CURRICULUM VITAE/STUDIORUM di Sandra Pucciarelli ...

CURRICULUM VITAE/STUDIORUM
di Sandra Pucciarelli
Via Monte Vettore 1, Camerino (MC), 23 Ottobre 1969
62022, Castelraimondo (MC) Cittadinanza italiana
FORMAZIONE DI BASE
Ricercatore a tempo determinato
settore BIO/07 (Ecologia)
Luglio 1988 Diploma di maturità classica. Liceo Classico Statale "A. Varano", Camerino
(MC)
FORMAZIONE SCIENTIFICA
22 Luglio 1993 Laurea in Scienze Biologiche, con discussione di una tesi sperimentale in
Zoologia dal titolo: "Organizzazione ed espressione dei geni codificanti la
β−tubulina in un organismo antartico, il ciliato Euplotes focardii". Relatore:
Prof.ssa Cristina Miceli, Dipartimento di Biologia Molecolare, Cellulare e
Animale, Università di Camerino. Valutazione: 110/110 con lode.
1993-1997 Dottorato di Ricerca in Biologia (IX ciclo) conclusosi con la discussione di una
tesi dal titolo: "Caratterizzazione di microtubuli e tubuline del ciliato antartico
Euplotes focardii", presso Università di Tor Vergata (Roma), l’8 Maggio 1998.
Relatore: prof.ssa C. Miceli.
Luglio-Dicembre
1995
28 marzo-10
maggio 1997
Novembre 1998-
Giugno 2000
Luglio 2000-
Dicembre 2003
Maggio 2004tutt’oggi
CORSI E WORKSHOP
13 Marzo-3
Aprile 1994
9-19 Settembre
1996
26-27 Marzo
2002,
1-7 Dicembre
2002.
Soggiorno per attività di perfezionamento all'estero presso il laboratorio del
Prof Harry William Detrich III, Northeastern University, Boston-MA, USA.
Spedizione nella base americana Palmer Station, in Antartide, coordinata dal
Prof. H.W. Detrich III.
Post-dottorato presso il laboratorio del Dr. Ronald Melki, Laboratoire
d'Enzymologie et Biochimie Structurales, CNRS, Gif-Sur-Yvette, Francia.
Assegnista per la collaborazione ad attività di ricerca presso il Dipartimento di
Biologia Molecolare, Cellulare e Animale, Università di Camerino.
Ricercatore a tempo determinato, settore BIO/07 (Ecologia), presso il
Dipartimento di Biologia Molecolare, Cellulare e Animale, Università di
Camerino.
Soggiorno ERASMUS "Interest of current studies on protists for cellular and
molecular biology, health and environment". Università "Blaise Pascal",
Clermont Ferrand. Francia
"EMBO practical course on Cytoskeleton Dynamics" Institute of Molecolar
Biology, Austrian Academy of Sciences, Salisburgo, Austria.
“Colture cellulari: metodiche di base ed applicazioni”. Milano
I Workshop SCAR-EVOLANTIA Certosa di Pontignano (Si)
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18-21 Settembre
2006
Statistics for the design and analysis of research studies. Camerino (MC).
Instructor Prof. Simon Cousens. Professore di Epidemiologia e Statistica
Medica del London School of Hygiene and Tropical Medicine
2-6 Ottobre 2006 Statistical models and data analysis for experimental research. Camerino
(MC). Instructor Prof. Lisandro Benedetti Cecchi. Professore Associato
BIO/07- Ecologia, Dipartimento di Biologia, Università di Pisa
SINOSSI DELLA RICERCA.
La mia attività di ricerca si è svolta nell’ambito dell’ecologia molecolare. Le tematiche che ho
sviluppato si possono schematizzare in tre linee principali:
1- Evoluzione molecolare
Fin dallo svolgimento della mia tesi di laurea mi sono interessata delle strategie evolutive e i
meccanismi molecolari responsabili dell’adattamento al freddo degli organismi antartici.
Il freddo è un fattore di “stress” per tutti gli organismi che rispondono con adattamenti
fisiologici e molecolari per sopravvivere alle variate condizioni climatiche. La risposta molecolare al
freddo è la sintesi di proteine che legandosi alle strutture cellulari la cui funzione è inibita, ne
ripristinano la normale attività. Quando lo stress è persistente, entrano in gioco dei meccanismi di
adattamento più radicali. Gli organismi che vivono in ambienti cronicamenti freddi hanno evoluto
macromolecole capaci di funzionare in condizioni estreme. Questa “evoluzione adattativa” si basa
su mutazioni che aumentano la fitness di un organismo nel suo habitat ed hanno come bersaglio
geni sotto forte pressione evolutiva in condizioni di stress e rendono il prodotto mutato più
funzionale di quello originario in quelle determinate condizioni ambientali.
La mia attività di ricerca è stata inizialmente indirizzata alla caratterizzazione dei meccanismi
molecolari responsabili della polimerizzazione e stabilità al freddo dei microtubuli, analizzando la
famiglia genica codificante l’α- e β-tubulina, il cui eterodimero costituisce l’unità base dei
microtubuli. Più recentemente mi sono occupata della caratterizzazione dei meccanismi molecolari
che permettono una efficiente sintesi proteica anche a basse temperature. Ho affrontato questo
argomento analizzando i geni codificanti le proteine ribosomali P0 e P2. Per chiarire questi
meccanismi di adattamento al freddo ho utilizzato come sistema di studio Euplotes focardii, un
ciliato endemico del continente antartico isolato dalle acque interstiziali della costa della baia di
Terra Nova, la cui temperatura è costantemente di –1,8 °C. Analisi fisiologiche, biochimiche e
molecolari hanno dimostrato che questo organismo è strettamente psicrofilo: ha una temperatura
ottimale di crescita intorno ai 2-4 °C, e non sopravvive a temperature oltre 10 °C; non risponde ai
stress termici mediante l’induzione della proteina “Heat Shock” HSP70, ed infine ha un codice
genetico ricco di A e T, atto a favorire la separazione del doppio filamento di DNA durante la
duplicazione o la trascrizione genica, in condizioni energeticamente sfavorevoli.
Ottimi organismi di confronto per avvalorare la correlazione tra l’adattamento al freddo e le
sostituzioni aminoacidiche di E. focardii sono cellule di Euplotes di un ceppo denominato MR13,
prelevate nella regione nord orientale dell’Africa e poi allevate nei nostri laboratori a temperature
intorno a 22°C. Queste cellule si presentano come una ‘sibling species’ di E. focardii, con molti
caratteri morfologici in comune, ma incapaci di sopravvivere a temperature inferiori ai 8-10 °C.
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Sulla base delle sequenze del DNA codificante l’RNA della subunità minore del ribosoma, il ceppo
MR13 mostra una distanza genetica da E. focardii dell’ordine di 60 milioni di anni sulla base di
dati analoghi riferiti ad altri ciliati. Le subunità ribosomali sono considerate un buon orologio
molecolare per scandire la distanza evolutiva tra due organismi, in quanto il ribosoma è una
molecola ubiquitaria e molto conservata durante l’evoluzione. Questi risultati lasciano ipotizzare
che le E. focardii ed il ceppo MR13 derivino da uno stesso progenitore, dal quale si sono
diversificati dopo la separazione dell’Antartide dalla Gondwana ed il raffreddamento dell’oceano
antartico. Nonostante la vicinanza evolutiva con E. focardii, le sequenze proteiche di MR13
mostrano una chiara e maggiore similarità di sequenza con quelle di altre specie di Euplotes non
adattate al freddo. Questo lascia supporre che il tasso mutazionale delle proteine di MR13 sia lo
stesso di quello delle altre specie di Euplotes, mentre quello delle tubuline di E. focardii sia più
elevato sotto la pressione selettiva dell’ambiente antartico. Questo studio di comparazione di
strategie evolutive tra E. focardii ed MR13 è stato sviluppato con la collaborazione del prof.
Fernando Dini e del Dr. Graziano Di Giuseppe dell’Università di Pisa ed è attualmente oggetto di
un manoscritto in preparazione.
