12 - Proteine fosfatasi pp 158-218.pdf - Corso di Laurea in Biologia

Proteine fosfatasi
Ora che abbiamo completato la rassegna delle proteine cinasi, vediamo in dettaglio gli enzimi che
determinano la rimozione del fosfato da proteine. L’attività di tali enzimi è indispensabile per
assicurare fenomeni ciclici di attivazione – disattivazione di proteine bersaglio. Si pensi alla
glicogeno fosforilasi, che da b viene portata nella forma a (attiva) mediante fosforilazione della
Ser14 della glicogeno fosforilasi. L’attività fosfatasica garantisce il ritorno della a nella forma b e,
pertanto, è instaurato un ciclo.
Anche la p34 cdc-2 va incontro a tali meccanismi fosfo-defosfo (defosfo Tyr-15 ≡ cdc-2 attiva; forma
fosfo Tyr-15 ≡ cdc-2 inattiva).
Le proteine fosfatasi rappresentano una famiglia molto numerosa di proteine. (Nel 2000 si sa che
nel genoma umano: circa 2000 proteine cinasi e poche proteine fosfatasi). (Nel lievito 124 cinasi e
37 fosfatasi subunità catalitica). Per razionalizzare lo studio è stato stabilito un criterio di
classificazione. È stato scelto un substrato ben conosciuto: la glicogeno fosforilasi cinasi (GPK).
In particolare:
Proteine fosfatasi tipo 1 (PP1) sono quelle fosfatasi che determinano la rimozione idrolitica del P
dalla subunità β della GPK (vedi pag.123). PP1 agiscono su β.
Proteine fosfatasi tipo 2 (PP2) sono gli enzimi fosfatasi che determinano la rimozione idrolitica
del P dalla subunità α della GPK. PP2 agiscono su α.
Questo criterio era già stato introdotto quando si è parlato del ciclo della GPK (vedi pag.123).
Sono stati inoltre identificati peptidi che sono inibitori solo delle PP1. Sono protein phosphatase
inibitor 1 e protein phosphatase inibitor 2 – PPI1 e PPI2 – con PM 19000 e 23000.
Proteine fosfatasi 1 (PP1)
La PP1 è direttamente implicata nell’interconversione della glicogeno fosforilasi e della glicogeno
sintetasi. L’attività della PP1 è direttamente collegata alla presenza o meno di inibitori proteici che
possono, a loro volta, essere fosforilati o defosforilati. In particolare, solo PPI1 può essere
fosforilato in una treonina dalla PKA (vedi pag.122; sequenza estremamente basica):
Gln-Ile-Arg-Arg-Arg-Arg-Pro-Thr-Pro-Ala-Thr
Residui basici fosforilazione
PPI1, nella forma fosforilata, è attivo come inibitore. Per comprendere il significato fisiologico
occorre fare il punto della situazione:
L’inibitore fosforilato si lega alla proteina fosfatasi 1 e la inattiva, per cui tale fosfatasi non può
rimuovere il fosfato dalla Ser14 della glicogeno fosforilasi.
L’AMP ciclico blocca pertanto il meccanismo di disattivazione della glicogeno fosforilasi. Quindi
mentre AMPc attiva la glicogeno fosforilasi cinasi e la conseguente attivazione della fosforilasi,
contemporaneamente blocca (con questo meccanismo mediato dall’inibitore PPI1 fosforilato)
l’inattivazione dello stesso enzima, evitando un assurdo ciclo futile (quello della continua
attivazione e disattivazione della glicogeno fosforilasi).
E’ noto che l’insulina promuove (indirettamente) la defosforilazione del PPI 1 (≡ inattivazione della
glicogeno fosforilasi ≡ stop alla scissione del glicogeno ≡ proteina fosfatasi 1 attiva ≡ glicogeno
sintetasi attiva). Viene quindi bloccata dall’insulina una reazione catabolica, e viene promossa
un’azione anabolica.
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Per quanto concerne la PP1 (quindi la proteina fosfatasi e non l’inibitore), occorre ricordare che
esiste anche una proteina accessoria G (perché legata al glicogeno), di PM 135000 descritta
recentemente da Philip Cohen. Questa è di fatto un attivatore della proteina fosfatasi 1. Infatti
l’insulina (con un meccanismo non ancora del tutto decifrato) porta alla fosforilazione della
subunità G (non chiamiamola proteina G per evitare confusione con le ben note proteine G,
traduttrici del segnale), che rende la PP1 più attiva ( = defosforilazione della GS con conseguente
attivazione, etc.). Inoltre la subunità G tiene la PP1 legata normalmente ai granuli di glicogeno,
impedendo che questa PP1 possa agire senza controllo (questo è stato dimostrato nel muscolo
scheletrico). Ne consegue che la fosforilazione della G porta al distacco della PP1 dal glicogeno:
perché la PP1 è unita alla G, si stacca la G e porta con sé la PP1.
Adrenalina ≡ stimolo catabolico (degradazione del glicogeno) ≡ PKA attiva ≡ fosforilazione della
β della GFK e quindi attivazione GP ≡ fosforilazione dell’inibitore PPI 1b e conseguente inibizione
della proteina fosfatasi PP1
Proteine fosfatasi 2 (PP2)
Le proteine fosfatasi 2 sono caratterizzate dall’essere attive sulla subunità α della glicogeno
fosforilasi cinasi. Ne sono state descritte tre (PP2A, PP2B, PP2C). Nessuna delle tre forme è
inibita da inibitori proteici (abbiamo visto che PPI 1 e PPI 2 sono attivi solo su PP1). Sono noti però
inibitori proteici, come l’acido okadaico.
Tabuliamo alcune proprietà:
PP2A (o INH) PP2B PP2C
Substrato: subunità
α o β della GPK
α α α
Inibizione da PPI 1 o
PPI2
no* no no
Dipendenza assoluta
da cationi bivalenti
no Ca ++ Mg ++
Stimolazione da CaM no sì no
*(ma è inibita da acido okadaico; vedi pag.132 la INH che è una PP2A)
Proteina fosfatasi 2A:
Si lega all’antigene T piccolo del polyoma e dell’SV-40. Tale T
piccolo inibisce la defosforilazione di MEK ad opera di PP2A.
E’ una famiglia numerosa. In genere è formata da 3 subunità.
E’ anch’essa implicata nel ciclo del glicogeno, anche se l’attività della PP1 è in larga maggioranza
nel muscolo. Nel fegato è maggiore l’attività della PP2A.
È implicata (nel muscolo) nella defosforilazione delle catene leggere della miosina (anche una PP1
lo è, quella di tipo C, cioè la PP1C).
L’acido okadaico è un importante inibitore della proteina fosfatasi 2A ! E’ ben documentato a
pag.132, dove l’acido okadaico è citato come inibitore della INH (una PP2A).
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Proteine Fosfatasi 2 A [da Curr. Op. in Cell Biol. 12 (2) 180 (2000)]
Le forme attive delle PP2A sono eterotrimeriche, formate da una subunità catalitica (C), e due
subunità regolatorie, una subunità A, che interagisce sia con C che con B, ed una subunità B, che
è codificata da almeno 13 geni.
La subunità A è più grande di B e C, e interagisce con la zona N terminale con B, mentre con la Cterminale
interagisce con la subunità C.
La subunità A è costituita da 15 ripetizioni (repeat) di 39 aminoacidi. Tale repaeat è denominato
dominio HEAT ( da Huntingtin Elongation factor PP2A and Tor kinase).
Questo dominio è importante. E’ stato trovato recentemente nell’importina β.
In molti tumori della pelle si trova una subunità A mutata.
Sia l’antigene T piccolo che il T medio possono sostituire la subunità B.
Nella prostata si ha un’elevata espressione del gene per la proteina pp32, che codifica per la
proteina inibitrice (di PP2A): I1/PHAP-1. Nelle forme tumorali della prostata la normale pp32 non è
più espressa, per essere sostituita da pp32r1 e pp32r2.
Proteina fosfatasi 2B:
Presenta un particolare interesse perché è stimolata da Ca ++ . Quando è estratta da tessuti nervosi
è un eterodimero, formato da una subunità A (61000, subunità catalitica) e da una subunità B
(19000, subunità regolatoria).
Da tempo era nota una proteina fosfatasi Ca-dipendente denominata Calcineurina, che è molto
abbondante nell’encefalo (anche 1% delle proteine totali). Quando furono meglio definiti i criteri di
classificazione delle proteine fosfatasi, si scoprì che la calcineurina è la PP2B.
La subunità B presenta omologia di sequenza con la calmodulina (possiede anch’essa 4 EF-hand,
vedi pag.45). tra l’altro ha l’N-terminale miristoilato, per consentire l’inserimento in membrana.
L’omologia riguarda solo le “chele” che legano il calcio. La restante parte della molecola è molto
diversa. Nel complesso l’identità riguarda solo il 30% della sequenza.
La subunità B della PP2B ha un ruolo singolare. Possiamo, in prima approssimazione, dire che è
un inibitore dell’attività fosfatasica. Se la subunità B è sostituita dalla CaM, si ha un forte aumento
dell’attività proteina fosfatasica Ca-dipendente. Stranamente la PP2B è stimolata anche dal solo
Ca ++ (A0.5 ≅ 1 µM). Con CaM saturante A0.5 non varia, ma Vmax aumenta di ben 10 volte.
Questo fenomeno viene interpretato nel seguente modo: la subunità B stimola la subunità catalitica
A via Ca ++ . Con CaM si forma un complesso ternario, con extra stimolazione da Ca ++ . La subunità
B sembra coinvolta nel riconoscimento della proteina substrato che deve subire la defosforilazione.
Possiamo qui citare questo fenomeno comune ad altre proteine fosfatasi: esistono, per le proteine
fosfatasi, delle zone che riconoscono il substrato e che, pertanto, “convogliano” la proteina
fosfatasi su tale substrato. Tali domini sono denominati “ZIP – Code”. Vedremo che una PTB
(Proteina Tirosina Fosfatasi), la PTB1 D o Syp, contiene 2 SH2 che la “spediscono” sulla tirosina
fosforilata. Infatti, fin tanto che la tirosina è defosforilati, i domini SH2 non la riconoscono. Quando
invece la Tyr è fosforilata, essa “arruola” proteine tramite gli essenziali SH2 (vedi Syp a pag.117,
che si lega al recettore per PDGF).(vedi inserto zip – code a pag.167).
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Ruolo della calcineurina (CN) nell’attivazione delle cellule T:
L’aumento di Ca ++ determina il legame
di Ca/CaM (calcio/calmodulina) alla CN
(calcineurina), che si attiva e
defosforila NF-AT (Nuclear Factor –
Activation T cells), che può trasferirsi al
nucleo (nella forma defosforilati) dove,
insieme ad altri fattori di trascrizione
(per es. Jun e Fos), si lega a siti
promotori sul DNA (per esempio al sito
AP-1), con trascrizione del gene per IL-
2 (Interleuchina 2; vedi pagg.267 e
270), uno dei primi geni studiati
nell’attivazione delle cellule T.
Ciclosporine ed attività immunosoppressiva:
Le ciclosporine (vedi pag.7) sono importanti
agenti immunosoppressori. Si sa che sono
composti (non proteici) di basso peso
molecolare che inibiscono le ciclofiline (o
peptidil-prolil-cis-trans-isomerasi). Non era
chiara la loro azione immunosoppressiva.
Oggi [vedi TIBS 21, (11) 407-1996] è stato
chiarito che la ciclosporina forma un
complesso stabile con la ciclofilina che si lega
alla PP2B legata, a sua volta, alla subunità B
della calcineurina stessa. Si tratta quindi di un
complesso quaternario che blocca la
calcineurina (CN) impedendole di legare il
naturale attivatore (la CaM). Non avviene
pertanto l’attivazione della CN e viene a
mancare l’essenziale defosforilazione di NF-
AT, con attivazione delle cellule T (vedi
schema in precedente).
Proteina fosfatasi 2C:
Dipende strettamente dal Mg ed anche dal Mn (è detta anche famiglia PPM). La Piruvato
Deidrogenasi Fosfatasi è una PP2C. Negli Eucarioti la PP2C ribalta la cascata di proteine cinasi
che si attiva in risposta a stress o elevati rapporti AMP/ATP. Defosforilazione piruvico deidrogenasi
= aumento decarbossilazione ossidativa del piruvato = produzione ATP via catena respiratoria.
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Proteine Tirosin – Fosfatasi (PTP)
Si è già detto che le proteine fosfatasi sono molto importanti: sono la naturale controparte delle
proteine cinasi. Le proteine cinasi sono state classificate in Serin/Treonin cinasi, Tirosin-Cinasi e
miste (si ricordi, per esempio, che MEK, detta anche MAPKK, che fosforila la MAP-cinasi sia su
treonina che su tirosina in corrispondenza della sequenza TEY del subdominio VIII). Anche le
proteine fosfatasi sono classificabili in tre grandi famiglie:
• Ser/Thr proteine fosfatasi, contraddistinte dalla sigla PP (abbiamo visto PP1 e PP2).
• Tyr proteine fosfatasi, che sono proteine fosfatasi specifiche per residui tirosinici di proteine
(sono contraddistinte dalla sigla PTP).
• Proteine fosfatasi a funzione mista, nel senso che staccano con meccanismo idrolitico un
residuo di acido ortofosforico sia da serin/treonine che da tirosine. Anche in questo caso
possiamo citare l’esempio della Cdc-25 (vedi pag.132), che stacca il fosfato sia dalla Treonina-
14 che dalla Tirosina-15 del Rossman motiv della Cdc-2.
Il “capitolo” delle protein-tirosin fosfatasi (PTP) è della massima importanza, ed è in continuo
aggiornamento. Gli studi sulle PTP iniziarono, in pratica, nel 1988, quando una PTP fu purificata
da placenta umana da un gruppo di ricercatori coordinato dal Prof. Edmond H. Fischer (che
conseguì, insieme ad Edwin G. Krebs, il premio Nobel nel 1992 per la Medicina e la Fisiologia). Fu
una realizzazione importante, e per un certo verso inusuale, nell’ambito degli enzimi che
partecipano al metabolismo regolatorio. Infatti tali enzimi sono normalmente presenti in quantità
molto limitata e sfuggono, in pratica, ai tentativi di purificazione ed isolamento in forma omogenea:
gran parte degli enzimi che partecipano al metabolismo regolatorio e che sono stati studiati
provengono, in genere, da applicazioni di tecnologie biomolecolari. Con la purificazione di una PTP
(si trattava della PTP-1B), fu disponibile la sequenza di una proteina tirosina fosfatasi, e fu
possibile constatare, mediante una ricerca su banche dati, che non aveva omologia di sequenza
con altre ser/thr proteine fosfatasi. Oggi è anche disponibile (vedi più avanti) la struttura completa,
mediante l’analisi ai raggi X, della PTP-1B.
Mediante la stessa ricerca su banche dati, fu possibile constatare che parte della PTP-1B aveva
omologia di sequenza con una proteina transmembrana già nota: si tratta della CD45 che, intorno
alla metà degli anni ’70, era stata caratterizzata quale maggior componente delle glicoproteina
trans-membrana di tutte le cellule della linea ematopoietica. Poiché la CD45 era posseduta solo da
tali cellule, fu utilizzata come marker importante a livello clinico, anche se la sua funzione restava
completamente ignota. Per esempio la diagnosi di linfomi non-differenziati passa anche attraverso
la determinazione della CD45. Seguì l’identificazione di altre importanti proteine fosfatasi
specifiche per il residuo tirosinico e, a tutt’oggi, le proteine studiate sono più di 35.
K.M. Walton & J.E. Dixon, Ann. Rev. Biochem., 62, 101-20, 1993
I.S. Towbridge, J. Biol. Chem., 266, 23517, 1991
Inserto: NiceProt View of SWISS-PROT: P08575 (CD45)
Le PTP presentano, in generale, un’elevata attività: si ritiene che per tale elevata attività i residui
tirosinici delle proteine (oggetto di fosforilazione) siano, “di norma”, defosforilati. Le tirosin-cinasi
possono in effetti determinare una fosforilazione transiente.
Struttura primaria delle Proteine Tirosin Fosfatasi e loro principali proprietà
Dalla monografia di Walton & Dixon è qui sotto riportato lo schema delle PTP più studiate. Si fa
riferimento alla PTP-1B con un dominio ben caratterizzato, specifico dell’attività proteina tirosinfosfatasica,
e, quindi, l’esistenza del dominio fosfatasico accomuna tutte le proteine riportate in
figura. Interessante che tale dominio PTP può essere presente anche due volte (come in CD45).
La presenza di altri domini a funzione nota in varie proteine del gruppo PTP può guidare nella
ricerca della funzione delle PTP stesse, funzione che, d’altronde, è inscindibile dalla localizzazione
subcellulare delle medesime, localizzazione ottenuta con sequenze che “spediscono” la PTP nel
suo sito(denominate ZIP-code). Infatti la PTP-1B al C-terminale possiede una sequenza che ne
giustifica l’adesione al reticolo endoplasmatico, con la PTP-1B che è rivolta al citoplasma. In tale
sede potrà agire su particolari substrati. La PTP-1B presenta serine fosforilabili da Cdc-2 (cioè Ser
seguite immediatamente da Pro) e il suo coinvolgimento è stato dimostrato nel ciclo cellulare ed
anche come mediatore dell’azione dell’insulina.
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Altre PTP possiedono extra-domini a funzione nota.
La PTP-MEG presenta, all’N-terminale, un dominio simile ad altre proteine del citoscheletro. In
particolare alla proteina della banda 4.1 dei globuli rossi umani. Tale 4.1 collega l’actina alla
“rete” adesa al lato interno della membrana che è formata dalle molecole di spettrina. Ma la 4.1 è
omologa della talina (che a sua volta è substrato della Src-proteina cinasi; vedi pag.117). È del
tutto proponibile il seguente sillogismo: come la 4.1 sta unita al citoscheletro, così può farlo anche
la PTP-MEG, ed i suoi substrati andranno ricercati tra le proteine del citoscheletro stesso.
La PTP-1C è stata isolata da tessuti umani e di topo: contiene il consueto dominio PTP nella parte
C-terminale, mentre all’N-terminale contiene due domini di tipo SH2. Questi domini “Src Homology”
di tipo 2 sono di grande importanza. Abbiamo già visto (pag.117) che riconoscono una tirosina
della stessa proteina che porta T/SH2 o di un’altra proteina (per es. il recettore per il PDGF) solo
se è nello stato fosforilato. Abbiamo visto che è stato anche decifrato il codice con il quale sono
riconosciute tali tirosine fosforilate (sono gli amminoacidi che immediatamente seguono la tirosina).
Ricordiamo che gli SH2 su proteine non si legano alla tirosina se questa non è nello stato
fosforilato (in genere autofosforilato). (Già considerato a pag.160).
La presenza di domini SH2 su proteine tirosin fosfatasi è estremamente pertinente alla funzione
della tirosina fosfatasi stessa: infatti gli SH2 consentono di “pilotare” la PTP sulla tirosina da
defosforilare.
Esistono diverse altre proteine riconducibili alla struttura della PTP-1C, alcune delle quali
partecipano allo sviluppo dell’embrione della Drosophila. A pag.117 era stata introdotta la proteina
Syp, che è simile alla PTP-1C, che è anche denominata PTP-1D e che ha affinità per una
particolare tirosina in forma fosforilata del recettore per il PDGF.
La YOP51 appartiene alla famiglia di proteine tossiche prodotte da batteri del genere Yersinia. È
sorprendente che i batteri possiedano attività PTP. Infatti non è nota la presenza di tossine
fosforilate nei batteri. Ma l’attività enzimatica proteina tirosina fosfatasica è presente su proteine
prodotte dai batteri per attaccare cellule eucariote.
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Vedremo più avanti che altri batteri patogeni producono enzimi che producono AMP-ciclico
(pertosse ed antrace), e ciò rientra nel medesimo tipo di strategia: l’attacco alle cellule bersaglio
degli organismi eucarioti mira a disarticolare qualche punto importante della fitta rete dei segnali
intracellulari. Del genere Yersinia sono studiate in particolare tre specie:
▪ Yersinia pseudotuberculosis: prima specie identificata per essere produttrice di PTP
▪ Yersinia enterocolitica: produce PTP contraddistinta dalla sigla YOP51
▪ Yersinia pestis: agente eziologico della peste bubbonica. Produce una PTP dalla sigla YOP2b
La YOP51, che è stata molto studiata, possiede un’attività PTP da 20 a 1000 volte più elevata di
altre PTP. Alcune specie mutanti di Y. enterocolitica, con il gene codificante per YOP51 mutato in
modo tale da codificare una PTP mancante dell’AA essenziale nel sito attivo (una cisteina), non
sono più patogene! La PTP mutata è inattiva cataliticamente ma riconosce ugualmente i substrati e
resta associata ad essi. Questo è stato molto utile per identificare i substrati di questa PTP (vedi
pag.165: cisteina-215 del sito attivo).
VH1. E’ la proteina con attività PTP dal peso molecolare più basso: 20000 Da. Una parte del
genoma del Vaiolo Bovino, denominata H1, codifica per la proteinaVH1. Tale proteina ha la
proprietà di essere, non solo fosfatasica per residui di fosfo-tirosina, ma idrolizza anche fosfoserine
e fosfo-treonine. Quindi appartiene alle PTP a “funzione mista”.
Cdc-25. Abbiamo già parlato di tale importante PTP, che in realtà fosforila anche treonina-14 oltre
alla tirosina-15 della Cdc-2. Quindi, come VH1, è una PTP a funzione mista.
Importante proprietà (già considerata): la cdc-25 è attiva, come fosfatasi quando è, a sua volta,
fosforilata.
Sino a questo punto abbiamo parlato di PTP intracellulari, o, comunque, interagenti con la
membrana. Ora occupiamoci di PTP transmembrana (qualche notizia è già stata fornita per la
CD45) ed è interessante esaminare la parte extra-cellulare che scatena (all’interno della cellula)
una serie di fenomeni mediati da attività PTP. Iniziamo dalla nota:
CD45. All’inizio di questo capitolo abbiamo già accennato alla CD45, che è una glicoproteina
transmembrana presente in tutte le cellule ematopoietiche. Era nota da tempo, ma solo con la
definizione della struttura della PTP-1B e della intrinseca attività PTP, fu possibile scoprire che la
CD45, in effetti, è una PTP. È da considerarsi come prototipo delle PTP transmembrana.
La CD45 era già nota come LCA (Leucocite Common Antigen) ed ha una struttura compatibile con
il ruolo di ipotetico recettore. E’ importantissima per la risposta contro antigeni (produzione di
anticorpi), sia da parte di linfociti B che T. Cellule mancanti solo di CD45 non proliferano in risposta
all’antigene. Lo studio dettagliato della ricerca dei substrati defosforilati dalla CD45 è in corso.
Nella parte esterna alla cellula troviamo una regione N-terminale (1-177) ricca di glucidi legati all’O.
Dal residuo 177 al 542 c’è un dominio ricco in cisteina con ben 15 siti di glicosilazione all’N. La
parte extracellulare della CD45 media interazioni con altre proteine di adesione (per es.CD22).
Nella parte citoplasmatica, la CD45 è interessante perché presenta ben due domini di tipo PTP,
ripetuti in tandem. Lo studio dettagliato della struttura primaria di tali domini ha rivelato una buona
omologia con PTP-1B. Tale omologia è esaltata in un tratto di 11 residui che contengono
l’amminoacido del sito attivo (una cisteina, che forma un tio-estere con il gruppo fosforico del
substrato, cioè con il gruppo fosforico che va incontro a rimozione). Più avanti ci occuperemo della
struttura del sito attivo della PTP.
HLAR. Nella ricerca di proteine simili alla CD45 (detta anche LCA, Leucocite Common Antigen),
sono state identificate diverse LAR (LCA – Related molecole), tra cui, nell’uomo (Human), la
HLAR. Questa ha un dominio extracellulare estremamente articolato. Infatti presenta (a partire
dall’estremità N-terminale):
- 3 domini tipo Immunoglobulina: si tratta di una struttura ridondante fra le proteine di membrana.
Ricordiamo i complessi maggiori di istocompatibilità di classe I e II (MHCI e MHCII), i recettori
delle cellule T, le IgG e le IgM.
- 9 domini di tipo III della fibronectina: li abbiamo già visti a pag.65 (il decimo residuo di tipo III
della fibronectina contiene la sequenza RGD che è essenziale per il legame alle cellule, in
genere alle integrine).
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Tale struttura è molto simile, nel suo insieme, alle N-CAM (Neuronal Cellular Adesion Molecule) e
si ritiene che la HLAR partecipi alla crescita dell’assone verso le cellule bersaglio. In tale processo
vedremo che è importantissimo il ruolo svolto dal Fattore di Crescita delle Cellule Nervose (NGF).
Conformazione delle Proteine Tirosin Fosfatasi e sequenza del sito attivo
Nel marzo del 1994 è comparsa sulla rivista Science un articolo di D. Barbord e coll. con la
struttura dettagliata della PTP-1B, definita mediante cristallografia a raggi-X. Tutto lo studio è stato
portato avanti su di un singolo cristallo di tale proteina, di dimensioni: 0.8x0.15x0.15 mm, che era
impregnato di tungsteno di sodio.
La proteina presenta diversi tratti ad α-elica e tratti a β-struttura antiparallela.
La sequenza di amminoacidi tra la posizione 213 e la 223 è essenziale per l’attività fosfatasica,
con un residuo di cisteina che forma un tioestere fosforico. Anche un residuo basico di arginina (R)
è essenziale.
Conoscendo la sequenza di numerose altre PTP, è stato confermato che tale successione di 10
amminoacidi è importante, con alcuni residui invarianti. Gli amminoacidi essenziali sono i seguenti:
Rossmann motiv
I/V – H – C215 – X – A – G – X – X – R221 – S/T – G
↑
Gly in PTP-1B
È diffusa la sigla Cx5R, perché, in realtà, tra C ed R possono essere compresi 5 AA (qualsiasi/X).
Nella PTP-1B l’AA 220 è Gly (anche in altre PTP), per cui è presente il noto Rossmann motiv Gly –
X – Gly – X – X – Gly che è ideale per “avvolgere” il gruppo fosforico. Normalmente, nelle proteine
cinasi, il Rossmann motiv “avvolge” i tre residui fosforici dell’ATP. È interessante che proteine dalla
funzione antitetica (le proteine cinasi da una parte e le fosfatasi dall’altra) ricorrono agli stessi
elementi strutturali anche per assolvere a funzioni così diverse.
È anche importante (infatti è sempre presente in PTP-1B), un residuo D (aspartico), che precede in
genere la C circa 25 residui prima.
Proteine di Adesione Cellulare e attività proteina-tirosin-fosfatasica
[CB- 5 (12) 1368 (1995)]
Le proteine d’adesione cellulare (CAM – vedi pag.73-74) sono importantissime per la realizzazione
di tanti tipi d’interazione cellula-cellula. Abbiamo visto che le CAM con caratteristiche Cadipendenti
sono le CADERINE (vedi pag.73), che presentano una caratteristica struttura a moduli
di tipo in line (vedi pag.2), come del resto anche le CAM stesse. Le due HLAR e DPTP 10 D,
appena citate, sono CAM con, in più, la caratteristica attività Proteina Tirosin Fosfatasica (PTP).
Per la DPTP10D (con 12 domini tipo Fibronectina III) è stato trovato un substrato. Si tratta della
gp-150 (gp=glico proteina), che è una CAM della Drosophila, con 18 domini extracellulari ricchi di
leucina (non ne abbiamo ancora parlato), ed un tratto intra-cellulare dove esistono 4 residui di
tirosina fosforilabili, inseriti in sequenze identificabili da domini SH2. E’ stato dimostrato che la gp-
150 è substrato dell’attività PTP, sia in vitro che in vivo. In questo caso ha particolare significato la
presenza ridondante di domini ricchi di leucina della gp-150. Tali domini sono stati trovati in
numerose altre proteine della Drosophila, che controllano importanti processi cellulari, come
l’aggregazione dei fotorecettori, dei neuroni motori, dove le interazioni omofiliche (vedi pag.73) tra i
domini ricchi di leucina potrebbero coinvolgere la attività PTP ad esse collegate.
Citiamo un’altra importante CAM con attività PTP:
PTPµ: è una CAM che inizia, nella zona extra-cellulare, con un dominio particolare (MAM-
Meprin/a5/µ), seguito dal “classico” dominio tipo immunoglobulina -uno solo- seguito, a sua volta,
da 4 residui Fibronectina di tipo III (FN3) in successione. Esiste il tratto transmembrana, quindi,
nella parte citosolubile, ritroviamo 2 domini Proteina Tirosin Fosfatasi (PTP). E’ un caso un po’
analogo alla già citata HLAR (vedi pag.164).
Le interazioni omofiliche tra le zone extracellulari di PTPµ, e la zona extracellulare di alcuni tipi di
caderine, determina de-fosforilazione di tirosine delle caderine stesse.
165

