Szteroid kinyerés gyakorlati leírás.pdf - Biomérnöki Tanszék

IPARI KINYERÉSTECHNIKA GYAKORLATBIOMÉRNÖK MScV. SZTEROID KINYERÉS FERMENTLÉBŐL(METIL-SZEKOOLON KINYERÉSE)Gyakorlatvezető: Csákiné dr Jäger SzilviaDE TTK Biomérnöki Tanszék, Kémia épület D61. SzteroidkonverziókAz emberi szervezetben a szteránvázas hormonoknak a víz- és sóháztartásszabályozásában (mineralo-kortikoidok), az anyagcserében (pl. glükokortikoidok -glükoneogenezis), a nemi működésekben (ösztrogének, gesztagének, tesztoszteron) és agyulladásos folyamatok szabályozásában van szerepük.A gyógyszeripar sok szteroid hormont és hormon-analógot állít elő, e gyártások egyrésze biotechnológiai lépéseket tartalmaz. Előállításuk általában soklépéses folyamat,amelyben a biokémiai és szintetikus lépések egyaránt előfordulnak. A biokémiai lépésekrendszerint egyetlen enzimes átalakítást jelentenek, azaz biokonverziókról van szó. Azátalakítások során leggyakrabban nyugvósejtes fermentációt (olyan elszaporított sejttömeg,melynek nincs szénforrása, nem szaporodik) alkalmaznak. A kémiai eljárások sok,környezetre káros anyagot bocsájtottak ki és emellett költségesek is voltak. Az elmúlt kétévtizedben nagyon sok kémiai szteroid technológia lett biotechnológiai eljárássalhelyettesítve.Az alkalmazott törzsek nagyon sokfélék, lehetnek baktériumok, élesztők, fonalasgombák. A bennük azonosított, és a technológiában kihasznált enzimek eredeti szubsztrátjanem az átalakítandó szteroid, hanem valamilyen más molekula, csak a szerkezeti hasonlóságmiatt az enzim felismeri, megköti és átalakítja a szteránváz bizonyos régióját. A szteránvázasvegyületek előállítása soklépéses, hosszadalmas folyamat. Egy-egy lépésben csak egy kisszerkezeti részt változtatnak meg, (sztereo)szelektív átalakításokra van szükség.1.1. A szteroidok általános előállítása:enzimindukciókonverziónyugvó sejttömeg enzimtermelés szteroid hormonszteroid v. analógmolekulával

