CRD nell'allergia al veleno di imenotteri: marcatori primari di ... - SIAIP

Component Resolved Diagnosis (CRD): l’utilizzo dei componenti molecolari nella diagnostica allergologica in vitro
CRD nell’allergia al veleno di imenotteri: marcatori primari di
sensibilizzazione ape/vespa (Rassegna)
Valerio Pravettoni, Laura Primavesi
Unità Operativa Complessa di Allergologia e Immunologia Clinica, Fondazione IRCCS Ca’ Granda Ospedale
Maggiore Policlinico, Milano
PRINCIPALI INSETTI PUNGITORI
Gli insetti aculeati principalmente coinvolti in reazioni
allergiche appartengono al numerosissimo ordine degli
Imenotteri (dal greco ymèn, membrana, e pteròn, ala) al
cui interno sono presenti diverse superfamiglie e famiglie.
Tra esse le famiglie degli Apidi e dei Vespidi sono le più
importanti in Europa 1,2 (Fig. 1).
Tra gli Apidi la specie più studiata è sicuramente quella
delle api (Apis mellifera), che vivono in colonie socialmente
organizzate e rappresentano insieme ai bombi i
principali insetti impollinatori. Morfologicamente l’ape e il
bombo sono simili: entrambi pelosi con striature tendenti
al marrone. I bombi però sono generalmente più grossi e
pelosi, con bande di colore più larghe di cui una distintiva
di colore più chiaro sull’addome. Caratteristica peculiare
dell’ape è quella di avere un pungiglione seghettato che si
infigge nella carne della vittima portando alla morte per
eviscerazione l’ape che, allontanandosi, lascia pungiglione
e vescicola velenifera. Tale sacrificio porta però anche
alla liberazione di un ferormone di allarme che richiama
altre api. Il bombo, al contrario, presenta un pungiglione
liscio come quello dei Vespidi, pertanto la puntura non
porta l’insetto a morte.
All’interno della superfamiglia dei Vespidi si distinguono
principalmente la famiglia dei Vespini e quella dei
Polistini, che morfologicamente si differenziano per
l’aspetto del torace e dell’addome e per la diversa giunzione
tra le due parti.
Tali distinzioni sono utili per l’identificazione dell’insetto
pungitore, anche se la pratica ambulatoriale insegna che
molto spesso la vittima di un attacco, specie se con conse-
Figura 1
Schema tassonomico semplificato degli Imenotteri di maggiore rilevanza allergologica.
guenze serie, difficilmente ricorda l’aspetto dell’insetto. La
diagnosi più spesso si avvale di altre informazioni, che
distinguono i diversi insetti, e che il paziente può ricordare
più facilmente (distacco del pungiglione, luogo e ora dell’attacco,
numero delle punture, posizione del nido, etc.).
ALLERGENI PRESENTI NEL VELENO DI
IMENOTTERI
I componenti del veleno degli Imenotteri in grado di
indurre una reazione allergica sono generalmente glicoproteine
aventi peso molecolare compreso tra 10 e 50
kDa 3. Molti di questi allergeni sono noti e sequenziati da
tempo, alcuni sono già presenti in forma ricombinante. La
Tabella 1 mostra i principali allergeni per alcuni dei più
comuni Imenotteri. È possibile notare come proteine omologhe
siano presenti in veleni di specie diverse.
Gli allergeni principali del veleno di ape sono la fosfolipasi
A 2 (Api m 1), isolata ed identificata anche nel bombo
(Bom p 1, Bom t 1), la ialuronidasi e la fosfatasi acida. La
fosfolipasi A 2 possiede una struttura pressoché identica tra
api di diverse specie, mentre tra i bombi esiste una variabilità
maggiore. Gli omologhi dei due insetti presentano
un’identità di sequenza del 53%, sono pertanto possibili e
frequenti casi di sensibilizzazione ad entrambe 4,5.
Gli allergeni maggiori dei Vespidi sono: la fosfolipasi
A 1; la ialuronidasi, che presenta circa il 50% d’identità di
sequenza con il suo omologo degli Apidi 1; l’antigene 5, che
è presente nel veleno di tutti i Vespidi. Generalmente i
fenomeni di cross-reattività tra Vespa, Vespula e
Dolichovespula sono molto frequenti, mentre è minore la
cross-reattività tra Polistini e Vespini. Tra i Polistini la
34 LigandAssay 15 (1) 2010

Component Resolved Diagnosis (CRD): l’utilizzo dei componenti molecolari nella diagnostica allergologica in vitro
Tabella 1
Allergeni presenti nel veleno di alcuni Imenotteri, secondo la classificazione IUIS (International Union of Immunological Societies - Allergen
Nomenclature Sub-Committee, www.allergen.org).