Un notevole contributo alla mia attività scientifica è derivato da periodi di soggiorno all'estero
presso il laboratorio del Prof H.William Detrich, della Northeastern University di Boston (USA), e
presso il laboratorio del Dr. Ronald Melki, del CNRS di Gif-Sur-Yvette (Francia). Durante questi
soggiorni, mi sono dedicata alla caratterizzazione dei meccanismi molecolari responsabili del
folding delle tubuline di E. focardii alle basse temperature, dell’evoluzione di questo fenomeno, e
della caratterizzazione molecolare e funzionale della ciaperonina citosolica, responsabile del
folding della tubulina e di altre proteine citoscheletriche, purificata dal pesce antartico Notothenia
coriiceps.
2- Filogenesi molecolare
La filogenesi molecolare si basa sulla comparazione di sequenze di DNA e di aminoacidi di
organismi diversi e si fonda sul presupposto che esiste una diretta correlazione tra differenze
geniche/aminoacidiche e distanza filogenetica. L’uso di sequenze geniche codificanti le subunità
ribosomali per risolvere le relazioni filogenetiche tra organismi ha confermato alcune idee
tradizionali basate sulla comparazione di caratteri morfologici, come il monofiletismo dei bilateri,
ma ha rivoluzionato la classificazione basata sulla cavità celomatica: i protostomi sono suddivisi in
Ecdisozoa, che comprende tra altri artropodi e nematodi, e in Lofotrocozoa, che comprende
anellidi, molluschi e platelminti.
Durante la mia attività di ricerca mi sono occupata di due argomenti molto dibattuti. Il primo
riguarda la storia evolutiva dei gastrotrichi e le relazioni filogenetiche del phylum Gastrotricha con
gli altri metazoi bilateri. Il secondo argomento concerne il problema dell’origine filogenetica degli
eucarioti. Ho affrontato questi argomenti effettuando delle analisi filogenetiche utilizzando diversi
marker molecolari: l’ rDNA e marker alternativi come le proteine ribosomali e i geni omeotici.
3- Biomonitoraggio ambientale.
Il biomonitoraggio ambientale tramite utilizzo di organismi viventi è sicuramente una
strategia alternativa e/o complementare al monitoraggio per via strumentale che permette una
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apida individuazione di aree a rischio con bassi costi, tempi ridotti e una alta densità di
campionamento.
Durante la mia attività di ricerca ho partecipato a due progetti di biomonitoraggio: il primo
ha riguardato lo stato di contaminazione ambientale del Porto di Piombino ed ha implicato l’analisi
di biomarker di espressione nei sipunculidi, utilizzati per la prima volta come organismi
bioindicatori nei confronti di stress chimici e/o ambientali. I biomarker sono modificazioni delle
attività enzimatiche, alterazioni del DNA, o sintesi di proteine che proteggono la cellula dal danno
indotto dalle sostanze xenobiotiche. Il secondo argomento ha riguardato un aspetto di una analisi
qualitativa della biodiversità della comunità fitoplanctonica del Lago di Garda, ritenuta importante
quale indicatrice di cambiamenti di stato dei corpi lacustri, utilizzando tecniche molecolari.
Una trattazione più dettagliata dei tre temi sopra delineati è riportata qui di seguito.
1a) I microtubuli e la famiglia genica codificante le tubuline in Euplotes focardii.
I microtubuli sono polimeri essenziali per la cellula eucariotica in quanto implicati nel
mantenimento dell’architettura cellulare, nella costituzione del fuso mitotico, nel trasporto
intracellulare di organuli e nel movimento ciliare. I sistemi microtubulari degli organismi che
vivono in ambienti temperati mostrano diversi gradi di stabilità al freddo ed alcuni sistemi, a
localizzazione citoplasmatica, tendono a depolimerizzare a temperature inferiori a 4°C. L’interesse
a conoscere la struttura delle tubuline di E. focardii è stato essenzialmente motivato dall’ipotesi
che queste molecole, estremamente conservate nell’evoluzione, siano direttamente coinvolte
nell’adattamento della cellula a vivere a basse temperature. Questo organismo, come tutti quelli
che sono permanentemente esposti al freddo, deve possedere tubuline caratterizzate da sostituzioni
aminoacidiche che siano in grado di permettere meccanismi di polimerizzazione in condizioni
estreme. In primo luogo ho dimostrato che i microtubuli di E. focardii mantengono, al freddo,
regolari caratteristiche di dinamica di polimerizzazione e depolimerizzazione. Queste
caratteristiche sono apparse evidenti anche in assenza di proteine associate ai microtubuli,
indicando che gli stessi eterodimeri di α− e β−tubulina, costituenti i protofilamenti dei microtubuli
sono responsabili della stabilità al freddo, probabilmente per la presenza di peculiari residui
aminoacidici e/o specifiche modificazioni post-traduzionali.
In secondo luogo ho analizzato mediante clonaggio, le sequenze genomiche di α− e
β−tubulina. In E. focardii, l’α−tubulina è codificata da un solo gene e la β−tubulina da quattro geni
paraloghi. Quest’ultima caratteristica sembra essere unica di E. focardii. Negli organsmi
unicellulari, l’α- e β-tubulina sono codificate da uno o due geni che producono un unico isotipo.
Anche nel ceppo MR13, la β-tubulina è codificata da due geni i cui prodotti aminoacidici sono
identici. Quindi, l’organizzazione della famiglia genica codificante la β-tubulina in E. focardii
potrebbe essere una conseguenza della colonizzazione dell’habitat antartico. L’analisi delle
sequenze aminoacidiche predette da quelle nucleotidiche con gli ortologhi di specie di Euplotes non
adattate al freddo, tra cui il ceppo MR13, ha rivelato che l’α−tubulina si è relativamente conservata
durante l’evoluzione. Diversamente, la β−tubulina presenta numerose sostituzioni aminoacidiche,
soprattutto in due dei quattro geni caratterizzati. La maggior parte delle sostituzioni aminoacidiche
determinano un aumento nel numero di residui di alanina, serina, treonina e glicina. Analisi
biochimiche di enzimi di organismi psicrofili associano l’abbondanza di questi residui ad un
aumento della flessibilità molecolare che, in un ambiente energeticamente sfavorevole come quello
antartico, permette di superare più facilmente la barriera cinetica dei cambiamenti
conformazionali durante le reazioni enzimatiche.
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Per capire l’importanza funzionale e strutturale di queste sostituzioni aminoacidiche, ho
iniziato una collaborazione con la Dr. Eva Nogales (Università della California, Berkeley, USA),
nota per la risoluzione della struttura tridimensionale del dimero di tubulina. Nell’ambito di questa
collaborazione ho potuto constatare che le sostituzioni caratterizzate nella β−tubulina di E. focardii
sono in posizioni coordinate della struttura tridimensionale: anche se localizzate in posizioni
distanti della struttura primaria, esse interagiscono nell’ambito della struttura terziaria. Queste
sostituzioni possono quindi generare una diversa flessibilità del dimero di tubulina. Inoltre, molte
sostituzioni aminoacidiche delle tubuline di E. focardii sono coinvolte proprio nelle più importanti
interazioni idrofobiche che permettono l’assemblaggio della struttura microtubulare durante il
processo di polimerizzazione, a livello delle interazioni sia longitudinali intra− e interdimeriche, sia
laterali tra protofilamenti. In generale, queste sostituzioni aminoacidiche aumentano il numero di
residui di natura idrofobica, come è stato osservato anche nelle tubuline di alghe psicrofile e di
pesci antartici (Nototenoidei). Questa osservazione ha fatto ipotizzare che specie antartiche anche
evolutivamente distanti abbiano seguito una strategia adattativa convergente per favorire la
polimerizzazione dei microtubuli al freddo.
Le analisi biochimiche dell’α− e β−tubulina di E. focardii mi hanno permesso, inoltre, di
confrontare alcune modificazioni post-traduzionali con quelle presenti in ciliati non antartici.
