La lotta contro le malattie infettive degli animali nella legislazione ...

La lotta contro le malattie infettive degli animali nella legislazione italiana
Testo Unico delle Leggi Sanitarie (T.U.LL.SS.) 1934.
Prende in considerazione le misure contro le malattie infettive degli animali
-Obbligo di denuncia di morte improvvisa, o di malattia infettiva accertata o sospetta
-L'autorità può emanare, mediante apposite ordinanze, disposizioni tese a limitare la
diffusione di malattie infettive diffusive (compresa la facoltà di abbattere e distruggere
animali infetti, contemplando la possibilità di indennizzare parzialmente il proprietario).
Legge 34/1968 (modificata dalla legge 98/1985)
- Da facoltà al ministro della sanità di disporre l'obbligo di abbattimento di infetti sospetti
infetti e sospetti di contaminazione (in caso di malattie esotiche)
- Dispone l'indennità di abbattimento sulla base del valore commerciale (tale indennità
graverà sul bilancio dello stato ma non verrà corrisposta se gli allevatori interessati non
avranno segnalato tempestivamente l'insorgenza della malattia.
Il regolamento di polizia veterinaria
Attualmente in vigore, è stato approvato nel 1954
E' un regolamento speciale (previsto dal T.U.LL.SS.) che determina le norme di applicazione
dell'art. 264 dello stesso T.U. ( il quale si limitava ad una enunciazione di carattere generale circa le
misure da adottarsi per impedire la diffusione delle malattie del bestiame).
Il regolamento di Polizia Veterinaria è una codificazione delle conoscenze scientifiche relative alla
natura delle malattie infettive e in particolare alla loro epidemiologia.
Per la lotta ai microrganismi bisogna infatti conoscere in quali momenti del loro ciclo bisogna agire
per interrompere la loro diffusione (se i focolai si sono già verificati) oppure quali precauzioni
bisogna adottare per impedirne l'insorgenza.
Le disposizioni contenute considerano sia l'azione repressiva che preventiva
Il regolamento è diviso in tre parti (titoli)
Il primo titolo comprende le norme generali ed in particolare quelle che riguardano la vigilanza
veterinaria permanente. Nel secondo sono elencate le norme speciali che devono essere adottate per
combattere le specifiche malattie infettive. Queste hanno carattere prevalentemente repressivo
perchè prevedono misure applicabili dopo che si è verificato l'episodio morboso.
Il terzo titolo contiene disposizioni finali sulle sanzioni per chi infrange il regolamento.
L'art. 1 considera le malattie infettive denunciabili per le quali si applicano le misure contenute nel
regolamento. A questo primo elenco di 30 malattie si sono aggiunte nel corso degli anni,
integrazioni e aggiunte ( mediante ordinanze ministeriali, adeguamenti normative CEE) via via che
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le conoscenze scientifiche hanno ampliato la gamma delle patologie o migliorato il modo per
combatterle.
Sono considerate contagiose le malattie infettive a carattere diffusivo. Ogni caso di insorgenza di
malattia infettiva viene indicato con il termine di focolaio (stalla, scuderia, ovile, pascolo,
abbeveratoio, mercato).
Si considerano:
Sospetti ammalati : animali che presentano sintomi dubbi di una malattia contagiosa
Sospetti infetti : animali che albergano l’ agente eziologico (portatori subclinici, presintomatici,
convalescenti, asintomatici)
Animali sospetti contaminati : animali che si presume siano venuti in contatto con l'agente
eziologico e per i quali non si può escludere che abbiano assunto il contagio.
Animali indenni : animali che sicuramente non albergano l'agente eziologico
Denuncia della malattie infettive
Anche dopo l'istituzione del Servizio Sanitario Regionale, il Sindaco rimane l'autorità sanitaria del
comune, al quale deve essere inviata la denuncia di malattia infettiva. Ricevuta la segnalazione, il
Sindaco provvederà a rivolgersi alla USL affinchè sul posto venga inviato un veterinario ufficiale
per l'accertamento della diagnosi.
Una volta sul luogo il veterinario ufficiale, accertata la natura della malattia infettiva, dovrà
eseguire rilevamenti fra i quali: provvedimenti immediati adottati, animali recettivi, colpiti, sospetti
ecc.
Articoli 2-5: persone tenute alla denuncia, modalità (verbale o scritta), precauzioni da adottare
immediatamente, denuncia di zoonosi .
Art.6,8,9 : disposizioni per laboratoristi che refertano esiti diagnostici relativi a malattie di cui
all'art.1. Registro malattie infettive. Provvedimenti consecutivi alla denuncia del veterinario
ufficiale.
Precauzioni da adottare nel sopralluogo
Vestiario adeguato
Istruzione del personale (zoonosi, malattie altamente diffusive)
separazione degli animali (appartenenti a diversi gruppi)
Indagine epidemiologica (animali entrati od usciti nell'ultimo periodo) tesa ad accertare la
provenienza dell'infezione o allertare i servizi veterinari di zone a rischio (se animali
sono usciti dal focolaio prima della comparsa di sintomi).
