Multiplikasi, Induksi Planlet dan Seleksi Tembakau Hasil ...

Bioteknologi 1 (2): 31-36, Nopember 2004, ISSN: 0216-6887Multiplikasi, Induksi Planlet dan SeleksiTembakau Hasil Transformasi Gen Coat ProteinSMV Secara Kultur in VitroIn-vitro multiplication, planlets induction, and selectionof tobacco transformed with the SMV coat protein geneAGUNG-ASTUTI, E. HANDAYANI ♥ , I.A. RINEKSANE,N.A. FITRIYAHProgram Studi Budidaya Pertanian Universitas Muhammadiyah Yogyakarta55256Diterima: 15 Maret 2004. Disetujui: 17 Mei 2004.ABSTRACT♥ Alamat korespondensi:Jl. HOS Cokroaminoto 17,Yogyakarta 55256.Tel/Fax: +62-274-618044.e-mail: ettym@umy.ac.id,ettym@eudoramail.comA study has been conducted to screen and multiply calluses and buds oftobacco transformed with the Soybean Mosaic Virus (SMV) coat proteingene and to induce them to plantlet formation by using MS medium withphytohormon treatments. The multiplication of calluses and buds wascarried out by sub-culturing on MS medium using 0.3 mg/L NAA+1 mg/LBAP, followed by induction of plantlet formation on MS mediumsupplemented with NAA and BAP at varied concentration. The resultsshowed that tobacco calluses transformed with SMV coat protein gene wasmultipliable on MS medium supplemented with NAA at a concentration of0.3 mg/mL and BAP at 1 mg/L concentration. In this experiment kanamycinwas used at a concentration of 100 μg/mL which resulted in the viabilitylevel of 84%. On MS medium supplemented with 0.3 mg/L NAA, 0.1 mg/LBAP, and 100 μg/mL kanamycin, induction of calluses to plantlet formationreached 20% level.Keywords: multiplication, induction, selection, tobacco, SMV coat proteingene.PENDAHULUANBanyak penyakit tanaman yang sesungguhnyadisebabkan infeksi virus namun disebarkanmelalui vektor serangga inang. Mosaik daunmerupakan penyakit virus penting padatanaman yang hingga kini belum ditemukanmetode pengendalian yang memadai. Virustersebut dapat bertahan hidup bertahun-tahundalam sisa tanaman yang mudah terinfeksi ataudi dalam tanah, mudah menular, dan sulitdikendalikan (Agrios, 1988; Prescot et al., 1999).Soybean Mosaic Virus (SMV) merupakan virusyang menyerang kedelai, penyebab penyakitmosaik (crinkle). Bibit memperlihatkan gejalatumbuh tinggi dan kurus. Daun nekrotik,keriput, dan melengkung ke bawah, tulang daunmenguning dan cepat rontok, tanaman menjadikerdil dan akhirnya mati. Virus merupakan ageninfeksi dengan satuan terkecil virion yang terdiridari bahan genetik DNA atau RNA dan proteinselubung coat protein (cp). Pada saat menginfeksisel, virus akan memasukkan bahan genetiknyadan bereplikasi dengan cepat dan setelah coatprotein (cp) menyelubungi bahan genetik makaterjadi lisis sel (Prescott et al., 1999). Penyakitmosaik kedelai dapat mempengaruhipertumbuhan dan hasil panen 60-90%, bahkanmengakibatkan kegagalan panen (Somaatmadja,1988; Semangun, 1991). Tobacco Mozaic Virus(TMV) merupakan virus yang menyerangtanaman tembakau, dapat menghambat