Mediante uso di anticorpi monoclonali anti-fosfoserina e anti-tubulina poliglutamilata ho potuto
osservare che la β−tubulina è fosforilata e non poliglutamilata, come avviene in molti altri
organismi. La fosforilazione potrebbe essere implicata nella stabilità al freddo dei microtubuli in
quanto è una modificazione post-traduzionale rara nelle tubuline, ed è stata evidenziata proprio
nella frazione di microtubuli stabili al freddo di neuroni ed eritrociti di vertebrati.
Ho rivolto il mio interesse anche alla caratterizzazione della γ−tubulina, che è la
componente principale delle strutture subcellulari note come centri organizzatori dei microtubuli
(MTOC). In organismi mesofili anche la nucleazione dei microtubuli è inibita dal freddo e le basi
molecolari che caratterizzano questo processo a basse temperature non sono noti. In E. focardii, la
γ−tubulina è codificata da due geni paraloghi che presentano caratteristiche strutturali divergenti
rispetto agli ortologhi di altri organismi. La maggior parte delle sostituzioni aminoacidiche è
localizzata nelle regioni coinvolte nella formazione di legami laterali e longitudinali tra la
γ−tubulina e il dimero di tubulina e/o altre proteine del MTOC durante la nucleazione dei
microtubuli. In particolare, una sostituzione aumenta la natura idrofobica della regione nota come
“M loop”, coinvolta nelle interazioni laterali tra i monomeri della γ−tubulina nella costituzione del
MTOC. Esperimenti di mutagenesi in Aspergillus nidulans hanno messo in evidenza che una
riduzione di idrofobicità nel ”M loop” aumenta la sensibilità al freddo dei microtubuli di questo
organismo. Inoltre, nella γ−tubulina di E. focardii si nota, rispetto ad altri organismi, un aumento
nel numero di residui di asparagina, serina, treonina e glicina. Quindi, in E. focardii i cambiamenti
conformazionali intramolecolari della γ−tubulina che hanno luogo durante la nucleazione dei
microtubuli potrebbero essere permessi proprio da quelle sostituzioni che aumentano la flessibilità
della molecola.
1b) Adattamento al freddo delle proteine ribosomali P0 e P2
Negli organismi che vivono in ambienti temperati, la sintesi proteica è inibita dal freddo,
mentre nei pesci antartici, l’attività del ribosoma è mantenuta efficiente anche alle temperature
cronicamente basse del proprio habitat. Tuttavia, i meccanismi molecolari responsabili di una
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efficiente sintesi proteica negli organismi psicrofili non sono stati determinati. Ho affrontato
questo argomento caratterizzando le proteine ribosomali del “gruppo P” in E. focardii. Queste
proteine sono chiamate P in quanto fosforilate da diverse chinasi quando esse sono associate al
ribosoma, mentre sono defosforilate nel pool citoplasmatico. Nel ribosoma, le proteine P sono
responsabili della formazione della protuberanza laterale nota come “ribosomal stalk”. P2
costituisce un eterodimero con il paralogo P1, associato al ribosoma tramite l’interazione con P0. Il
“ribosomal stalk” interviene nella sintesi proteica interagendo con i fattori di traduzione e
promuovendo l’idrolisi del GTP che ne guida il processo. Nell’ambito di questo argomento ho svolto
una confronto delle sequenze aminoacidiche di P0 e P2 di E. focardii con quelle di altri organismi
non adattati al freddo (tra cui MR13). Nella P0, le mutazioni hanno prodotto sostituzioni
aminoacidiche che aumentano la flessibilità strutturale e potrebbero facilitare i cambiamenti
conformazionali associati all’interazione con il centro GTPasico della subunità 60S ribosomale.
Altre sostituzioni aumentano l’idrofobicità del dominio coinvolto nell’interazione con l’etrodimero
P1/P2, la cui funzione potrebbe essere quella di stabilizzare il “ribosomal stalk” al freddo. Nella P2,
sostituzioni aminoacidiche che aumentano la flessibilità molecolare sono state riscontrate solo a
livello del dominio N-terminale, dove possono facilitare l’interazione con la P1 durante la
formazione dell’eterodimero. Diversamente, nel dominio C-terminale della P2, che ha una stretta
interazione con la P1, sono presenti sostituzioni aminoacidiche che riducono la flessibilità,
aumentano l’idrofobicità, e sono interpretabili come stabilizzanti il complesso P1/P2 soggetto ad
effetti disgreganti causati dal freddo durante la sintesi proteica.
Infine, sia in P0 che P2 ho osservato la presenza di un maggior numero di residui di serina e
treonina. Queste sostituzioni, oltre ad aumentare la flessibilità strutturale delle proteine P,
aumentano anche il numero di siti forforilabili, interpretabile come una strategia di adattamento al
freddo per facilitare il turn-over tra le proteine P associate al ribosoma stalk e quelle nel pool
citoplasmatico. Questo risultato conferma come la fosforilazione sia una modificazine posttraduzionale
alternativa e sia probabilmente favorita alle basse temperature in quanto rapidamente
reversibile e quindi poco dispendiosa a livello energetico, una proprietà ideale per le necessità
adattative di un organismo che vive alle basse temperature.
1c) Folding delle tubuline facilitato dalla ciaperonina (CCT) alle basse temperature
Per “folding” si intende il processo molecolare che porta all’acquisizione della struttura nativa
di una proteina. La cellula utilizza una grande quantità di energia per sintetizzare le proteine.
Questo investimento sarebbe inutile se il folding e l’assemblaggio delle proteine non fosse
produttivo. In vitro, anche in condizioni ottimali, il folding delle proteine è un processo inefficace.
Questa inefficacia dà origine alla formazione di aggregati stabili ed inattivi da parte della proteina
neo-sintetizzata che non ha ancora acquisito la propria struttura nativa. Malgrado l’informazione
per il folding risieda nella sequenza aminoacidica, alcune proteine richiedono l’assistenza di
complessi proteici chiamati ciaperonine per raggiungere la propria struttura nativa.
La CCT (denominazione che sta per Cytosolic Chaperonin containing Tcp-1) è una
ciaperonina citoplasmatica eucariotica che facilita principalmente il folding di proteine
citoscheletriche. E’ un complesso formato da 8-9 distinte catene polipeptidiche che assemblano a
formare una struttura toroidale cava. L’interno della cavità accoglie la proteina in uno stato quasinativo
e attraverso diversi cicli di legame e rilascio nel citoplasma, che implica cambiamenti
conformazionali della CCT guidati dall’idrolisi dell’ATP, la proteina raggiunge lo stato nativo. Il
folding della β−tubulina e la costituzione del dimero α/β necessitano non solamente della CCT ma
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di altri cofattori. Il cofattore A e B stabilizzano rispettivamente la forma monomerica della β− e
dell’α−tubulina prima dell’intervento dei cofattori C, D, E per la formazione del dimero.
Per determinare eventuali cambiamenti strutturali e funzionali della CCT dovuti alla
pressione evolutiva in un ambiente cronicamente freddo come l’Antartide, ho caratterizzato questo
complesso proteico nel pesce antartico Notothenia coriiceps. A livello strutturale, la CCT di N.
coriiceps (Nc CCT) ha una conformazione diversa rispetto quella purificata da coniglio, come
risulta comparando i due coefficienti di sedimentazione. Inoltre, diversamente da tutte le altre
ciaperonine citoplasmatiche caratterizzate finora, Nc CCT è in equilibrio con una forma composta
da un solo anello anziché i due tipici della struttura toroidale. Questa forma alternativa potrebbe
essere una conseguenza all’adattamento al freddo di N. coriiceps per facilitare i cambiamenti
conformazionali che accompagnano l’attività della ciaperonina in un ambiente energeticamente
sfavorevole. Anche le sequenze primarie di due subunità della Nc CCT, ovvero Nc β e θ, contengono
numerose sostituzioni aminoacidiche che ne aumentano la flessibilità rispetto le sequenze
ortologhe di pesci non adattati al freddo.