Art.10 provvedimenti adottati dal sindaco con apposita ordinanza
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- Isolamento : separazione degli animali ammalati o sospetti dagli animali ritenuti sani, nel modo
più completo possibile
- Accantonamento: se gli animali si trovano al pascolo, verrà recintata una parte lontana da strade e
corsi d'acqua
- Sequestro : può completare l'isolamento, e consiste nella proibizione di spostare gli animali dal
luogo dove essi sono stati isolati o accantonati.
Il sequestro può essere fiduciario (si affidano le responsabilità dell'osservanza delle norme impartite
al proprietario o detentore degli animali) o di rigore ( prevede il piantonamento della zona da parte
della forza pubblica. Si applica in caso di malattie particolarmente diffusive)
- Abbattimento degli animali infetti
Macellazione: quando permesso dalle norme del regolamento , avverrà alla presenza di un
veterinario ufficiale che darà il suo giudizio sulla ammissibilità al consumo delle carni e
disporrà le misure necessarie ad evitare lo spargimento di materiale infettante.
Abbattimento e distruzione: avverrà se possibile in vicinanza dell'allevamento, senza
spostare gli animali. Dovrà essere effettuato con mezzi che assicurino una morte rapida
senza spargimento di sangue. A questo si deve aggiungere la disinfezione degli indumenti e
degli arnesi di contenzione. Le necroscopie vanno eseguite nel luogo di distruzione. Il
trasporto delle carcasse, se necessario, deve avvenire in veicoli a tenuta stagna. A seconda
delle infezioni può essere utile utilizzare repellenti contro gli insetti (teloni imbibiti di
petrolio).
I metodi di distruzione contemplati dal regolamento sono l’infossamento, la cremazione, la
sterilizzazione e la denaturazione con sostanze chimiche. I primi due sono i più utilizzati
Infossamento
E' il sistema più usato per la possibilità di scavare una fossa in vicinanza dell'allevamento e per la
limitatezza degli oneri economici. In pianura bisognerà tenere conto del livello della falda idrica
superficiale, in montagna va considerata la permeabilità del terreno ed il pendio. Nei terreni
permeabili si ha putrefazione, mentre in presenza di clima secco, si può avere mummificazione
(nessuna garanzia di inattivazione). Nel terreno impermeabile saturo di acqua si ha trasformazione
in adipocera. I terreni impermeabili sono i meno indicati per una rapida eliminazione delle spoglie
ma danno le migliori garanzie per l'inquinamento e la loro compattezza impedisce agli eventuali
animali predatori di arrivare alle spoglie.
Cremazione
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può essere eseguita negli inceneritori oppure mediante una pira scavando una fossa di un metro e
stratificando nell'ordine: calce, copertoni di camion, legna grossa, animali (in unico strato),
pneumatici di auto, paglia, combustibile.
Art.11
Emanazione di zona infetta
Per molte infezioni viene fissato un
raggio minimo di 3 km. Per stabilire l'estensione della zona
infetta.
Si deve
tenere in considerazione la topografia della località, il tipo di allevamento e di ricoveri,
esigenze di traffico, vicinanza di altri allevamenti, rete stradale. Comprenderà tutti gli allevamenti
circostanti al focolaio che, per non essere separati da barriere naturali, possono facilmente essere
esposti al contagio. I confini saranno determinati da barriere naturali: strade, fiumi, canali.
Divieto di spostare dalla zona infetta tutti gli animali (ad eccezione di sani vaccinati in tempo utile)
se la zona infetta interessa più di un comune, il provvedimento sarà preso dalla autorità regionale.
Art. 12 comunicazione di insorgenza di malattia infettiva (da parte del sindaco al presidente della
giunta regionale ed alle usl)
Art.13 Zona di protezione
Viene adottata dal sindaco
quando è tutta compresa nel territorio comunale, dal presidente della
giunta regionale quando interessa più comuni. Ha lo scopo di proteggere i territori indenni dalla
possibilità di penetrazione del contagio dalla zona dichiarata infetta. Si può rendere obbligatoria la
vaccinazione delle specie recettive (vaccinazione accerchiante).
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Art.14 e 15: Spostamento di animali fuori dalle zone infette e di protezione
Per alcune malattie è comunque vietata ed è eccezionalmente consentita quando sussistano
insormontabili difficoltà di alimentazione o di macellazione sul posto
Art.16 revoca dei provvedimenti di zona infetta e di protezione.
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Lista A, B, C delle Malattie secondo il codice zoosanitario internazionale
Lista A :malattie trasmissibili a rapida diffusione, anche da un paese all'altro, con gravi
conseguenze socio-economiche o di sanità pubblica . Molto importanti per gli scambi internazionali
di animali e prodotti di origine animale . Tutti i focolai devono essere segnalati all'OIE.
Lista B: malattie trasmissibili considerate di importanza socio-economica all'interno di ciascun
Paese , con conseguenze negli scambi anche internazionali. Le segnalazioni sono fatte una volta
all'anno all'OIE.
Lista C: malattie importanti all'interno di un allevamento o di importanza individuale .
