. PLoS ONE. 2007 Aug 

1;2(1):e689. 

Suzuki M, McHugh J, Tork C, Shelley B, Hayes A, Bellantuono I, Aebischer P, 

Svendsen CN. Direct muscle delivery of GDNF with human mesenchymal stem cells 

improves motor neuron survival and function in a rat model of familial ALS. Mol 

Ther. 2008 Dec;16(12):2002-10. 

Szatmári T, Lumniczky K, Desaknai S, Trajcevski S, Hidvegi EJ, Hamada H, Safrany 

G. Detailed characterization of the mouse glioma 261 tumor model for experimental 

glioblastoma therapy. Cancer Sci. 2006, 97(6):546-53. 

Szente M, Toldi J. A gerinces idegrendszer ontogenezise és plaszticitása Dialóg 

Campus, 1999. 

Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic 

and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 2006 Aug 25;126(4):663-76. 

Tan XW, Liao H, Sun L, Okabe M, Xiao ZC, Dawe GS. Fetal microchimerism in the 

maternal mouse brain: a novel population of fetal progenitor or stem cells able to 

cross the blood-brain barrier? Stem Cells. 2005 Nov-Dec;23(10):1443-52. 

Tashiro A, Makino H, Gage FH. Experience-specific functional modification of the 

dentate gyrus through adult neurogenesis: a critical period during an immature stage. J 

Neurosci. 2007 Mar 21;27(12):3252-9. 

Tate MC, Shear DA, Hoffman SW, Stein DG, Archer DR, LaPlaca MC. Fibronectin 

promotes survival and migration of primary neural stem cells transplanted into the 

traumatically injured mouse brain. Cell Transplant. 2002;11(3):283-95. 

Tárnok K, Pataki A, Kovács J, Schlett K, Madarász E. Stage-dependent effects of cell- 

to-cell connections on in vitro induced neurogenesis. Eur J Cell Biol. 2002 

Jul;81(7):403-12. 

Toni N, Laplagne DA, Zhao C, Lombardi G, Ribak CE, Gage FH, Schinder AF. 

Neurons born in the adult dentate gyrus form functional synapses with target cells. 

Nat Neurosci. 2008 Aug;11(8):901-7. 

123

Tropepe V, Coles BL, Chiasson BJ, Horsford DJ, Elia AJ, McInnes RR, van der Kooy 

D. Retinal stem cells in the adult mammalian eye. Science. 2000 Mar 

17;287(5460):2032-6. 

Uchida N, Buck DW, He D, Reitsma MJ, Masek M, Phan TV, Tsukamoto AS, Gage 

FH, Weissman IL. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proc 

Natl Acad Sci USA 2000 Dec 19;97(26):14720-5. 

Uno K, Merges CA, Grebe R, Lutty GA, Prow TW. Hyperoxia inhibits several critical 

aspects of vascular development. Dev Dyn. 2007 Apr;236(4):981-90. 

Urrea C, Castellanos DA, Sagen J, Tsoulfas P, Bramlett HM, Dietrich WD. Widespread 

cellular proliferation and focal neurogenesis after traumatic brain injury in the rat. 

Restor Neurol Neurosci. 2007;25(1):65-76. 

Xu F, Zhu JH. Stem cells tropism for malignant gliomas. Neurosci Bull. 2007 

Nov;23(6):363-9. Review. 

Yamashita T, Ninomiya M, Hernandez Acosta P, Garcia-Verdugo JM, Sunabori T, 

Sakaguchi M, Adachi K, Kojima T, Hirota Y, Kawase T, Araki N, Abe K, Okano H, 

Sawamoto K. Subventricular zone-derived neuroblasts migrate and differentiate into 

mature neurons in the post-stroke adult striatum. J Neurosci 2006, 26:6627– 6636. 

Varga BV, Hádinger N, Gócza E, Dulberg V, Demeter K, Madarász E, Herberth B. 

Generation of diverse neuronal subtypes in cloned populations of stem-like cells. 

BMC Dev Biol. 2008 Sep 22;8:89. 

Vassilopoulos G, Russell DW. Cell fusion: an alternative to stem cell plasticity and its 

therapeutic implications. Curr Opin Genet Dev. 2003 Oct;13(5):480-5. Review. 

Veltkamp R, Warner DS, Domoki F, Brinkhous AD, Toole JF, Busija DW. Hyperbaric 

oxygen decreases infarct size and behavioral deficit after transient focal cerebral 

ischemia in rats. Brain Res. 2000 Jan 17;853(1):68-73. 

Veltkamp R, Siebing DA, Sun L, Heiland S, Bieber K, Marti HH, Nagel S, Schwab S, 

Schwaninger M. Hyperbaric oxygen reduces blood-brain barrier damage and edema 

after transient focal cerebral ischemia. Stroke. 2005 Aug;36(8):1679-83. 

Vesely I. Heart valve tissue engineering. Circ Res. 2005 Oct 14;97(8):743-55. Review. 

Vlodavsky E, Palzur E, Soustiel JF. Hyperbaric oxygen therapy reduces 

neuroinflammation and expression of matrix metalloproteinase-9 in the rat model of 

traumatic brain injury. Neuropathol Appl Neurobiol. 2006 Feb;32(1):40-50. 

124

Weinzierl MR, Laurer HL, Fuchs M, Wolf-Ingo S, Mautes AE. Changes in regional 

energy metabolism after cortical cold lesion in the rat brain. J Mol Neurosci. 2002 

Jun;18(3):247-50. 

Weiss S, Dunne C, Hewson J, Wohl C, Wheatley M, Peterson AC, Reynolds BA. 

Multipotent CNS stem cells are present in the adult mammalian spinal cord and 

ventricular neuroaxis. J Neurosci. 1996 Dec 1;16(23):7599-609. 

Windrem MS, Nunes MC, Rashbaum WK, Schwartz TH, Goodman RA, McKhann G 

2nd, Roy NS, Goldman SA. Fetal and adult human oligodendrocyte progenitor cell 

isolates myelinate the congenitally dysmyelinated brain. Nat Med 2004 Jan;10(1):93-7 

Wobus AM, Guan K, Yang HT, Boheler KR. Embryonic stem cells as a model to study 

cardiac, skeletal muscle, and vascular smooth muscle cell differentiation. Methods 

Mol Biol. 2002, 185:127-56. 

Zádori A, Ágoston VA, Demeter K, Hádinger N, Várady L, Gőbl A, Nagy Z, Madarász 

E. Effects of oxygen tension on the survival and differentiation of neural stem cells. 

2010, kézirat benyújtva. 

Zhang CP, Zhu LL, Zhao T, Zhao H, Huang X, Ma X, Wang H, Fan M. Characteristics 

of neural stem cells expanded in lowered oxygen and the potential role of hypoxia- 

inducible factor-1Alpha. Neurosignals. 2006-2007;15(5):259-65. 

Zhao M, Momma S, Delfani K, Carlen M, Cassidy RM, Johansson CB, Brismar H, 

Shupliakov O, Frisen J, Janson AM. Evidence for neurogenesis in the adult 

mammalian substantia nigra. Proc Natl Acad Sci USA 2003 Jun24;100(13):7925-30. 

Zhuang J, Schmoker JD, Shackford SR, Pietropaoli JA. Focal brain injury results in 

severe cerebral ischemia despite maintenance of cerebral perfusion pressure. J 

Trauma. 1992 Jul;33(1):83-8. 

Ziu M, Schmidt NO, Cargioli TG, Aboody KS, Black PM, Carroll RS. Glioma- 

produced extracellular matrix influences brain tumor tropism of human neural stem 

cells. J Neurooncol. 2006 Sep;79(2):125-33. 

125

Saját publikációk jegyzéke 

Az értekezés alapjául szolgáló publikációk: 

Zádori A, Ágoston VA, Demeter K, Hádinger N, Várady L, Gőbl A, Nagy Z, Madarász 

E. Survival and differentiation of neural stem cells at different oxygen supply. 2010, 

kézirat benyújtva. 

Zádori A - Ágoston VA, Demeter K, Nagy Z, Madarász E. Different behaviour of 

implanted stem cells in intact and lesioned forebrain cortices. Neuropathol Appl 

Neurobiol. 2007 Oct;33(5):510-22. IF: 2.86. Kettős első szerzős cikk. 

Demeter K, Zádori A, Ágoston VA, Madarász E. Studies on the use of NE-4C embryonic 

neuroectodermal stem cells for targeting brain tumour. Neurosci Res. 2005 53(3):331-42. 

IF: 2,184. 

Eltérő témájú publikációk: 

Vigh B, Manzano MJ, Zádori A, Frank CL, Lukáts A, Röhlich P, Szél A, Dávid C. 

Nonvisual photoreceptors of the deep brain, pineal organs and retina. Histol 

Histopathol. 2002 Apr;17(2):555-90. Review. 

Fejér Z, Röhlich P, Szél A, Dávid C, Zádori A, Manzano MJ, Vígh B. Comparative 

ultrastructure and cytochemistry of the avian pineal organ. Microsc Res Tech. 2001 Apr 

1;53(1):12-24. Review. 

126

Köszönetnyilvánítás 

Köszönettel tartozom a dolgozat megszületéséért mindenekelőtt témavezetőmnek, Dr. 

Madarász Emíliának, aki bevezetett az idegi sejtbiológia világába, mindvégig rendkívüli 

türelemmel és megértéssel segítette munkámat, és nemcsak szakmai inspirációt adott, de 

emberi példát is mutatott. 

Köszönettel tartozom kutatótársamnak és mentoromnak, dr. Demeter Kornélnak, aki 

leglelkesebb oktatóm volt a laboratóriumi munkában, és dr. Ágoston Viktornak, állandó 

munkatársamnak, akivel együttműködésünk építő és örömteli volt. 

Köszönöm a Magyar Tudományos Akadémia Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézet 

vezetőjének, Prof. Freund Tamásnak, hogy lehetővé tette, hogy kutatásaimat ebben a 

nagyhírű intézetben végezhessem, és az Idegi Sejt- és Fejlődésbiológiai Labor összes 

munkatársának, hogy rengeteg szakmai segítséget nyújtottak és, hogy vidám perceket 

tölthettem velük. Köszönöm az egykori Országos Pszichiátriai és Neurológiai Intézet 

vezetőjének, Prof. Nagy Zoltánnak munkánkban nyújtott elméleti és gyakorlati 

segítségét, és a Sejtbiológiai Labor munkatársainak közreműködését kísérleteinkben. 

Köszönöm Dr. Gőbl Annának és a Baromedical Zrt. munkatársainak munkánkban 

nyújtott segítségét. 

Köszönöm Vígh Béla Professzor Úrnak, hogy érdeklődésemet felkeltette a sejtbiológia 

és az idegtudományok iránt. 

Végül, de nem utolsósorban, köszönöm férjemnek, Gergőnek bátorítását és támogatását, 

sógornőmnek, Gabinak együttérző biztatását és Szüleimnek a mindig megértő és 

támogató családi hátteret. 

127

dr. Zádori Anita - Semmelweis Egyetem Doktori Iskola

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?