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Dario Ghigo
Danno citotossico e genotossico indotto da nanoparticelle e microparticelle di
silice: basi molecolari e strategie di prevenzione e inattivazione
PRESUPPOSTI DELLA RICERCA
L'esposizione a silice cristallina avviene in molte attività industriali ed è causa di fibrosi e tumori
polmonari. Le silici amorfe (non cristalline) non sono generalmente associate a fibrosi polmonare, ma la loro
inalazione induce infiammazione polmonare reversibile ed enfisemi. Tale potenziale infiammatorio della
silice amorfa dovrebbe indurre cautela nell'escludere la sua tossicità in tessuti umani, soprattutto ora che
nanoparticelle a base di silice stanno destando crescente interesse come potenziali biosensori, carrier di geni
e vettori di farmaci.
Si ritiene che nella patogenicità delle silici giochino un ruolo cruciale le caratteristiche di superficie, la
composizione e le proprietà strutturali. Tuttora i siti attivi di superficie restano indefiniti e non ci sono dati
certi sulla relazione tra taglia delle particelle e bioreattività. Le silici catalizzano la formazione di ossidanti
derivati dall’ossigeno (ROS) alla loro superficie e/o ne inducono la produzione nei fagociti.
Lo stress ossidativo può provocare lipoperossidazione delle membrane cellulari, ossidazione delle
proteine e danni a carico del DNA, indurre la produzione di ossido nitrico (NO), chemochine, citochine e
fattori di crescita coinvolti nell'inizio e progressione di pneumopatie da silice. Il meccanismo con cui si
genera lo stress ossidativo deve ancora essere determinato con precisione. Gli studi sulle silici cristalline
sono resi più complessi dall'estrema variabilità del potenziale patogeno di polveri di diversa origine, le cui
cause sono tuttora ignote.
Con la presente ricerca ci si è proposti di chiarire la correlazione tra attività citotossica di particelle di
silice e loro dimensioni e cristallinità. A tal fine sono state usate silici sintetiche, amorfe e cristalline, in cui
queste proprietà fossero strettamente controllate e modificabili in maniera indipendente. Sono state
investigate l'azione ossidante, proinfiammatoria e citotossica delle seguenti polveri:
1) silice amorfa vetrosa (VS);
2) silice pirogena Aerosil OX 50 (A50);
3) silice precipitata (FK320);
4) quarzo puro (Qz).
L’effetto biologico di questi materiali è stato studiato su macrofagi alveolari murini MH-S.

TECNICHE UTILIZZATE NELLA RICERCA
Come indici di stress ossidativo sono stati misurati: produzione di derivati della lipoperossidazione
lipidica (TBARS); livello intracellulare di glutatione, principale molecola antiossidante intracellulare, sia
nella forma ridotta (GSH) che ossidata (GSSG); attività della via dei pentosi (PPP); attività della G6PD e
della 6PGD (due enzimi del PPP). Come indice di attivazione pro-infiammatoria è stata misurata la sintesi di
NO. L’azione citotossica delle polveri è stata determinata in base al rilascio di lattato deidrogenasi (LDH)
nell’ambiente extracellulare.
RISULTATI DELLA RICERCA E LORO SIGNIFICATO
Tutti i campioni di silice hanno mostrato effetti citotossici, evidenziati dal rilascio di LDH nel mezzo
extracellulare. L'effetto, osservato dopo 24 ore di incubazione, è risultato dose-dipendente, con valore
massimale a 100 µg/cm2. Però la minima concentrazione necessaria per indurre una significativa
citotossicità differiva tra i campioni. La FK320 ha indotto un significativo rilascio di LDH a partire da 40
µg/cm2, mentre il Qz, la VS e l'A50 sono risultati citotossici a partire già a 10 µg/cm2. La FK320 è risultata
significativamente meno citotossica delle altre polveri testate.
Dopo 24 ore di incubazione con 80 µg/cm2 di VS, A50 o Qz si è osservato un accumulo di TBARS; al
contrario, l'incubazione con la stessa dose di FK320 non ha prodotto effetti significativi. A 20 µg/cm2 nessun
campione di silice ha modificato significativamente i livelli di TBARS rispetto alle cellule di controllo. Dopo
24 ore di incubazione con 20 µg/cm2 di polveri di silice, solo l'A50 ha indotto una diminuzione del PPP.
Questo effetto era evidente sul PPP attivato dall'agente ossidante menadione. A 80 µg/cm2 tutte le silici
hanno prodotto una significativa riduzione del PPP. L'inibizione era evidente sia sul PPP basale che sul PPP
attivato da menadione.
L'A50, ma non le altre silici, a 20 µg/cm2 ha significativamente diminuito anche l'attività della G6PD, il
principale enzima regolatore del PPP. L'attività G6PD è stata inibita da tutti i campioni di silice a 80 µg/cm2,
in concordanza con quanto osservato sull'attività PPP. D'altra parte l'attività della 6PGD, che catalizza una
tappa successiva del PPP, non è stata significativamente inibita da alcuna silice. Una ridotta attività
PPP/G6PD potrebbe compromettere la capacità di mantenere livelli intracellulari adeguati di GSH, necessari
a proteggere la cellula dallo stress ossidativo.
In accordo con questa ipotesi, dopo 24 ore di incubazione con 20 µg/cm2, solo l'A50 ha
significativamente diminuito i livelli intracellulari di GSH, ed in parallelo aumentato i livelli di GSSG. A 80
µg/cm2 tutte le silici hanno indotto un calo significativo di GSH, associato ad un aumento di GSSG. Dopo
24 ore di incubazione, solo l'A50 ha indotto accumulo extracellulare di nitrito. A 80 µg/cm2 A50, VS e Qz
hanno significativamente indotto la sintesi di nitrito. Invece la FK320 non ha prodotto variazioni di rilievo
dei livelli di nitrito extracellulare alle dosi testate.

In base a questi dati si può concludere che i campioni di silice amorfa testati esercitano effetti citotossici,
provocano perossidazione lipidica e sintesi di NO. La silice vetrosa e la silice pirogena Aerosil OX 50 sono
in grado di indurre un'azione tossica maggiore del Qz, mentre la silice precipitata FK320 è la meno attiva.
Inoltre, tutte le silici sono in grado di inibire PPP e G6PD ed abbassare il rapporto GSH/GSSG, rendendo le
cellule più suscettibili al danno indotto da altri stress ossidativi. Anche in questo caso merita rilevare che
l'inibizione causata dalla silice amorfa è maggiore di quella esercitata dalla silice cristallina, e che la silice
pirogena Aerosil OX 50 risulta la più attiva.
Questi dati sono in assoluto i primi che dimostrano una inibizione del PPP da parte della silice, sia
cristalina che amorfa, suggerendo un nuovo meccanismo patogenetico per l'azione tossica della silice, e
forniscono per la prima volta una valutazione della differenza di citotossicità tra campioni differenti di silice
a basse dosi.
PRODOTTI DELLA RICERCA
La prima parte della ricerca è stata oggetto del seguente lavoro:
- Manuela Polimeni, Elena Gazzano, Mara Ghiazza, Ivana Fenoglio, Amalia Bosia, Bice Fubini, Dario
Ghigo. Quartz inhibits glucose 6-phosphate dehydrogenase in murine alveolar macrophages, inviato
alla rivista Chemical Research in Toxicology ed in corso di revisione dopo le osservazioni dei
reviewers della rivista.