Insetto pungitore Allergene Nome Biochimico Peso molecolare (kDa) in SDS-PAGE
Apis mellifera
Polistes spp.
Vespula spp.
Vespa crabro
cross-reattività è frequente per le diverse specie europee,
mentre è minore tra queste ultime e le specie americane 2.
DIAGNOSI
La prima parte della diagnosi prevede la raccolta dell’anamnesi,
al duplice scopo di cercare di identificare l’insetto
responsabile e di valutare la gravità dei sintomi. Il
medico dovrà cercare di inquadrare il più possibile la reazione
allergica, ad esempio indagando l’orario, le condizioni
climatiche, il numero di punture, il tempo d’insorgenza
dei sintomi, l’eventuale trattamento farmacologico adottato,
la presenza di altre allergopatie, l’anamnesi di precedenti
punture, ecc.
La sintomatologia più frequentemente riportata è la
reazione locale estesa, mentre le reazioni sistemiche coinvolgono
fino al 5% della popolazione europea e del nord
America 6. Le prime sono definite come gonfiore loco regionale
maggiore di 10 cm di diametro che insorge poco dopo
Api m 1 Fosfolipasi A 2 16
Api m 2 Ialuronidasi 39
Api m 3 Fosfatasi acida 43
Api m 4 Mellitina 3
Api m 5 Dipeptil-peptidasi IV 100
Api m 6 "-" 8
Api m 7 CUB serin proteasi 39
Api m 8 Carbossilesterasi 70
Api m 9 Serin-carbossipeptidasi 60
Api m 10 Icarapina variante 2 50-55
Pol a 1 Pol d 1 Fosfolipasi A 1 34
Pol a 1 Ialuronidasi 38
Pol d 4 Serin proteasi 33
Pol a 5 Pol d 5 Antigene 5 23
Ves v 1 Fosfolipasi A 1 34
Ves v 2 Ialuronidasi 38
Ves v 3 Dipeptil-peptidasi IV 100
Ves v 5 Ves g 5 Antigene 5 23
Vesp c 1 Fosfolipasi A1 34
Vesp c5 Antigene 5 23
Tabella 2
Classificazione delle reazioni sistemiche a veleno di Imenotteri secondo Mueller. (Da Rif. 4)
Grado Sintomi
I orticaria generalizzata, malessere, ansia
la puntura. Le reazioni sistemiche prevedono il coinvolgimento
dei diversi organi bersaglio dell’anafilassi, quali la
cute e le mucose, il sistema gastrointestinale, respiratorio,
cardiovascolare. Nel corso degli anni sono state proposte
diverse classificazioni, in funzione della gravità dei sintomi;
la più utilizzata resta comunque quella di Mueller 7 (Tab.
2).
Parallelamente all’indagine anamnestica sono di notevole
utilità anche alcuni test diagnostici, in particolare test
cutanei e test in vitro, che devono essere eseguiti ad almeno
due - tre settimane di distanza dalla puntura, per evitare
esiti falsamente negativi (periodo refrattario). Tali test
generalmente possono essere dirimenti quando l’insetto
pungitore non è ben identificato dal paziente ed essere
dunque decisivi nella scelta del veleno con cui condurre
un’eventuale immunoterapia specifica. I test cutanei d’elezione
sono quelli intradermici, molto più sensibili dei prick
test anche a basse concentrazioni.