Infatti esiste una caderina caratterizzata dalla presenza di una tirosina fosforilabile nel dominio
intra-cellulare. Tale caderina è normalmente legata, attraverso le catenine, ai microfilamenti di
actina del citoscheletro (vedi pag.73). Quindi le interazioni omofiliche tra domini extra-cellulari di
PTPµ e domini extracellulari delle caderine determina la veicolazione dell’attività PTP sulla tirosina
che deve essere defosforilata. E’ una forma di “zip code”.
166

Inserto: ZIP - code
Il termine zip-code indica un codice, ovvero un particolare dominio proteico, che indirizza una
proteina, che contiene tale dominio, verso particolari destinazioni cellulari. Le PTP (proteine-tirosinfosfatasi)
presentano una molteplicità di zip-code. Ricordiamoci, tuttavia, di non confondere questi
zip-code con i leucine-Zipper (anch’essi contraddistinti dalla sigla ZIP; sono detti anche cerniere di
leucina) presenti in diversi fattori di trascrizione (vedi pag.242; per esempio CREB, Cyclic AMP
Element Binding, che è una proteina b-ZIP; b=basica).
Gli zip-code di PTP comprendono:
1) domini di associazione a membrana;
2) domini di localizzazione nucleare;
3) domini SH2 (Src Homology di tipo 2)
4) domini di associazione al citoscheletro.
Nella figura di fondo pagina (riprodotta da TIBS
19-4, 153, aprile ’94) sono indicate alcune di
queste destinazioni.
Situazione 1): esistono le proteine tirosin cinasi di adesioni focali (FAK), che possono trovarsi in
competizione con una PTP (indicata con ?), per esempio la PTP1.
Situazione 2): nel nucleo è possibile trovare una DPTP 61 F [p61/62n, che nasce per splicing
alternativo di un’altra, la DPTP 61 F (p61/62m)].La prima, contraddistinta da n finale- n=nucleo, ha
una sequenza di 11 AA idrofilici che assomiglia alla sequenza di destinazione al nucleo. Infatti è
KRRRGNRLKKSKTK (in grassetto sono indicati gli AA nettamente basici K-lisina o R-arginina).
Vedi anche indicazioni di pag.6, ovvero alcune sequenze altamente basiche determinano
l’importazione nel nucleo delle proteine che le contengono.
Situazione 3): sempre nell’ambito di associazione a membrana, la PTP2 può legarsi ad un
recettore per fattore di crescita (GFR-Growth Factor Receptor), fosforilato su tirosina, tramite il
proprio SH2; vedi pag.163 caso comune a PTP1D o Syp.
Situazione 4): è possibile un legame alla matrice, come PTPH1, ma anche all’ER, oppure alla
matrice mitocondriale. Infatti esiste la sopra citata DPTP 61F8p61/62m - m=matrice - che al posto
degli 11 AA sopra citati presenta la sequenza KRRSLLTYIAAGVVVGICAYAYTKLG, che è
tipicamente idrofobica, e adatta ad attraversare la membrana ER ed anche quella mitocondriale
interna.
167

Interazione: Caderine - Tirosin Cinasi - Tirosin Fosfatasi
[da Curr.Opin.Cell.Biol. 11 (5) 554 (ott.1999)]
In relazione alle molecole d’adesione (CAM), che costituiscono una famiglia assai articolata,
possiamo oggi comprendere nei particolari il funzionamento delle caderine, che rappresentano
certamente una classe importante di CAM. Ricordiamo che le caderine sono CAM calciodipendenti.
Possiamo far riferimento a quanto già trattato a pag.73 per approfondirlo con la seguente figura.
In alto è schematizzata la struttura primaria delle caderine, con i seguenti domini (cominciando da
sinistra):
CYTO - è il dominio citoplasmatico, che contiene, a sua volta, le zone di legame a β-catenine o
alla plakoglobina (β-cat/plak), che a sua volta lega la α-catenina. Quest’ultima lega, ancora, l’actina
o direttamente, oppure attraverso l’interposizione di α-actinina, vinculina e altre (vedi figura di
pagina seguente). Tutte queste proteine, nel loro insieme, costituiscono il CAC (Cadherin-
Associated Complex).
Il dominio CYTO comprende anche la zona di legame ad una famiglia di catenine, le p120.
Queste ultime furono isolate inizialmente come substrati dell’azione della tirosin-cinasi Src. In
particolare la proteina p120 ctn (la più nota) contiene 10 copie del dominio armadillo (formato da 42
amminoacidi). La p120 è fosforilabile e diversi riscontri sperimentali depongono a favore di un suo
stato de-fosforilato e coesivo in antitesi ad uno stato fosforilato e dissociato, per il contributo
(ovvio) della repulsione elettrostatica tra cariche negative portate dal gruppo fosforico.
TM - è il tratto transmembrana formato in prevalenza da amminoacidi idrofobici.
C5, C4, C3, C2, C1 - sono i domini costituenti l’ecto-domain, che legano (non sempre) calcio.
L’ultimo di questi domini, il C1, vicino all’N-terminale, presenta la sequenza HAV tipica delle
caderine (vedi figura sopra e pag.73) che è importante per i legami di tipo omofilico.
Nella figura (sopra) sono illustrati i domini leganti calcio, ed il calcio stesso.
168