LISTA A
Afta epizootica
Stomatite vescicolare
Peste bovina
Pleuropolmonite contagiosa bovina
Peste suina classica
Peste equina
Peste suina epizootica
Morbo di Teschen
Peste ovina
Malattia di New Castle
Vaiolo ovino
Malattia della valle del Rift
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Vaccini antivirali
La vaccinazione è un metodo di prevenzione molto valido contro le malattie virali . I primi casi di
utilizzo di vaccinazioni risalgono ai primi dell' '800. Per molti anni si è distinto tra :
vaccini inattivati ( molti vaccini virali rientrano in questa categoria )
vaccini vivi o attenuati ( il virus riesce a replicarsi ma ha bassa patogenicità.)
Attualmente , con l'avvento di nuove tecnologie , si tende a classificare i vaccini secondo diversi
criteri, in modo tale da ottenere due nuove categorie, più ampie, che comprendano anche i nuovi tipi
di vaccino che male rientrano nelle due vecchie categorie:
-vaccini a base di immunogeni esogeni (introduciamo dall'esterno la sostanza che deve
stimolare l'attività immunogena. Tra questi rientrano i virus inattivati .)
-vaccini a base di immunogeni endogeni (sono sostanze prodotte direttamente dalle cellule
animali . Tra questi rientrano i virus vivi e attenuati, che replicando nelle cellule, inducono
la sintesi delle proteine che stimolano la risposta immunitaria . L'immunità è mediata dalle
cellule infettate dal virus)
Questa distinzione è abbastanza utile e valida se si tiene conto del diverso tipo di risposta
immunitaria che si verifica a seconda del tipo di immunogeno utilizzato:
- immunogeni esogeni: risposta tramite Ag di istocompatibilità di classe II , che stimolano
soprattutto i linfociti T helper, i quali inducono una risposta di tipo umorale .
- immunogeni endogeni : risposta tramite Ag presentati sulla superficie delle cellule infette e
stimolano le molecole di classe 1, le quali attivano i linfociti citotossici , inducendo quindi una
risposta cellulo- mediata.
Immunogeni esogeni
Virus inattivati
Sono rappresentati da stipiti virulenti che vengono inattivati totalmente . La capacità replicativa è
insita nel acido nucleico e l'inattivazione avviene per tanto a questo livello . L' inattivazione, che
può avvenire con l'utilizzo di mezzi chimici o fisici non deve alterare gli Ag di superficie
Alcuni incidenti vaccinali hanno avuto luogo nel programma di prevenzione dell'Afta epizootica .
Si tratta però solitamente di vaccini innocui e sicuri al 100%.
Possono essere utilizzati anche in animali in non perfette condizioni, o lievemente immunodepressi.
Presentano lo svantaggio di evocare una buona risposta umorale ma non sempre anche una risposta
cellulo-mediata. Sono inoltre necessarie numerose vaccinazioni ,con richiami semestrali o annuali ,
per mantenere un buon livello di immunità. Ulteriore svantaggio è rappresentato dal fatto che per
ottenere una adeguata immunità è necessario un titolo virale elevato, con conseguente aumento dei
costi.
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Vaccini purificati costituiti da Subunità
Il vaccino influenzale è un vaccino a subunità , così come il vaccino contro l ‘epatite B. In questi
casi sono stati identificati gli Ag di superficie del virus e successivamente, grazie a mezzi chimici ,
sono stati estratti e concentrati e somministrati con l'aggiunta di adiuvanti .
Sono vaccini purificati , che danno meno problemi per quanto riguarda i fenomeni allergici.
Stimolano poco l'immunità locale e quella di tipo cellulo-mediata , mentre stimolano molto di più la
risposta umorale. Sono vaccini molto sicuri. L’ inconveniente principale è legato al loro scarso
potere immunogeno. Numerose ricerche sono attivate per sperimentare una nuova generazione di
sostanze adiuvanti, dette immunostimolanti (ISCOM =immuno stimolating complex), che vengono
aggiunte alle subunità antigeni; solitamente sono rappresentate da glicosidi e presentano una
struttura tridimensionale. Il più noto è il quil A (estratto da una pianta). Gli Ag si depositano su
queste sostanze alle quali si legano per interazioni chimiche, mimando in questa maniera la
costituzione tridimensionale di un virus .
La risposta immunitaria è migliore di quella che si può ottenere con la somministrazione della sola
sostanza immunogena ; si ha infatti una migliore risposta cellulo-mediata.
Subunità prodotte in cellule eucariote (eucarioti ricombinanti)
Alcune proteine presenti sulla superficie virale assumono la loro configurazione naturale solo
quando sono prodotte da cellule animali eucariote. Le proteine sono prodotte, ma tramite processi
post-trascrizionali (glicosilazione, trasporto a livello della membrara cellulare) esse assumono la
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loro nativa configurazione.
Si è così tentato di far produrre le subunità antigeni in cellule eucariote provenienti da insetti,
utilizzando il Baculovirus come vettore (un virus che parassita gli insetti). La cellula infettata
produce ed espone le glicoproteine con la configurazione ottimale.