II i sintomi precedenti più angioedema, nausea, vomito, diarrea, addominalgia, vertigine, costrizione toracica
III i sintomi precedenti più dispnea, stridore raucedine e sibilo da edema laringeo, disartria, astenia, confusione mentale,
sensazione di “morte imminente”
IV i sintomi precedenti più ipotensione o shock con perdita di coscienza, incontinenza sfinterica, cianosi
LigandAssay 15 (1) 2010 35

Component Resolved Diagnosis (CRD): l’utilizzo dei componenti molecolari nella diagnostica allergologica in vitro
FENOMENI DI CROSS-REATTIVITA’ E
SENSIBILIZZAZIONE MULTIPLA
Una percentuale molto elevata, fino al 50%, di pazienti
con allergia ad Imenotteri presenta test positivi sia per
ape sia per vespa 6,8. Tale fenomeno può essere indicativo
di una doppia sensibilizzazione, che tuttavia appare realistica
solo in pochi casi. Altre possibili spiegazioni possono
essere una cross-reattività dovuta ad omologie di sequenza
tra allergeni di veleni diversi, ma, soprattutto, la presenza
di catene laterali oligosaccaridiche legate a residui di
asparagina definite Cross-reactive Carbohydrate
Determinants (CCD). I CCD sono ubiquitari, si ritrovano
nei pollini, negli alimenti ed anche nel veleno di imenotteri
e sono in grado di legare le IgE mediante almeno due siti
di legame. Circa il 5% di soggetti non allergici possiede
IgE anti-CCD, mentre tale percentuale sale al 10-15% in
soggetti allergici al polline di graminacee e fino al 60% in
pazienti con multiple pollinosi. Circa un paziente su quattro
con allergia al veleno di ape e circa uno su dieci con
allergia al veleno di vespula presenta valori positivi di IgE
anti-CCD 6. Inoltre alcuni allergeni contenuti nel veleno
degli Imenotteri, quali la ialuronidasi e la fosfolipasi A 2,
sono glicosilati. In particolare gli N-glicani della ialuronidasi
sono stati caratterizzati mediante cromatografia
HPLC/spettrometria di massa, evidenziando al loro interno
un core α-1,3 fucosio, che rappresenta la struttura chiave
responsabile dell’allergenicità 9. Può dunque essere utile
dosare le IgE specifiche verso allergeni contenti CCD,
come ad esempio l’estratto intero di polline di codolina
(Phleum pratense), di lattice, oppure l’epitopo glicosilato
MUXF3 della bromelina. Tuttavia una positività ai CCD
non può di per sé escludere una doppia sensibilizzazione,
in quanto alcuni pazienti possono possedere sia IgE contro
tali molecole sia verso gli epitopi proteici allergenici
specifici di un dato veleno 6. Allo stesso modo test negativi
per i CCD non confermano la doppia sensibilizzazione, in
quanto pazienti con bassi valori di IgE anti-CCD presenta-
Tabella 3
Allergeni ricombinanti di Imenotteri. (Da Rif. 11 e 12)
no un dosaggio delle IgE negativo per la bromelina 9.
Per individuare quale veleno abbia rilevanza clinica e
pertanto sia quello da utilizzare per l’immunoterapia specifica,
la metodica di maggiore utilizzo è la RAST inibizione,
cioè il dosaggio delle IgE specifiche per un dato veleno
dopo preincubazione del siero con concentrazioni scalari
dei diversi veleni che hanno dato una positività in vitro, con
conseguente inibizione del legame antigene-anticorpo 10.
Si ottengono così delle curve di inibizione che sono funzione
della concentrazione del veleno inibente. Generalmente,
valori di inibizione superiori al 70% vengono considerati
indicativi di una cross-reattività marcata, mentre valori
inferiori al 25% escludono fenomeni di cross-reattività 6.
Questo test comunque non può risolvere tutti i dubbi ed
inoltre scarsamente si adatta alla routine ambulatoriale in
quanto è costoso, laborioso e necessita di personale qualificato
per la metodica e la refertazione.
COMPONENT RESOLVED DIAGNOSIS
Attualmente, i metodi “classici” di diagnosi allergologica
utilizzano estratti naturali interi di veleno purificato, contenenti
una miscela standardizzata a 100 μg/mL di componenti
allergeniche. L’impiego di singoli allergeni ricombinanti,
seppure con una sensibilità a volte inferiore, consente
una specificità più elevata. Molti studi hanno infatti
rilevato come tali molecole abbiano una maggiore capacità
di evidenziare sensibilità specifiche rispetto agli allergeni
naturali purificati, che in ogni caso contengono impurità
più o meno consistenti di altri allergeni 11.
La Component-Resolved Diagnosis (CRD) valuta la
positività anticorpale a singoli marcatori molecolari, consentendo
una diagnosi altamente specifica e la definizione
per ciascun paziente di un profilo di reattività individuale,
distinguendo le molecole del singolo veleno realmente
coinvolte nella reazione allergica da quelle cross-reattive.