E’ altresì illustrata l’interazione di tipo cis, tra caderine cioè della stessa cellula, che si realizza alle
interconnessioni tra C2 e C1. Il Calcio determina una maggiore rigidità della catena e consente lo
stabilirsi del legame cis. Importanti sono i legami trans (tra caderine di cellule diverse) che sono
promossi da un inserimento del triptofano-2 (W2 - secondo amminoacido della catenina, quindi
praticamente all’N-terminale), che interagisce con l’alanina-80, che è al centro della terna HAV. La
struttura HAV-W è essenziale per le dimerizzazioni di tipo trans, ma non per quelle di tipo cis.
Completiamo ora l’analisi di quanto accade nella zona citosolica, che interessa per le connessioni
al citoscheletro, e per comprendere il ruolo centrale delle tirosin-cinasi (come Src e, più in generale
le RTK- attività tirosin cinasica associata a recettori), nonché delle proteine-tirosin-fosfatasi (PTP)
che sono trattate a pag.162 e seguenti.
L’aggregato che si forma nella parte citosolica è denominato CAC (Cadherin-Associated-Complex)
e alla sua formazione contribuiscono una molteplicità di macromolecole. Comunque nella figura qui
sotto sono illustrate la β-catenina e la Plakoglobina, fosforilabili in serina (S), tirosina (Y) e treonina
(T). Ma l’attività più importante è la fosforilazione a carico delle tirosine. La fosforilazione, in
generale, dissocia la β-catenina e la Plakoglobina dal CAC, annullando l’adesione. Infatti
l’esposizione ad un certo numero di fattori di crescita (EGF, TGF-β, PDGF, CSF1, HGF) si traduce
nella fosforilazione di tirosine diretta (ad opera di recettori con attività RTK) oppure indiretta
(attraverso attività tirosin cinasica non-recettoriale come src).
Al contrario l’azione di tirosin-fosfatasi (PTP) come PTPµ (vedi figura b di pag.166) indirizzate alle
tirosine fosforilate dai propri zip-code (il dominio PTP stesso è uno zip-code) porta alla defosforilazione
di proteine della famiglia armadillo, ed al conseguente aumento di coesività.
CAC: Caderin Associated Complex
169

Proteine fosfatasi a funzione mista
Con quest’approfondimento delle proteine tirosin fosfatasi, possiamo riprendere il discorso con la
MAP-cinasi fosfatasi, che era stata introdotta a pag.151. In particolare era prevista, per tale
fosfatasi, la funzione mista, cioè la possibilità di idrolizzare sia tirosine che serine/treonine. Diverse
fosfatasi con tali proprietà sono state sequenziale, ed ora possiamo confrontare la loro sequenza.
Riassumiamo brevemente una serie di esperimenti, condotti peraltro in laboratori differenti:
1) Se fibroblasti NIH 3T3 sono stimolati da siero, si ha una rapida attivazione (5 minuti circa) della
MAP-cinasi, ma la sua attività comincia a scendere dopo circa 60 minuti. È stato accertato che
l’espressione della doppia fosfatasi 3CH134 coincide, nel tempo, con la defosforilazione ed in
attivazione della MAP-cinasi. Inoltre in cellule di scimmia
2) COS trasfettate ed arricchite con la doppia fosfatasi 3CH134 si aveva selettivo blocco
dell’attivazione della MAP-cinasi.
3) Anche nel budding yeast Saccharomyces cerevisiae è stata studiata e sequenziata una MSG5
con analoghe proprietà di doppia attività protein-fosfatasica.
È stata studiata anche la PAC1, che è presente nei Mammiferi ed è omologa della 3CH134.
Una doppia proteina fosfatasi, già presa in considerazione, è la Cdc-25, che rimuove il fosfato dai
residui Thr-14 e Tyr-15 inseriti nel Rossmann motiv della Cdc-2. Ricordiamo (vedi pag.152) che si
tratta di un subdominio (il I) diverso dal subdominio (l’VIII) fosforilato nelle MAP-cinasi,
doppiamente defosforilati dalle MAP-cinasi fosfatasi.
Nella seguente figura (da Current Biology, 4, 647, 1994), è riportata la sequenza amminoacidica
nei dintorni del sito attivo di diverse PTP, sia solo tirosin fosfatasi che con doppia affinità.
La PTP-1B è stata studiata per prima.
La VHI (coinvolta nel vaiolo bovino) ha doppia specificità.
La CL100 e la MAP-cinasi fosfatasi umana, omologa della 3CH134 espressa dal topo (ambedue
presentano doppia specificità).
La Pac1 è presente nei mammiferi ed è omologa delle due precedenti.
La MSG25 è del lievito, con doppia specificità.
La Cdc-25 umana è nota.
Si può constatare che non esistono elementi strutturali di tale breve tratto di sequenza per
prevedere la semplice o doppia specificità come proteina fosfatasi.
Possiamo concludere che tale sequenza è caratteristica di tirosin proteine fosfatasi, che, in alcuni
casi, possono essere anche tirosina e serina fosfatasi.
Si può constatare la sequenza Cx5R caratteristica di tutte le PTP.
170

Enzimi che producono AMPciclico e GMPciclico
Abbiamo completato lo studio delle proteine cinasi e delle proteine fosfatasi, che sovente
partecipano a reazioni in sequenza o cascata, dalla formulazione anche molto complessa. Nel
flusso di informazioni che lega un evento extracellulare ad un processo endocellulare, in genere
metabolico (per esempio sintesi o degradazione di glicogeno), troviamo gli importanti nucleotidi
ciclici AMPC e GMPC, che possono stimolare specifiche proteine cinasi. Vediamo in dettaglio i
sistemi enzimatici implicati nella sintesi di tali importanti “secondi messaggeri”.
Adenilato ciclasi (A.C.)
Ne sono conosciute 9 forme. Le più studiate sono 2:
⇒ Adenilato ciclasi calmodulina indipendente.
⇒ Adenilato ciclasi calmodulina dipendente.
Occupiamoci prima della CaM – dipendente, che è stata clonata da cDNA. È nota altresì la
sequenza ricavata direttamente dall’analisi di alcuni peptidi, che risultano sottolineati a pag.172.
Infatti l’Adenilato Ciclasi CaM – dipendente è stata purificata con il metodo della cromatografia per
affinità, con colonne cromatografiche portanti calmodulina o forscolina (vedi dopo). Facilmente la
A.C. purificata porta a sé strettamente legata la subunità α della proteina-G stimolatoria. È stata
verificata, quindi, una perfetta corrispondenza fra una parte della proteina effettivamente estratta
da cervello bovino ed il gene che codifica per l’Adenilato Ciclasi (A.C.) CaM – dipendente.
È interessante che non presenta omologia di sequenza con l’A.C. CaM – indipendente, quindi
sono due enzimi distinti.
In riferimento, quindi, alla struttura primaria putativa (pag.172) vediamo di estrapolare alcune
proprietà dell’A.C. CaM – dipendente.
▪ È formata da 1134 AA (P.M. 120000 Da circa) e contiene 12 tratti idrofobici transmembrana
(vedi schema), che sono ripartiti in 2 gruppi da 6 ciascuno. I due gruppi di 6 tratti sono separati da
un dominio idrofilico di P.M. 43000 Da (dall’AA 236 all’AA 613). Al C-terminale esiste un’altra zona
idrofilia (36 KDa). Anche l’ammino-terminale è idrofilico. Queste tre zone sono coinvolte nel
legame con l’ATP ed il suo processamento ad AMP – ciclico.
Poiché la proteina lega ATP, dovrà contenere alcuni elementi strutturali comuni alle proteine cinasi
(vedi classificazione HQH pag.82 e seguenti). Analizziamo infatti i residui amminoacidici presenti
da 16 a 21 e osserviamo la “curiosità” dovuta a ben 7 glicine in successione che precedono:
⇓ ⇓ ⇓
− Gly16 – Ala17 – Gly18 – Glu19 – Ser20 – Gly21 –
Sono evidenziati i residui di glicina, che si susseguono secondo il “classico” Rossmann motiv Gly-
X-Gly-X-X-Gly, e quindi questa è, teoricamente, la zona destinata al legame con l’ATP.
From Krupinsky et all. Science 244, 1558, 1989
171

172

▪ Contiene un sito di glicosilazione extracellulare. Infatti, in posizione 706 esiste l’asparagina (N)
seguita, in seconda posizione, dalla serina. Trattasi della tipica sequenza Asn-X-Ser, sito di
glicosilazione all’N (vedi pag.28).
▪ Contiene due serine fosforilabili. Infatti la Ser-481 è seguita, in seconda posizione, da Arg-Arg-
Lys, e questo è un requisito essenziale per la fosforilabilità da PKC (in realtà possono essere
presenti anche AA basici prima del residuo fosforilabile). Infatti una A.C. da globuli rossi di rana, di
P.M. 120000 è fosforilata da PKC.
Anche la Ser-1035 è fosforilabile da PKA (è preceduta, in seconda e terza posizione, da Arg-Arg).
Queste fosforilazioni sono previste come inibizioni a feed-back. La PKA è attivata, per definizione,
da AMPC e può essere regolata dall’inibizione dell’enzima che produce l’AMP – ciclico stesso.
Anche il recettore β-adrenergico è estensivamente fosforilato e inattivato da proteine cinasi.
▪ Contiene un dominio legante CaM al C-terminale. È situato tra la Valina-987 e la Glicina-1050.
Possiede proprietà comuni ad altri domini leganti CaM di altre proteine. Come tale, l’A.C. CaM –
dipendente sarà proteolizzata dalla calpaina (questo è un tema ricorrente di tutte le proteine che
legano calmodulina; per es.: Fosfodiesterasi per AMPC, Ca-ATPasi di membrane plasmatiche,
Calcineurina, Proteina Cinasi CaM – dipendente).
Nel complesso esistono strette omologie con altre GuanilatoCiclasi, mentre esistono nette
differenze tra A.C. CaM – dipendenti e indipendenti.
La maggior parte delle Adenilato Ciclasi sono attivate da concentrazioni micro-molari del diterpene
Forscolina (isolato dalla pianta Coleus forskohlii). Infatti, come è stato detto all’inizio del
paragrafo, la cromatografia per affinità con forscolina consente la purificazione dell’A.C. CaM –
dipendente dal cervello bovino.
L’Adenilato Ciclasi CaM – indipendente è stata clonata ed è formata da 834 AA (P.M. 92000 da),
quindi ha un P.M. inferiore alla CaM –dipendente. Non presenta omologie con la CaM –
dipendente.
Funzioni dell’Adenilato Ciclasi CaM – dipendente
È alquanto incomprensibile l’attivabilità da CaM dell’A.C., in relazione soprattutto al fatto che la
CaM è anche un noto attivatore dell’enzima Fosfodiesterasi, l’enzima cioè che scinde l’AMPC
(ricordiamo che la CaM fu scoperta per tale proprietà, ed ancora oggi viene denominata “attivatore
della fosfodiesterasi”). Quindi la CaM, contemporaneamente, attiva sia l’enzima che produce
l’AMPC che l’enzima che lo scinde (cioè la fosfodiesterasi) e quindi s’instaurerebbe un ciclo futile.
In realtà l’A.C. non può essere attivata dalla sola CaM e, come è oggi ben noto (ritorneremo
sull’argomento), svolgono un ruolo importante le proteine-G, cioè attivate da GTP, che sono
classici trasduttori del segnale.
Interessante è la struttura transmembrana dell’A.C., tipica di una proteina che forma canali. È
particolarmente marcata la somiglianza tra A.C. e la proteina “multidrug resistence”, che vedremo
più avanti. Può comunque essere ipotizzato che tale A.C. sia anche implicata nell’esportazione di
AMPC dalle cellule, come nel Dictyostelum discoideum, che lo sintetizza e lo esporta per
controllare la chemiotassi, l’aggregazione e la differenziazione.
AMP – ciclico in Eucarioti semplici e in Procarioti
Negli organismi superiori, l’AMPC media, come abbiamo già visto, segnali intracellulari: attiva una
PKA. Nel Dictyostelium discoideum (D.D.), media invece segnali intercellulari ed è prodotto come
“segnale di carenza di nutrienti” e promuove l’aggregazione di cellule. In situazione d’emergenza, il
D.D. produce nel mezzo AMPC, che è percepito da altre cellule le quali, per chemiotassi, si
aggregano alla cellula “fondatrice” e sono, quindi, da questa “reclutate”. Il D.D. è un eucariote
semplice e, quando i nutrienti sono abbondanti, il D.D. esiste come cellula indipendente.
173

D’altra parte abbiamo visto che, in procarioti, l’AMPC si lega alla proteina CAP (vedi pag.88), che si
lega al DNA in corrispondenza di certi siti promotori, con conseguente trascrizione di geni che
consentono l’utilizzo di nutrienti alternativi (per esempio lattosio) ad un nutriente di base (per
esempio glucosio).
Doppia azione della CaM su Adenilato Ciclasi (A.C.) e Fosfodiesterasi (PDE)
Effetto paradosso della Calmodulina:
→ Attiva l’Adenilato Ciclasi (che produce AMPC)
→ Attiva la Fosfodiesterasi (PDE) che idrolizza l’AMPC
→ Potrebbe essere assicurata la transitorietà nella formazione di AMPC
→ Potrebbe, l’aumento di calcio, smorzare i segnali da AMPC per far risaltare i segnali Ca –
dipendenti
174

Inserto: generalità su tossine batteriche
Tossine
batteriche
Esotossine
Endotossine
L
I
P
O
P
O
L
I
S
A
C
C
A
R
I
D
E
polisaccaride
lipide A
Per es.: fattore ADP-ribosilante del Colera e
Adenilato ciclasi di Pertosse e Antrace (vedi
pag.176)
Botulismo
da “Le Scienze” 290, 34, (1992)
175
- determina l’antigenicità (catena Ospecifica)
- segmento interno
- segmento interno con Kdo
- causa di tutti gli effetti nocivi delle
endotossine. Per esempio E. coli e
Salmonella typhimurium possiedono lo
stesso lipide A.

Adenilato ciclasi tossine
Già avevamo parlato di questa tossina (vedi pag.88). Analizziamo ora l’Adenilato ciclasi prodotta
dal batterio Bordetella pertussis (che causa la pertosse) e dal Bacillus anthracis (che causa il
carbonchio).
La Bordetella pertussis produce una miscela di tossine, tra cui la Pertussis Toxin propriamente
detta (che è un enzima che ADP-ribosila le subunità α delle Gi).
Contiene inoltre un’insolita Adenilato ciclasi, che è CaM stimolata (decine di volte). Il batterio non
possiede Calmodulina. Viceversa questa Adenilato Ciclasi (A.C.) penetra facilmente nelle cellule
ospiti e in esse trova la CaM, che la stimola. La sovrapproduzione di AMPC blocca la chemiotassi,
la fagocitosi dei macrofagi. La malattia è caratterizzata da assenza di febbre (perché i neutrofili
non rispondono) e da elevata incidenza di batteri della polmonite, grazie alla scarsa risposta
immunitaria. Esiste una prova di questo comportamento.
Un mutante di Bordetella pertussis, mancante di A.C. è non patologico. Questa A.C. produce molto
AMPC, avendo un elevato numero di turnover.
Qui a lato è riportato lo
schema della struttura
primaria dell’A.C. di
Bordetella pertussis. Nei
primi 450 AA c’è l’attività
A.C., più, molto
importante, un dominio
legante CaM.
Proseguendo, dall’AA 450
al 1600, abbiamo una
catena polipeptidica che
ha omologia di sequenza
con l’α-emolisina di E.coli
(è una esotossina che lisa i
globuli rossi). L’omologia è
particolarmente
pronunciata tra i residui
640 e 910 (zona a
tratteggio orizzontale).
Inoltre, tra l’AA 1000 e 1600, esiste una sequenza Gly – Gly – Asp – Gly – Asp – Asp – Thr – Leu
– X (9 AA) ripetuta un numero rilevante di volte (sempre omologa con l’α-emolisina).
Essendo nota la sequenza putativa è possibile costruire un grafico di idrofobicità e sono
individuabili 4 tratti idrofobici. Se ne ipotizza la partecipazione al processo di penetrazione della
proteina nella cellula ospite. Se si opera la delezione indicata in figura, non si ha più penetrazione
all’interno della cellula ospite.
È cruciale la capacità di essere attivata da CaM. Infatti la CaM è una proteina presente in tutte le
cellule eucariote con una struttura molto ben conservata. Quindi CaM è un ottimo marker
endocellulare di qualsiasi cellula eucariotica. Pertanto l’A.C., una volta penetrata all’interno di una
cellula, viene gradualmente attivata. Tale A.C. ha un numero di turnover molto più alto dell’A.C.
endogena, e si ha sovrapproduzione di AMPC, con sbilanciamento di delicati cicli regolatori.
Anche Bacillus anthracis genera una tossina del tutto analoga a quella di Bordetella pertussis.
Anch’essa contiene all’N-terminale l’attività A.C. stimolata da CaM. Entra nelle cellule per
endocitosi.
176

From E.Hanski TIBS 14 459 (1989)
177
Qui a lato è riprodotto lo schema
d’azione di questa tossina. Le parti (a)
e (b) non richiedono commenti.
(c): per l’inattivazione si è visto che è
strettamente ATP dipendente. È
ipotizzabile anche l’intervento delle
calpaine endocellulari (come
meccanismo d’azione comune a tutte le
proteine che legano CaM; vedi pag.44).
Essendo ATP-dipendente, la proteolisi
potrebbe essere dipendente da
ubiquitina (vedi pag.36).
Si può constatare che questo
meccanismo d’azione di una tossina
batterica ha analogie di funzionamento
con il batterio patogeno Yersinia pestis
(vedi pag.164), che introduceva
nell’organismo infettato una potente
attività proteina tirosin fosfatasica
(PTP).