Non sempre è però possibile far produrre grandi quantità di Ag a basso costo, così come per le
sostanze prodotte dai batteri.
In alcuni casi abbiamo la produzione di capsidi vuoti ( virus privi di acido nucleico) e si producono
così delle proteine che si auto-assemblano poichè hanno una configurazione naturale.
Vaccini sintetici
Nel caso dei peptidi sintetici gli epitopi preferenziali sono rappresentati da sequenze di aminoacidi
che per lo più vengono esposte esteriormente. Con questo pezzo di proteina viene immunizzato
l'animale, soprattutto nel caso di virus piccoli, con composizione Ag semplice. Le sequenze
aminoacidiche più esposte sono quelle più idrofiliche, essendo il virus maggiormente presente nei
liquidi biologici.
Nel caso dell'afta epizootica è stata identificata la sequenza responsabile dell’ induzione di anticorpi
protettivi: si tratta di un virus nudo, con acido nucleico piccolo e guscio proteico formato da quattro
proteine, VP1, VP2, VP3, VP4, delle quali la più importante risulta essere la VP1. La sequenza
aminoacidica è stata ricavata dalla sequenza del rispetttivo gene e risulta formata da 213 AA. La
porzione contenente gli epitopi più importanti va dall’ AA 141 all’ AA 160. Questo peptide è stato
Chimicamente sintetizzato ed ha consentito di ottenere un vaccino capace, se opportunamente
veicolato, di indurre una risposta di tipo protettivo.
sintetizzato in vitro introducendo in batteri (Escherichia coli) la frazione del gene corrispondente;
successivamente il prodotto è stato purificato, addizionato ad un carrier adiuvante e inoculato negli
animali.
Vaccini a subunità ricombinanti
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Sono proteine virali espresse in Escherichia coli e purificate mediante metodi cromatografici.
Questo metodo risulta economico ed ha avuto successo con animali da laboratorio, ma non ha
ancora trovato impiego negli animali da reddito nelle pratiche preventive, per la necessità di dover
sperimentare gli adiuvanti più adatti ; il problema da risolvere è infatti ancora quello di arrivare a
presentare bene l’ antigene al sistema immunitario.
Immunogeni
endogeni
Vaccini attenuati
Tali virus vengono inattivati con metodi convenzionali , in modo anche abbastanza empirico,
tramite passaggio in specie animali non recettive , in colture cellulari , in uova embrionate.
Si selezionano così mutanti non patogene e più adatte a vivere sul substrato prescelto.
Esistono molti vaccini ottenuti con virus attenuati. Essi danno infatti alcuni vantaggi:
con il loro
utilizzo si ha l'insorgere di un'infezione vera e propria, ma molto blanda, con conseguente
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stimolazione bilanciata dell'immunità nelle sue tre modalità (umorale, locale, cellulo-mediata).
Contemporaneamente però non si ha insorgenza di malattia .I dosaggi necessari risultano più bassi
rispetto a quelli utilizzati nel caso di virus inattivati, comportando quindi minori costi. I problemi
riguardano invece i metodi di conservazione; è necessario mantenere la catena del freddo per
conservare inalterate le caratteristiche del vaccino.
I vaccini possono essere somministrati localmente per contatto diretto con le mucose ( ad esempio
tramite nebulizzazione per le prime vie respiratorie , via orale per malattie intestinali, o
instillazione congiuntivale.).
Esistono vaccini vivi attenuati
che vengono detti mutanti termosensibili in quanto in seguito a
mutazioni si inducono alcune modificazioni delle caratteristiche biologiche legate al ciclo
replicativo che avviene a determinate temperature . Nel caso ad esempio dei mutanti termosensibili
responsabili di malattie respiratorie (IBR), instillati nella cavità nasale , trovano nel sito di inoculo
una temperatura inferiore a quella corporea ; è sufficiente uno scarto di 1-2° C perchè il virus si
replichi localmente, comportandosi come vaccino vivo. Se il virus però supera la barriera locale e
generalizza, non si replica più (per aumento della temperatura) comportandosi come un vaccino
spento.
Questo tipo
di virus è utilizzato ad esempio nel caso delle malattie respiratorie del bovino.
Il virus replicandosi a livello locale permette la produzione di IgA. Lo svantaggio di questo
tipo di
virus è costituito dalla possibilità dell'esistenza di una virulenza residua per certe specie di animali .
La vaccinazione con virus attenuati è sconsigliabile nelle femmine in gravidanza , poichè può
oltrepassare la placenta ; è altresì da evitarsi in soggetti immunodepressi poichè si avrebbe una
risposta anomala ; anche nel caso di animali troppo giovani è preferibile evitare questa metodica
vaccinale.
Inoltre è bene
tener presente che, per alcuni virus, anche gli stipiti vaccinali possono dare infezione
latente. La riattivazione può interessare sia il ceppo selvaggio che quello vaccinale attenuato. E’
inoltre possibile che il virus vaccinale possa venire eliminato e risultare virulento per animali di
specie diversa e più sensibile ai virus della specie vaccinata come verificatosi in gatti ammalatisi di
pseudorabbia che vivevano nei pressi di allevamenti di suini vaccinati.
