Hukum Lambert-Beer - Fakultas Farmasi Universitas Andalas

Metode Analisis ObatPENGGOLONGAN METODE ANALISIS OBATBeberapa metode analisis obat yang biasa digunakan, baik yangkonvensional maupun yang menggunakan instrumen dapatdikelompokkan sebagai berikut:1. Metode Analisis Kimia• Gravimetri• Titrasi (volumetri): meliputi titrasi asam basa, pengendapan, pembentukankomplek, oksidasi-reduksi, nitrimetri2. Metode Analisis Fisikokimia• Analisis elektrokimia: meliputi polarografi, potensiometri, konduktometri• Spektrofotometri meliputi: spektrofotometri sinar UV-tampak (UV-visibel), sinarinfra merah (IR), serapan atom.• Kromatografi: Kromatografi Kertas, Kromatografi Lapis Tipis, Kromatografi Kolom,Kromatografi Gas3. Metode Analisis Hayati (Bioassay)28/03/2013 Harrizul Rivai 4

SPEKTROFOTOMETRIULTRAVIOLET DAN VISIBLE(SPEKTRO UV-VIS)28/03/2013 Harrizul Rivai 5

PendahuluanSpektrofotometri Ultraviolet-Visibel adalahteknik analisis yang memanfaatkan sumberradiasi (sinar) elektomagnetik ultraviolet dekat( 190 – 380 nm) dan sinar tampak ( 380 – 780nm).Radiasi ultraviolet jauh (100 – 190 nm) tidakdipakai dalam analisis sebab di daerah tersebutudara juga ikut mengabsorpsi radiasi.Spektrofotometri Ultraviolet dan Visible dalamanalisis obat digunakan untuk :• Analisis kuantitatif (penentuan kadar)• Karakterisasi (identifikasi) obat,pengotornya, metabolitnya dan senyawasenyawasejenisnya28/03/2013 Harrizul Rivai 6

Pendahuluan …• Absorpsi molekulardalam daerah UVdan Visible timbulkarena transisienergi yangmelibatkan elektronorbital kulit terluaratau elektronvalensi.28/03/2013 Harrizul Rivai 7

Pendahuluan …• Spektrum dalam media cairbiasanya lebar karenabanyak transisi vibrasionaldan rotasional berdekatanjaraknya.• Spektrum yang lebih rumitdiperoleh untuk senyawasenyawayang mudahmenguap bila diukur dalamfase uap, karena strukturhalus vibrasi dan rotasinyadapat terlihat denganmudah.• Lihat spektrum senyawa1,2,4,5-tetrazine padagambar di samping.28/03/2013 Harrizul Rivai 8

Pendahuluan …• Dalam spektrum UV dan Vis, energi foton yang menyebabkan transisielektronik terletak dalam rentang 147 – 630 kJ/mol. Energi ini (∆E)dapat dinyatakan sebagai parameter-parameter radiasielektromagnetik, yaitu: frekuensi (Hz), panjang gelombang (nm)dan bilangan gelombang (cm -1 ).Ehhchch = tetapan Planck, c = kecepatan cahaya dalam vakum.Posisi puncak serapan dinyatakan sebagai:1. Bilangan gelombang, (untuk spektrofotometer IR)2. Panjang gelombang () (untuk spektrofotometer UV dan Vis)Posisi serapan maksimum suatu puncak disebut max .28/03/2013 Harrizul Rivai 9

• Eksitasi elektron ( *) terjadi pada daerahultraviolet jauh oleh ikatan tunggal seperti pada alkana• Eksitasi elektron ( *) diberikan oleh ikatan rangkapdua dan tiga (alkena dan alkuna) juga di daerahultraviolet jauh• Pada gugus karbonil (dimetilketon dan asetaldehida)akan terjadi eksitasi elektron (n *) di daerah UVjauh.28/03/2013 Harrizul Rivai 12

Hukum Lambert-BeerAda dua hukum yang menghubungkan intensitas cahaya yang mengenai sistempengabsorpsi (Io) dengan intensitas cahaya yang diteruskan (I). b c1. Hukum Lambert pada konsentrasi (c) tertentu suatu sistempengabsorpsi yang homogen, intensitas cahaya yang diteruskan (I)berkurang secara eksponensial dengan bertambahnya panjang jalancahaya (b).2. Hukum Beer pada panjang jalan tertentu (b), intensitas cahaya yangditeruskan (I) berkurang secara eksponensial dengan bertambahnyakonsentrasi (c) sistem pengabsorpsi yang homogen.28/03/2013 Harrizul Rivai 13