Il GMPciclico (GMPC)
Qui sotto è riportata la struttura dell’AMP – ciclico e del GMP – ciclico. Trattasi di esteri fosforici
ciclici, che per semplice idrolisi possono convertirsi nei comuni acidi adenilici (AMP) o guanilici
(GMP).
AMPc
GMPc
Del ruolo dell’AMPC quale secondo messaggero abbiamo già parlato. Dell’esistenza di un GMPC si
è cominciato a parlare solo in tempi più recenti, anche perché la sua concentrazione, in generale,
nelle cellule eucariote è di gran lunga inferiore all’AMPC. L’AMPC, in genere, è presente a
concentrazioni intorno all’1 micromolare, mentre il GMPC oscilla intorno allo 0.1 - 0.001
micromolare. Il GMPC fu scoperto come importante componente del processo di fototrasduzione
intorno alla metà degli anni ’80 (vedi inserto pag.292). Intorno alla metà degli anni ’80, furono
scoperti gli importanti fattori natriuretici (ormoni), che inducono la produzione di GMPC
intracellulari. Tutto lascia intendere che il GMPC sia implicato in una varietà di altri importanti
processi cellulari.
Vediamo ora le proprietà degli enzimi che lo producono (guanilato ciclasi) che, a differenza delle
adenilato ciclasi, sono note in più di due forme (ne descriveremo 4).
Guanilato ciclasi dipendente da calcio – recoverina
Cominciamo da questa forma perché connessa al processo di foto-trasduzione nei vertebrati, dove
il ruolo del GMPC è stato completamente definito. Vedremo in dettaglio più avanti tutto il processo.
Ora ricordiamo solo che il GMPC tiene aperti i canali per il sodio della membrana del segmento
esterno dei bastoncelli. Uno stimolo luminoso porta ad un calo massiccio del GMPC con
conseguente chiusura dei canali stessi. Nella fase di riposo, il GMPC deve essere risintetizzato
dalla guanilato ciclasi (G.C.), che è calcio dipendente. Si pensava (in analogia con quanto succede
con l’Adenilato Ciclasi) che anche la G.C. dipendesse dalla calmodulina. Invece è stato scoperto
da Stryer che è coinvolta una proteina della famiglia della CaM, nota con il nome di recoverina.
Tale proteina assicura una stimolazione dell’attività G.C. quando il calcio intracellulari (che pure è
molto basso, circa 0.1 – 0.3 µM) scende ulteriormente. È stato accettato uno schema di
funzionamento del tipo:
178

La Recoverina (con P.M. 23000: possiede 4 EF hand come la CaM) a calcio elevato lo lega,
secondo un equilibrio di associazione-dissociazione e, in tale forma, si lega alla G.C.,
disattivandola. Se il calcio scende, la recoverina perderà lo ione calcio e, nella forma che non lega
calcio, si dissocerà da G.C., lasciandola libera di esprimere attività catalitica. Premettiamo che
questo è soltanto un modello. È accertato che sono coinvolti anche altri elementi ancora da
identificare, ma, nelle linee generali, è accettato.
Interessante che la recoverina è un po’ la controparte della calmodulina. In genere, la calmodulina
attiva gli enzimi ai quali si lega (vedi calcio – ATPasi e Adenilato Ciclasi). Qui la recoverina
disattiva l’enzima al quale si lega.
La recoverina è stata scoperta e clonata nel 1991 da Lubert Stryer ed è presente nei bastoncelli.
Nei coni è contenuta una proteina omologa (la visinina), con struttura leggermente diversa,
codificata da un gene distinto da quello che codifica per la recoverina, ma con funzioni
sostanzialmente analoghe alla recoverina.
Nei bastoncelli potrebbe essere implicata anche un’altra Guanilato Ciclasi, del tipo “solubile” e
stimolata da ossido d’azoto (vedi più avanti). La G.C. dei bastoncelli è legata all’assonema che sta
alla base del segmento esterno.
Guanilato ciclasi attivata da fattori natriuretici
L’Atrial Natriuretic Peptide (ANP) è una proteina ormonale secreta da diversi tipi cellulari. È
prodotta dai miociti atriali in situazione di sovraccarico per il muscolo cardiaco. L’ANP viene
immesso in circolo e, come tutti gli ormoni, interagisce con tutte le cellule di un organismo
superiore. In particolare, nel rene, determina un’aumentata estrusione di ione sodio, con
conseguente calo di pressione. L’ANP possiede anche proprietà rilassanti sul muscolo liscio (come
l’ossido di azoto; vedi più avanti).
In realtà, non esiste un unico ANP (ne sono stati
descritti tre: ANP A, B, C). Gli ANP si legano a
specifici recettori delle cellule sulle quali
agiscono inducendo, in generale, la sintesi di
GMPC all’interno della cellula. Quindi tali
recettori sono, ad un tempo, recettori
propriamente detti ed enzimi produttori del
secondo messaggero.
Per la sintesi di AMPC, invece, esiste il recettore che si lega all’ormone (una proteina con la sua
identità), il trasduttore del segnale (la proteina-G), e l’enzima (Adenilato Ciclasi), che produce il
secondo messaggero. Per i fattori natriuretici, invece, in una sola proteina transmembrana sono
comprese tutte e tre le funzioni. Infatti non avviene una traduzione del segnale come per le
proteine-G, ma i recettori per i fattori natriuretici legano anche il nucleotidi ATP e risultano essere
da questo attivate.
Ora parliamo dei fattori natriuretici, e poi dei rispettivi recettori.
179
• = amminoacidi identici
in A, B, C
ANP = Atrial Natriuretic
Peptide
BNP = Brain Natriuretic
Peptide
CNP = Natriuretic
Peptide C