In conseguenza di fenomeni di ricombinazione genetica può poi avvenire
che stipiti selvaggi e
stipiti vaccinali determinino l'infezione contemporanea della stessa cellula generando varianti con
caratteristiche nuove.
Vaccini a delezione ge nica
I vaccini deleti, attenuati creando
mutazioni con una manipolazione genetica , rappresentano un
metodo di inattivazione razionale. In questo caso si sequenzia il genoma virale, si identificano i geni
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e se ne selezionano alcuni che si ritengono responsabili della virulenza e si eliminano ( delezione ).
Si ottiene in questo modo un attenuamento dello stipite .
La delezione può avvenire anche a livello di proteine immunogene non essenziali al virus per
replicarsi. E’ così possibile selezionare gli animali vaccinati (che non producono anticorpi verso la
proteina il cui gene è stato deleto) rispetto agli animali infetti ( che venendo a contatto con il virus
selvaggio producono anticorpi verso la proteina) ( vaccini a marker immunologico negativo).
Questo sistema è utilizzato nei piani di eradicazione contro alcune malattie erpetiche.
L’
attenuazione è ottenuta per delezione del gene timidino-chinasi (responsabile della latenza virale)
mentre il marker immunologico negativo è costituito da una proteina dell’ envelope virale che
manca per delezione del rispettivo gene nel vaccino (gE). Con test sierologici che utilizzano come
antigene la proteina deleta è così possibile capire se l'animale è infetto (sieropositivo) o vaccinato
(sieronegativo).
Le delezioni geniche
offrono più garanzie poichè quando la delezione riguarda i geni codificanti per
la virulenza è difficile che si verifichino delle retromutazioni.
Molti vaccini deleti possono essere utilizzati come vaccini inattivati , ma anche come vaccini
attenuati. Questi ultimi vengono utilizzati soprattutto in soggetti destinati all'ingrasso.
Con la vaccinazione si controllano gli effetti dell'infezione , non l'infezione stessa .Alla luce di ciò è
importante tener conto della possibilità che alcuni animali vaccinati presentino già , albergati dentro
di essi , il virus.
Vettori virali
Nel caso di vaccini a virus vettori ( vettori di geni estranei ) o virus ricombinanti si manipola il
genoma di alcuni virus con tratti di corredo genetico del virus per il quale si vuole vaccinare.
Il virus in questo modo ha il proprio corredo , più un gene di codifica per una glicoproteina
estranea. La risposta immunitaria sarà perciò diretta sia verso il virus , sia verso la proteina
particolare dell'altro virus.
Nel caso della vaccinazione contro la rabbia si identificano gli Ag che stimolano la produzione di
anticorpi ad attività neutralizzante.
Si isola il gene e lo si inserisce nel vettore virale. Sono vaccini ancora in via sperimentale , ma che
presentano tutti i vantaggi del vecchio metodo a virus attenuato.
I virus vettori devono però essere molto sicuri in quanto possono attecchire in diverse specie., sono
resistenti agli agenti fisico-chimici, e hanno genoma corposo e consistente che può essere
manipolato senza danneggiarli. Possono essere rappresentati da virus grossi , come i poxvirus (500
geni), o da virus piccoli , formati da 3-4 geni. Lo stesso vettore virale non può essere utilizzato due
volte perché l'infezione non avrebbe luogo, essendo l'animale già vaccinato e immunizzato contro lo
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stesso. In questo caso si potrebbero inserire più geni che codificano per proteine di diversi virus e
diverse malattie contemporaneamente (vaccini polivalenti ).
Immunizzazione genetica
Vaccini basati sulla immunizzazione genetica sono ancora in via di sperimentazione. Si sa che
attraverso la transfezione si possono inoculare dei geni in una cellula , facendo si che questa
produca una proteina. In vivo l'inoculazione di DNA veicolato da plasmidi può portare alla
espressione di tale gene nella cellula. Se tale metodo funziona ed è sicuro può rappresentare un
vaccino del futuro.
Vaccinazione
per via parenterale
Il rilievo di anticorpi sierici rimane a tuttoggi il metodo più usato per valutare l'efficacia di vaccini
somministrati per via parenterale .Infatti , nonostante l'immunità cellulo-mediata giochi un ruolo
anche superiore nelle malattie virali , i metodi per valutare questo tipo di risposta ( blastizzazione
linfocitaria) sono ancora da perfezionare e attualmente vengono impiegati in laboratori
specializzati.
La cinetica della
risposta anticorpale in seguito a vaccinazione può esssere così schematizzata .
1a inoculazione : latenza 5-7 giorni, picco anticorpale 15 giorni , decremento veloce al'inizio
, più lento in seguito.
2a inoculazione: non prima di 15 giorni ( meglio se dopo 20-30) latenza poche ore, picco
dopo 3-5 giorni , alto livello anticorpale per lungo tempo.
Per i vaccini
vivi è spesso sufficiente un'unica somministrazione .