A folyamat lépései:1.Oltás.2. Sejtszaporítás a törzs igényeinek megfelelő tápoldaton. A sejtek elszaporodása és a táptalajrészleges kimerülése után a konverzióhoz szükséges enzimet indukálják - induktor anyagotadagolnak. Ez lehet a szteroid szubsztrát kis adagja, vagy olcsóbb szintetikus molekula, pl.naftol-származék. Az indukció hatékonyságát enzimaktivitás méréssel lehet ellenőrizni. Azaktivitás általában 10-24 óra alatt eléri a kívánt szintet.3. A szteroid szubsztrát beadagolása. Komoly problémát jelent, hogy a szteroidok rosszuloldódnak vízben, ezért azokat különböző technikákkal viszik be a fermentlébe:3.a. Oldott formában:- A szubsztrátot felveszik oldószerben (pl.: etanol, mert az nem nagyon károsítja atenyészetet), és lassan a fermentorba engedik. A szteroid a vizes fázisbankikristályosodik, megfelelő kivitelezéssel igen apró, nagy felületű kristályokat kapunk.Az enzimek az oldott szubsztrátot átalakítják végtermékké, ami szinténkikristályosodik.- A ciklodextrinek molekulája alkalmas apoláris jellegű molekulák befogadására, így aszteroidokkal is zárványvegyületet képeznek. Ez egy reverzibilis folyamat, a szabad éskötött molekulák kémiai egyensúlyban vannak. Ahogy az átalakulás során a szabadszubsztrát molekulák fogynak, a komplexből felszabadulva folyamatosan pótlódnak.3.b. Kristály formában:- Kristályfermentáció: A rosszul oldódó szubsztrát apró, nagy fajlagos felületűkristályok formájában van jelen a lében, a vizes fázis telített oldatnak tekinthető. Amikroba az oldatból felveszi a szubsztrátot, átalakítja, és leadja a terméket. A termék isrosszul oldódó szteroid, koncentrációja gyorsan eléri az oldhatósági határt, és ez iskikristályosodik a fermentléből. A folyadékban a kristályok mennyisége nem változik,az oldott szubsztrátum és a termék telítési koncentrációban van jelen, a szilárd fázisösszetétele változik. Ha a termék kristályformája eltér a bevitt anyagétól, a változásmikroszkópon is követhető. Végtermékgátlás rendszerint nem lép fel, hátrányaviszont, hogy tömegátadási problémák léphetnek fel.- Olajokkal, tenzidekkel és detergensekkel forró vizes közegben megolvasztják aszteroidot, és az olvadt anyag apró cseppekre diszpergálható (emulzió képzés). Lehűtveaz apró cseppekből apró szemcsék/kristályok lesznek, nagy fajlagos felülettel, amigyorsabb beoldódást biztosít.- A Mycobacteriumoknak viaszos tokjuk van. A szteroid kristályok ideadszorbeálódnak, így a sejthez közel kerülnek, meggyorsul az anyagátadás.4. Feldolgozás. A szteroid termékek egy része oldott, a másik része szilárd fázisban van,ilyenkor rendszerint teljes/totál extrakciót végeznek erősen apoláris oldószerrel, pl. diklórmetánnal,mely minden apoláris anyagot kiold. Az oldószer lehajtása után vegyes anyagmarad vissza (pl. szubsztrát, termék és melléktermékek együtt). A következő lépésben olyanoldószert alkalmaznak, mely szelektíven old ki egy komponenst; ez a szelektív-, vagydifferenciál-extrakció (pl.: di-izopropil-éter, etil-acetát, metanol vagy ezek keveréke). Atermékek különböző adszorpciós-deszorpciós tulajdonságait adszorpciós gyantákalkalmazásával lehet kihasználni.

1.2. Szteroid alapanyagok:A különböző szteroidok előállításához növényi, állati és szintetikus szteroidokathasználnak fel alapanyagként. Növényi eredetű szteroidok a szitoszterin, illetve asztigmaszterin melyek a szójaolajban találhatók. A koleszterint állati szervekből, pl.gerincvelőből nyerik. Szintetikus úton a szteránvázat kezdeti lépésként pl. β-naftol ésborostyánkősav-anhidrid reakciójával, majd további kémiai lépésekkel – gazdaságosabbanmikrobiológiai átalakításokkal kombinálva - állíthatjuk elő.Ezen szteroid molekulákat enzimek segítségével alakítják át és szteroid hormonokat,hormonananalógokat és egyéb gyógyszereket állítanak elő.A különböző törzsek számára a szteránvázas vegyületek alternatív szubsztrátotjelentenek, melynek csaknem minden funkciós csoportját át tudja alakítani valamelyikmikroorganizmus.1.3. A szterán alapváz:Alapváz a gonán, csak a 4 gyűrűből áll, további alapvázak metil- ill. etil- csoportokkalkiegészülve az esztrán, androsztán és pregnán.