Sintesi e struttura dei fattori natriuretici
L’urodilatina (ANF) è il fattore natriuretici descritto per primo. È un piccolo peptide formato da 28
AA, che deriva da un precursore inattivo formato da 126 AA (pro-ANF), che, a sua volta, deriva dal
pre-pro-ANF:
Il pro-ANF è la forma d’immagazzinamento nei granuli atriali. Dietro appropriati stimoli il pro-ANF
perde l’ammino-terminale 1-98 ed è secreto l’ANF attivo, che è formato da 28 AA. È detto anche
fattore natriuretico di tipo A. Esiste poi il tipo b (BNF; B da brain perché identificato inizialmente nel
cervello di maiale), ed il tipo C (CNF, pure esso purificato dal cervello di maiale), con spiccate
omologie strutturali tra essi.
Nei tre fattori natriuretici ritroviamo il caratteristico anello formato da 17 AA, che è “saldato” per la
presenza di due cisteine invarianti che formano un ponte disolfuro. Sono sopra illustrate le strutture
dei tre fattori natriuretici, dove sono tratteggiati gli AA identici nei tre peptidi. Le differenze più
marcate sono fuori dell’anello e una delle due cisteine che formano il ponte disolfuro, in pratica,
risulta essere l’amminoacido C-terminale.
Il tipo B è stato identificato nei granuli cromaffini della ghiandola surrenale.
Cenni sulle funzioni fisiologiche dei fattori natriuretici
Recettori per i fattori natriuretici
I fattori natriuretici si legano a specifiche proteine recettoriali transmembrana, che sono più di una,
che non rispondono necessariamente ad un solo tipo di fattore natriuretici.
Sono contraddistinti dalla presenza di cinque domini:
- Dominio extracellulare (all’N-terminale) che lega
il fattore natriuretico.
- Dominio idrofobico transmembrana
- Dominio citoplasmatico che lega ATP e con
omologia di sequenza con le proteine cinasi
- Dominio citoplasmatico con attività guanilato
ciclasica
- Zona C-terminale con 10-20 siti di fosforilazione.
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Sino ad oggi sono stati descritti 3 recettori per fattori natriuretici e sono stati contraddistinti dalle
sigle:
ANFR – A
ANFR –B
ANFR – C
Occorre ricordare che le sigle A, B, C, non sono necessariamente legate al tipo di fattore
natriuretico legato dal recettore. Infatti, per esempio, un ANF può reagire con un recettore di tipo A,
ma anche con un recettore di tipo C.
I fattori natriuretici di tipo A, si legano a:
ANPR – A ed ANPR – B
I fattori natriuretici di tipo B, si legano a:
ANPR – C ed ANPR – A (modestamente)
I fattori natriuretici di tipo C, si legano a:
ANPR – C ed ANPR – B
Nello schema sopra riportato sono evidenziati i domini. Sia il recettore di tipo A, che quello di tipo
B, sono formati da poco più di 1000 AA. Il recettore di tipo C è invece formato da solo 496 AA, con
una zona citoplasmatica formata da soli 37 AA. Tale ANPR – C non possiede ovviamente attività
guanilato cilclasica, e quindi è una presenza un po’ misteriosa nelle membrane plasmatiche. Si
ritiene che abbia funzione di “tampone”o “clearance” per i fattori natriuretici, cioè ne legherebbe
l’eccesso, rimuovendoli dalla circolazione. Tuttavia è anche in grado di interagire con proteine-G
inibendo l’adenilato ciclasi e con l’attivazione del ciclo dei fosfoinositidi.
Le interazioni tra fattori natriuretici e recettori sono state ben documentate da Koller & Coll.
(Science, 252, 120, 1991), che hanno utilizzato cellule in coltura Cos-7, che sono versatili per
procedimenti di trasfezione. È stato possibile inserire il gene per i recettori di tipo A, oppure B,
oppure C, in distinte cellule per fare esprimere a tali cellule quantità superiori alla norma dei
rispettivi recettori. Quindi Koller & Coll. disponevano di tre linee cellulari arricchite nei tre tipi di
recettori. Esponevano tali cellule ai tre fattori natriuretici ed osservavano la risposta ai fattori
natriuretici, misurando il GMPC prodotto.
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Il fattore hANP (h = human) innalzava la
produzione di GMPC nelle cellule con recettori
di tipo A ed un po’ nelle cellule con recettori di
tipo B.
Il pBNP (p = porcine) incrementava la
produzione di GMPC sia in cellule con recettori
di tipo A che B.
L’hCNP (h = human) induceva la produzione di
GMPC solo in cellule arricchite in recettori di
tipo B.
Si può verificare che, comunque, i recettori di
tipo C non rispondono a nessun fattore
natriuretico come ipotizzato, perché mancanti,
in pratica, del dominio citoplasmatico ∗ .
Produzione di GMPC
Il recettore di tipo A è normalmente fosforilato, ed in tale stato risponde bene al fattore di tipo A,
producendo GMPC. È stato osservato (J. Biol. Chem., 267, -21-15431, 1992) che la
defosforilazione è associata a de-sensibilizzazione. Infatti, l’acido okadaico (vedi pag.163, che è un
noto e potente inibitore delle proteine fosfatasi di tipo 2A, inibisce la INH, che defosforila la Cdc-25,
vedi pag.132) blocca sia la desensibilizzazione del recettore di tipo A che la sua defosforilazione.
Quindi tutto lascia intendere che se un recettore è nello stato fosforilato è attivo, mentre è disattivo
nello stato de-fosforilato.
La fosforilazione dei recettori è un fenomeno che si ripresenta. Infatti anche il recettore βadrenergico
è estesamente fosforilato da una specifica cinasi, con conseguente disattivazione.
Anche la rodopsina (che è il recettore della luce) è disattivata da un’estesa fosforilazione al Cterminale.
Per i recettori dei fattori natriuretici troviamo che la fosforilazione del recettore provoca una
risposta di segno opposto a quella provocata nei due esempi prima citati.
Infatti la fosforilazione del recettore per il fattore natriuretico attiva la funzionalità del recettore
stesso, mentre per il β-adrenergico e la rodopsina accade il contrario.
Nelle uova di riccio di mare la GC contiene sino a 17 serine fosforilate. Il trattamento con resact
(vedi più avanti) fa diminuire a circa 2 tali residui.
Per i recettori dei fattori natriuretici resta ancora da definire quale proteina cinasi è implicata nel
processo di fosforilazione.
∗ I risultati riportati in figura (produzione di cGMP) sono in accordo con quanto è schematizzato nella figura di
pag.181.
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Legame con ATP dei recettori per i fattori natriuretici
È interessante analizzare la struttura
primaria del dominio citoplasmatico, che,
per primo, segue immediatamente il
dominio transmembrana, per ritrovare in
esso molti degli elementi strutturali delle
proteine cinasi, secondo la classificazione
di Hanks, Quinn e Hunter (vedi pagg.83-
85). Qui di seguito è riportata una figura
tratta da J. Biol. Chem., 268 (8), 5997,
1993, con la struttura primaria del dominio
con omologia per cinasi (Kinase Domain)
del recettore per l’EGF (EGFR-KD).
E’ stata confrontata con il recettore per l’EGF perché esiste, come si può constatare, un’elevata
omologia di sequenza tra questo e l’NPRA – KHD (dominio con omologia per la cinasi – Kinase
Homology Domain – del recettore A per il fattore natriuretico NPRA). In numeri romani sono
riportati i subdomini HOH.
È possibile riconoscere il consueto Rossmann motiv nel subdominio I. La lisina “72” (in riferimento
alla PKA), il Glu “91”. La sequenza APE nell’VIII, preceduta nove residui prima dalla treonina “197”
(assente nell’EGFR – KD) autofosforilabile nella PKA e l’Arg (R) 280 della PKA.
Inoltre sono stati prodotti recettori del tipo A con sostituzioni di alcuni degli amminoacidi invarianti
con l’AA alanina in quasi tutti i subdomini (le sostituzioni sono indicate con frecce verso il basso
indicanti A). Sono stati preparati 8 recettori mutanti con Alanina che sostituisce altri AA come
indicato, e nell’istogramma B è riportato il GMPC prodotto per stimolazione da ANP. La prima barra
verticale indica, con un tratto nero, l’attività guanilato ciclasica del recettore non modificato trattato
con 0.5 micromolare di ANP, accanto al controllo (barra vuota), cioè alle cellule (si tratta sempre di
Cos-7) controllo, cioè non trattate con ANP.
Si può concludere che i subdomini I e II non compromettono l’attività guanilato ciclasica. Invece
tutti gli altri domini sono singolarmente indispensabili per l’attività guanilato ciclasica del recettore.
Possiamo interpretare questi risultati affermando che il dominio “cinasico” non è affatto deputato
ad attività cinasica, perché non è indispensabile orientare con Rossmann motiv l’ATP e, d’altra
parte, mancano alcuni dei residui essenziali nel subdominio VI (l’Arg-R-165 è essenziale per il
trasferimento del fosfato e nel NPRA tale R manca). D’altra parte gli stessi autori hanno verificato,
su membrane delle cellule COS, che l’ATP è indispensabile per la produzione di GMPC.
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Quindi l’ATP si lega al dominio cinasico, ma non è il substrato di alcuna attività cinasica. Serve a
regolare l’attività guanilato ciclasica.
Fertilizzazione
È noto che specifici peptidi prodotti dalle cellule uovo attraggono gli spermatozoi. Studi approfonditi
sono stati eseguiti con il riccio di mare. Sono noti due peptidi:
speract: Gly – Phe – Asp – Leu – Asn – Gly – Gly – Gly – Val – Gly
10 AA
resact: Cys – Val – Thr – Gly – Ala – Pro – Gly – Lys – Val – Gly – Gly – Gly – Arg – Leu
14 AA
Questi peptidi, prodotti dalla cellula uovo, determinano chemiotassi negli spermatozoi. Si è visto
che nello spermatozoo provocano un aumento di AMPC, GMPC e calcio. Questa risposta
biochimica è dovuta ad un recettore degli spermatozoi per speract o resact, con forte omologia con
i noti recettori per i fattori natriuretici di tipo A o B (ANPR – A e ANPR – B).
Anche per tali recettori degli spermatozoi, la defosforilazione de-sensibilizza la cellula all’azione dei
peptidi speract e resact.
L’aumento di GMPC controlla la motilità delle code degli spermatozoi.
Guanilato ciclasi delle cilia dei protozoi
Nelle membrane ciliari di Tetrhymena e Paramecium è stata identificata una guanilato ciclasi
legata a membrana che è attivata da Calcio + Calmodulina, diversa, presumibilmente, dalla G.C. di
bastoncelli, che, invece, è inibita da Calcio, essendo il processo (nei bastoncelli) mediato dalla
recoverina. La G.C. dei flagelli dei protozoi è attivata (e non inibita) da Calcio + Calmodulina.
Prima di occuparci della guanilato ciclasi comunemente detta solubile, accenniamo all’esistenza di
un altro importante secondo messaggero, l’ossido di azoto (NO), perché è stato dimostrato che
l’ossido di azoto può essere prodotto da specifici sistemi enzimatici, alquanto complessi (ce ne
occuperemo dopo). L’NO diffonde alle cellule immediatamente vicine e stimola la Guanilato Ciclasi
cosiddetta solubile, che contiene l’importante gruppo prostetico eme, che interagisce direttamente
con l’NO.
Ci occuperemo dopo dei sistemi cellulari produttori di NO. Per il momento ricapitoliamo i 4 tipi di
guanilato ciclasi da noi studiate:
• Guanilato ciclasi dei fotorecettori dei vertebrati (inibita da calcio-recoverina)
• Guanilato ciclasi presente su recettori per fattori natriuretici o per peptidi chemiotattici degli
spermatozoi
• Guanilato ciclasi dei flagelli dei protozoi (attivata da calcio-calmodulina)
• Guanilato ciclasi “solubile” attivata da NO, dalle seguenti proprietà:
Guanilato ciclasi “solubile”
Tale G.C. è attivata da NO, ed è composta di due subunità:
- Subunità P.M. 70000 Da, che lega NO; denominata presunta “regolatrice”
- Subunità P.M. 82000, denominata presunta “catalitica”.
È la 82 KDa che è deputata alla sintesi di GMPC, perché presenta omologia di sequenza con G.C.
dei recettori per fattori natriuretici (FEBS Lett., 239, 29, 1988).
Probabilmente è la subunità 70 KDa che lega l’NO e che quindi dovrebbe contenere il gruppo eme.
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L’Ossido di Azoto
L’ossido di azoto è un importante secondo messaggero individuato in anni recenti (1989).
Da tempo si sapeva che certi derivati azotati possono indurre rilassamento sui vasi sanguigni. Per
esempio, la nitroglicerina ed il nitroprussiato sodico sono calmanti di spasmi del muscolo cardiaco.
Da tempo era stata ipotizzata l’esistenza di un Fattore Rilassante Derivante dall’Endotelio
(Endothelium Derived Relaxing Factor – EDRF), ma, nonostante innumerevoli tentativi, non era
mai stato isolato. Oggi è unanimemente riconosciuto che l’EDRF è il semplice ossido di azoto
(NO). È proprio la natura gassosa di tale NO che ha impedito di fatto il suo isolamento.
Si pervenne tuttavia all’identificazione dell’NO nei sistemi biologici, in seguito ad osservazioni a
carico delle cellule macrofagi, che lo producono perché citotossico, quindi senza legame alcuno
con eventuali proprietà di mediazione chimica.
L’NO è un radicale (possiede un elettrone spaiato) e, come tale, è citotossico, come tutte le
sostanze radicaliche (si pensi all’anione superossido). Può essere correttamente indicato con tale
elettrone spaiato: • NO. Lo sviluppo di NO è sempre accompagnato dalla produzione di nitriti e di
nitrati, in quanto l’NO, a contatto con l’ossigeno, da’ luogo alla seguente importante reazione:
2 • NO + O2 —————→ N2O4 —————→ - NO2 + - NO3
ipoazotide nitriti nitrati
Cioè lo sviluppo di NO in ambiente ossigenato da’ luogo alla produzione di nitriti e di nitrati. In
generale, la produzione di nitrati può derivare dallo sviluppo di NO.
Già nel 1981 era stato osservato che le infezioni batteriche, nell’uomo, sono accompagnate dalla
produzione di nitrati. Si accertò poi che il donatore di azoto era l’azoto guanidinico del noto
amminoacido standard arginina e che tale reazione sull’arginina era portata avanti dai macrofagi,
che sono cellule di tipo leucocitario, e quindi di origine eritroide, che sono distribuite ampiamente
nei tessuti e che sono presenti anche nel sangue; tali macrofagi (anche neutrofili) portano avanti la
fagocitosi, con la distruzione di cellule estranee all’organismo.
Si accertò che l’arginina veniva convertita in citrullina, durante la fagocitosi e, soltanto nel 1989, fu
dimostrato che l’ossido di azoto è prodotto per conversione dell’arginina in citrullina. La successiva
conversione a nitriti e nitrati avviene per reazione dell’NO con l’ossigeno, come sopra specificato.
Nei macrofagi l’NO svolge funzioni citotossiche perché un radicale. D’altra parte in tale specifica
sede è prodotto in quantità relativamente elevate.
Quindi in sintesi, nei MACROFAGI:
Per quanto riguarda l’identificazione della funzione mediatrice chimica (secondo messaggero)
dell’NO, furono importanti le proprietà note da tempo dei vaso-rilassanti nitroglicerina e
nitroprussiato sodico, che sono, in realtà, produttori in loco di ossido di azoto, che diffonde alle
cellule vicine e stimola il noto enzima Guanilato Ciclasi, la forma “solubile”, che è dotata di gruppo
eme. L’ossido di azoto stimola la guanilato ciclasi, e l’aumento locale di GMPC porta, con modalità
ancora da definire, al rilassamento del muscolo liscio. È stato ipotizzato che l’aumento del GMPC
porti all’attivazione della Proteina Cinasi dipendente da GMPC (PKG) che, a sua volta, fosforila le
catene leggere della miosina, competendo con la nota fosforilazione da parte della cinasi specifica
per le catene leggere della miosina (vedi pag.93-94), che, secondo lo schema già approfondito, va
verso la contrazione del muscolo liscio. Però questa parte del meccanismo è ancora da
dimostrare. È certo che il GMPC prodotto porta al rilassamento del muscolo liscio.
Quindi per l’NO sono stati identificati due ruoli indipendenti (apparentemente):
- svolge funzioni citotossiche nei macrofagi
- ha un ruolo di Secondo messaggero in un ampio spettro di tipi cellulari.
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Occorre ricordare che l’NO è un gas. Come tale diffonde rapidamente, ignorando qualsiasi “filtro”,
cioè canale, di membrana. Interessa quindi tutte le cellule nei dintorni del sito di produzione
dell’ossido di azoto stesso. È tra l’altro l’unico secondo messaggero di natura gassosa sino ad
oggi identificato.
Sappiamo che tutti i messaggi chimici devono avere carattere transitorio. Per esempio l’AMPC è
sintetizzato dall’adenilato ciclasi, ma esiste la fosfodiesterasi che lo rimuove. Anche il GMPC ha 4
enzimi ciclasici (appena trattati) e una specifica fosfodiesterasi (importantissima nel processo di
fototrasduzione): è infatti attivata dalla proteina-G specifica dei fotorecettori, cioè la trasducina.
Perché l’NO è un radicale, questo reagirà a-specificamente con molti diversi tipi di sostanze,
innescando reazioni radicaliche, oppure può essere “spento” con le modalità che in parte abbiamo
già detto (produzione di nitriti e nitrati). Comunque resta stabilito che l’NO non necessita di
specifici processi enzimatici per la sua rimozione. Infatti si “spegne” spontaneamente,
interessando, nell’arco della sua breve vita, un ristretto ambiente che circonda il sito stesso di
produzione (dell’NO). È stato calcolato che:
- l’NO “vive” circa 5 secondi
- l’NO non può diffondere a più di 0.2-0.6 mm dal sito di produzione.
Meccanismo di rimozione dell’ossido di azoto
Tra le più importanti reazioni alle quali partecipa l’NO ricordiamo le seguenti (oltre alla reazione
con O2, vedi pag.186):
▪ reazione con l’ossiemoglobina (nel sangue arterioso), con produzione di nitrato e
metaemoglobina:
• NO + Hb (Fe ++ ) O2 —————→ - NO3 + Hb (Fe +++ )
▪ reazione con metaemoglobina (nel sangue venoso):
• NO + Hb (Fe +++ ) —————→ NO3 · Hb (Fe +++ )
Enzimi produttori di ossido di azoto
Esistono più forme dell’enzima che produce ossido di azoto. È denominato NO Sintasi (NOS).
Presenta una notevole complessità, e dipende da diversi fattori. Tra l’altro è attivato da calcio +
calmodulina (qui ritroviamo una caratteristica che si ripete per enzimi produttori di secondi
messaggeri: anche l’adenilato ciclasi, una forma di guanilato ciclasi e vari altri enzimi produttori di
secondi messaggeri dipendono, a loro volta, dalla calmodulina). Questo aspetto è anche
importante per la purificazione della NO Sintasi stessa. Infatti la CaM può scomparire
progressivamente durante le varie tappe della purificazione e, parallelamente, si osserva una
progressiva scomparsa di attività enzimatica NOS. In realtà deve essere sempre presente la CaM
per registrare l’attività enzimatica NOS.
La reazione No Sintasica è ossidoriduttiva e dipende dal NADPH. Per la purificazione dell’NO
Sintasi è interessante riportare le osservazioni di Brendt & Snyder, che, per la purificazione ad
omogeneità di NOS da cervello, hanno impiegato una preliminare cromatografia a scambio ionico
(DEAE cellulosa), seguita da una cromatografia per affinità. Infatti, la NOS specificamente si lega,
come altri enzimi NADP dipendenti, ad una resina che porta covalentemente legato Adenosin 2’-5’
di fosfato (che corrisponde circa a ½ NADPH o NADP).
Ci si accorse, studiando la struttura primaria dell’NOS, che ha molte analogie con l’enzima
Citocromo P-450 reduttasi.
Infatti anche la NOS lega Flavin Adenin Dinucleotide (FAD), Flavin Mononucleotide (FMN) e
dipende da tetraidrobiopterina (BH4), che è precursore dell’acido folico (è il cofattore della
fenilalanina idrossilasi). Quindi riassumiamo i fattori da cui dipende:
Calmodulina – NADPH – FAD – FMN - BH4
Inoltre si tenga presente che contiene un gruppo eme con un atomo di ferro. Quindi la reazione
dipende da ben 6 cofattori, oltre il substrato.
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Per entrare nel merito del meccanismo di reazione, si tenga presente che avviene un trasferimento
bielettronico come in una monossigenasi a funzione mista, della quale ricordiamo lo schema:
R – H + NADPH + H + + O2 —————→ R – OH + NADP + + H2O
Simile a questo schema è la prima parte della reazione catalizzata dall’NOS. Il substrato è
l’arginina, che riceve un ossigeno nell’azoto omega del gruppo guanidilico e che diventa perciò
idrossi-arginina. Tale composto però è solo intermedio, perché NOS utilizza ancora ½
equivalente di NADPH ed 1 equivalente di ossigeno molecolare per convertire l’idrossi-arginina in
citrullina, con formazione di NO secondo lo schema:
Osserviamo subito quali sono gli utili inibitori specifici di questa reazione: in genere sono analoghi
dell’intermedio N-idrossi-arginina, per esempio l’N-metil-arginina (NMA). È opportuno ricordare
che un notevole ostacolo al rilevamento di questo enzima nei sistemi biologici è costituito dal
semplice dosaggio dell’enzima stesso: infatti, producendo una sostanza gassosa (l’NO), non è
possibile rilevarlo con metodologie semplici. Oltre a tutto, l’NO reagisce subito e si usa pertanto
misurare la formazione di citrullina dall’arginina, anche se occorre porre attenzione a non dosare
enzimi del ciclo dell’urea! Quindi, in pratica, la citrullina che si accumula rispecchia l’NO prodotto,
adottando le dovute precauzioni per una corretta interpretazione.
Isoenzimi dell’NO sintasi
In seguito al lavoro notevole sviluppato in questi ultimi tempi, è possibile confrontare le strutture di
NOS proprie di diversi tessuti. È riprodotto, a tal fine, lo schema seguente, incluso nella
monografia di Bredt & Snyder (Ann. Rev. Biochem., 63, 175-195,1994).
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E’ qui confrontata la struttura di NOS da cervello (brain = bNOS); da endotelio (eNOS); da
macrofagi (macNOS) e da fegato (hepNOS). Viene inoltre riportata, per confronto, la struttura
della citocromo P-450 reduttasi (CPR).
Si può, in generale, rilevare che le NOS sintasi possiedono due domini principali:
- all’N-terminale esiste il dominio di legame con il gruppo eme
- al C-terminale abbiamo la serie di subdomini, leganti CaM, FMN, FAD e NADP che, sommati
assieme, costituiscono il dominio riduttasico.
Ora commentiamo brevemente le proprietà di queste 4 NOS.
Ossido di azoto sintasi neuronale (bNOS)
Esistono più forme di bNOS dovute a splicing alternativo. Nella zona di legame per l’eme è stato
individuato, nella Ser-372, un sito di fosforilazione da parte di PKA. Può inoltre essere fosforilata
da PKG e PKC. La fosforilazione porta ad un calo di attività sia della bNOS che della eNOS; tale
fenomeno potrebbe costituire un’inibizione tipo feed-back della NOS. Infatti, l’NO prodotto dalla
NOS determina l’attivazione della guanilato ciclasi. Il GMPC attiva la PKG che, con la fosforilazione
e in attivazione della NOS, instaura un meccanismo di inibizione retroattivo.
È stato dimostrato che l’NO svolge importanti funzioni di neurotrasmettitori nel sistema nervoso.
Da “Le Scienze” 287, 28, 1992.
Nelle congiunzioni sinaptiche, i terminali presinaptici fondono con la membrana le vescicole
contenenti glutammato, che è liberato nella giunzione e che, quindi, diffonde. Occorre ricordare
che esistono gli importanti recettori NMDA, che rispondono al glutammato e riversano calcio nella
post-sinapsi. Infatti tali recettori NMDA (cosiddetti perché rispondono ad un analogo del
glutammato, cioè l’acido N-Metil-D-Aspartato), in presenza di glutammato, si aprono e lasciano
entrare lo ione calcio. L’aumento di calcio determina un legame di tale ione alla CaM, che cambia
conformazione e si lega alla bNOS attivandola, con consumo di arginina e produzione di citrullina e
dell’importante NO.
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Nei grafici è ben riportato che l’aumento di NMDA (in ascisse, grafico a sinistra) determina un
contemporaneo aumento di citrullina ed anche di GMP ciclico. D’altra parte (grafico a destra), se i
processi avvengono in presenza dell’importante inibitore dell’NO sintasi (cioè della N-Metil-
Arginina, NMA), si ha progressivo calo di formazione di citrullina e di GMP ciclico. Da queste prove
si può concludere che la produzione di NO è correlata alla produzione di GMP ciclico.
L’NO è anche neurotossico, se prodotto in eccesso
Interessante è lo schema seguente, per spiegare la neurotossicità dell’NO (da Bredt & Snyder,
Ann. Rev. Biochem. 63, 175-195, 1994). L’NO, come altri radicali, può danneggiare il DNA,
deaminandolo. Tale danno stimola l’attivazione della Poli ADP Ribosio Sintetasi (PARS, vedi
pag.193), che utilizza NAD come substrato depletando la cellula di NAD e, di conseguenza, di ATP
utilizzato per la sua sintesi: la conseguenza è la morte della cellula. Si tenga presente che la PARS
può utilizzare anche 50 NAD per una singola ADP-ribosilazione degli istoni.
NO sintasi di endotelio (eNOS)
È l’enzima che spiega la vasodilatazione, ed è comunemente accettato che l’NO è il più importante
vasodilatatore.
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Uno stimolo esterno, per esempio Acetil Colina, provoca un influsso di calcio nelle cellule
dell’endotelio (che rifasciano i vasi sanguigni). Tale aumento determina un’attivazione della eNOS
con produzione di NO, il quale diffonde nelle vicine cellule del tessuto muscolare liscio che riveste i
vasi sanguigni, dove incontra il gruppo eme della Guanilato Sintetasi “solubile”. La GS viene
attivata da NO, ed il GMP ciclico rilassa il muscolo. Si tenga presente che la GS è attivata di
almeno 50 volte da parte dell’NO!!!
La eNOS è caratterizzata da una sequenza consenso per la miristoilazione (vedi tabella pag.6), e
ciò le consente di essere “ancorata” alla membrana plasmatica. Anche l’eNOS può essere
fosforilata come bNOS.
NO sintasi dei macrofagi (macNOS)
Questo isoenzima è caratterizzato dall’inducibilità. Ovvero è in pratica assente nel macrofago non
stimolato. È solo l’attivazione innescata da specifici componenti della membrana dei batteri che
consente livelli elevati di NOS nei macrofagi. Infatti nei macrofagi attivati è evidenziabile un
incremento dello Shunt dei pentosi fosfato, proprio per il NADPH consumato dall’NO sintasi
(comunque in macrofagi e neutrofili si attiva anche la NADPH ossidasi – che produce superossido
– e che consuma anch’essa NADPH).Vedi pag.192.
L’NO ed il superossido si uniscono in una reazione non enzimatica, generando perossinitrito, che è
più tossico delle due specie, NO e superossido, prese singolarmente. Avviene la seguente
reazione tra le due specie radicaliche:
Il perossinitrito si decompone in radicale idrossile (sembra, in effetti, che la tossicità del
perossinitrito sia dovuta alla sua capacità di generare tale specie radicalica altamente tossica).
È stato individuato il componente del batterio che determina “attivazione” del macrofago: si tratta
dell’endotossina, dalla struttura molto complessa – contenente l’importante lipide A – che è stata
già illustrata (vedi pag.175). Si tratta di un lipopolisaccaride (LPS).
Apparentemente la macNOS purificata non è stimolata da calmodulina. In realtà ha una fortissima
affinità per essa e, in pratica, la macNOS la lega sempre, per cui non è possibile rilevare in
laboratorio la stimolazione da CaM aggiunta, in quanto è già presente prima dell’eventuale
aggiunta. L’endotossina da sola da’ una risposta forte, ma con l’interferone-γ si ha un notevole
potenziamento.
NO sintasi di epatociti (hepNOS)
La NOS di macrofagi non è l’unico esempio di NO sintasi inducibile. Anche nel fegato (privo di
macrofagi) può essere indotta una NO sintasi con una varietà di stimoli, oltre al LPS e
all’interferone-γ. Anche Tumor Necrosis Factor-α ed interleuchina-1 β inducono la sintesi di NO
sintasi nel fegato. Poiché una risposta simile a quella del fegato è fornita da una certa varietà di
tessuti, è stato ipotizzato che l’NO sintasi costituisca un “primordiale” elemento di difesa dei
tessuti, prima dello sviluppo, nel corso dell’evoluzione, del sistema immunitario.
Analogie tra NO e CO
L’ossido di Carbonio (che non è un radicale) ha una struttura chimica alquanto simile all’NO (che
invece è un radicale) e tutti e due sono composti gassosi.
L’ossido di carbonio può attivare la Guanilato Ciclasi “solubile”, come l’NO. L’ossido di carbonio è
prodotto in vivo dall’eme ossigenasi, che scinde il gruppo eme formando biliverdina e CO. Se in
vivo l’eme ossigenasi è inibita dal forte suo inibitore Zinco-Protoporfirina IX (un analogo del gruppo
eme), si osserva una contemporanea diminuzione del GMP ciclico: ovvero si ipotizza che parte del
GMP ciclico sia prodotto dalla guanilato ciclasi per stimolo da CO; quando è inibito l’enzima che
produce CO si ha, per conseguenza, la diminuita produzione di GMPC. La forte tossicità del CO
potrebbe essere dovuta a questa sua proprietà vicariante dell’ossido di azoto.
191