Per vaccini inattivati , è opportuno somministrare più volte il vaccino,
unitamente ad adjuvanti che
favoriscono il lento rilascio dell'antigene dal punto di inoculazione .
L'uso di adjuvanti conferma che è più efficace la somministrazione protratta nel tempo di piccole
dosi piuttosto che la somministrazione unica abbondante.
Vi
sono alcune nozioni supplementari che hanno valore pratico nella vaccinazione e che è utile
ricordare.
Concorrenz a antigenica
Quando vendono inoculati
vaccini polivalenti ( o misti )si può avere una risposta diversissima verso
ogni antigene presente nel vaccino ( Es.:elevatissima verso due , modesta verso un terzo ed
insufficiente verso un quarto). Variando opportunamente le dosi di ogni antigene si può ovviare a
questo inconveniente.
Un 'altra evenienza può
essere che il soggetto da vaccinare abbia contratto in precedenza rapporti
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naturalmente con un virus presente nel vaccino polivalente. La risposta alla vaccinazione sarà
elevatissima verso il microrganismo omologo, a scapito degli altri (Crowding out).
Effetto della dose
Una dose troppo bassa non stimola adeguatamente. Superata la soglia efficace , la risposta aumenta
un modo irregolare. Dosi troppo elevate possono portare a paralisi immunitaria.
Tolleranza indotta
Incapacità dell'animale di produrre anticorpi in seguito a vaccinazione se ha avuto precedenti
contatti durante il primo periodo della vita intrauterina.
Blanketing
Presenza di anticorpi passivi ricevuti per via materna nel periodo peri-natale , in grado di interferire
con l'antigene vaccinale annullandone l'effetto. La prima vaccinazione infatti dovrebbe essere
effettuata dopo un periodo sufficiente perchè gli anticorpi materni siano notevolmente diminuiti o
scomparsi.
Fase negativ a
Dopo la seconda
inoculazione si può assistere alla caduta del tasso anticorpale prodotto in seguito
alla prima inoculazione, dovuta alla neutralizzazione degli anticorpi da parte dell'antigene vaccinale
.
E ffetto booster
Possibilità che un individuo vaccinato potenzi la risposta anticorpale venendo naturalmente a
contatto con il microrganismo (rivaccinazione spontanea )
Vaccinazione
per via mucosale
Vaccinazioni per via orale sono stati ritenuti per
lungo tempo inefficaci per la mancanza di una
adeguata risposta immunitaria di tipo sistemico. I successi ottenuti con la vaccinazione antipolio
hanno portato a riesaminare questi concetti. L'interesse era suscitato dal fatto che vaccinazioni
parenterali verso le più comuni infezioni batteriche intestinali non davano l'effetto desiderato. La
vaccinazione per via orale invece risulta più semplice e sicura.
Requisiti:
Vaccini vi vi danno i migliori risultati. La natura della risposta immunitaria è condizionata da
quantità e persistenza dell'antigene. La memoria immunologica è scarsa o assente per le Ig A ed è
presente nella componente cellulo-mediata dell'immunità locale. La stimolazione degli aggregati
linfoidi intestinali (GALT) mobilizza i linfociti B attivati e le Ig A in altri distretti mucosali. I
linfociti attivati raggiungono anche la mammella, producendo in loco Ig A (immunità passiva).
Le caratteristiche fisiche dell'antigene (dimensioni 1.5-100µm) condizionano il sito di adesione
e
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quindi il sito di maggiore produzione delle difese locali.
Futuri sviluppi:
Integrazione di vaccini inattivati con la dieta.
Vaccini economici, sicuri, che superino la difficoltà di una scarsa memoria immunologica e
garantiscono la costante presenza dell'antigene. Utilizzo di microrganismi geneticamente modificati
che siano dotati della caratteristica di colonizzare l'apparato gastroenterico ed esprimano sulla loro
superficie proteine di batteri e virus patogeni .
DIFFICOLTA'
DI VACCINARE CONTRO TUTTE LE MALATTIE
Vengono di seguito elencati alcuni problemi che rendono ancora oggi difficoltoso
l'allestimento di
vaccini per determinati agenti patogeni. Alcuni di questi problemi coinvolgono agenti virali:
- scarsa immunogenicità di alcune proteine (specialmente protozoi)
- infezioni eminentemente localizzate
- virus immunosoppressori (anche stipiti
vaccinali)
- agenti non coltivabili in laboratorio
- eterogeneità genetica (virus del raffreddore:
più di 100 sierotipi)
- variabilità genetica (shifts & drifts antigenici dei virus influenzali)
- mimetismo antigene (protozoi) con proteine ematiche dell'ospite
- latenza virale (herpesvirus, retrovirus).