A livello funzionale, Nc CCT forma un complesso molto stabile solo con la tubulina, mentre
lega solo debolmente l’actina. Tuttavia, la tubulina non viene rilasciata dalla CCT come prodotto
nativo, nemmeno in presenza del cofattore A. Infatti, mediante reazioni di competizione, ho potuto
dimostrate che le proteine bersaglio una volta legate alla Nc CCT rimangono intrappolate nella
cavità toroidale. Quindi, Nc CCT ha subito durante l’evoluzione e sotto la pressione dell’ambiente
antartico delle modificazioni tali che la rendono morfologicamente diversa, più specifica per la
tubulina e biologicamente attiva solo in presenza di un probabile cofattore, diverso dal cofattore A,
che facilita il rilascio della proteina bersaglio dalla cavità toroidale della CCT e quindi il suo folding.
1d) Evoluzione del folding delle tubuline
Per determinare eventuali differenze nei meccanismi molecolari del folding di tubuline
divergenti in E. focardii, ho effettuato una analisi comparativa di questo processo utilizzando come
proteine bersaglio due isotipi di β−tubulina di E. focardii, uno molto conservato denominato β-T1,
ed un altro più divergente denominato β-T3, in confronto con l’isotipo β5 umano. Attraverso saggi
di folding in presenza o in assenza di CCT e del cofattore A (entrambi purificati da coniglio) ho
dimostrato che l’isotipo di β−T1, più conservato, necessita dell’assistenza di questi macchinari
molecolari per acquisire la propria struttura nativa, come d’altra parte l’isotipo umano, mentre
l’isotipo più divergente, β−T3, necessita della CCT e cofattori diversi dal cofattore A non ancora
identificati, in quanto la reazione di folding effettuata in presenza di CCT e cofattore A non genera
un prodotto del folding. Attraverso esperimenti di competizione sulla CCT purificata da coniglio tra
le β−tubulina di E. focardii e quella umana, ho mostrato che esse competono per lo stesso sito di
legame, ma la tubulina di E. focardii si lega con minore affinità. Poiché le regioni della β−tubulina
di E. focardii coinvolte nel legame sulla CCT sono modificate rispetto quelle della tubulina umana,
è ipotizzabile che queste sostituzioni aminoacidiche siano la causa di una minore affinità di legame.
Sulla base di questi risultati, ho potuto concludere che il folding della tubulina è un processo
conservato nell’evoluzione solo per isotipi che non presentato particolari modificazioni
aminoacidiche, mentre per isotipi divergenti il processo del folding può seguire vie alternative.
Come ulteriori analisi comparativa ed evolutiva del processo del folding mi sono chiesta se
anche la FtsZ (proteina batterica coinvolta nella costituzione del setto di separazione durante la
divisione cellulare che per l’analoga struttura tridimensionale viene considerata l’antenato della
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tubulina) ha bisogno della CCT per il proprio folding. Grazie a saggi di folding in presenza o in
assenza della CCT ho mostrato che FtsZ è una proteina capace di raggiungere la propria struttura
nativa spontaneamente. Tuttavia, in presenza di CCT, la FtsZ forma un complesso stabile con esso.
Attraverso esperimenti di competizione sulla CCT purificata da coniglio tra la FtsZ e la β−tubulina
umana, ho mostrato che esse competono per lo stesso sito di legame. Inoltre, in presenza di CCT la
FtsZ nativa è più stabile nel tempo, per cui presumo che una volta che la proteina abbia perso la
propria struttura nativa si leghi nuovamente alla CCT per poterla riacquistare. Questo risultato è
alquanto interessante perché mostra come la CCT non sia responsabile solamente del folding delle
proteine sintetizzate ex novo, ma anche di quello di proteine denaturate in conseguenza a shock
termici o di altra natura, come altre proteine “heat-shock”.
Il fatto che la tubulina batterica non necessita l’ausilio di ciaperonine per il raggiungimento
del proprio stato nativo supporta l’ipotesi di una coevoluzione tra tubulina e CCT, cominciata con la
nascita della cellula eucariotica.
2a) Origine filogenetica dei primi eucarioti.
Il problema dell’origine filogenetica degli eucarioti è un argomento ancora irrisolto molto
dibattuto. Attualmente, due modelli alternativi sono stati proposti: il modello di Sogin basato sulle
sequenze geniche del rRNA 18S prevede una prima radiazione di eucarioti “semplici” come
Micetozoa e Euglenozoa dalla linea evolutiva che parte dagli Archebatteri, e una successiva grande
radiazione di eucarioti “complessi” che include animali, funghi, piante, alveolari (ciliati e
apicomplessi) ed alcune alghe. Un modello più recente di Stechmann e Cavalier-Smith, prevede
una grande radiazione di supergruppi di eucarioti, in cui quello di animali e funghi è localizzato alla
base dell’albero, che precede la radiazione di supergruppi che includono i protisti e piante.
Un mio contributo a questa problematica è rappresentato da una analisi filogenetica
utilizzando come marker molecolari le sequenze delle proteine ribosomali P0 e P2. La scelta è
caduta su queste sequenze in quanto P1 e P2 derivano molto probabilmente da un fenomeno di
duplicazione genica da un singolo gene ancestrale, e il fenomeno della duplicazione genica ha
giocato un ruolo importante nella radiazione degli eucarioti.
Ho costruito due alberi filogenetici rispettivamente con le sequenze aminoacidiche P0 e P2 di
E. focardii e gli ortologhi noti di altri eucarioti e di archebatteri. Entrambi gli alberi confermano il
modello proposto da Sogin, per cui si riscontra una prima radiazione dagli archebatteri di
Micetozoa e Euglenozoa, e una radiazione successiva di Alveolari, animali e funghi. Questo
risultato, oltre a dare un contributo al dibattito sull’origine degli eucarioti, mostra anche che le
proteine ribosomali possano essere considerate un valido marker filogenetico.
2b) Relazioni filogenetiche interne al phylum Gastrotricha.
In collaborazione con il gruppo di ricerca del prof. Paolo Tongiorgi dell’Università di Modena
e della prof.ssa Maria Balsamo dell’Università di Urbino, mi sono occupata della problematica della
filogenesi dei gastrotrichi. La storia evolutiva di questo gruppo di organismi è molto dibattuta.
Sulla base di caratteri morfologici, questo phylum era tradizionalmente inserito tra gli
“pseudocelomati”, con caratteristiche morfologiche simili ai rotiferi e nematodi (denominati
aschelminti e anch’essi inseriti nel gruppo degli pseudocelomati), ma anche a turbellari e
Gnatostomulidi (acelomati). Inoltre, i due ordini di gastrotrichi Chaetonotida e Macrodasyida
presentano numerose differenze a livello morfologico ed ecologico che suggerivano una
appartenenza a due diversi taxa. Per risolvere i rapporti filogenetici tra i due ordini di gastrotrichi e
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tra questi con altri invertebrati abbiamo costruito degli alberi filogenetici basati sulle sequenze
geniche del rDNA 18S di diverse specie di gastrotrichi che hanno permesso, assieme all’analisi dei
caratteri morfologici dei due ordini Chaetonotida e Macrodasyida, di ottenere dei risultati alquanto
innovativi, che sono qui riassunti: i- il phylum dei gastrotrichi costituisce un taxon monofiletico
non direttamente associato agli altri aschelminti; ii- contrariamente a quanto riportato
precedentemente in letteratura, i Chaetonotida e non i Macrodasyida sono il gruppo più ancestrale
all’interno del phylum; iii- la posizione dei gastrotrichi e rotiferi in due cladi separati nell’albero
filogenetico fa supporre non solo una origine polifiletica degli aschelminti, ma anche che il termine
“pseudocelomato” può essere ormai considerato privo di significato, come già suggerito da altre
analisi filogenetiche basate su caratteri molecolari.
2c) Relazioni filogenetiche del phylum Gastrotricha con gli altri metazoi bilateri: clonaggio di un
gene omeotico Ubx-like di Paraturbanella teissieri.