Hukum Lambert-BeerGabungan kedua hukum tersebut disebut Hukum Lambert-Beer dan dapatdirumuskan sebagai berikut:I0logI bc = absorptivitas molar, yang didefinisikan sebagai absorban larutan 1 molar dalamsel (kuvet) 1 cm lebarnya.b = lebar kuvetc = konsentrasi (mol/L)Transmitan (T= I/Io) dan persen transmitan (%T = 100(I/Io)) tidak linearhubungannya dengan konsentrasi (c) dan lebar kuvet (b), dan dapat dihubungkandengan absorban sebagai berikut:AI 1 log 0 log 2 log(% T)I T bc28/03/2013 Harrizul Rivai 14

Hukum Lambert-BeerContoh Soal:Hitunglah persen radiasi masuk yang diserap oleh suatu sampel jika serapannyasebesar (i) 2 dan (ii) 0,1.Penyelesaian:(i)I 1A log 0 logI T2 2 log(% T )log(% T ) % T0 anti log 0 1 2 log(% T )Jadi radiasi yang diserap = 100 – 1= 99%(ii)I 1A log 0 logI T0,1 2 log(% T )log(% T )% T 2 0,1 1,9 anti log1,9 2 log(% T )79,4Jadi radiasi yang diserap = 100 – 79,4= 20,6%28/03/2013 Harrizul Rivai 15

A bcA atauA A atauA AEMacam-macam Rumus Hukum Lambert-Beerabckbc1%1cm1%1cmbcbc1%Acma 1 10 BM adalah absorptivitas molar bila c dinyatakan dalam mol/La atau k adalah absorptivitas bila c dinyatakan dalam g/L1% 1%A1 cmatau E1cmadalah absorptivitas spesifik bila c dinyatakandalam g/100 mL (% b/v)Contoh, suatu senyawa dengan BM = 100 danabsorptivitas a = 20 pada panjang gelombang dalampelarut tertentu pada pH tertentu dan pada suhutertentu, mempunyai absorptivitas spesifik A(1%, 1 cm) =200 dan absorptivitas molar = 2.000.28/03/2013 Harrizul Rivai 16

Dalam produk farmasi, konsentrasi dan jumlah biasanya dinyatakan dalam gramatau mg dan bukan dalam mol sehingga untuk keperluan analisis produkfarmasi, Hukum Lambert-Beer ditulis dalam bentuk sebagai berikut:A atauA AE1%1cm1%1cmbc c bc c A1%A . b1cmA1%E . b1cmMonografi Farmakope dan textbook lainnyasering menyatakan nilai baku A(1%, 1 cm)untuk suatu obat, yang akan digunakandalam proses perhitungannya.LatihanBerapakah konsentrasi larutan obat berikut dalam satuan g/100 mL dan mg/100mL bila diketahui nilai absortivitas spesifik dan absorbannya?1. Karbimazol, nilai A(1%, 1 cm) = 557 dan absorbans terukur = 0,557 pada =291 nm2. Hidrokortison natrium fosfat, nilai A(1%, 1 cm) = 333 dan absorbans terukur= 0,666 pada = 248 nm.3. Isoprenalin, nilai A(1%, 1 cm) = 100 dan absorbans terukur = 0,500 pada =280 nm28/03/2013 Harrizul Rivai 17

Validitas Hukum Lambert-BeerValiditas Hukum Lambert-Beer dipengaruhi oleh beberapa faktor:1. Radiasi harus monokromatik. Jika radiasi tidak monokromatik, makaabsorbans yang diamati akan lebih rendah daripada nilai batas yangsesungguhnya untuk radiasi monokromatik.2. Larutan analit harus homogen, tidak mengalami asosiasi, disosiasi,fotodegradasi, solvasi, kompleksasi atau adsorpsi dan tidak berfluoresensi.Jika tidak, maka akan terjadi penyimpangan positif atau negatif dariHukum Lambert-Beer.3. Cahaya sesatan tidak boleh ada, karena akan menyebabkan tidakberlakunya Hukum Lambert-Beer. Cahaya sesatan adalah radiasi yangmempunyai panjang gelombang yang berbeda dari panjang gelombangyang diinginkan.4. Jenis pelarut yang digunakan harus melarutkan analit dengan mudah dantidak boleh menyerap pada panjang gelombang pengukuran analit.28/03/2013 Harrizul Rivai 18

SYARAT PENGGUNAAN HUKUM BEER1. KONSENTRASI : Hukum Beer baik untuk larutan sampelyang encer, sebab jika pekat ( 0,01 M), tidak maksimalmengabsorpsi cahaya pada maks yang digunakan.Peristiwa ini menyebabkan penyim-pangan kelineranhubungan antara absorbansi dan konsentrasi.2. KIMIA : Zat pengabsorpsi tidak boleh berdisosiasi,bereaksi dengan pelarut menghasilkan produk yangberbeda dengan zat yang dianalisis3. CAHAYA : Hukum Beer hanya berlaku untuk sinarmonokromatik (hanya satu macam ).4. KEJERNIHAN : Larutan sampel harus jernih, karenakalau tidak jernih intensitas sinar yang diabsorpsiberkurang dari yang seharusnya.28/03/2013 Harrizul Rivai 19