32Bioteknologi 1 (2): 31-36, Nopember 2004pertumbuhan tanaman. Daun belang denganwarna hijau muda sampai kuning, luas dauntidak merata, daun menjadi kering dan keriput,sehingga menurunkan mutu daun dan nilaijualnya menjadi rendah. Mosaik tembakau dapatmenurunkan produksi hingga 60% (Semangun,1991).Berbagai cara pengendalian penyakit akibatvirus telah dilakukan, namun hasilnya kurangmemuaskan. Pada saat ini banyak penelitimenggunakan teknik rekayasa genetik untukmengembangkan tanaman transgenik yang tahanterhadap virus yang disebut sebagai CP-MediatedResistance (CP-MR),, yaitu: ketahanan tanamanyang disebabkan oleh ekspresi gen coat protein(Beachy, 1998). Dilaporkan oleh Power-Abel etal., (1986) tembakau transgenik cp-TMV yangresisten terhadap TMV ternyata tidakmenunjukkan adanya gejala penyakit, meskipundiinokulasi dengan Tomato Mosaic Virus(ToVM)maupun SMV. Demikian juga tomat yangdiinfeksi gen cp-TMV ternyata tahan terhadapToVM (Nelson, 1988).Untuk mendapatkan tanaman kedelai yangtahan terhadap penyakit Mosaik, perludikembangkan tanaman transgenik denganpenyisipan gen cp-SMV. Isolasi virus SMV isolatlokal dari Yogyakarta dan amplifikasi gen coatprotein SMV telah dilakukan dan berhasil diklonpada plasmid pCP 19-1, kemudian dipindah kevektor pRT 101 dan pCV002, lalu ditransformasike bakteri Agrobacterium (Sismindari dan Sujadi,1996). Selanjutnya Agrobacterium yangmengandung cp-gen tersebut telah berhasilditransformasikan ke daun tembakau denganmetode leaf disc transformation dan membentukkalus tunas pada medium MS yang ditambahNAA kadar 0,3 mg/L dan BAP kadar 1 mg/Ldengan penanda kanamisin untuk seleksi(Agung-Astuti et al., 2002).Tujuan jangka panjang penelitian ini adalahuntuk mendapatkan tanaman kedelai yang tahanterhadap infeksi virus SMV dengan mekanismeCP-MR. Untuk mengetahui bekerjanya sistemekspresi gen cp-SMV isolat lokal, maka perluditransformasi ke tembakau sebagai tanamanmodel, karena tembakau sudah biasa digunakandalam penelitian transformasi, sehingga relatifmudah diperoleh transformasi genetik danregenerasi tanaman transgeniknya dalam kulturin vitro.Untuk mengembangkan tembakau transgenikyang tahan virus, maka harus dilakukanmultiplikasi kalus dan induksi planlet, sebelumaklimatisasi serta serangkaian pengujian baiksecara in vitro pada aras molekular maupunpengujian dilapangan berupa ketahananterhadap virus. Faktor yang mempengaruhikeberhasilan kultur in vitro antara lain: keadaanaseptis, lingkungan fisik seperti cahaya dantemperatur, sumber eksplan, komposisi mediadan ZPT (zat pengatur tumbuh) (Pierik, 1987).Kultur in vitro tembakau transgenik cp-SMVpada medium MS yang ditambah NAA kadar 0,3mg/L dan BAP kadar 1 mg/L dapatmenghasilkan kalus dan tunas (Agung-Astuti etal., 2002). Selanjutnya hasil penelitianEstuningsih (1999) menunjukkan bahwa kultur invitro tembakau akan menghasilkan planlet padamedium MS yang ditambah dengan NAA 3mg/L dan BAP 1 mg/L.Tujuan penelitian ini adalah (i)memperbanyak