Negli ultimi anni, molte indagini di filogenesi molecolari hanno avuto come oggetto i geni
Hox. Questi ultimi presenti in tutti i Metazoi, sono costituiti nei Bilateri da un complesso di geni
omeotici (geni per lo sviluppo) associati in tre gruppi: anteriore, centrale e posteriore. Essi
controllano la formazione dello schema corporeo dell’animale e di tutti i suoi elementi strutturali
nel tempo e nello spazio. Si chiamano geni omeotici in quanto la perdita completa della funzione di
uno qualsiasi di questi geni, causa la trasformazione dell’identità segmentale, con la conseguenza
che la struttura corrispondente del corpo si genera, ma in posizione anomala. L’ordine di questi
geni corrisponde all’ordine dei segmenti che essi influenzano: esiste cioè una colinearità tra
l’ordine dei geni lungo il cromosoma e la loro espressione lungo l’asse antero-posteriore del corpo.
I geni Hox possono essere considerati un buon marker filogenetico in quanto l’analisi della loro
sequenza e organizzazione sostiene quello che è uno dei risultati più discussi ottenuto con le
sequenze di RNA 18S, ovvero la suddivisione dei protostomi nei due cladi dei Lophotrocozoa e
degli Ecdisozoa.
In collaborazione con l’Università di Urbino, ho iniziato l’analisi dei geni Hox nei gastrotrichi
per determinare le relazione del phylum Gastrotricha con gli altri protostomi. Come primo
approccio per il clonaggio dei geni omeotici ho utilizzato la tecnica della PCR. Per la scelta degli
oligonucleotidi da utilizzare come primers, ho effettuato una ricerca in banca dati di sequenze di
geni omeotici di specie filogeneticamente vicine ai gastrotrichi. Dall’allineamento delle
corrispondenti sequenze proteiche ho notato la presenza di motivi aminoacidici conservati che
fiancheggiano l’omeodominio nella maggior parte dei geni omeotici noti, le cui sequenze sono
rispettivamente ELEKEF e WFQNRRM. Ho quindi costruito dei primers degenerati sulla base di
questi motivi per le reazioni di PCR. Delle tante strategie effettuate, ho ottenuto una sequenza
omeotica solo da DNA di Paraturbanella teissieri. Effettuando una ricerca in banca dati con la
sequenza parziale determinata, ho ottenuto degli allineamenti con il “Ultrabithorax gene product”
di Drosophila melanogaster. Questo gene regola il numero delle ali e delle zampe nell’individuo
adulto, ed è stato caratterizzato finora solo in artropodi ed onicofori. Il rinvenimento di un gene
Ubx in gastrotrichi è il primo riportato, e mi ha permesso di costruire un albero filogenetico in cui i
gastrotrichi sono legati agli Ecdisozoa da una netta relazione di “sister-group”, in accordo con
alcune recenti analisi filogenetiche basate su dati morfologici. Questi interessanti risultati sono
oggetto di un manoscritto in preparazione.
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3a) Biomonitoraggio delle aree portuali di Piombino mediante utilizzo di biomarker molecolari.
Nell’ambito di uno studio di monitoraggio ambientale in aree portuali, ho condotto un lavoro
che si proponeva la messa a punto di metodologie basate sull’utilizzo dei sipunculidi come
bioindicatori ambientali nuovi, da usare in sinergia o in alcuni casi in alternativa a classici
organismi “sentinella”. Il tipo di alimentazione dei sipunculidi li rende particolarmente interessanti
come organismi bioindicatori alternativi in quanto sono “deposit feeders” e non “filters feeders”
come i mitili, quindi filtrano sedimenti e non materiale particolato in sospensione e notoriamente i
sedimenti sabbiosi contengono un accumulo di contaminati. Inoltre, questi organismi adottano un
sistema di filtrazione non selettivo per cui, non essendo in grado di discernere particelle dannose
da quelle utili per la sopravvivenza, inglobano anche discrete quantità di sostanze inorganiche tra
cui metalli pesanti (Pb, Hg, Co, ecc.) peraltro dannosi per il loro metabolismo. In questo progetto
ho focalizzato l’attenzione sull'indagine dell’espressione di una famiglia di “stress proteins”, le Hsp
70, poiché indotte da un largo spettro di agenti e condizioni stressanti tra cui anche i metalli
pesanti. Le Hsp 70 sequestrano le proteine in uno stato non ripiegato (unfolded) impedendo la
forma di aggregati, nocivi per la cellula, e permettendo il loro corretto ripiegamento fino al
raggiungimento dello stato nativo. Le variazioni di questi ultimi a livello biochimico e/o fisiologico
possono rappresentare uno strumento di diagnosi precoce di perturbazioni e di contaminazioni
ambientali.
Campioni di sipunculidi sono stati prelevati nelle aree portuali di Piombino, di Portoferraio
(Isola d’Elba), ed in corrispondenza del pontile “Solmine” presso Follonica (GR). Il porto di
Piombino è adibito al carico e scarico merci (carbone e minerale ferroso) ed è soggetto allo scarico
di acque reflue provenienti dallo stabilimento della Magona, invaso da depositi di carbone e
minerali ferrosi, e dagli scarichi a mare delle acciaierie Lucchini. Il pontile della Solmine a
Follonica è stato scelto per la presenza di scarichi industriali diversi da quelli di Piombino e per
verificare se le popolazioni di Sipunculidi soggette ad altri tipi di stress ambientali siano
geneticamente vicine a quelle degli altri siti. Il porto di Portoferraio è adibito esclusivamente al
transito dei traghetti che consentono i collegamenti con Piombino.
In primo luogo ho verificato che nelle aree prese in considerazione fosse presente una popolazione
omogenea di sipunculidi. Attraverso il sequenziamento del gene codificante la subunità ribosomale
18S, ho potuto verificare che i campioni presi in esame appartenevano tutti alla specie
Phascolosoma granulatum.
Quindi, attraverso analisi di Western blot di estratti cellulari di sipunculidi, utilizzando
anticorpi commerciali anti-Hsp 70 ho potuto verificare che in tutti i campioni è presente un livello
base di Hsp70 rappresentato da una banda di peso molecolare di circa 70 kDa. Questo risultato era
prevedibile considerando che l’Hsp 70 viene comunque espressa in forma basale in quanto
essenziale per mantenere le proteine nello stato nativo anche in assenza di stress. Invece, nei
campioni prelevati dalle aree portuali di Piombino, soggette a scarichi industriali, sono presenti
bande supplementari di peso molecolare superiore (denominate Hsp 79) imputabili a isoforme di
Hsp 70 inducibili da specifici stress. Infatti, anche in altri sistemi isoforme di Hsp 70 inducibili
hanno pesi molecolari maggiori. Questa seconda forma potrebbe essere attivata nella sua
trascrizione e quindi traduzione soltanto in presenza di uno stress eccessivo e/o specifico, come
quello presente nelle aree portuali di Piombino soggette a scarichi industriali. Quindi, I sipunculidi
possono essere utilizzati come organismi “sentinella” per ottenere informazioni della qualità
dell’ambiente, in quanto la quantità di Hsp 70 espressa appare correlabile con le condizioni di
inquinamento nei siti di prelievo.
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3b) Biomonitoraggio del Lago di Garda: determinazione della specie di protozoo ciliato, e
relativa alga simbionte, infestaste le acque nell’agosto 2004.
Il monitoraggio della qualità delle acque superficiali rappresenta uno dei principali strumenti
di conoscenza circa lo stato di salute della "risorsa acqua" e un momento di verifica degli effetti
delle politiche ambientali attivate in questo settore.
L’interesse per il biomonitoraggio del lago di Garda è nato in conseguenza ad un fenomeno di
fioritura anomalo che si è verificato nell’estate 2004 e terminato nel mese di ottobre, che ha
colorato il lago di nero. Questi episodi hanno indotto l’APPA (Agenzia Provinciale per la Protezione
dell’Ambiente) della provincia di Trento a dedicare particolare attenzione alla raccolta qualitativa
dei dati sulla composizione della comunità fitoplanctonica del Lago di Garda, ritenuta importante
quale indicatrice di cambiamenti di stato dei corpi lacustri.