Al momento vari sono gli allergeni ottenuti in forma
ricombinante (Tab. 3), espressi in differenti organismi (E.
Specie Allergene Vettore di espressione
Apis mellifera
Vespula vulgaris
D. maculata
Api m 1 ** E. coli
Api m 2 E. coli / cellule infettate da Baculovirus
Api m 3 cellule infettate da Baculovirus
Ves v 1 * E. coli
Ves v 2 E. coli
Ves v 5 * E. coli /lievito
Dol m 1 E. coli
Dol m 2 E. coli
Dol m 5 E. coli
Polistes annularis Pol a 5 E. coli / cellule infettate da Baculovirus
P. dominulus Pol d 5 * procariota
Solenopsis invicta Sol i 2 eucariota
**disponibile in commercio anche la molecola naturale glicosilata
* disponibile in commercio per diagnostica
Sol i 3 eucariota
36 LigandAssay 15 (1) 2010

Component Resolved Diagnosis (CRD): l’utilizzo dei componenti molecolari nella diagnostica allergologica in vitro
coli, cellule infettate da Baculovirus, etc.) 11,12. Studi comparativi
sull’attività allergenica delle singole molecole naturali
e ricombinanti hanno evidenziato come in alcuni casi il
vettore di espressione abbia un ruolo decisivo. Ad esempio
la fosfolipasi di ape (PLA 2) espressa in E. coli è deglicosilata;
un recente studio ha dimostrato come le cutireazioni
eseguite con nPLA 2, rPLA 2 e nPLA 2 deglicosilata
diano risultati assolutamente comparabili. In questo caso
la glicosilazione, modifica post-trasduzionale della proteina
non supportata da E. coli, ha poca importanza nel legame
con le IgE. Al contrario, per la ialuronidasi di ape (HYA)
è stata necessaria l’espressione in un altro vettore (cellule
infettate da Baculovirus), affinchè avvenissero le corrette
modifiche post-trasduzionali in quanto la molecola rHYA
espressa in E. coli, non glicosilata, possedeva un’attività
allergenica molto inferiore (30%) rispetto al corrispettivo
naturale purificato 13.
La possibilità di avere singole componenti allergeniche
pertanto comporta notevoli vantaggi, tra cui quello di attuare
un’accurata scelta del veleno da utilizzare per l’immunoterapia
specifica nei casi dubbi con doppia sensibilizzazione
ape/vespa. Più che indagare molteplici allergeni è utile
testare molecole che rappresentino dei marcatori di sensibilizzazione
per uno specifico veleno. Tali molecole dovranno
dunque rispondere ad alcuni requisiti, soprattutto essere
allergeni maggiori e specie-specifici, dunque strutturalmente
poco simili ad altri allergeni di veleni diversi.
Per quanto riguarda i marcatori primari di sensibilizzazione
ape/vespa, la HYA è stata a lungo considerata un
allergene maggiore dell’ape e della vespa, responsabile di
molte doppie positività, in quanto tra i due allergeni omologhi
esiste il 50% di identità di sequenza.
Uno studio recentissimo 9 ha tuttavia evidenziato come
il legame tra HYA e IgE specifiche sia in realtà dovuto ai
CCD, indagando la reale positività a tale allergene in soggetti
allergici unicamente al veleno di Vespula (Yellow yacket,
YJ) oppure aventi una doppia positività in vitro per ape
e Vespula. Tra i soggetti monosensibilizzati alla Vespula (n
= 31) solo un paziente ha legato YJ-HYA, a differenza dei
pazienti con doppia positività (n = 105), nei quali il legame
Figura 2
Component-Resolved Diagnosis: approccio diagnostico per l’identificazione dell’insetto responsabile.
con YJ-HYA si è verificato nell’87% dei casi. Le inibizioni
condotte nello studio (n = 83) hanno inoltre evidenziato
che il 65% dei pazienti reagiva a YJ-HYA a seguito di legami
con i CCD, il 27% marcava sia i CCD sia gli epitopi peptici
di YJ-HYA e solamente l’8% reagiva unicamente al
peptide YJ-HYA. Tale studio, fortemente innovativo, ha
dunque rimodellato la funzione di YJ-HYA nell’allergia alla
Vespula, stabilendo come tale allergene possa essere
considerato un allergene minore, in quanto riconosciuto
solo dal 10-15% dei soggetti allergici. Al contrario l’antigene
5 (Ves v 5) e la fosfolipasi A1 (Ves v 1) sono stati riconosciuti
da circa il 90% dei pazienti di entrambi i gruppi, ed
insieme hanno identificato il 97% dei pazienti realmente
sensibili a YJ. Jin e coll. concludono affermando che la
CRD svolta con l’antigene 5 (Ves v 5) e la fosfolipasi A1
(Ves v 1) è virtualmente in grado di identificare i pazienti
allergici al veleno di Vespula.