kalus dan tunas tembakau hasiltransformasi gen cp-SMV; (ii) menginduksimenjadi planlet pada medium MS denganperlakuan ZPT; dan (iii) menyeleksi transformanterhadap ketahanan kanamisin. Dari hasilpenelitian ini diharapkan diperoleh kalus, tunasdan planlet tembakau hasil transformasi yangselanjutnya dapat dikembangkan denganserangkaian penelitian dan pengujian. Apabilatelah dihasilkan tanaman tembakau atau kedelaitransgenik tahan virus maka pada akhirnyadapat dikembangkan bibit tahan virus secaramassal melalui kultur in vitro untuk memenuhikebutuhan petani, sehingga penurunan produksiakibat serangan virus dapat dikendalikan.BAHAN DAN METODEBahan dan alatBahan yang digunakan pada penelitian terdiridari: bakteri Agrobacterium yang mengandungplasmid rekombinan cp-SMV isolat lokal dari Dr.Sismindari, Apt. Kalus tembakau transgenik cp-SMV koleksi Ir. Agung-Astuti, M.Si. Medium MSdengan NAA dan BAP untuk multiplikasi daninduksi kultur in vitro. Alat-alat yang digunakanterdiri dari: alat gelas untuk kultur in vitro,dissetting set, laminar air flow, autoklaf,timbangan analitik, dan mistar.Cara kerjaMultiplikasi kalusKalus tembakau hasil transformasi dimultiplikasipada medium MS sesuai prosedur Goergedan Sherington yang ditambah NAA kadar 0,3

AGUNG-ASTUTI dkk. – Tembakau hasil transformasi gen coat protein SMV 33mg/L dan BAP kadar 1 mg/L+kanamisin 100ug/mL sebagai marker seleksi. Diamatipersentase hidup eksplan, tinggi eksplan (mm),dan jumlah daun yang ditampilkan dalambentuk histogram untuk menunjukkan tingkatmultiplikasi eksplan.Kalus dan daun tembakau hasil transformasiyang diperoleh selanjutnya diinduksi menjadiplanlet pada medium MS perlakuan ZPT yangdirancang dengan CRD faktor tunggal 15perlakuan, yaitu: kombinasi NAA (0,1; 0,3; 1; 2; 3)mg/L dan BAP (0,1; 0,3; 1) mg/L, masingmasingdiulang 5 kali. Diamati berat segar (g)dan persentase planlet (%). Data dianalisisdengan uji F pada taraf beda nyata 5%.Seluruh tahapan multiplikasi dan induksidilakukan dalam kondisi aseptis dan diinkubasipada pencahayaan sekitar 1000 lux (dengantransmission light) fase gelap 8 jam dan faseterang 16 jam serta suhu 25-28 0 C selama 8minggu.HASIL DAN PEMBAHASANMultiplikasi kalus dan seleksi tembakau hasiltransformasi gen cp-SMVKalus tembakau hasil transformasi gen cp-SMV hasil penelitian terdahulu dimultiplikasipada medium MS yang ditambah NAA kadar 0,3mg/L dan BAP kadar 1 mg/L+kanamisin 100μg/mL sebagai penanda seleksi, hasilnya tersajipada Gambar 1.Selama multiplikasi 8 minggu tampakpeningkatan biomassa kalus tembakau hasiltransformasi gen cp-SMV secara eksponensial.Hal ini menunjukkan bahwa sel dapat tumbuhsendiri, meskipun telah dipisah dari tanamaninduknya karena memiliki potensi genetik yangmampu memperbanyak diri dengan jalanregenerasi, sesuai teori totipotensi sel (Pierik,1987).MultiplikasiKalus transformangen –cp SMVInduksi tunasPlanlet tembakauhasil screeningGambar 1. Kalus tembakau hasil transformasi gen cp-SMV.