192

ADP Ribosilazioni e Poli-ADP Ribosilazioni
Il NAD, classico coenzima ossidoriduttivo, funziona anche da donatore di residui Adenosin Di
fosfato-ribosio. Esempi noti: Tossina colerica subunità A e B (1 subunità A + 5 B). La B riconosce il
GM1 sulla superficie della cellula e A (subunità ADP ribosilante) entra nella cellula e ADP ribosila Gi
(in corrispondenza di un residuo di arginina = blocco attività GTPasica della G-protein = GTPasi
inattiva = G-Protein sempre attiva).
Tossina difterica: ADP ribosila EF2 (traslocasi) = blocco della sintesi proteica.
La poli ADP ribosilazione è esclusivamente nucleare. Sembra sia implicata nell’evidenziazione di
danni al DNA.
193

Ciclo dei fosfoinositidi
mio-inositolo: è un polialcol. È classificato come vitamina. Se manca nella dieta di animali da
esperimento si hanno disordini di varia natura. Si forma, nei vegetali, dal Glucosio-6P.
Nelle piante è largamente diffuso come galactinolo (galattosio + myo-inositolo).
Nel 1984, Berridge & Irvine (Nature, 312, 315) stabilirono che IP3 (vedi più avanti) è un secondo
messaggero implicato nella mobilizzazione del calcio endocellulare.
Ma già nel 1953, Hoking & Hoking videro che sotto stimolo da Acetilcolina le cellule pancreatiche
determinavano l’incorporazione del 32 P nell’inositolo.
Negli animali è presente in un fosfolipide (fosfatidil inositolo, PI).
194

Vediamo la biosintesi di questo fosfolipide.
L’acido fosfatidico reagisce con il CTP:
195

Esiste un enzima (anzi più enzimi; vedi pag.232) che presentano attività fosfolipasica C:
⇒ IP3:
Ha vita breve. Nell’ambito di pochi secondi viene idrolizzato progressivamente a inositolo. Trova un
recettore specifico R2 sulla membrana del reticolo endoplasmatico e si ha liberazione di calcio da
una riserva endocellulare di calcio (il reticolo endoplasmatico).
⇒ Digliceride (DG):
Diffonde lateralmente in membrana. È un forte attivatore della PKC (vedi pag.101). Tale PKC è
però attivata anche da calcio (e fosfolipidi acidi tipo PS, fosfatidilserina).
Quindi l’attività fosfolipasica C genera 2 secondi messaggeri che convergono ambedue su PKC.
Infatti IP3 fa innalzare il calcio endocellulare.
Si ricordi che la PKC è attivata anche da proteolisi da calpaina (e si forma una PKC indipendente
da Ca ++ ).
In apparenza si instaura un ciclo autoattivante: il Ca ++ attiva la Fosfolipasi C (vedi più avanti
pag.231), si libera IP3 e DG; IP3 libera Ca ++ che, insieme ad altri fattori, attiva la fosfolipasi C.
Rilascio di calcio da parte di microsomi
I microsomi sono ottenuti in vitro per
vescicolazione del reticolo endoplasmatico.
Se questi sono sospesi in un medium
contenente 2 µM Ca ++ , si ha, in circa 5
minuti, un calo considerevole del Ca ++ libero
(circa 0.25 µM Ca ++ finale). Se si aggiunge
tapsigargina (un sesquiterpene, estratto
dall’Ombrellifera Thapsia garganica,
promotore di tumori sulla pelle di topi), si ha
un aumento considerevole del calcio.
IP3 conferma l’aumento (vedi fig.C).
In D si vede che 1µM IP3 determina un
istantaneo rilascio di calcio da parte dei
microsomi, confermato dalla Tg.
Si ritiene che Tg inibisca le SERCA ATPasi
(vedi pag.97). Poiché molto probabilmente
esiste uno stato stazionario, tra Ca ++ che
entra per azione della pompa del calcio e
Ca ++ che esce, bloccando l’ingresso, si
osserva solo il rilascio (riserve di
Ca ++ endocellulari, vedi anche pag.231).
196
From:
Thastrup e coll. Proc. Note. Acad. Sci. 87,
2466, 1990

Diversi ormoni stimolano l’attività fosfolipasica C
(tra cui la serotonina). Anche analoghi del GTP
non idrolizzabili (che stimolano
permanentemente G-protein) determinano
attivazione di fosfolipasi C. Si pensa che la
fosfolipasi C sia attivata per mediazione da parte
di G-proteins. La tossina della pertosse (che
ADP ribosila le Gi) inibisce la fosfolipasi C.
M = microsomi Tg = tapsigargina
Metabolismo dell’IP3
Sicuro bersaglio dell’IP3 sono i recettori (R2) sull’ER. Ma, come si è detto, è un segnale transiente
(come tutti i secondi messaggeri) e viene degradato rapidamente da fosfatasi a inositolo libero:
197

Con la reazione 2 (vedi pag.199), l’inositolo può reagire direttamente con CDP diacilglicerolo e il
ciclo riprende con la formazione di fosfatidil inositolo ed, eventualmente, due fosforilazioni con
ripristino del PIP2. I sali di litio bloccano la fosfatasi che catalizza il distacco dell’ultimo fosfato. Tali
sali sono utilizzati in medicina, in quanto esercitano azione tranquillante. Tuttavia l’IP3 non viene
soltanto degradato (inserto: vedi pag.200). Può essere ulteriormente fosforilato in 3 a Inositolo 1, 3,
4, 5 P4 da una inositol cinasi (vedi tappa 1 a pag.197 e 1 a pag.200). È anch’esso un secondo
messaggero e sembra che promuova l’ingresso di calcio dalla membrana plasmatica. L’Inositolo 1,
3, 4, 5 P4 è defosforilati in 5 a Inositolo 1, 3, 4 P3 (diverso dall’IP3 “classico”), che, a sua volta, può
essere fosforilato in 6 a Inositolo 1, 3, 4, 6 P4, che sembra inattivo (vedi tappa 2 a pag.200 e tappa
2 a pag.197).
Comunque l’Inositolo 1, 3, 4 P3 è defosforilati prima in posizione 3 a IP2 e subisce successivi
passaggi di defosforilazione.
I tempi di risposta all’IP3 variano: da 1 sec negli astrociti a 5-10 minuti in oociti. Nelle cellule sono
stati identificati anche IP5 e IP6 (anche 1 mM!! Sono i fosfoinositoli più abbondanti in cellule HL60:
IP5 = 35 µM e IP6 = 50µM; 100 volte superiori a IP3), la cui concentrazione endocellulare non
sembra variare in seguito a stimoli esterni. Questi composti vengono secreti ed hanno azione
extracellulare. Presentano un limitato turnover. Microiniezioni di IP5 e IP6 inducono rapide
alterazioni del battito cardiaco. Sono 10 – 100 volte più potenti dell’acido glutammico. IP4 non ha
effetto.
Il fosfatidilinositolo (PI) può costituire ancore per
proteine esterne alle cellule.
A pag.203 e riportato l’insieme dei processi prima esaminati. Si osservi che la PLC libera DG, che
verrà riciclato ad acido fosfatidico (vedi DGK), CDP-DG, etc. e IP3 che ritornerà inositolo.
198

199

Inserto: Metabolismo dell’Inositol Trifosfato (IP3)
Formazione dell’isomero dell’IP3 (analisi dei processi riassunti a pag.197)
Con queste due reazioni è spiegata la formazione dell’isomero dell’IP3 (la posizione 3 è fosforilata
anziché la 5). Tale isomero è effettivamente presente e può accompagnare la produzione di IP3. In
certi casi questo IP3 può essere presente a concentrazioni maggiori rispetto a quelle dell’IP3
“classico”. L’IP3 isomero può essere fosforilato in 6 e si ha un nuovo tetrafosfato.
Bombesina:
Neuropeptide di 14 AA, prodotto da neuroni del
sistema nervoso centrale e periferico.
Regola la concentrazione del Ca ++ nel muscolo
liscio.
200

La fosforilazione in posizione 3 dei fosfatidilinositidi
Nei paragrafi precedenti sono state analizzate le vie che scindono il fosfolipide acido Fosfatidil
Inositolo 4, 5 – bis fosfato (ad opera della fosfolipasi C) e i processi che rielaborano il suo prodotto
IP3. Ci siamo cioè occupati soprattutto di processi degradativi degli inositolo. Circa la sintesi dei
fosfatidilinositidi è stato ben caratterizzato un nuovo enzima ubiquitario che fosforila in una
posizione un po’ insolita del fosfatidilinositolo: infatti la nuova cinasi in questione è in grado di
fosforilate specificamente la posizione 3 dell’anello del myo-inositolo del fosfatidil inositolo. In vitro
tale enzima è in grado di portare avanti le seguenti tre fosforilazioni, che differiscono solo per il
substrato (già variamente fosforilato, ovvero sono gli intermedi che portano alla sintesi del PIP2 –
vedi via centrale di pag.199):
- Fosforilazione in 3 del fosfatidilinositolo
- Fosforilazione in 3 del fosfatidilinositolo 4-fosfato
- Fosforilazione in 3 del fosfatidilinositolo 4, 5 bis-fosfato
L’enzima è denominato fosfatidilinositolo 3-cinasi (PI3 cinasi), ed in vivo sembra che il suo
substrato sia soltanto il PIP2, ovvero sembra che sia operativa solo la terza reazione, con
formazione del fosfatidilinositolo 3, 4, 5 tris-fosfato. Per semplicità indicheremo tale composto con
la sigla PIP3.
Con una reazione di questo tipo si ottiene un fosfatidil inositolo ancora più fosforilato del PIP2
“classico”. È stato dimostrato che tale fosfoinositidi non è scisso da alcun tipo di fosfolipasi C. Ci
occuperemo dopo delle importanti funzioni biologiche di tale PIP3. Vediamo ora le reazioni a suo
carico:
- Il PIP3 è defosforilato in posizione 5, ottenendo il fosfatidil inositolo 3, 4 bisfosfato, che, a sua
volta, è ancora defosforilato in posizione 4, ottenendo il fosfatidil-inositolo 3-fosfato (quindi si
ha defosforilazione della posizione 5 e poi della 4, cioè è ripercorsa schematicamente a ritroso
la via di sintesi del PIP2). In conclusione la posizione 3 è resistente nei confronti delle fosfatasi.
Possiamo subito constatare che il PIP2 è substrato di due enzimi:
- la fosfolipasi C, che libera digliceride ed IP3;
- la PI3 cinasi, che forma PIP3.
N.B.: questa cinasi, che fosforila in posizione 3 il fosfolipide, non va confusa con la cinasi che
fosforila in 3 l’inositolo fosforilato IP3 (tappa 1, pag.200)
Ambedue gli enzimi sono sotto il controllo di proteine G: la PI3 cinasi è attivata da Ras (è una
proteina G di tipo monometrico) e dal recettore per PDGF (vedi paragrafo seguente). La PLC è
attivata dalle proteine G di tipo Gp.
201

Circa la funzione di questo nuovo fosfatidil inositolo tris-fosfato, diciamo solo che avvia importanti
stimoli mitogeni. Per esempio la riorganizzazione del citoscheletro in cellule PAE (vedi pag.214) è
stata ben delucidata (vedi Curr. Biology, 4, 385, 1994). In realtà il suo meccanismo d’azione non è
ancora noto nei dettagli. Meglio conosciuta è la via d’attivazione della PI3K (ma dal 1997 la PI3K è
legata all’attività della PKB; vedi pagg.205-207):
Attivazione della PI3 cinasi
La PI3 cinasi (PI3K) è formata da due subunità:
▪ una subunità p85 di PM 85000 Da, con funzioni regolatorie. Esiste una p85-α ed una p85-β
con elevata omologia di sequenza fra di loro. Sono note le proprietà della α. Tale p85 presenta
due domini SH2 ed un dominio SH3.
▪ una subunità p110 di PM 110000 Da, con funzioni catalitiche, che è attivata quando i domini
SH2 della p85 si legano alle tirosine nello stato fosforilato del recettore per il PDGF.
È qui sotto riportato lo schema del recettore per il PDGF. Tale schema, insieme a quello
dell’EGFR, è riportato anche a pag.117. Qui è più dettagliato: per esempio è messa in risalto la
struttura etero-dimerica della PI3K; inoltre è chiaramente specificato che l’autofosforilazione delle
tirosine avviene per dimerizzazione del recettore sotto stimolo del PDGF. Inoltre la parte
extracellulare del recettore contiene 5 domini “tipo immunoglobulina”.
From Current Biology 4, 385 (1994)
Le tirosine autofosforilabile sono 7. Non sono equivalenti tra loro, ai fini dell’interazione con i
domini SH2 delle varie proteine che ad essi si legano. Infatti sono giustamente indicati con segni
convenzionali diversi tra loro. Ricordiamo che sono i 3 AA che immediatamente seguono la tirosina
a conferire specificità per il tipo di SH2 e quindi per la proteina che ad essi si lega. Sono indicate le
proteine: p60-src; PI3K; Ras-GAP (proteina che aumenta la capacità di idrolizzare il GTP della
proteina-G p21-Ras); la fosfolipasi-C di tipo γ (la sua attivazione è descritta in dettaglio a pag.232).
202

Per quanto riguarda l’interazione PI3K e PDGFR, si può osservare che le tirosine autofosforilabili
implicate sono:
- Tyr 740, inserita nella sequenza YMDM
- Tyr 751, inserita nella sequenza YVPM.
Nel paragrafo seguente vedremo meglio i domini di tipo SH2 ed SH3.
Possiamo ricostruire la catena di eventi che porta all’attivazione della PI3K:
Fattore di crescita piastrinico Recettore per il PDGF
⇓
complesso PDGF-dimero del recettore
⇓
autofosforilazione delle tirosine
⇓
legame della PI3K (ed altre proteine)
a specifiche tirosine fosforilate tramite
il dominio (o i domini) SH2
⇓
attivazione della PI3K
Sull’importanza della PI3K abbiamo un preciso riscontro con il virus a DNA del Polioma, che è
molto simile all’SV 40 (vedi prima struttura c-Src; pag.211). Questi sono virus oncogeni a DNA.
La trascrizione avviene in corrispondenza di
un’origine (ori) e procede in senso antiorario e
orario nello schema a lato. È prodotto, per
splicing alternativo, un mRNA per antigene Tpiccolo,
T-medio e T-grande. In senso orario
sono trascritti i geni per proteine virali (VP), ma
ciò avviene tardivamente.
(T = tumorali)
La proteina T-media (PM 58000 Da) forma un
complesso 1:1 con proteine di tipo src, attivando
generalmente la capacità tirosin-cinasica di
queste. Le T-media fosforilate si associano, via
SH2 (di p85 della PI3K), con PI3K. La T-media
impedisce la fosforilazione di Tyr 527 di src.
È stato dimostrato che tutte le mutazioni del Tmedio
che annullano l’interazione con PI3K
sono accompagnate da scomparsa dell’azione
trasformante del polioma in cellule 3T3
(fibroblasti) in coltura.
Le linee nello schema indicano le parti
dell’mRNA tradotte.
T-piccolo inibisce la defosforilazione di MEK da parte di Proteina Fosfatasi 2A (PP2A); vedi
pag.159.
203