A szterán alapváz és származékainak számozása:1.4. Nor-szteroidok:A nor kitétel a szerves kémiában arra utal, hogy a molekulában egy szénatomhiányzik. Ebben az esetben a 19. metilcsoport hiányzik. A nor–szteroidok a fogamzásgátlókhatóanyagai.A szeko- előtag pedig felnyitott gyűrűre utal, a C gyűrű nem záródik, a 8-14 kötéshiányzik. A molon mellett az etil származék (etolon) is gyártott intermedier.A gyártás első lépései szintetikusak: a naftolból részleges hidrogénezéssel tetralint, aborostyánkősav-anhidridből metil-ciklopentán-diont állítanak elő. A két molekulaösszekapcsolásával jön létre a metil-szekodion. Ezután következik a biokonverzió, a kétegyenértékű keto-csoport egyikét redukálják. A reakciót alkohol dehidrogenáz enzimekvégzik, melyeket különböző szelektált élesztő törzsek (Saccharomyces bayanus) termelnek. Aterméket rövid néven molonnak nevezik. Feldolgozás: a kivált terméket és a sejteket leszűrik,majd a szűrőlepényt etilacetáttal extrahálják. Az etil származék (etolon) gyártása teljesenanalóg módon történik.A reakció lefolyását gyorsítja, ha a szubsztrátumot, a metil-szekodiont - (3-metoxi-8,14-szeko-1,3,5(10),9(11)-ösztratetraén-14,17-dion) - mikrokristályos formában adagolják azélesztő tenyészethez, mert a mikrokristályos anyag oldódási potenciálját befolyásolja akristály mérete. A redukált termék viszont mikroszkópon is jól látható méretbenkristályosodik. A kristály folytonosan növekvő mérete elősegíti a kívánt termékfelszaporodását, a nagy méretű kristály a termék kiválást is segíti.

Ha a 13. helyen metil csoport van: metil-szekodion → metil-szekoolon (molon).Ha a 13. helyen etil csoport van: etil-szekodion → etil-szekoolon (etolon).

1.5.A Me-szekodion fermentáció és termékkinyerés folyamatábrája:1 db szilárd ferde tenyészet3 x 100 ml oltótáptalajFelületi tenyészetOltófermentációvisszasterilezve, csatornába230 ml tenyészet visszasterilezve0,9 l tenyésztő táptalajkb. 0,1 ml habgátlóFőfázis,előtenyésztés25 g Me-szekodion85 ml vízBiokonverzió43 mg Tween-8085 mg mosópor37,5 g szacharóz részletekbenSzűréskb. 1 l fermentlékb. 950 ml szűrlet visszasterilezve400 ml 80 %-s EtOHExtrakció1 óra 48-50 o C50 ml 80 %-s EtOH Szűréskb. 12 g száraz biomasszakb. 500 ml extraktumBepárlás vízigkb. 360 ml 80 %-s EtOH80 ml kristályszuszpenzió120 ml etilacetátBeoldás,szeparáláskb. 50 ml vizes fáziskb. 150 ml szerves fázis0,6 g aktív szén Derítés, szűrés derítőszer égetésreBepárláskb. 90 ml etilacetátKristályosításkb. 40 ml kristályszuszpenzióSzárítás

2. A gyakorlat: Me-szekoolon fermentléből történő kinyeréseA szteroidok biokonverziója gyakorlat során metil-szekodion szubsztrátbólmikrobiális konverzióval előállított termék a metil-szekoolon, más néven molon. A fermentlécentrifugálása után a kivált termékkristályokat -20 o C-n tároltuk felhasználásig. A gyakorlatcélja a metil-szekoolon termék kristályos formában történő kinyerése a fermentléből.A kiindulási anyag (Metil-szekodion)IUPAC szerinti elnevezés:13β-metil-3-metoxi-8,14-szeko-1,3,5(10),9(11)-gonatetraén-14,17dionCAS szerinti elnevezés:1,3-Ciklopentándion, 2-[2-(3,4-dihidro-6-metoxi-1(2H)-naftalinilidén)etil]-2-metilCAS no. [899-79-6] (Chemical Abstract System)A biokonverzióval előállított termék (Metil-szekoolon):IUPAC szerinti elnevezés:13 -metil-3-metoxi-17 -hidroxi-8,14-szeko-1,3,5(10),9(11)-gonatetraén-14-onCAS szerinti elnevezés:Cyclopentanone,- 2-[2-(3,4-dihydro-6-methoxy-1(2H)-naphtalenylidene) ethyl]-3-hydroxy-2-methyl-, 2R cisCAS no. [16976-39-9]Szerkezeti képletOHOCH 3 O