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Diagnostica delle malattie infettive virali
Le prove di laboratorio specifiche per una infezione virale possono essere divise in due gruppi:
- quelle che dimostrano la presenza dell’ agente infettante, dei suoi antigeni o sequenze
geniche (metodi diretti)
- quelle che dimostrano la presenza di anticorpi specifici (metodi indiretti)
Più di 200 virus appartenenti a 20 differenti famiglie causano infezioni di un certo significato nelle
principali specie domestiche. Se si considerano inoltre i tipi antigenici nell’ ambito di ciascun virus
e se il numero di specie recettive viene allargato per includere specie domestiche minori o specie
selvatiche il numero dei virus conosciuti supera il migliaio. Non deve quindi sorprendere che un
singolo laboratorio non disponga di reagenti necessari per la diagnosi di ogni virus. Per tale ragione
i laboratori diagnostici tendono a specializzarsi nella diagnosi delle infezioni virali che colpiscono
alcune specie animali o causate da agenti appartenenti ad alcune famiglie virali.
Negli ultimi anni, i maggiori progressi nella diagnostica delle infezioni virali sono stati ottenuti con
l’ impiego delle tecniche di ibridazione ed amplificazione genica che, evidenziando direttamente la
presenza di acido nucleico virale nel campione in esame, accorciano notevolmente il tempo
necessario per emettere il referto diagnostico. E’ probabile che nel giro di pochi anni sorgeranno
laboratori in grado di coprire con queste tecniche, una più ampia gamma di patologie
diagnosticabili.
L'importanza di una rapida e precisa identificazione di un patogeno può essere legata ad uno o più
dei seguenti motivi:
- malattie esotiche
- zoonosi
- certificazioni di indennità richieste nei confronti di specifiche infezioni in occasione di
fiere, mercati, mostre, competizioni
- inseminazione artificiale, embrio transfer, trasfusioni
- programmi di eradicazione
- sorveglianza epidemiologica
- menagement aziendali
La diagnosi virologica nel significato classico del termine implica l'isolamento del virus su colture
cellulari ( o altri substrati vivi come le uova embrionate o gli animali da esperimento ) e la sua
identificazione mediante metodi immunologici ( immunoflorescenza , sieroneutralizzazione , ecc.).
Tutto ciò comporta lunghe , impegnative e costose indagini .La formazione quindi di una diagnosi
presuntiva è una condizione indispensabile per valutare la necessità di un tale esame , soprattutto
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quando dall'esito dell'esame dipendono provvedimenti di polizia sanitaria di una certa urgenza ed
importanza .
Scelta dei campioni.
Il tipo di campione da prelevare dipende dal tropismo del virus e più in generale dei tessuti
visibilmente coinvolti nel processo patologico.
Nelle malattie virali generalizzate , è sempre presente una fase viremica . Quindi un prelievo di
sangue con e senza anticoagulante può risultare utile.
Cute e mucose
Il campione da prelevare è costituito da liquido delle vescicole , epitelio che le ricopre , biopsie per
raschiamento.
Malattie respiratorie
Tamponi nasali , secrezioni nasali , liquido di lavaggio tracheo- bronchiale ; sull'animale morto ,
biopsie tracheali , polmonari , linfonodali.
Apparato gastroenterico
Feci , tamponi rettali , linfonodi regionali , tratti di intestino.
Sintomi neurologici
Encefalo, midollo spinale , liquido cefalorachidiano.
Apparato riproduttore
Secreti , sperma , tamponi vaginali , in caso di aborto, feti ed invogli fetali.
Tempi di prelievo
Le possibilità di successo sono tanto maggiori quanto più precoce è il momento del prelievo
rispetto all'inizio dell'infezione. Dopo la morte dell'animale, diminuisce velocemente la carica
infettante virale mentre aumenta il numero di germi invasori.
Modalità di prelievo
Il prelievo va fatto in modo sterile , utilizzando terreni contenenti soluzioni saline bilanciate ,
sostanze tampone , antibiotici , antimicotici.
Per le analisi istopatologiche è necessario fissare in formalina tamponata piccoli pezzi di tessuto
sede di lesione .
Temperatura di trasporto.
Se possibile, inviare il campione entro poche ore; questo va raffreddato rapidamente e trasportato a
+4°C . Per periodi più lunghi , il campione va congelato e spedito in ghiaccio secco.(-20-70°).
Come regola generale si deve usare la più bassa temperatura ottenibile con i mezzi a disposizione. I
campioni per le indagini istologiche non vanno mai congelati.
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Prove di identificazione diretta
Tecniche istopatologiche
Hanno il vantaggio di utilizzare un semplice microscopio ottico, ma lo svantaggio di essere
applicabili solo per lesioni virali caratteristiche .
Es.:nella diagnosi di rabbia mettendo in evidenza corpi del negri nelle cellule dell'ippocampo;nelle
infezioni da virus vaiolosi mettendo in evidenza corpi inclusi del Guarnieri (mammiferi) e di
Bollinger (uccelli); nella malattia di Borna mettendo in evidenza inclusioni nucleari basofile;ecc..
Ricerca degli antigeni virali
A differenza della precedente è dotata oltre che di specificità anche di una buona sensibilità.