Il mio contributo all’attività dell’APPA si è concretizzati nell’identificazione dell’organismo
responsabile del fenomeno della “macchia nera” nel Lago di Garda. Analisi morfologiche in vivo e
su cellule fissate hanno inequivocabilmente rivelato le caratteristiche diagnostiche di Stentor
amethystinus: 1) dimensioni tra i 250 e i 400 µm; 2) citostoma e citofaringe a forma di “imbuto”;
3) capacità di ancorarsi al substrato; 4) possesso di granuli di pigmento, che nel caso in oggetto
conferiscono una colorazione marrone scuro o nera; 5) notevole capacità di contrazione; 6)
presenza nel citoplasma di alghe verdi simbionti, probabilmente appartenenti al genere Chlorella;
7) macronucleo di forma sferica. Le chiavi dicotomiche usate per l’identificazione sono quelle
riportate nella guida di Foissner et al., (1999) “Identification and Ecology of Limnetic Plankton
Ciliates” Bayerisches Landesamt für Wasserwirtschaft. In coesistenza con S. amethystinus sono
stati anche osservati individui identificati come appartenenti ad un’altra specie di Stentor, S.
polymorphous (5-10% degli individui totali).
L’esame molecolare è stato condotto mediante analisi genica della sequenza codificante la
subunità 18S del ribosoma. Ho effettuato due strategie di PCR, ognuna con combinazioni di due
primer rispettivamente specifici di Stentor e Chlorella, corrispondenti a regioni conservate del
gene codificante il 18S rRNA, rilevate mediante allineamento di tutte le sequenze di organismi del
genere Stentor e Chlorella disponibili in banca dati. La ricerca in banca dati delle sequenze
ottenute ha evidenziato che la specie di Stentor del Lago di Garda non appartiene ad alcuna di
quelle la cui sequenza del 18S rRNA è stata analizzata e depositata in banche dati geniche, cioè S.
coeruleus, S. polymorphous, e S. roeseli, confermando che si tratta di S. amethystinus. Quindi, la
sequenza da me otteunuta è la prima caratterizzazione della sequenza genica del 18S rDNA di
Stentor amethystinus. Il grado di similarità della suddetta sequenza genica e la costruzione di un
albero filogenetico evidenzia che Stentor amethystinus è strettamente correlato filogeneticamnete
con S. coeruleus, S. polymorphous, e S. roeseli, anche se la linea evolutiva di Stentor amethystinus
si è separata precocemente da quelle degli altri Stentor Lo S. amethystinus non era mai stato
rilevato in precedenza nel Lago di Garda, e di conseguenza anche suoi fenomeni di fioritura, quindi
si ipotizza che questo protozoo sia stato introdotto di recente da attività antropiche.
L’alga endosimbionte si identifica come una specie di Chlorella non ancora caratterizzata a
livello molecolare ed in più ha la stessa percentuale di identità (99%) con quattro diverse alghe:
Micractinium pusillum, Chlorella vulgaris, Chlorella sorokiniana, ed un’altra specie di Chlorella
non identificata. L’albero filogenetico che deriva dall’analisi della sequenza ribosomale determinata
pone la Chlorella endosimbionte in un clade poco divergente da quello che include Micractinium
pusillum, Chlorella vulgaris, e Chlorella sorokiniana. La Chlorella endosimbionte potrebbe essere
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esponsabile della veloce fioritura di Stentor. Infatti, è interessante far notare come Micractinium
pusillum sia stato identificato come causa di fenomeni di fioritura di un lago in Arabia Saudita (Al-
Homaidan & Arif, 1998, Journal of Arid Environments, 38: 15–25). Comunque, la simbiosi
potrebbe non essere obbligatoria, e la Chlorella endosimbionte potrebbe essere anche presente a
vita libera nella comunità fitoplanctonica del Lago di Garda.
In relazione alla improvvisa e poco compresa fioritura di Stentor, questo fenomeno non si è
più verificato negli anni successivi e lo S. amethystinus non è stato più ritrovato nella comunità
fitoplanctonica del Lago di Garda, suggerendo che esso sia stato introdotto da attività antropiche e,
dopo il fenomeno della fioritura, non abbia trovato le ottimali condizioni ecologiche per la propria
sopravvivenza.
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PUBBLICAZIONI:
Le pubblicazioni indicate dal numero seguito da una A corrispondono ad “abstract”.
Linea di ricerca n°1
1) Marziale F., Pucciarelli S., Ballarini P., Melki R, and Miceli C. “Microtubule nucleation in
the cold: characterization of γ−tubulin from the Antarctic ciliate Euplotes focardii”. Cell Motil.
Cytoskel. Submitted
2) Joachimiak E., Pucciarelli S., Ballarini P., Kaczanowska J., Miceli (2007) C. Cell-cycle
dependent expression of γ-tubulin in the amicronuclear ciliate Tetrahymena pyriformis.
Protist. 158(1):39-50
3) Pucciarelli S., Parker S., Detrich H.W. and Melki R. (2006) Cytoplasmic chaperonin
containing tcp-1 (CCT) from the Antarctic fish Notothenia coriiceps: functional and structural
properties. Extremophiles. 10(6):537-49
4) Pucciarelli S., Marziale F., Di Giuseppe G., Barchetta S., Miceli C.(2005) Ribosomal coldadaptation:
characterization of the acidic ribosomal P0 and P2 proteins from the Antarctic
ciliate Euplotes focardii. Gene. 360: 103-11
5) Pucciarelli S., Marziale F., Ballarini P., Miceli C. (2005) Microtubule cold-stability in the
Antarctic ciliate Euplotes focardii. Polarnet Technical Report. Proceedings of the Fifth PNRA
Meeting on Antarctic Biology 29-30 April 2004, Messina, pp 34-38
6) [A] Pucciarelli S., Di Giuseppe G., Dini F., Luporini P., Miceli C. (2003) “Euplotes focardii,
an Antarctic psychrophilic ciliate of presumed Gondwanan origin?”. J. Euk. Microbiol. 50:133
7) Pucciarelli S., Miceli C., Melki R. (2002) Heterologous expression and folding analysis of the
Antarctic ciliate Euplotes focardii β-tubulin. Eur J Biochem. 269(24):6271-7.
8) Pucciarelli S., Miceli C. (2002) Microtubule cold adaptation: characterization of α−tubulin
from the Antarctic ciliate Euplotes focardii. Extremophiles. 6(5):385-9.
9) [A] Pucciarelli S., Ballarini P., Miceli C. (2002) Adaptive evolution of alpha- and betatubulins
in the Antarctic ciliate Euplotes focardii. J. Euk. Microbiol. 49:53
10) [A] Pucciarelli S., Ballarini P., Melki R., and Miceli C. (2001) Heterologous expression and
folding analysis of the Antarctic ciliate Euplotes focardii β-tubulin. J. Euk. Microbiol. 48:92
11) Miceli C., Pucciarelli S., Ballarini P., Luporini P. (2000) Cold-stable microtubules of the
Antarctic ciliate ciliate Euplotes focardii. In Antarctic Ecosystem. (eds Davison W., Howard-
Williams C., Broady P.) Christchurch: Canterbury University Press. 154-7
12) Pucciarelli S. (1998) Caratterizzazione di microtubuli e tubuline del ciliato antartico
Euplotes focardii. Tesi di dottorato.
13) Pucciarelli S., Ballarini P., Miceli C. (1997) Cold-adapted microtubules: characterization of
tubulin posttranslational modifications in the Antarctic ciliate Euplotes focardii. Cell Motil.
Cytoskel. 38:329-40.
14) [A] Pucciarelli S., Ballarini P., Miceli C. (1997) Characterization of α- and β-tubulin in the
Antarctic ciliate Euplotes focardii. J. Euk. Microbiol. 44:40
15) Pucciarelli S., Ballarini P., Miceli C., Luporini P. (1996). Posttranslational tubulin
modifications of the Antarctic ciliate Euplotes focardii. Proceeding of the third meeting on
Antarctic Biology, Santa Margherita Ligure, pp 311-315.