1) T medio forma un
complesso 1:1 con
proteine src, attivando
l’attività tirosin cinasica di
pp60. E’ promossa la
defosforilazione di Tyr-
527 e, quindi, l’attivazione
di src.
2) Quando T medio è
fosforilato su Tyr-315 si
associa con PI3K.
3) Tutte le mutazioni del T
medio che annullano
interazioni con PI3K =
polioma non trasformante.
4) T medio si associa a csrc
(che possiede Tyr-
527) attivandola, ma non
a v-src, che non ha Tyr-
527.
204

Correlazioni tra la Leucemia Acuta Trasformante (AKT) e la Proteina Cinasi B
[TIBS 22(261)pag. 355, sett. 1997- TIBS 22(259)pag.267, luglio 1997]
L’enzima PI3-Cinasi è responsabile dell’attività di altri enzimi. Tra questi è importante una nuova
Proteina Cinasi, denominata Proteina Cinasi B (PKB), che pertanto andrà aggiunta al nutrito
numero di proteine cinasi che sono già state descritte. Tale PKB è una Serin/Treonin Cinasi.
In breve è stato dimostrato che il Fosfatil Inositolo 3,4,5 tris-fosfato (PIP3) “arruola” su membrana
la PKB, che per essere completamente attiva richiede anche alcune fosforilazioni su se stessa da
parte di altre proteine cinasi (vedi oltre , sono le PDK1 e PDK2, ovvero P-inositol Dipendent
Kinase). La PKB attiva determina la fosforilazione di una serie di substrati (vedi più avanti) che
generano una risposta complessiva di tipo anabolico, tipo quella scatenata dall’insulina; infatti per
tale PKB è stato ipotizzato un ruolo importante nel processo a cascata generato dall’insulina
stessa. E’ molto interessante, inoltre, che si ottenga anche una risposta di soppressione
dell’apoptosi, che sotto il profilo logico è del tutto congruente. Ovvero, se in una cellula è promosso
un processo di sviluppo (più in generale anabolico), è doveroso che contemporaneamente sia
annullato il processo di morte cellulare programmata, perché assolutamente incompatibili.
Tale PKB è stata individuata grazie all’attività enzimatica codificata dall’RNA di un virus (di tipo
retrovirus come moltri altri virus oncogeni, primo fra tutti il virus del sarcoma di Rous che codifica
per v-src). Tale virus è denominato AKT (AKute Trasforming), identificato nei linfomi di cellule T in
roditori. Il gene trasmesso dal virus codifica per una proteina, la cui controparte cellulare fu presto
identificata nell’uomo: si tratta della PKB.
Proprietà della Proteina Cinasi B
Le proprietà funzionali sono leggibili attraverso la struttura modulare della PKB stessa. Nell’uomo
sono state descritte 3 PKB (PKB-α, PKB-β1 e PKB-β2). Ci riferiamo, per semplicità alla PKB-α
umana. Le altre presentano, comunque, un’elevata omologia di sequenza.
1) La PKB-α presenta, all’Nterminale
(dall’amminoacido 1 al
106), un dominio di tipo
Plekstrina, denominato PH
(Pleckstrin-Homology).
Thr 308 Ser473
PH Dominio cinasico Coda
1 106 148 412 480
I domini PH sono riscontrabili in molte altre proteine. La plekstrina è una proteina, contenente tali
domini PH, che è il principale substrato della fosforilazione della PKC nelle piastrine (vedi
pag.107). Il ruolo di tali domini non era ben definito. In generale, per essi è stato ipotizzato un ruolo
di zip-code, cioè un dominio che indirizza la proteina che lo contiene verso determinati bersagli. Gli
stessi SH2 ed SH3 sono, di fatto, dei zip-code (tipici domini zip-code sono quelli che indirizzano
alcune PTP-Protein Tirosin-Phosphatases- vedi pag.167).
I domini PH sono assai diffusi tra le GEP, cioè le proteine che attivano le G-protein di tipo Ras
(SOS è una GEP). Recentemente sono state identificate una intera famiglia di GEP, che
contengono tutte un dominio PH (si tratta della Dbl-Diffuse B cell Limphoma, che sono le GEP di
Rho; quest’ultima appartiene alla superfamiglia delle proteina Ras). S’ipotizzava che tali PH
indirizzassero le proteine che li contengono verso determinati elementi presenti sulla membrana.
Con la scoperta della PKB tale ipotesi è stata verificata.
⇒ Infatti il dominio PH della PKB indirizza la PKB stessa verso il Fosfatidil-
Inositolo 3,4,5-tris fosfato (PIP3)
Questo processo è di fondamentale importanza, anche per comprendere il ruolo della PI3-cinasi
stessa. Infatti la PI3K produce un composto, il PIP3, per il quale non era stato identificato un
enzima che lo elabora, come per esempio avviene per il PIP2 (infatti la fosfolipasi C idrolizza il
PIP2, con produzione di digliceride ed IP3). La funzione della PI3K è quella di produrre il PIP3 che,
in quanto tale, attira la PKB. Infatti il processo è transiente, perché esiste una PIP3-fosfatasi, che
rimuove il fosfato dalla posizione 5, annullando il possibile “arruolamento” della PKB. Infatti il
prodotto di defosforilazione in posizione 5 del PIP3 non arruola la PKB attraverso il dominio PH.
205
⇐

2) In posizione centrale la PKB presenta il “classico” dominio proteina-cinasico, omologo a quello
di altre proteine cinasi, con struttura riconducibile a quella illustrata a pag.91.
Per presentare completa attività occorre anche che la Treonina-308 sia fosforilata. E’ stato
ipotizzato che tale fosforilazione avvenga ad opera di una P-inositol Dipendent Kinase, cioè una
proteina cinasi che è attivata dal Fosfatidil-Inositolo 3,4-bis-fosfato.
3) Nella parte C-terminale esiste una cosidetta “tail” (coda) dove una serina 473 deve essere
fosforilata da una PDK2.
La seguente figura (riprodotta da TIBS sett.’97 pag.357) riassume questi processi.
206

Processi up-stream alla PKB:
(fare riferimento allo schema della pagina precedente).
Un fattore di crescita, per esempio l’insulina, si lega al suo recettore. Si ha autofosforilazione di
alcune tirosine, che richiamano la subunità regolatoria (p85) della PI3Kinase attraverso i domini
SH2. La p85 tiene a sé legata anche la subunità catalitica della PI3K, ovvero la p110. (Per
l’attivazione della PI3K è possibile anche seguire la via che coinvolge Ras- vedi pag.216).
Comunque sia, via recettore per fattore di crescita, o via Ras, si ottiene l’attivazione della
PI3Kinase, che sintetizza PtdIns (3,4,5) P3; quest’ultimo composto richiama sulla membrana la
proteina PKB.
Con l’azione accessoria delle PDK1 e PDK2 si ottiene anche la fosforilazione della Treonina-308 e
della Serina-473, con piena attività della PKB.
Processi down-stream alla PKB:
Il seguito di questo processo a cascata è decifrabile attraverso l’individuazione dei substrati della
PKB stessa.
Come osservazione di carattere generale, ricordiamo che la PKB è una Serin-Treonin cinasi. E’
stata definita la sua sequenza consenso di fosforilazione:
sito di fosforilazione
↓
- Arg- x -Arg- y - z -S/T - h - y -
La Serina, o treonina, fosforilabile da PKB è preceduta dai 2 residui fortemente basici di Arginina,
dove x può essere qualsiasi amminoacido, y e z devono essere amminoacidi di basso ingombro
(per esempio glicina) ed h-y rappresenta un nucleo idrofobico.
→ Ricercando sulla banca dati i possibili substrati della PKB, è stata individuata la Glicogeno
Sintasi Cinasi 3 (GSK3), che nella forma fosforilata è meno attiva, e quindi fosforila meno
intensamente la Glicogeno Sintasi, che esisterà più facilmente in forma de-fosforilata, cioè attiva.
(Questa GSK3 è stata scoperta recentemente, e si pensava che la GS fosse direttamente
substrato della PKA. Possono essere operativi ambedue i fenomeni. Comunque la GS può essere
fosforilata, e disattivata, in una molteplicità di modi, diversamente dalla Glicogeno Fosforilasi, che
è fosforilata, e quindi attivata, solo sulla Serina-14).
→ La PKB fosforila, e attiva, la S6cinasi (S6K), ovvero la proteina cinasi specifica per le subunità
S-6 dei ribosomi, con incremento dalla sintesi proteica.
→ La PKB rende attivo E2F, regolando il ciclo cellulare. Si ricorderà che il fattore di trascrizione
E2F è di norma legato alla proteina retinoblastoma (Rb), risultando da questa bloccato. Quando
Rb è fosforilata, si ha rilascio di E2F (vedi pag.137). E’ stato ipotizzato che PKB fosforili Rb.
E’ stato dimostrato che l’attivazione di PKB determina un blocco dell’apoptosi. Infatti cellule
esposte a raggi UV e contemporaneamente attivate in PKB non entrano in apoptosi.
Da ultimo (vedi figura di pagina precedente), stress cellulari di varia natura attivano una particolare
proteina cinasi attivata da MAPK (MAPKAP2) che fosforila la Ser 473, contribuendo ad attivare la
PKB.
207

Proteine con attività Tirosin Cinasica non recettoriali
Esistono numerose proteine con attività tirosin cinasica non legata a recettori (cioè non-RTK). Le
più note sono le Src-PTK (vedi paragrafo seguente). Ma ne esistono altre. La struttura di alcune di
queste è illustrata nella figura seguente, tratta da Thomas & Brugge, Ann. Rev. of Cell and
Developmental Biology, 13, 515, 1997):
La Csk è una PTK cellulare che ha una struttura assi simile alla Src, mancante però
dell’ancoraggio alla membrana plasmatica (infatti non presenta il dominio SH4), pur presentando
una struttura assai simile a quella della Src (a partire dall’N-terminale esiste, infatti, un dominio SH-
3, un dominio SH-2 ed il dominio proteina-tirosin-cinasico). Csk deriva da Cellular src kinase, e
tale denominazione riflette molto bene la sua reale funzione. Infatti fosforila la tirosina 527 della
stessa Src (rendendola non-attiva, vedi alla pagina seguente il meccanismo molecolare di tale
inibizione). Tale enzima si rende necessario anche perché la stessa Src non è in grado di
autofosforilarsi sulla tirosina 527. La Csk è, d’altronde, versatile per questo ruolo (fosforilazione di
un’altra PTK), in quanto non contiene una tirosina equivalente alla tirosina-527 della Src.
La Tec è una PTK non associata a recettori che presenta forti omologie strutturali con Csk, con
qualche dominio accessorio in più. Infatti, come Csk (vedi figura sopra) ha i domini SH3, SH2 e il
catalitico con, in più all’N-terminale, un dominio PH (Plekstrin Homology, vedi pag.205). Quindi ha
qualche analogia con la PKB, solo che PKB è una S/T cinasi, mentre Tec è una Tirosin cinasi.
Le Syk/ZAP possono essere substrati della stessa Src. Il dominio catalitico è preceduto da due
domini SH2. Syk e ZAP sono due proteine distinte, anche se altamente omologhe. Syk è attivata
da opportune lectine sia in piastrine che in cellule B, mentre ZAP svolge un ruolo critico
nell’attivazione delle cellule T.
Fak (Focal adesion kinase) è una PTK non associata a recettori che è fosforilata ed attivata in
seguito all’associazione a molte integrine. Infatti, all’N-terminale, possiede l’importante dominio di
legame alle integrine. Possiede poi altri domini accessori al C-terminale che controllano il legame
alle placche di adesione, in particolare alla proteina talina in esse presente.
208

Proteine cinasi della famiglia Src (da S.A. Courtneidge, “Protein Kinase”, pag.213)
L’importante proteina tirosin-cinasi Src appartiene ad una famiglia che comprende numerose altre
proteine: si tratta della Famiglia della Src-cinasi (Src-PTK). Nella Tabella seguente sono elencate
le principali Src-PTK:
Src è riportata per prima; può essere considerata Src-PTK prototipo. Contiene anche un dominio
SH4 (all’N-terminale), che governa la reazione di miristoilazione, dove la glicina in posizione 2 è
essenziale.
La proteina Yes deriva dai virus Y73 che genera il sarcoma di Esh (Yes = Y73 and Esh sarcoma).
Le proteine della famiglia Src sono assai distribuite (Xenopus, Drosophila, Hydra, spugne, ecc.).
Non si trovano nel lievito, per cui si pensa che siano associate ad organismi pluricellulari.
Struttura terziaria della proteina Src [da Current Biology 7 (5) R295 (1997)]
E’ stata definita in dettaglio la struttura terziaria della proteina c-Src. Nella parte destra della figura
della pagina seguente è riconoscibile il noto dominio bi-lobato della Proteine Cinasi (vedi pag.87).
E’ evidenziato l’Activation segment, che corrisponde alla nota ansa catalitica con l’importante
Treonina-197 (riferita alla PKA) che, di norma, deve essere fosforilata per consentire l’accesso al
peptide substrato. Infatti una importante Src-PTK (la Lck) è fosforilata proprio in tale posizione per
essere attivata. L’elica C contiene il Glutammico-91 (numerazione riferita alla PKA).
La Y527, se fosforilata, s’innesta nella fessura presente nel dominio SH2, e la Src risulta
quiescente (non attiva), come è già stato esposto a pag.117. Ne deriva che il dominio SH2
accoglie il “retro” del dominio catalitico.
Anche il dominio SH3 si lega al segmento proteico che unisce l’SH2 al dominio catalitico. Infatti
tale segmento, che contiene uno o due residui di proline, forma un’elica sinistrorsa (è possibile
constatarlo mediante attenta osservazione della figura) di tipo PP-II. Vedremo che i domini SH3 di
alcune proteine presentano tale proprietà, ovvero di legare eliche sinistrorse contenenti prolina
presenti in altre proteine. Qui, in Src, l’interazione è realizzata nell’ambito della stessa
macromolecola.
L’interazione della ”coda” C-terminale contenente Y527-fosforilata con SH2 è di natura debole.
Altre interazioni SH2 con tirosine fosforlate sono, al contrario, ben più intense.
Anche l’interazione SH3 ⎯→ elica PP-2 è di natura debole. Al riguardo è interessante che nel
cosiddetto RT loop del dominio SH3 di Src-virale esistono delle sostituzioni amminoacidiche, che
indeboliscono tale interazione e rendono la proteina v-Src più attiva della controparte protooncogenica.
Quindi la proteina v-Src è doppiamente indebolita nelle sue funzioni quiescenti:
1. manca della Tirosina 527
2. ha il loop RT del dominio SH3 modificato, con conseguente minor attrazione per la parte
catalitica.
209

Quindi la struttura di Src-quiescente è stata paragonata a quella di un armadillo arrotolato su sé
stesso. In tale conformazione la C helix, che contiene il glutammico-91, è esposta al solvente e
non può interagire con la lisina-72, che trasferirebbe il fosfato dell’ATP sulla proteina substrato. E’
interessante che un cambio analogo di orientazione dell’elica C è realizzato nel processo di
attivazione della Cdk2 per legame alla ciclina.
210