Infatti , anche in assenza di lesioni istologiche caratteristiche , è possibile mettere in evidenza
antigeni virali precoci o tardivi. Inoltre la presenza dell'antigene rimane più a lungo rispetto alla
sopravvivenza del virus stesso. L'ELISA cattura (sandwich) è ampiamente utilizzato laddove si
disponga di monoclonali per un determinato virus, così come l'immunofluorescenza diretta su
tessuto e l'immunoistochimica, che rappresenta la fusione di tecniche immunoenzimatiche con
tecniche istologiche.
Tecnica ELISA sandwich per il rilievo di antigeni in campioni biologici
Microscopia elettronica
Si può utilizzare la ME su omogenati di tessuti , liquidi organici , secrezioni ecc.
Il tipo di identificazione è morfologico cioè limitato alla famiglia virale . Inoltre è di utilizzo
routinario solo per quei virus dalla morfologia caratteristica (virus nudi, parapox ed altri) presenti in
gran quantità nei secreti o escreti ( diarrea da rotavirus ). Peraltro la ME risulta tutt’oggi un metodo
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di elezione per l’ identificazione morfologica di nuovi virus agenti di enteriti negli animali, alcuni
dei quali non sono coltivabili in vitro.
Una particolare tecnica di ME studiata per aumentare la sensibilità del metodo è
l'immunoelettromicroscopia in cui anticorpi specifici tendono ad aggregare come in agglutinato le
particelle virali.
Prove di isolamento
I virus sono bioparassiti obbligati pertanto si possono isolare in vitro solo su substrati viventi.
I primi substrati viventi utilizzati sono stati gli animali da esperimento , seguiti dalle uova
embrionate e, più recentemente , dalle colture cellulari.
Si rimanda al corso di Microbiologia per ulteriori dettagli.
E' sufficiente ricordare che una volta isolato il virus su colture cellulari , è necessaria la sua
identificazione mediante prove immunologiche ( sieroneutralizzazione , immunofluorescenza ,
ELISA ) o prove che mettano in evidenza particolari caratteristiche biologiche
(es.:emoagglutinazione ).
Prove indirette
Diagnostica sierologica
Un test diagnostico deve essere dotato di:
• sensibilità
• specificità
• praticità di utilizzo
• economicità
SENSIBILITA’_ :quando il test classifica correttamente tutti i soggetti realmente positivi la
sensibilità è del 100%.
SPECIFICITA’: quando il test classifica correttamente tutti i soggetti negativi (non infetti) la
specificità è del 100%.
Non esiste un test che abbia sensibilità e specificità del 100%.
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L’ impiego di tecniche sierologiche volte a rilevare e titolare anticorpi specifici risulta in alcuni
casi estremamente vantaggiosa se paragonata ai metodi diagnostici diretti. Il siero di sangue si
ottiene con metodi pratici e rapidi, senza particolari cautele. Le analisi sierologiche si effettuano in
breve tempo, risultano automatizzabili ed economiche.
Gli esami sierologici sono utili nel corso di infezioni acute non mortali (es.: malattie respiratorie), a
patto che vengano esaminati due prelievi a distanza di 2-4 settimane. Il primo prelievo (acuto o
sintomatico) viene effettuato durante la fase clinica. Il secondo (convalescente) viene effettuato
dopo la remissione dei sintomi. La sieroconversione positiva indica la presenza di anticorpi solo
nel siero convalescente o un aumento del titolo di almeno 4 volte fra i due campioni di siero. E’
un’ indagine retrospettiva che è utile per identificare i principali agenti eziologici coinvolti nelle
diverse sindromi. Gli esami sierologici, basati sul singolo prelievo sono utili per monitorare le
infezioni virali all’ interno di una popolazione animale, ma non consentono normalmente di
discriminare gli anticorpi da pregressa infezione rispetto a quelli di origine vaccinale. Nelle
infezioni croniche, latenti o persistenti, soggette a piani di risanamento, il singolo prelievo, se
positivo, è indice di infezione in atto e classifica come positivo l’ animale che viene eliminato
Ottenimento del siero e del plasma .
Siero : la provetta non contiene anticoagulante . Dopo 2 ore circa dal prelievo , si scolla il coagulo
dal tubo e si centrifuga per 1000g per 5' per separarne il siero dal coagulo e da eventuali globuli
rossi non coagulati.
Plasma : si utilizzano provette contenenti anticoagulante (EDTA, eparina ). La provetta viene
capovolta più volte , poi si centrifuga per separare il plasma dalla parte corpuscolata. Nell’
interfaccia fra plasma e globuli rossi si ritrovano le cellule della serie bianca che possono essere
raccolte per le prove dirette nei casi in cui il virus sia associato alla serie bianca (adsorbito sulla
superficie od all’ interno delle cellule). Il plasma può essere utilizzato per ricercare anticorpi.
Conservazione e trasporto del siero: 2h a 25°; 48h a 4°; tempi più lunghi a -20°.
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Le principali reazioni sierologiche :
-agglutinazione rapida su vetrino (test al lattice)
-immunodiffusione in gel di agar
- fissazione del complemento
-immunofluorescenza
-sieroneutralizzazione
-ELISA
tecnica ELISA indiretta per il rilievo di anticorpi specifici
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