34Bioteknologi 1 (2): 31-36, Nopember 2004Gambar 2. Pertambahan tinggi tanaman tembakau eksplan selama multiplikasi.Gambar 3. Jumlah daun tanaman eksplan tembakau selama multiplikasi.Hasil multiplikasi menunjukkan bahwa 84%eksplan mampu hidup pada medium MSditambah NAA kadar 0,3 mg/L dan BAP kadar 1mg/L dengan kanamisin 100 μg/mL sebagaimarker seleksi. Hal ini disebabkan gen cp-SMVtelah dikonstruksi pada plasmid pCV002 yangmempunyai resistensi terhadap kanamisin, danpada saat transformasi terjadi integrasi ke seltembakau melalui T-DNA bakteri Agrobacterium,sehingga kalus tembakau yang mengandung gencp-SMV mampu hidup pada medium MS yangditambah kanamisin (Sheng dan Citovsky, 1996;Sismindari dan Sudjadi, 1996).Pertambahan tinggi eksplan dan jumlah daunselama multiplikasi pada medium MS denganNAA kadar 0,3 mg/L dan BAP kadar 1 mg/Ldan seleksi kanamisin 100 μg/mL diamati,hasilnya disajikan pada Gambar 2 dan Gambar 3.Dari Gambar 2 dan 3 diketahui bahwabeberapa eksplan tanaman tembakau mengalamipertambahan tinggi dan jumlah daun yangsangat nyata. Hal ini menunjukkan adanyaperkembangan kalus tembakau hasiltransformasi gen cp-SMV secara in vitro melaluiorganogenesis,, yaitu: terbentuk kalus yang barudan tunas atau daun. Eksplan yang dikulturkanmengalami morfogenesis organ adventif secaratidak langsung. Eksplan membentuk kalusterlebih dahulu, kemudian dirangsang padamedium baru, selanjutnya sel kalus akanberdiferensiasi dan bermorfogenesis membentuktunas dan daun (Mantell et al., 1985).

AGUNG-ASTUTI dkk. – Tembakau hasil transformasi gen coat protein SMV 35Induksi planlet dan seleksi tembakau hasiltransformasi gen cp-SMVKalus dan daun tembakau hasil trans-formasiyang diperoleh dari multiplikasi kalus padamedium MS diinduksi dengan variasi berbagaikadar NAA dan BAP. Rerata berat segar eksplandan persentase planlet tersaji pada Tabel 1. Daritabel tersebut tampak bahwa medium MS yangdiinduksi dengan variasi berbagai kadar NAAdan BAP menunjukkan tidak adanya pengaruhsecara nyata terhadap berat segar eksplan.Namun kadar NAA 0,3 mg/L dan BAP 0,1 mg/Lmampu menginduksi planlet tertinggi, 80%.Auksin merupakan ZPT yang secara in vitroberperan dalam pembentukan akar. NAA 0,3mg/L dapat memacu pembentukan akar,selanjutnya ditambah dengan BAP 0,1 mg/Lmampu meng-imbangi adanya sitokinin endogendalam eksplan sehingga merangsangpembentukan tunas dan planlet. Kadar auksindan sitokinin yang tinggi menyebabkanterbentuknya kalus.Tabel 1. Rerata berat segar eksplan dan persentaseplanlet tembakau hasil transformasi gen cp-SMV umur8 minggu.Medium MS denganperlakuan kadarNAA+BAP (mg/L)Rerataberat segar(g)Persentaseplanlet(%)0,1+0,1 1,75 a 400,1+0,5 1,72 a 00,1+1,0 1,58 a 400,3+0,1 2,81 a 800,3+0,5 1,85 a 200,3+1,0 1,67 a 01,0+0,1 1,66 a 201,0+0,5 1,71 a 01,0+1,0 1,72 a 202,0+0,1 1,48 a 02,0+0,5 1,49 a 02,0+1,0 1,98 a 03,0+0,1 1,81 a 03,0+0,5 1,85 a 03,0+1,0 1,80 a 0Keterangan: angka yang diikuti dengan huruf samamenunjukkan tidak ada beda nyata menurut uji Fjenjang 5%.Selanjutnya planlet diseleksi menggunakanmedium MS ditambah NAA kadar 0,3 mg/L danBAP kadar 0,1 mg/L dengan kanamisin 100μg/ml. Hasil seleksi transforman terhadapketahanan kanamisin menunjukkan bahwaplanlet yang terinduksi sebanyak 20%,pembentukan kalus dan tunas sebesar 