16) Miceli C., Pucciarelli S., Ballarini P., Valbonesi A., Luporini P. (1996) The β−tubulin gene
family of the Antarctic ciliate Euplotes focardii: determination of the complete sequence of
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β−T1 gene. In Battaglia B. and Walton J. (eds) "Antarctic Communities". London: Cambridge
University Press, pp. 300-306.
17) Miceli C., Pucciarelli S., Di Giuseppe G. (1995) Characterization of the β−tubulin gene family
in the Antarctic ciliate Euplotes focardii. Proceedings of the II European Congress of
Protistology and VIII European Conference on Ciliate Biology, Clermond-Ferrand, pp 71-75.
18) [A] Pucciarelli S., Miceli C. (1995) "Structural characterization and expression of the βtubulin
gene family in the cold-poikilotherm ciliate Euplotes focardii." J. Euk. Microb. 42:
24A.
Presentazioni a congressi:
1- XXVI Congresso della Società Italiana di Protozoologia. Macerata 30 giugno e 1 luglio 2007
Different tubulin folding mechanisms in the Antarctic ciliate Euplotes focardii Marziale F.,
Pucciarelli S., Melki R. and Miceli C. (Comunicazione)
2- XXVI Congresso della Società Italiana di Protozoologia. Macerata 30 giugno e 1 luglio 2007
Nucleazione dei microtubuli al freddo: studio della funzione degli isotopi di gamma-tubulina
del ciliato antartico Euplotes focardii. Pucciarelli S., Marziale F., Ballarini P. e Miceli C.
(Comunicazione)
3- FASEB Summer Reserarch Conference, “Il Ciocco” Lucca (Italia), 3-8 Agosto 2005 Marziale F.,
Pucciarelli S., Ballarini P., Miceli C. “The γ−tubulin of the Antarctic ciliate Euplotes focardii”.
(comunicazione)
4- EMBO-FEBS WORKSHOP on Biology of Molecular Chaperones, 28 maggio-2 giugno 2005,
Zakopane, Polonia, Pucciarelli S., Parker S., Detrich H.W. and Melki R. “Cytoplasmic
chaperonin containing tcp-1 (CCT) from the Antarctic fish Notothenia coriiceps: functional and
structural properties” (poster)
5- SCAR international Biology Symposium, 25-29 Luglio 2005, Curitiba, Brasile. Pucciarelli S.,
Parker S., Melki R. and Detrich H.W. “Cytoplasmic chaperonin containing tcp-1 (CCT) from the
Antarctic fish Notothenia coriiceps: functional and structural properties” (comunicazione).
6- 24° Congresso della Società Italiana di Protozoologia. Rapallo (GE), 1-2 Ottobre 2004.
Pucciarelli S. and Miceli C.“Approach to statistical methods for detecting molecular coldadaptation”
(Comunicazione)
7- 4th European Congress of Protistology and 10th European Conference on Ciliate Biology. San
Benedetto del Tronto (AP) August 31-September 5, 2003 Pucciarelli S., Marziale F., Ballarini
P., Miceli C. “The γ−tubulin of the Antarctic ciliate Euplotes focardii”. (poster)
8- III Convegno Nazionale delle Scienze del Mare, CONISMA, Bari 27-29 Novembre 2002.
Pucciarelli S., Ballarini P., Miceli C.”Meccanismi molecolari responsabili dell’adattamento
dell’ α− e β−tubulina nel ciliato antartico Euplotes focardii a condizioni climatiche estreme”.
(comunicazione)
9- 23° Congresso della Società Italiana di Protozoologia. Porto Conte, Alghero (SS), 4-5 Ottobre
2002. Pucciarelli S., Di Giuseppe G., Dini F., Luporini P., Miceli C.. “Euplotes focardii, an
Antarctic psychrophilic ciliate of presumed Gondwanan origin”. (comunicazione)
10- 63° Congresso Nazionale Unione Zoologica Italiana, Rende (CS) 22-26 Settembre 2002.
Pucciarelli S., Di Giuseppe G., Dini F., Luporini P., Miceli C.. “Euplotes focardii, an Antarctic
psychrophilic ciliate of presumed Gondwanan origin”. (poster)
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11- XXII Congresso della Società Italiana di Protozoologia (SIP) La Spezia, 20-21 Settembre 2001.
Pucciarelli S., Ballarini P., Miceli C "Adaptive evolution of α− and β−tubulins of the Antarctic
ciliate Euplotes focardii." (Poster)
12- XI International Congress of Protozoology (ICOP). Salisburgo, 15-19 Luglio 2001. Pucciarelli
S., Ballarini P., Miceli C "Adaptive evolution of α− and β−tubulins of the Antarctic ciliate
Euplotes focardii." (Poster)
13- FASEB Summer Reserarch Conference, Vermont (USA), 28 Luglio-2 Agosto 2001. Miceli C., La
Terza A., Pucciarelli S., Barchetta S. Molecular evolution: adaptation, disaptation and gene
plasticity as response to thermal stress in Euplotes and Tetrahymena (Comunicazione)
14- XXI Convegno della Società Italiana di Protozoologia (SIP). Casalmaggiore (CR) 9-10
Novembre 2000. Pucciarelli S., Melki R, Miceli C. "Espressione eterologa e folding
dell'isotipo β−T1 di tubulina del ciliato antartico Euplotes focardii” (comunicazione)
15- ABCD-AGI-SIBBM-SIMGBM. Montesilvano Lido (PE) 1-4 ottobre 1998 Pucciarelli S.,
Ballarini P., Miceli C. Caratterizzazione dei microtubuli del ciliato antartico Euplotes focardii.
(poster)
16- 13th European Cytoskeleton Forum, Strasbourg, France, August 22-26 1998. Pucciarelli S.,
Ballarini P., Miceli C. “Distribution of the β−tubulin isotypes in the cold-adapted microtubules
of the Antarctic protozoa ciliate Euplotes focardii.” (poster)
17- 58° Congresso nazionale Unione Zoologia Italiana, Cattolica 24-28 Settembre 1997
Pucciarelli S., Ballarini P., Miceli C. Modificazioni strutturali e funzionali della tubulina nel
protozoo ciliato antartico Euplotes focardii. (poster)
18- 10th European Cytoskeleton Forum, Stockholm Univer., Stockholm, Sweden, May 27-31 1995
Pucciarelli S., Miceli C. Tubulin posttranslational modification in the Antarctic ciliate
Euplotes focardii. (comunicazione)
19- 9th European Cytoskeleton Forum, Dundee, Scotland, September 7-12 1994 Pucciarelli S.,
Miceli C. Structural characterization and expression of the β−tubulin gene family in the coldpoikilotherm
ciliate Euplotes focardii. (poster)
Linea di ricerca n°2
1- Wirz A, Pucciarelli S, Miceli C, Tongiorgi P, Balsamo M. (1999). Novelty in phylogeny of
gastrotricha: evidence from 18S rRNA gene. Mol Phylogenet Evol. 13:314-8.
2- Wirz A., Fregni E., Pucciarelli S., Miceli C., Balsamo M. (1998) Pylum Gastrotricha: a new
phylogenetic perspective from molecular analysis. Atti 1° Colloquio Nazionale di Sistematica
Clastidistica, Verona, Vol. 1: 63-65
Presentazioni a Congressi
1- 59° Congresso U.Z.I., San Benedetto del Tronto (Italy), 20-24 settembre, 60° Wirz A., Fregni
E., Pucciarelli S., Miceli C., Balsamo M. (1998) Posizione della famiglia Xenotrichulidae
nella filogenesi del phylum Gastrotricha. (Comunicazione)
2- 58° Congresso nazionale Unione Zoologia Italiana, Cattolica 24-28 Settembre, pag. 59° Wirz
A., Pucciarelli S., Miceli C., Tongiorgi P. (1997) Rapporti filogenetici del phylum
Gastrotricha sulla base dell'analisi molecolare del gene 18S rRNA. (Comunicazione)
3- 57° Congresso nazionale Unione Zoologia Italiana, San Benedetto del Tronto 22-26 Settembre,
Wirz A., Pucciarelli S., Miceli C., Balsamo M, Tongiorgi P. (1996) Studio dei geni codificanti
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gli RNA ribosomali 18S e 16S ai fini di un’analisi tassonomica e filogenetica del phylum
Gastrotricha. (Comunicazione)
Linea di ricerca n°3:
1- Pucciarelli S., Buonanno F., Defrancesco F., Miceli C. Biomonitoring of Garda lake: specie
determination of a blooming Stentor during Summer 2004. Manoscritto in preparazione.