HAL YANG PERLU DIPERHATIKAN DALAM ANALISISSPEKTROFOTOMETRI UV-VIS1. Pembentukan Molekul yang dapat Mengabsorpsi Sinar UV-VIS :Pereaksi yang digunakan harus selektif dan sensitif,reaksinya cepat dan reprodusibel, hasil reaksi stabil dalamjangka waktu lama.• Analisis golongan Sulfonamida melalui reaksi diazotasi dandikopling dengan naftil etilen diamin (NED) membentuk warna.REAKSI DIAZOTASISulfisoksazol28/03/2013 Harrizul Rivai20

REAKSI PENGKOPLINGANSENYAWA BERWARNA28/03/2013 Harrizul Rivai 21

• Reaksi diazotasi tersebut akan kelebihanasam nitrit dan dapat dihilangkan denganpenambahan asam sulfamat. Jika tidakdihilangkan, maka senyawa yang sudahberwarna akan dirusak (dioksidasi) olehasam nitrat sehingga kembali menjadi tidakberwarna. Reaksi penghilangan asam nitrit,sesuai reaksi berikut :HNO 2 + HSO 3 NH 2N 2 + H 2 SO 4 + H 2 O28/03/2013 Harrizul Rivai 22

2. Waktu Operasional (operating time) :Cara ini biasanya untuk pengukuran hasilreaksi atau pembentukan warna, denganmaksud mengetahui waktu pengukuran yangmemberikan lautan sampel yang stabil atauselama pengukuran warna sampel tidakmengalami perubahan.Abswaktu operasionalwaktu, t28/03/2013 Harrizul Rivai 23

3. Pemilihan Panjang Gelombang :Dipilih panjang gelombang yang memberikanabsorbansi maksimal, yaitu pada max , karena didaerah tersebut kepekaannya maksimal atauperubahan absorbansi untuk setiap satuankonsentrasi adalah yang paling besar.A12AAPada 1Pada 2KonsentrasiKonsentrasi28/03/2013 Harrizul Rivai 24

• Disekitar max , bentuk kurva absorbansidatar dan pada kondisi tersebut hukumBeer akan terpenuhi• Jika dilakukan pengukuran ulang makakesalahan yang disebabkan oleh penggunaanulang panjang gelombang, akan sangat kecilketika digunakan max .28/03/2013 Harrizul Rivai 25

4. Pembuatan Kurva Baku.Mula-mula dibuat seri larutan baku dari zatyang akan dianalisis dalam berbagai konsentrasidan masing-masing diukur absorbansinya pada max , kemudian dibuat kurva baku yangmerupakan hubungan antara absorbansi dengankonsentrasi.Bila hukum Beer terpenuhi maka diperoleh garisliner, dimana kemiringan atau slope adalah nilaia (absortivitas) atau (absortivitas molar)Penyimpangan dari garis liner dapat disebabkanoleh : kekuatan ion yang tinggi, perubahan suhusaat pengukuran, dan reaksi ikutan yang terjadi28/03/2013 Harrizul Rivai 26

1,0 -Absorbansi0,8 - -0,6 - -0,4 - -0,2 - -! ! ! ! !0 2 4 6 8 10Konsentrasi 10 -4 MPlot Hukum Beer untuk Teofillin dalam Pelarut AirTabel Hasil Pengukuran Absorbansi Teofillin dalam Pelarut Air pada 272 nmKONSENTRASI TEOFILLIN( X 10 -5 M)A pada 272 nm pada 272 nm( X 10 -4 )2,044,086,128,160,2090,4140,6210,8271,0251,0151,0151,013 pada 272 nm = 1,02 X 10 -4 M -1 Cm -128/03/2013 Harrizul Rivai 27

5. Pembacaan Absorbansi Sampel.Batas terendah dan batas tertinggi nilaiabsorbansi atau transmitansi yang diperkenankansehingga kesalahan fotometrik dalam pembacaanA atau T paling kecil sebesar 5% (0,05) adalahantara 0,2 sampai 0,8 atau 15% sampai 70% T.25 -20 -15 -10 -5 -! ! ! !20 40 60 80 100 % Transmitan! ! ! ! ! ! ! ! !1 0,8 0,5 0,3 0,2 0,1 0,05 0 AbsorbansiGrafik Hubungan Transmitansi/Absorbansi dengan Persen Kesalahan Relatif28/03/2013 Harrizul Rivai 28