Un altro recente studio 14 ha ribadito l’importanza dell’allergene
Ves v 5, come marcatore specie-specifico nell’allergia
al veleno di vespula. Tale allergene è stato infatti
riconosciuto dall’87% dei pazienti allergici al veleno di
vespula e solo dal 17% dei soggetti allergici all’ape. Gli
Autori hanno anche indagato la positività a rApi m 1 non
glicosilata, evidenziando come tale allergene sia riconosciuto
dal 97% dei soggetti allergici all’ape e solo dal 17%
dei soggetti allergici alla vespula. Pertanto, rApi m 1 può
essere considerato marcatore primario di allergia al veleno
di ape. La possibilità di poter indagare la positività alla
fosfolipasi A 2 non glicosilata ha consentito di ovviare al
problema della positività in vitro dovuta ai CCD.
Attualmente in commercio è disponibile anche la fosfolipasi
A 2 naturale glicosilata (nApi m 1); la determinazione del
titolo di IgE specifiche verso entrambe le forme di tale
allergene è di sicuro aiuto nella valutazione di un legame
anticorpale verso la componente peptidica rispetto alla
componente glicosilata (CCD). Il gruppo di Müller ha inoltre
evidenziato che una doppia positività ape/vespula in
vitro accade più frequentemente nei soggetti allergici
all’ape rispetto ai soggetti sensibilizzati alla vespula; probabilmente
a causa della maggior glicosilazione degli
LigandAssay 15 (1) 2010 37

Component Resolved Diagnosis (CRD): l’utilizzo dei componenti molecolari nella diagnostica allergologica in vitro
allergeni maggiori dell’ape (fosfolipasi A 2, ialuronidasi,
fosfatasi acida).
Nonostante lo studio partisse da due popolazioni (n =
100) selezionate di soggetti allergici all’ape o alla vespula,
numerose doppie positività sono state comunque riscontrate,
di cui il 56% dovute ai CCD. Gli Autori concludono
che una doppia positività in vitro per Api m1 e Ves v5 indica
una reale doppia sensibilizzazione clinica e, pertanto, la
necessità di una immunoterapia specifica con entrambi i
veleni.
Per distinguere una sensibilizzazione a polistini piuttosto
che a vespule, è necessario ricordare come gli allergeni
maggiori di questi due veleni sono, seppur omologhi,
notevolmente distanti a livello filogenetico 15. Sembra possibile
dunque stabilire la reale sensibilizzazione dosando
le IgE specifiche verso l’antigene 5 dei due veleni: Ves v 5
e Pol d 5.
In conclusione, la CRD applicata alla diagnostica allergologica
per veleno di Imenotteri sembra virtualmente in
grado di risolvere in modo rapido ed efficace tutti quei casi
di multipla sensibilizzazione (Fig. 2):
• l’allergene non glicosilato rApi m 1, riconosciuto dal
97% dei soggetti allergici all’ape e dal 17% degli allergici
alla Vespula, è il marcatore specie-specifico ideale
per l’allergia al veleno di ape;
• gli allergeni Ves v 1 e Ves v 5, identificati dal 97% dei
soggetti allergici alla Vespula, sono i marcatori primari
dell’allergia alla vespula;
• la determinazione delle IgE specifiche per allergeni
contenti N-glicani, quali la bromelina, MUXF3 (epitopo
glicosilato della bromelina) oppure nApi m 1, identifica
la presenza di anticorpi per i CCD, responsabili di circa
il 50% delle doppie positività in vitro per ape e Vespula.
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Per corrispondenza:
Dott. Valerio Pravettoni
UOC di Allergologia e Immunologia Clinica
Fondazione IRCCS Ca’ Granda
Ospedale Maggiore Policlinico
Via Pace 9 - 20122 Milano
Tel.: 0255036259 - Fax: 0255033122
e-mail: v.pravettoni@policlinico.mi.it
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