2- Bedini R., Pucciarelli S., Gatta R., Nannelli A., Miceli C. (2004). HSP70 gene expression in
sipunculids: a new biomarker for monitoring marine deposits Chemistry and Ecology, Vol. 20
(Supplement 1), pp. S345–S352).
Presentazioni a Congressi
1- III Convegno Nazionale delle Scienze del Mare, CONISMA, Bari 27-29 Novembre 2002. Bedini
R., Gatta R., Pucciarelli S., Miceli C. “I sipunculidi come nuovi bioindicatori nel monitoraggio
di sedimenti marini” (poster).
2- Convegno “Studio preliminare sulla situazione ambientale di aree interessate da scarichi
industriali della costa toscana”. Piombino (Li), 15 Novembre 2002. Pucciarelli S. “I
sipunculidi come bioindicatori nel monitoraggio ambientale del porto di Piombino”
(Comunicazione)
PROGETTI DI RICERCA:
La mia attività di ricerca è stata ed è inserita nei seguenti progetti:
- progetto di ricerca MIUR di interesse nazionale (2007) in “Analisi comparativa delle sequenze
genomiche, del folding e dell'adattamento molecolare di membri della superfamiglia delle
tubuline”. Coordinatore nazionale prof. C. Miceli.
- ENEA: Programma Nazionale di ricerca in “Genomica e Proteomica del ciliato antartico Euplotes
focardii” (2004-2006), coordinato dalla prof.ssa C. Miceli.
- ENEA: Programma Nazionale di ricerca in Antartide, coordinato dal prof Pierangelo Luporini, dal
1995 a tutt’oggi;
- progetto di ricerca MIUR di interesse nazionale (2000-2003 e 2002-2004) in "Evoluzione
molecolare e marcatori di filogenesi e di adattamento". Coordinatore nazionale prof. C. Miceli.
- progetto di ricerca finalizzato del CNR in Biotecnologie ambientali (unità operativa coordinata
dalla prof.ssa Miceli);
- progetto Giovani Ricercatori Anno 2002, dal titolo: " Espressione eterologa della tubulina del
ciliato antartico Euplotes focardii nella linea cellulare umana HepG2 per conferire ai microtubuli
endogeni resistenza a basse temperature”.
- progetto Giovani Ricercatori Anno 2001, dal titolo: “Analisi di folding e proprietà nucleative della
β-tubulina del ciliato Euplotes”.
REVIEWER PER LE SEGUENTI RIVISTE INTERNAZIONALI:
Antarctic Science
Polar Biology
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ATTIVITÀ DIDATTICA
Carichi
1- “Biologia dell’ambiente marino”, settore BIO/07, 5 CFU, corso di laurea in Biologia (sede di
San Benedetto)
2- “Laboratori didattici naturalistici”, settore BIO/07, 2 CFU , corso di Laurea in Scienze per la
natura e per l’ambiente
3-“Ecologia e Biologia Marina II”, settore BIO/07, 2 CFU, corso di laurea in “Biologia della
nutrizione” (sede di San Benedetto)
4-“Metodi diagnostici per la rilevazione ambientale di eucarioti”, settore BIO/07, 3 CFU, corso
di laurea specialistica in “Scienze biomolecolari e biofunzionali”
5-“Evoluzione e biodiversità”, settore BIO/07, 4 CFU , corso di laurea specialistica in
“Bioinformatica”
6-“Biomonitoraggio e bioindicatori”, settore BIO/07, 3 CFU, corso di laurea specialistica in
“Chimica e Metodologie Chimiche Avanzate ”
nell’anno accademico 2002/2003
“Esperienze Didattiche di Biologia” presso la Scuola di Specializzazione all’Insegnamento
Secondario
lezioni integrative
1-“Biologia Cellulare e Biotecnologie cellulari” nel corso di Laurea in Biotecnologie.
2-“Biologia Cellulare” e di “Laboratorio di esperienze didattiche in Biologia”.
3-Laboratorio di “Didattica Ambientale” del corso di Laura in Scienze della Formazione
primaria presso la Facoltà interuniversitaria di Scienze della formazione, Università degli studi
di Macerata.
Relatore di tesi di Laurea:
1- “Clonaggio di un gene omeotico in Paraturbanella teissieri (Gastroticha) e sue implicazioni
per le relazioni filogenetiche del phylum” Corso di Laura specialistica in Biologia Cellulare e
Molecolare della Facoltà di Scienze Matematiche Fisiche e Naturali dell’Università degli studi di
Urbino “Carlo Bo”, Laureando: Cerri M. Ottobre 2006
2- “Caratterizzazione della γ−tubulina e adattamento a basse temperature del ciliato antartico
Euplotes focardii”, Corso di Laurea in Scienze Naturali, Università di Camerino. Laureanda:
Marziale F. Luglio 2003
3- “I Sipunculidi come bioindicatori nel monitoraggio ambientale del porto di Piombino e zone
limitrofe”, Corso di Laurea in Scienze Naturali, laureando: Gatta R. Aprile 2002
4- “Caratterizzazione della proteina acida ribosomale della famiglia P2 in Euplotes”, Corso di
Laurea in Scienze Biologiche, laureanda Trovellesi M. Aprile 2002
5- “Espressione in batteri e analisi in vitro del “folding” della β−tubulina del ciliato antartico
Euplotes focardii”, Corso di Laurea in Scienze Biologiche, laureanda: Melonaro B. Aprile 2002
6- “Caratterizzazione dei geni per la β-tubulina nel ceppo di Euplotes MR13 e relazione
filogenetica con ceppi antartici di Euplotes focardii”, Corso di laurea in Scienze Naturali,
laureanda: Zaccari S. Aprile 2001
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7- “La Chaperonine Cytoplasmique (CCT) du poisson antarctique Notothenia coriiceps :
détermination des propriétés structurelles et fonctionnelles”. Laboratoire d’Enzymologie et
Biochimie Structurales, CNRS, Gif-Sur-Yvette, Francia. Laureando. Allard A. 2000.
8- “Adattamento alle basse temperature di cilati antartici: caratterizzazione dell’α-tubulina in
Euplotes focardii”. Corso di laurea in Scienze Naturali, laureanda: Campanelli L. Aprile 1998
CONOSCENZE TECNICHE
Biologia molecolare purificazione di DNA e RNA. Clonaggio e sequenziamento di DNA. Sintesi
di cDNA. PCR e Real Time-PCR. Southern e Northern blot. Espressione
eterologa di proteine in batteri. Tecniche di trasformazione e transfezione.
Biochimica Tecniche cromatografiche per la purificazione di proteine (scambio ionico,
affinità, esclusione molecolare, ecc.). HPLC. SDS-PAGE e PAGE in
condizioni native. IEF e elettroforesi bidimensionale. Western Blot.
Ultracentrifugazione analitica.
Analisi ecologiche Programmi per analisi statistiche di modelli ecologici: STATA e R
Colture cellulari. Generazione e mantenimento.
CONOSCENZE INFORMATICHE E BIOINFORMATICHE
Microsoft Office (Word, Excel, Powerpoint); Photoshop; programmi per l’analisi di sequenze di
DNA e proteine (BLAST, DNASTAR, CLUSTAL), analisi filogenetiche (PAML) e costruzione di
alberi filogenetici (TREECON).
LINGUE
Inglese Buon livello di comprensione ed espressione orale e scritta (livello PET-with merit).
Francese Ottimo livello di comprensione ed espressione orale e scritta
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