Domini SH2 e SH3
Sono domini con funzione caratteristica presenti nel prodotto di espressione dell’oncogene src,
cioè nella proteina pp60 src , dotata di attività tirosin-cinasica (vedi pag.72 e pag.110-113). Sono
denominati SH perché Src Homology. Esistono domini di tipo:
⇒ SH1
Ne è presente soltanto uno, verso il C-terminale della
60-Src, e possiede attività tirosin-cinasica. È seguito
dalla caratteristica Tyr-527, autofosforilabile =
inibizione dell’attività tirosin-cinasica. (classificazione
H.Q.H.; vedi pag.83, etc.).
⇒ SH2
È formato da circa 110 residui ed è presente in una
copia nella 60-Src. Tali domini sono presenti nella
zona centrale della 60-Src. Possiedono l’importante
proprietà di riconoscere tirosine fosforilate presenti in
proteine (vedi pag.117), anche nella Src stessa.
Infatti, nella forma “quiescente”, la Src è fosforilata in
Tyr-527, che porta all’associazione di tale Tyr con
l’SH2 della stessa Src, con ripiegamento su se stessa
della catena polipeptidica e scomparsa dell’attività
tirosin cinasica. La Src virale non possiede tale tyr-
527 e manca di tale meccanismo autoinibitorio. I
domini SH2 sono largamente distribuiti tra proteine: la
PI3K ne contiene 2. Anche la PLC-γ ne contiene 2.
Grb-2, un’importante proteina “adattatrice”, ne
contiene uno solo (ma contiene 2 domini SH3).
Un dominio SH2 è specifico per determinate tirosine
fosforilate. Come si è detto, il legame avviene in base
ai tre AA che seguono la tirosina fosforilata.
2 domini SH2 sono presenti nella Protein Tirosin
Fosfatasi PTP 1C (vedi pag.163). In tale caso la
fosfatasi è “pilotata” sui suoi substrati da tali domini
SH2.
⇒ SH3
Formato in media da circa 60 AA, è presente nella
porzione N-terminale della 60-Src. Ciascun SH3 ha
affinità per tratti ricchi di prolina di altre proteine (vedi
più avanti).
Vedremo in dettaglio gli SH3 presenti nella subunità 85-α della PI3K, nella spettrina e nella
proteina Src. La proteina c-Abl (è una tirosin cinasi ed è trasmessa, nella forma virale, dal virus
della leucemia murina di Abelson; vedi pag.113) è associata con filamenti di actina e la delezione
in suoi domini SH3 elimina l’associazione ai filamenti di actina e determina trasformazione
cellulare. In generale si ritiene che i domini SH3 consentano il legame al citoscheletro. Tuttavia
hanno una funzione più ampia.
All’N-terminale la Src è miristoilata (vedi pagg.23-24) per poter essere ancorata alla membrana
plasmatica.
Nell’importante “proteina adattatrice” Grb-2 (vedi più avanti) sono contenuti 2 domini SH3 (quindi
la Grb-2 possiede 1 dominio SH2 e 2 domini SH3).
In conclusione, nella proteina Src troviamo l’SH1, che conferisce alla Src la proprietà di fosforilate
le tirosine di vari substrati.
211

L’SH3 potrebbe essere inteso come dominio di posizionamento, perché può “pilotare” la Src
stessa sul citoscheletro, e l’SH2 garantisce l’inibizione dell’attività tirosin cinasica della stessa Src,
ma anche l’interazione con altre proteine perché si associa a tirosine fosforilate.
Circa i domini SH2 (che, ripetiamo, sono largamente distribuiti tra le proteine implicate nel
metabolismo regolatorio), occorre sottolineare che consentono di spiegare la finalità del processo
multiplo di autofosforilazione dei recettori per fattori di crescita (per esempio PDGFR ed EGFR;
vedi pag.117, etc.), processo che era rimasto enigmatico sino alla scoperta degli SH2.
È interessante che diverse proteine implicate nel metabolismo regolatorio contengono sia domini
SH2 che SH3 (per esempio PI3K e Grb-2), per cui può potenzialmente stabilirsi una rete
estremamente complessa di interazioni multiple (vedremo alcuni esempi che sono stati
completamente ricostruiti).
Proprietà strutturali dei domini SH2
La costante di dissociazione tra SH2 e peptidi sintetici formati da soli 5 AA con tirosina fosforilata
e opportune sequenze verso il C-terminale è dell’ordine del nanomolare: si tratta quindi di
interazioni molto forti.
Waksman e coll. (Nature, 358, 646, 1992) hanno risolto ai raggi-X la struttura di un SH2 di v-src
complessato a peptidi con tirosina fosforilata. Al di là dei dettagli strutturali, occorre rilevare che:
- L’N- ed il C-terminale di tale dominio sono spazialmente contigui (questo avviene anche negli
SH3). Pertanto tale dominio è, a tutti gli effetti, un modulo, perché è teoricamente inseribile in
qualsiasi proteina senza scompaginare eccessivamente la sua struttura e senza diminuire la sua
capacità di ripiegarsi nella struttura solita funzionale.
Qui sopra è riportato lo schema della struttura. I rettangoli indicano α-eliche e le frecce indicano
strutture β. Si può osservare che l’AA N-terminale 144 ed il C-terminale 249 sono contigui e
partecipano ad una β struttura. Il foglio A indica 4 tratti a struttura β, con le catene 2, 3 e 4
antiparallele. Il C-terminale del tratto 4 partecipa alla formazione del foglio B, dove esistono anche i
due tratti antiparalleli 5 e 6. Quindi parte del 4, il 5 ed il 6 sono su di un piano (foglio B). I due piani
A e B hanno quindi in comune l’asse 4. Esistono poi due α-eliche ai lati. Grosso modo l’intera
struttura è “a calice”, con le due α-eliche ai lati, ed al centro c’è la “tasca”, dove avviene
l’interazione con la fosfo-tirosina, mentre parte dei filamenti β 4, 5 e 6 legano gli AA generalmente
idrofobici collocati nel fosfo-tirosin peptide a valle della tirosina fosforilata. Tre amminoacidi basici
interagiscono con il residuo nettamente acido del fosfato: sono l’Arg-155 (sull’α-elica 1), l’Arg-175
(sul filamento β numero 2) e la Lys-203 (sul filamento β numero 4).
Waksman e coll. hanno confrontato le sequenze di 30 domini SH2, individuati in 30 diverse
proteine. Se tali sequenze vengono allineate si può constatare che i residui che legano
fosfotirosina sono invarianti, mentre esiste un gruppo di amminoacidi che formano una seconda
zona dove alloggiano gli AA del fosfo-tirosin peptide che sono in posizione +1 e +3, mentre in
posizione zero compare la fosfotirosina.
212

Si tratta del filamento 4, 5 e 6 dove (vedi area qui sottotratteggiata) esiste alta varianza
amminoacidica. Ciò è in linea con la necessità che diversi domini SH2 riconoscano specifiche (e
quindi diverse tra loro) sequenze “a valle” della fosfo-tirosina.
Studi cristallografici hanno dimostrato che, per esempio, Y (P) – M – D – M (AA n° 0 +1 +2 +3)
lega la struttura SH2 della PI3K.
Struttura e funzione dei domini SH3
Anche la struttura dei domini SH3 è stata risolta completamente (vedi Morton & Campbell, Curr.
Biology, 1994, 615).
Quale controparte riconoscono i domini SH3? È stato accertato che individuano i cosiddetti “peptidi
ricchi in prolina” presenti in altre proteine. Una di queste proteine, con i domini ricchi in prolina, è la
Sos (Son of Sevenless), identificata inizialmente con uno screen genetico nella Drosophila. La
proteina Sos ha due domini ricchi in prolina che si legano a due domini SH3 presenti nella proteina
adattatrice Grb-2. La Sos ha la proprietà di legarsi alla proteina-G p21-Ras, attivandola, cioè
incrementando lo scambio tra GDP (uscente dalla Ras) e GTP (entrante nella Ras). La Sos è una
GEP (GTP Exchange Protein) o GEF (GTP Exchange Factor).
Un peptide sintetico che è stato usato negli studi di legame con domini SH3 è qui riportato:
peptide sintetico R K L P P R P S K
Si è visto che il tratto ricco in prolina forma un’elica sinistrorsa, che s’inserisce perfettamente in
una “nicchia” formata dalla catena polipeptidica del dominio SH3. Sono qui di seguito riportati gli
schemi delle strutture di tre domini SH3 presenti nelle tre proteine p85-α (subunità regolatoria della
PI3K), spettrina e la proteina Src. Si può rilevare la stretta somiglianza delle tre strutture: un
“foglio” con due catene β antiparallele (c, d e anche b, spezzata, in spettrina e Src) ed un foglio,
inferiore nell’illustrazione, contenente tre catene β antiparallele (e, a, b).
Anche per i domini SH3 (come per gli SH2) si riscontra la contiguità del C-terminale e dell’Nterminale,
indicando che i domini SH3 sono moduli strutturali indipendenti, che possono
virtualmente essere inseriti in qualsiasi localizzazione in una proteina.
Il dominio SH3 si dispone con una struttura “a calice”, che lega, al centro, il dominio ricco in prolina
ed anche nell’SH3 esiste una varianza in certe zone, il che potrebbe spiegare una specificità di
interazione tra singoli SH3 e singoli domini ricchi in prolina. Ritorneremo sulla funzione biologica di
tali domini.
213

Un dominio SH3 è formato, in media, da circa 60 AA.
Increspatura di cellule endoteliali e PDGF
È stato dimostrato il diretto coinvolgimento della PI3 cinasi nel cambiamento di cellule endoteliali di
aorta di maiale, siglate PAE (Porcine Aortic Endothelial). Sotto stimolo da PDGF tali cellule danno
un significativo “ruffling” (increspatura) ben evidenziabile al microscopio, se le cellule sono trattate
con falloidina fluorescente, che visualizza i filamenti di actina. Infatti con PDGF si osserva nelle
cellule la comparsa di ruffling insieme ad una disarticolazione dei filamenti di actina. Continua a
restare enigmatico l’ipotetico ruolo del PIP3 sintetizzato dalla PI3K, ma gli effetti dell’”arruolamento”
da parte del recettore della PI3K sono ben documentati.
Wennstrom & Coll. (Current Biology, 4, 385, 1994) hanno condotto una serie di importanti
osservazioni, che possiamo commentare riferendoci direttamente ai principali risultati dei loro
esperimenti:
Materiale estratto con anticorpo anti PDGFR ed
esposte ad ATP-γ- 32 P
Materiale estratto con anticorpo anti p85-α
Materiale estratto con anticorpo anti p110
In (a) è illustrato il tracciato di membrane di cellule PAE trattate senza (-) e con (+) PDGF, che
hanno subito i seguenti trattamenti: dopo una breve incubazione con anticorpo anti recettore per
PDGF è stato estratto il recettore (con proteine eventualmente ad esso attaccate) ed è stato
esposto ad ATP-γ- 32 P, che marcava le tirosine autofosforilate.
214

Poi è stata eseguita l’elettroforesi su cellule Wild Type (WT), oppure WT + wortmannina (un
inibitore specifico della PI3K, estratto dal Penicillum fumiculosum), oppure cellule
bioingegnerizzate, il cui recettore per il PDGF aveva l’amminoacido fenilalanina al posto di tirosina
nelle posizioni 740 e 751 (Y740/751F; vedi pag.202). Inoltre, nello stesso modo sono state anche
trattate delle cellule WT che esprimevano transitoriamente un forte arricchimento in p85 (WT ∆
p85).
Si può osservare che sempre l’autofosforilazione è scatenata dalla presenza del PDGF (in
coincidenza con il Peso Molecolare 200 KDa). Le cellule Y740/751F non danno, in pratica,
autofosforilazione, mentre è ben evidente che, quando c’è arricchimento della p85, si ottiene
anche la sua fosforilazione.Si può inoltre osservare che (in aggiunta di wortmannina, inibitore della
PI3K), non si altera il quadro.
In (b) è illustrato che si ha fosforilazione della p85 perché è stata estratta specificamente tale
proteina con antisiero diretto contro di essa.
In (c) è illustrato che, con antisiero anti p110, si vede anche la subunità 110, che è la subunità
catalitica della PI3K.
Particolarmente interessanti sono i risultati in (b) e (c), dove le Wild Type danno la fosforilazione
della p110 e p85. Ma le cellule Y740/751F non fosforilano nessuna delle due. Quindi è sufficiente
non avere le due tirosine autofosforilate che specificamente “arruolano” la p85 della PI3K (vedi
pag.202), che viene meno l’adesione della PI3K e la conseguente sua fosforilazione.in questo
caso la fosforilazione probabilmente non ha effetti specifici apparenti sull’attività della PI3K: è una
conseguenza dell’associazione al recettore.
Nell’istogramma riportato a lato, sono
illustrati i risultati ottenuti (espressi come
PIP3 prodotto) con le stesse cellule già
utilizzate per le prove analizzate in
elettroforesi. Nelle cellule Wild Type (WT) è
evidente il forte aumento di PIP3 prodotto,
e la sua produzione è completamente
bloccata dalla wortmannina.
Si può inoltre constatare che, nelle cellule
Y740/751F, la produzione di PIP3 è già a
buoni livelli e non risente dello stimolo da
PDGF, anche se resta a livelli più bassi
delle cellule Wild Type. Quindi p85 e p110
sono arruolate e fosforilate (vedi (b) e (c),
pag.214) e questi processi non sono inibiti
da wortmannina, che inibisce, invece, la
produzione di PIP3.
215

Con questa premessa, da alcuni autori, è stata ipotizzata una via complementare di stimolazione
della PI3K, anche se quella legata alla traslocazione sul recettore autofosforilata sembra la
predominante. Il seguente schema è tratto da Kodkai & coll. (Current Biology, 4, 798, 1994):
Il recettore per il fattore di crescita ha tirosine autofosforilata che legano specificamente il dominio
SH2 della proteina “adattatrice” Grb-2, che, a sua volta, lega con due domini SH3 altrettanti domini
ricchi in prolina di un’altra proteina adattatrice Sos che, come è stato ampiamente documentato,
incrementa l’incorporazione di GTP dalla p21-Ras (una proteina G-monomerica), venendo da
questa attivata. La Ras “attivata” attiva, a sua volta, la subunità catalitica (p110) della PI3 cinasi.
Questa capacità da parte della p21-Ras di attivare direttamente la PI3K è stata dimostrata
recentemente. Anche la proteina Rac sembrerebbe coinvolta in tale processo (Rac e Rho sono
due proteine simili alla Ras, implicate nella riorganizzazione del citoscheletro).
In tale schema è riportata, nella parte destra, anche la via di attivazione della MAP-cinasi (vedi
pag.151).
Quindi da uno stesso recettore esistono due vie indipendenti e convergenti sulla PI3K (riportate
ambedue nella parte sinistra della figura).
Che esista un collegamento tra la PI3 cinasi e la Rac è anche supportato dalla ricerca di omologie
di sequenze alla banca dati: infatti la p85 contiene un dominio simile a quello delle “proteine
attivanti l’attività GTP-asica” di Rac e Rho. Come esiste la proteina GAP (proteina attivante
l’attività GTP-asica della Ras), così esistono specifiche proteine attivanti l’attività GTP-asica di altre
proteine-G appartenenti alla famiglia Ras (come le Rac e le Rho). È utile ricordare che la GAP, di
fatto, inattiva la Ras, perché incrementa la velocità d’idrolisi del GTP legato, e, come è noto, se la
Ras lega GTP è attiva, mentre è inattiva quando lega GDP.
Rho (Ras Homology) e Rac appartengono alla subfamiglia Rho. Rho e Rac sono mediatori delle
funzioni delle integrine.
216

In questa pagina sono riportate le sequenze del lato N-terminale di 11 proteine che presentano
una discreta omologia di sequenza. La quinta proteina è la RACGAP, cioè la proteina attivante
l’attività GTP-asica della Rac; la P190 è una Rho-GAP; la 3BP1 è una proteina che lega i domini
SH3 dell’oncoproteina c-Abl.
La seconda proteina (INP5P) è l’importante inositol-polifosfato 5-fosfatasi; tale enzima rimuove con
meccanismo idrolitico il fosfato dalla posizione 5 di un inositolo polifosforilato (si presti attenzione
al fatto che il substrato è un inositolo polifosforilato e non un fosfolipide fosforilato dell’inositolo).
Tale enzima catalizza la tappa 2 di pag.200, che porta alla formazione dell’inositolo 1, 3, 4
trisfosfato diverso dal “classico” inositolo 1, 4, 5 trisfosfato, che, comunque, è pure esso
defosforilati in posizione 5 per dare l’inositolo 1, 4 bis-fosfato (vedi prima tappa di pag.197 in
basso). È un enzima che comunque rimuove inositidi polifosfati con funzione specifica(l’IP3
“classico” e il tetra-kis-fosfato, che presentano funzioni più conosciute di altri derivati dell’inositolo):
è quindi un enzima che rimuove un messaggio.
Per l’uomo è stata descritta la Sindrome Oculo Cerebro Renale di Lowe (OCRL, vedi prima riga
della figura), che è una malattia ereditaria legata alla mutazione di un gene che codifica una
proteina che ha una stretta omologia con la inositolpolifosfato-5-fosfatasi (INS5P, seconda riga
della figura). L’OCRL ha profondi effetti sul cristallino, sul cervello e sul rene, e si ritiene pertanto
che la proteina codificata dal gene mutato sia particolarmente importante in tali organi. L’omologia
di sequenza con la INP5P porta a ipotizzare a ragion veduta che proprio tale enzima, implicato nel
turnover dei fosfoinositidi, sia alterato nella OCRL.
In particolare, le omologie tra tutte le proteine della figura sono tra l’AA-50 e l’AA-147. Non è nota
la specifica funzione di tale dominio.
In conclusione, le omologie di sequenze rilevate tra INP5P (idrolisi di inositol-polifosfati), p85
(subunità regolatoria della PI3K) e proteine del tipo GAP sono un’importante indicazione che
proteine legate direttamente o indirettamente al ciclo dei fosfoinositidi sono tra esse
strutturalmente collegate e quindi, in qualche modo, una è derivata dall’altra nel corso
dell’evoluzione.
D’altra parte viene rinforzata l’ipotesi che la Ras, o altre proteine di tale famiglia, possano
interagire con la PI3K (vedi schema di pag.216).
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