64%;sedang 12% mengalami pencoklatan (browning)atau pemucatan (filtrifikasi) dan 4% mengalamikontaminasi oleh bakteri. Penurunan persentaseinduksi planlet disebabkan adanya resistensiterhadap kanamisin. Sel yang tidak mengandunggen cp-SMV dengan penanda kanamisin akanmengalami pencoklatan, pemucatan ataukematian, sebab kanamisin akan mengubahkonformasi ribosom, sehingga ikatan aminoasiltRNA pada mRNA tidak mantap dan transferasam amino menjadi tidak sempurna akibatnyametabolisme terganggu dan terjadi kematian(Prescot et al., 1999).KESIMPULAN DAN SARANDari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa:(i) kalus tembakau hasil transformasi gen cp-SMV dapat dimultiplikasi pada mediumMS+NAA 0,3 mg/L+BAP 1 mg/L+kanamisin100 ug/mL dengan persentase hidup sebesar84%; (ii) eksplan mengalami morfogenesis organadventif secara tidak langsung denganmembentuk kalus yang akan berdiferensiasi danbermorfogenesis membentuk tunas dan daun;(iii) kalus tembakau hasil transformasi gen cp-SMV yang dapat didiinduksi menjadi planletsebesar 20% pada medium MS ditambah NAAkadar 0,3 mg/L dan BAP kadar 0,1mg/L+kanamisin 100 μg/ml.Penelitian selanjutkan disarankan untukmemfokus pada: (i) deteksi gen cp-SMV padakalus dan tunas tembakau hasil transformasi; (ii)penelitian in vitro untuk mempersiapkan planletagar dapat diaklimatisasi; (iii) pengujianketahanan bibit tembakau transgenik cp-SMVterhadap penyakit TMV; dan (iv) penelitiankultur in vitro kedelai untuk selanjutnyaditransformasi dengan gen cp-SMV.DAFTAR PUSTAKAAgrios, G.N. 1988. Plant Pathology. 3th ed. New York:Academic Press.Agung-Astuti, D. Sunarwati, dan Sismindari. 2002.Transformasi Gen Coat Protein SMV ke Daun Tembakaumelalui Agrobacterium. Prosiding Seminar Nasional InovasiTeknologi Dalam Mendukung Pengembangan Agribisnis. 2002Beachy, RN. 1998. Virus-resistant Transgenic Plants. In:Biotechnology in Plant Disease Control. New York: Wiley-Liss.Estuningsih, S.P. 1999. Budidaya Tembakau Temanggung yangBerciri Srintil Secara In Vitro. [Tesis S-2]. Yogyakarta:Program Pasca Sarjana UGM.Mantell, S.H., J.A. Matthews, and R.A. McKee. 1985. Principleof Plant Biotechnology An Introduction To Genetic

36Bioteknologi 1 (2): 31-36, Nopember 2004Engineering in Plants. London: Blackwell ScientificPublications.Nelson, R.S. 1988. Virus tolerance, plant growth and fieldperformance of transgenic tomato plant expressing coatprotein from TMV. Bio/Technology 6: 403-409.Pierik, R.I., 1987. In Vitro Culture of Higher Plant. Netherlands:Martinus Nijhoff Pub.Power-Abel, P., R.S. Nelson, B.D.N. Hoffmann, F. Roger, andR.N. Beachy. 1996. Delay of desease development intransgenic plant that express the TMV coat protein gene.Science 232: 738-743Prescot, L.M., J.P. Harley, and D.A. Klein. 1999. Microbiology.New York: McGraw-Hill Book Co.Semangun, H., 1991. Penyakit-penyakit Tanaman Perkebunan diIndonesia. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press.Sheng, J. and V. Citovsky. 1996. Agrobacterium-Plant CellDNA Transport: Have Virulence Protein, Will Travel. ThePlant Cell 8: 1699-1710.Sismindari dan Sujadi. 1996. Kloning Gen Coat Protein SMVdengan pendekatan PCR. Jurnal Perlindungan TanamanIndonesia 2: 36-39Somaatmadja, S. 1988. Kedelai. Bogor: Badan Penelitian danPengembangan Pertanian P3TP.