2.1. A centrifugált biomassza + kristály feldolgozásának módja:1. Szteroidok kioldása etilalkohol-víz eleggyel. A szteroidok kioldásánál érdemes vízzelelegyedő szerves oldószert használni, mivel a termék és a sejtek vizes közegbenvannak jelen. A szteroid vízben nagyon rosszul oldódik, a szilárd fázisban (kiváltkristályok) kb. 1000x mennyiségben van jelen, ezért a lecentrifugált fermentléből márnem érdemes kinyerni az esetlegesen oldott terméket.Az etanolos extrakció során melegítésre van szükség. A szteroid oldhatósága rosszabbvizes szerves oldószerben, melegítés hatására nő az oldhatósága és kevesebb oldószerszükséges.2. Szűrés, szűrt biomassza kimosása etilalkohol-víz eleggyel, maradék biomasszaelhelyezése égetésre szánt hulladékgyűjtőben. Meleg vízfürdőben kell szűrni, hogymegakadályozzuk kristályok kiválását.3. A szűrt vizes-etilalkoholos oldat lepárlása, a vizes sűrítményből kicsapódó szteroidokextrakciója etilacetáttal. Cél, hogy az etanolt teljesen lepároljuk, a visszamaradó vizesoldatban a szteroidok kicsapódnak. Lepárláskor előnyös, ha marad egy kis víz alombik alján, így nem kenődik ki az anyag a lombik falára, hanem kiönthető. Majd arázótölcsérben történő összerázás során a szteroid átoldódik a vizesből az etilacetátosfázisba.4. Az etilacetátos szteroid oldat szárítása Na 2 SO 4 -tal. Ezzel a lépéssel a még nyomokbanjelen levő vizet eltávolítjuk. Az etilacetát kb 10 % vizet tud oldani. A víztartalmúszerves oldószerek opálosak, s az adagolt Na 2 SO 4 pedig összeáll, csomósodik addig,amíg a vizet megköti. Miután már nincs víz, amit megkössön, por alakban marad azoldatban. Tehát addig adagoljuk a Na 2 SO 4 -t, amíg szép tiszta áttetsző lesz az oldat, ésa Na 2 SO 4 már nem tapad össze.Oldatok szárítására a legáltalánosabban használt módszer a szárítószerek alkalmazása.A szárítószerek általában olyan kémiai anyagok, melyek a vízzel fizikai vagy kémiaireakcióba lépnek, ezáltal a vizet megkötik. A szárítószerek szobahőmérsékleten vagyaz alatt is biztonsággal szárítanak, ezáltal hőre érzékeny vegyületek szárítása isbiztonsággal elvégezhető. A szárítószer kiválasztásánál a következőkre legyünktekintettel:- A szárítószer vagy a szárításnál keletkező termékek ne reagáljanak a szárítandóvegyülettel.- A szárítószer gyorsan és maradék nélkül eltávolítható legyen a szárítandófolyadékból, ne oldódjon a szerves oldószerben.- A szárító hatás megfelelően gyorsan és hatásosan érvényesüljön.- A szárítószereket a további feldolgozás előtt szűréssel távolítsuk el az oldatból.Soha ne használjunk nagy mennyiségű szárítószert az oldatok szárítására, mivel azadszorbeálhatja a kinyerni kívánt komponenst is! Ha a szárítószert szűréssel távolítjukel, az anyagveszteség csökkentésére a szűrőn maradt szárítószert kis mennyiségűvízmentes oldószerrel öblítjük át.5. Az etilacetátos szteroid oldat derítése aktív szénnel és Al 2 O 3 -dal.A derítés olyan eljárás melynek feladata az oldatban lévő színezékek megkötése, majdszűréssel elválasztva tisztítja az oldatot. A derítés lehet vegyipari, élelmiszeripari pl.borászati eljárás. Célja a bort tükrössé, vagyis kristálytisztává tenni azáltal, hogy olyankolloid anyagokat keverünk hozzá – például zselatin, tannin (csersav), fehérjék,

entonit – amelyek adhézió útján a lebegő, zavarosságot okozó anyagokat magukkalragadják.Az aktív szén gyártása során a szenet porrá őrlik, kötőanyag segítségével beállítják akívánt szemcseméretet, végül nagyhőmérsékletű gőzzel kezelik. A gőzzel való kezelésmaga az aktiválási folyamat, amely során a szénben üregek keletkeznek, igen nagyfajlagos felületet eredményezve. Az aktív szén fő felhasználási területe a szerves anyagokés illékony szerves vegyületek csökkentése, valamint a nem kívánt ízt és szagot okozóösszetevők eltávolítása. Nem kifejezetten alkalmas lebegőanyag eltávolítására, mert alegtöbb ilyen lebegőanyag eltömi az aktív szénben lévő üregeket, ezzel csökkentvefelületét és adszorpciós kapacitását. Nagy felülete miatt az aktív szén rendkívül jóadszorpciós tulajdonságokkal rendelkezik.Az aktivált alumíniumoxid (Al 2 O 3 ) az amorf- és a γ-alumíniumoxid keveréke, melyet azAl(OH) 3 kishőmérsékletű (300–600°C) dehidratációjával nyernek. A szűrési folyamatotfelületi adszorpciónak nevezik, de valójában a szennyező anyag és a szűrőanyag felületénlévő hidroxid kicserélődésén alapul. Az AA-t nátriumhidroxiddal regenerálják és néhányalkalmazás savas mosást is igényel.6. A derített oldat bepárlása, kristályosítás, szűrés.7. A kiszűrt kristályok mosása apoláros oldószerrel. A hexán a maradék zsírokat,olajokat kioldja, és a maradék etilacetátot eltávolítja a kristályokból. A hexános mosásután világosbarna porszerű anyagot kapunk.8. Szárítás. Alacsony hőmérsékleten, szárítószekrényben. Magas hőmérsékletemmegolvad az anyag.A műveletek részletezését lsd. külön táblázatban.84% (v/v) etanol-víz készítése: 840 ml etanol+160 ml víz (PW)

HPLC:Készülék: HP 1090 Liquid ChromatographOszlop: Lichrospher 100 RP18 (5 m) (Merck)A Lichrospher hagyományosan előállított gömb alakú szilikagél hordozó 5 μmrészecskemérettel, amely kiegyensúlyozott nyomás/szétválasztás arányt biztosít. C-18-as, fordított fázisú. Kiválóan alkalmas semleges, savas és gyengén lúgos vegyületekszétválasztására.HPLC mérés:Eluens: acetonitril + deszt. víz = 1:1 gondosan homogenizált elegyeÁramlási sebesség: 1,0 cm 3 /percDetektálás: 265 nmInjektálás: 25 lMennyiségi értékelés: külső standard módszer, molon és metil-szekodionmunkastandardokraStandard koncentráció: metil-szekoolon: 20 g/ cm 3metil-szekodion: 20 g/ cm 3Standardoldatok készítése: 10 mg munkastandardot bemérünk 10 cm 3 -esnormállombikba, acetonitrilben oldjuk, az oldódástultrahangos kezeléssel segítjük; az így elkészítetttörzsoldatot hűtve tároljuk; a törzsoldatból naponkéntkészítjük 100× higítással a 20-20 g/ cm 3koncentrációjú standard oldatokat; a hígítástacetonitrillel végezzükJellemző retenciós idők (perc): metil-szekoolon 2,85metil-szekodion 4,31Számolás: H.a. % = Tm x StB /StT/Bm x 100Jelölések a számolásnál: Tm= minta területStB= standard bemérésStT= standard területBm= minta bemérésH.a. %= hatóanyag tartalom %-banFelhasznált irodalmak, források:- Szentirmai Attila professzor úr előadásai, hallgatói segédlete- A Richter Gedeon Nyrt. önzetlen segítsége, Hantos Gábor szíves tanácsai- Pécs Miklós: Biotermék technológia 2. 9. Szteroidkonverziók, BME AlkalmazottBiotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék