Immunoistochimica e Biologia Molecolare - Università degli Studi di ...
Immunoistochimica e Biologia Molecolare - Università degli Studi di ...
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Tecniche <strong>di</strong> <strong>Immunoistochimica</strong> e<br />
<strong>Biologia</strong> <strong>Molecolare</strong><br />
applicate alla <strong>di</strong>agnostica<br />
istopatologica
<strong>Immunoistochimica</strong><br />
• Meto<strong>di</strong>che utilizzate per identificare<br />
costituenti cellulari e tissutali come<br />
antigeni in situ, utilizzando anticorpi<br />
• Le tecniche <strong>di</strong> IIC possono essere<br />
applicate su cellule isolate su preparati<br />
istologici e citologici
<strong>Immunoistochimica</strong><br />
Alcuni tumori possono essere<br />
<strong>di</strong>agnosticati con un semplice esame<br />
istologico, mentre altri per una<br />
corretta definizione richiedono l’ausilio<br />
<strong>di</strong> ulteriori indagini:<br />
• Istochimiche<br />
• Immunoistochimiche<br />
• <strong>Biologia</strong> molecolare
L’immunoistochimica<br />
al microscopio
<strong>Immunoistochimica</strong><br />
Il principio dell’IIC prevede<br />
il riconoscimento <strong>di</strong> un<br />
antigene me<strong>di</strong>ante l’utilizzo<br />
<strong>di</strong> un anticorpo specifico.
Antigene<br />
L’antigene è una molecola proteica,<br />
glicoproteica o lipoproteica capace <strong>di</strong> <strong>di</strong><br />
evocare una risposta immune da parte<br />
del sistema immunitario.<br />
Ogni antigene è costituito da uno o più<br />
siti antigenici. Disponendo dell’<br />
anticorpo specifico qualunque antigene<br />
può essere evidenziato me<strong>di</strong>ante<br />
reazioni <strong>di</strong> IIC.
DEFINIZIONE<br />
DI ANTIGENE<br />
Ogni singolo Ag è<br />
costituito da una o<br />
più porzioni<br />
chiamate epitopi o<br />
determinanti<br />
antigenici <strong>di</strong>fferenti<br />
tra loro<br />
ANTICORPO<br />
EPITOPO 1<br />
Ag<br />
EPITOPO 3<br />
EPITOPO 2
DEFINIZIONE DI ANTIGENE<br />
L’antigenicità <strong>di</strong> una molecola<br />
<strong>di</strong>pende dalla sua composizione<br />
e conformazione strutturale ed<br />
è mo<strong>di</strong>ficata da tutti i<br />
trattamenti fisici e chimici<br />
attuati durante la<br />
processazione dei campioni
Anticorpi<br />
Gli ac sono molecole proteiche (Ig) prodotte<br />
dalle plasmacellule in grado <strong>di</strong> legarsi ad un<br />
determinante antigenico. Possono essere:<br />
Monoclonali:costituiti da ac identici fra loro e <strong>di</strong>retti<br />
contro lo stesso determinante antigenico<br />
Policlonali: costituiti da anticorpi <strong>di</strong>versi fra loro e<br />
<strong>di</strong>retti contro <strong>di</strong>fferenti determinanti antigenici<br />
Ibri<strong>di</strong>: immunoglobuline mo<strong>di</strong>ficate in modo tale che<br />
ciascun frammento abbia specificità per un<br />
<strong>di</strong>fferente determinante antigenico
Struttura dell’anticorpo<br />
Frammento Fc<br />
porzione costante specie-specifica<br />
Frammento Fab<br />
porzione dell’ Ig in grado <strong>di</strong> legare l’Ag, è<br />
costituito da domini ipervariabili che<br />
consentono grande versatilità nel<br />
riconoscimento e nel legame con l’Ag<br />
(specificità e affinità)
STRUTTURA DI UN ANTICORPO
REAZIONE<br />
ANTIGENE-ANTICORPO<br />
Il complesso tra l’antigene e<br />
l’anticorpo che si forma nella<br />
reazione immune non è <strong>di</strong> per sé<br />
visibile. E’ necessario quin<strong>di</strong><br />
servirsi <strong>di</strong> marcatori che<br />
<strong>di</strong>rettamente o in<strong>di</strong>rettamente<br />
possano evidenziarne la<br />
formazione
Markers della reazione<br />
immunoistochimica<br />
Attualmente sono impiegati due<br />
<strong>di</strong>fferenti tipi <strong>di</strong> tracciante:<br />
• Fluorescente<br />
• Enzimatico
Tecniche Immunoistochimiche<br />
Tecniche <strong>di</strong> Immunofluorescenza<br />
utilizzano fluorocromi come<br />
marcatori della reazione antigene- antigeneanticorpo<br />
Tecniche Immunoenzimatiche<br />
utilizzano enzimi per evidenziare la<br />
reazione antigene-anticorpo
Tecniche <strong>di</strong> immunofluorescenza<br />
• Le sostanze fluorescenti<br />
maggiormente utilizzate sono:<br />
• Isotiocianato <strong>di</strong> fluoresceina<br />
• Tetrametil rodamina<br />
• Ficoeritrina<br />
• Cianina<br />
• Rosso Texas
Immunofluorescenza<br />
Carcinoma lobulare della mammella<br />
CK Fitc<br />
CK Rodamina
Meto<strong>di</strong> <strong>di</strong> indagine<br />
Immunofluorescenza<br />
Meto<strong>di</strong> in<strong>di</strong>retti<br />
Meto<strong>di</strong> <strong>di</strong>retti
Immunofluorescenza<br />
Metodo in<strong>di</strong>retto
Immunofluorescenza<br />
Metodo <strong>di</strong>retto
Metodo <strong>di</strong>retto<br />
Immunofluorescenza<br />
Doppia colorazione<br />
– Tessuto<br />
nervoso
Immunofluorescenza<br />
Limiti dell’immunofluorescenza<br />
-Scarsa possibilità <strong>di</strong> <strong>di</strong>luizione <strong>degli</strong> Ac<br />
-Mancanza <strong>di</strong> informazioni topografiche<br />
-Naturale estinzione della fluorescenza<br />
-Necessità <strong>di</strong> osservazione in microscopia<br />
particolare<br />
Non conservabilità dei preparati
Campi <strong>di</strong> applicazione<br />
dell’immunofluorescenza<br />
• Diagnostica nefropatologica<br />
• Diagnostica dermatologica<br />
• Indagini citoflussimetriche
Immunofluorescenza<br />
Nella <strong>di</strong>agnosi delle patologie renali l’IF<br />
<strong>di</strong>retta permette <strong>di</strong> identificare Ag e altri<br />
fattori presenti nelle strutture glomerulari.<br />
La evidenziazione <strong>di</strong> depositi <strong>di</strong><br />
immunocomplessi, <strong>di</strong> frazioni del<br />
complemento, <strong>di</strong> fibrinogeno e la loro<br />
<strong>di</strong>stribuzione a livello glomerulare è un<br />
fondamentale supporto nella <strong>di</strong>agnosi<br />
<strong>di</strong>fferenziale tra le varie glomerulonefriti.
Patologia renale<br />
Immunofluorescenza<br />
Glomerulonefrite granulare<br />
Pattern granulare<br />
IgG
Immunofluorescenza<br />
Patologia cutanea<br />
Depositi lineari anti anti-C3 C3<br />
Depositi lineari anti anti-IgG IgG
Immunofluorescenza<br />
Analisi Citofluorimetria<br />
Sospensione<br />
cellulare
Sezioni <strong>di</strong> 44-5<br />
5 µ al<br />
microtomo congelatore<br />
Asciugare le sezioni<br />
all’aria<br />
Fissare in acetone<br />
per 10’<br />
Immunofluorescenza<br />
Tessuto fresco<br />
Campionamento<br />
Congelamento rapido in azoto liquido<br />
Lavare con PBS Colorazione<br />
Conservazione a<br />
-80<br />
Sezioni non<br />
utilizzate
Congelamento<br />
Il congelamento permette <strong>di</strong> conferire al<br />
campione <strong>di</strong> tessuto una rigi<strong>di</strong>tà tale da<br />
consentire l’allestimento <strong>di</strong> sezioni sottili (2-<br />
5 µ) permette inoltre <strong>di</strong>:<br />
• Stabilizzare le strutture cellulari<br />
• Mantenere inalterate le<br />
caratteristiche <strong>di</strong> antigenicità del<br />
tessuto<br />
• Non interferire nella reazione Ag-Ac.
Congelamento<br />
La biopsia chirurgica viene inglobata in<br />
una particolare resina chiamata OCT<br />
che ha la proprietà:<br />
- Soli<strong>di</strong>ficare a basse temperature<br />
- Preservare il tessuto<br />
- Formare un supporto rigido<br />
necessario per il taglio delle sezioni.
Congelamento<br />
Il metodo maggiormente utilizzato è<br />
quello <strong>di</strong> immergere il tessuto per alcuni<br />
secon<strong>di</strong> in azoto liquido che essendo alla<br />
temperatura <strong>di</strong> –196°C consente un<br />
rapido congelamento senza provocare<br />
danni alla struttura antigenica e<br />
all’architettura morfologica
Tessuto fresco<br />
Campionare<br />
Congelare<br />
Tagliare al criostato<br />
Tecnica per If <strong>di</strong>retta<br />
Sezioni <strong>di</strong> 4 µ su vetrini con adesivo o polarizzati<br />
Asciugare le sezioni all’aria<br />
Fissare con acetone a 4°C<br />
Lavare con tampone<br />
Incubare con Ac primario fluorescinato 1 ora<br />
Lavare con tampone<br />
Montare con un sistema acquoso e conservare al buio<br />
Osservare al microscopio a fluorescenza
<strong>Immunoistochimica</strong><br />
tecniche e meto<strong>di</strong><br />
La tecnica Immunoenzimatica prevede<br />
l’uso <strong>di</strong> enzimi legati <strong>di</strong>rettamente o<br />
in<strong>di</strong>rettamente all’Ac I° per evidenziare<br />
la formazione del complesso immune.<br />
L’enzima catalizza la formazione <strong>di</strong> un<br />
precipitato colorato e insolubile visibile<br />
al microscopio, nel sito in cui è<br />
avvenuta la reazione Ag-Ac
EVIDENZIAZIONE DEL COMPLESSO IMMUNE<br />
A seconda del tracciante<br />
enzimatico:<br />
• IMMUNOPEROSSIDASI<br />
• IMMUNOFOSFATASI<br />
• IMMUNOGLUCOSIDASI<br />
• IMMUNOβ−GALATTOSIDASI
Perossidasi<br />
• E’ ottenuta dal rafano ma è<br />
presente anche nei tessuti umani<br />
• Può formare legami covalenti con<br />
le immunoglobuline<br />
• Suo substrato è il perossido <strong>di</strong><br />
idrogeno<br />
2 H2O2 2H2O+O2<br />
elemento ossidante per il cromogeno
Immunoperossidasi<br />
Il cromogeno più utilizzato è la DAB che<br />
da un prodotto <strong>di</strong> ossidazione insolubile e<br />
colorato in bruno.<br />
L’insolubilità e la stabilita del prodotto <strong>di</strong><br />
ossidazione della DAB consentono il<br />
montaggio e l’archiviazione dei preparati<br />
dei preparati secondo le tecniche <strong>di</strong><br />
routine.
Immunoperossidasi<br />
Altri substrati come ad es. l’ AEC<br />
fornisce un prodotto <strong>di</strong><br />
osssidazione rosso, è liposolubile e<br />
fotosensibile rendendo necessaria<br />
la conservazione al buio nonché la<br />
documentazione fotografica
I meto<strong>di</strong> immunoenzimatici possono<br />
essere:<br />
Diretti Diretti<br />
In<strong>di</strong>retti<br />
Meto<strong>di</strong> immunoenzimatici<br />
Il metodo <strong>di</strong>retto scarsamente sensibile<br />
non viene utilizzato nei laboratori <strong>di</strong><br />
Anatomia Patologica
Meto<strong>di</strong> Immunoenzimatici<br />
Il metodo in<strong>di</strong>retto:<br />
•E’ estremamente sensibile e ha il<br />
vantaggio che un solo anticorpo II°<br />
marcato può essere utilizzato per<br />
riconoscere <strong>di</strong>versi anticorpi I°<br />
appartenenti alla stessa specie.
Perossidasi<br />
La scelta del cromogeno si pone tra<br />
DAB - Cancerogena<br />
- Origina un precipitato marrone<br />
insolubile nei solventi organici<br />
AEC - Non cancerogeno<br />
- Origina un precipitato rossiccio<br />
solubile nei solventi organici
Fosfatasi alcalina<br />
• Si ottiene dall’intestino <strong>di</strong> bue<br />
• Substrati sono gli esteri fosforici<br />
alfa-naftilfosfato e naftolo AS-TR<br />
fosfato<br />
• Cromogeno è un sale <strong>di</strong> tetrazolio<br />
• Conferisce una colorazione rossa
<strong>Immunoistochimica</strong><br />
Tecniche e meto<strong>di</strong><br />
Enzima + substrato<br />
cromogeno<br />
Prodotto colorato
Meto<strong>di</strong> Immunoenzimatici<br />
Diretto Ac I° marcato<br />
Semplice e rapido<br />
In<strong>di</strong>retto Ac I° non marcato<br />
Ac II°
Storia dell’ dell’immunoistochimica<br />
immunoistochimica<br />
• 1941 Coons Coons:<br />
– Anticorpi marcati con fluoresceina per localizzare<br />
antigeni in sezioni <strong>di</strong> tessuto<br />
• 1966 Nakane Nakane:<br />
– Anticorpi marcati con enzimi<br />
• 1970 Sternberger<br />
Sternberger:<br />
– Perossidasi erossidasi-Anti nti Perossidasi erossidasi (PAP) PAP)<br />
• 1981 Hsu Hsu:<br />
– Avi<strong>di</strong>n vi<strong>di</strong>n Biotin iotin Complex omplex (ABC) ABC)<br />
• 1984 Cordell Cordell: :<br />
– Alkaline lkaline Phosphatase<br />
hosphatase Anti nti Alkaline lkaline Phosphatase<br />
hosphatase<br />
(APAAP) APAAP)<br />
• 1989 Bobrow Bobrow:<br />
– Catalysed Reporter Deposition (CARD CSA-TSA) CSA TSA)<br />
• 1993 Bisgaard<br />
– Polimeri del destrano
Perossidasi Anti Anti-Perossidasi<br />
Perossidasi<br />
Antigene<br />
Anticorpo primario<br />
Anticorpo secondario<br />
Enzima<br />
Complesso PAP
Meto<strong>di</strong> Immunoenzimatici<br />
Il sistema Avi<strong>di</strong>na Biotina (ABC) si<br />
basa sulla straor<strong>di</strong>naria affinità fra<br />
l’avi<strong>di</strong>na, una glicoproteina con p.m.<br />
68.000 D presente nell’albume d’uovo e<br />
la biotina piccola molecola vitaminica.<br />
In particolare la biotina si lega ai<br />
gruppi aminici -NH2 <strong>degli</strong> Ac e della<br />
Pr <strong>di</strong> modo che più molecole <strong>di</strong> biotina<br />
corrispondono a ciascuna molecola <strong>di</strong><br />
Ig
Metodo ABC<br />
LSAB<br />
Labelled Streptavi<strong>di</strong>n<br />
Biotin<br />
(Peroxidase)<br />
Press left mousebutton
• Antigene<br />
• Anticorpo primario<br />
• Anticorpo secondario<br />
biotinilato<br />
• Complesso ABC-Pr ABC Pr<br />
Metodo ABC
Sistemi avi<strong>di</strong>na avi<strong>di</strong>na-biotina biotina:<br />
vantaggi<br />
• Alta affinità dell’ dell’avi<strong>di</strong>na avi<strong>di</strong>na per la biotina<br />
• E’ possibile ottenere un elevato rapporto<br />
fluorocromo<br />
fluorocromo/enzima<br />
fluorocromo<br />
fluorocromo/enzima /enzima-proteina proteina<br />
• Elevata amplificazione<br />
• L’ L’avi<strong>di</strong>na avi<strong>di</strong>na coniugata è molto stabile<br />
• Un singolo coniugato marcato può essere<br />
utilizzato in molteplici meto<strong>di</strong>che<br />
• Basso costo
Sistemi avi<strong>di</strong>na avi<strong>di</strong>na-biotina biotina:<br />
svantaggi<br />
• Biotina endogena<br />
• Reazione con multipli passaggi
Polimeri del destrano<br />
Polymer Detection<br />
Press<br />
Press<br />
left<br />
left<br />
mousebutton<br />
mousebutton
Meto<strong>di</strong> Immunoenzimatici<br />
Polimeri del destrano<br />
Antigene<br />
Anticorpo primario<br />
Anticorpo secondariopolimero<br />
polimero-enzima enzima
Polimeri del destrano: destrano<br />
• Ottima sensibilità<br />
vantaggi<br />
• Nessuna interferenza legata alla biotina<br />
• Tempi <strong>di</strong> reazione ridotti
Catalyzed Signal Amplification
Catalyzed Signal Amplification<br />
•Tiramide Tiramide biotinilata<br />
•acqua acqua ossigenata
Catalyzed Signal Amplification
Catalyzed Signal Amplification
• Altissima sensibilità<br />
CARD: vantaggi<br />
• Aumenta la <strong>di</strong>luizione <strong>di</strong> anticorpi primari 05<br />
• Utilizzo <strong>di</strong> anticorpi non usualmente reattivi<br />
• Possibilità <strong>di</strong> utilizzo in svariate meto<strong>di</strong>che<br />
(ibridazione in situ, FISH, etc)<br />
• Numerosi apteni utilizzabili
Meto<strong>di</strong> Immunoenzimatici<br />
Doppie colorazioni<br />
Permettono <strong>di</strong> evidenziare<br />
contemporaneamente nella stessa<br />
cellula due o più antigeni <strong>di</strong>versi<br />
utilizzando <strong>di</strong>fferenti substrati<br />
cromogeni e <strong>di</strong>fferenti enzimi
Colorazioni doppie<br />
TCRBCL: CD20/CD54R0
Doppia colorazione
Inibizione <strong>di</strong> enzimi endogeni<br />
Applicando meto<strong>di</strong>che <strong>di</strong><br />
immunoistochimica enzimatica è<br />
necessario ricordare che alcuni enzimi<br />
utilizzati come traccianti possono<br />
essere presenti nel tessuto da<br />
analizzare, è necessario perciò inibire<br />
l’enzima endogeno senza danneggiare le<br />
proprietà antigeniche.
Trattamento del materiale istologico e<br />
citologico da sottoporre ad indagini <strong>di</strong> IIC<br />
Dall’effettuazione del prelievo bioptico<br />
o citologico al momento dell’esame<br />
microscopico dei preparati colorati con<br />
reazioni immunoistochimiche<br />
intervengono <strong>di</strong>versi fattori che<br />
possono influenzare i risultati e<br />
portare a false interpretazioni dei<br />
quadri patologici
Trattamento del materiale<br />
I campioni bioptici da sottoporre ad indagini<br />
<strong>di</strong> IIC vengono trattati secondo le normali<br />
procedure per l’allestimento delle sezioni<br />
per la <strong>di</strong>agnostica istomorfologica e cioè<br />
• Fissazione<br />
• Disidratazione e chiarificazione<br />
• Inclusione in paraffina<br />
• Taglio al microtomo
Fissazione<br />
Gli scopi principali della fissazione sono:<br />
• Preservare la morfologia cellulare e<br />
l’architettura tissutale<br />
• Permettere al campione <strong>di</strong> tollerare gli<br />
stress della processazione<br />
• Mantenere un buon grado <strong>di</strong> reattività per<br />
le colorazioni tra<strong>di</strong>zionali<br />
• Preservare l’integrità antigenica<br />
• Mantenere le molecole antigeniche nella<br />
loro posizione originale
Fissazione<br />
Tra i fissativi quello maggiormente<br />
impiegato è la formalina neutra<br />
tamponata (10%) (10%), (10%) (10%), , che permette il<br />
miglior compromesso tra stabilità,<br />
costo, preservazione <strong>di</strong> molti antigeni,<br />
buona morfologia.
Azione della formalina<br />
La fissazione con formalina<br />
determina legami crociati tra<br />
il liquido fissativo e gruppi<br />
attivi delle proteine, con<br />
mascheramento <strong>di</strong> molti siti<br />
antigenici.
Trattamento del materiale<br />
istologico<br />
•Azione della formalina sulle proteine del tessuto<br />
Proteina naturale<br />
Proteina denaturata<br />
Reticolazione
Trattamento del materiale istologico<br />
Azione della formalina sulle proteine<br />
del tessuto<br />
Prima della fissazione Dopo fissazione
Tempi e modalità <strong>di</strong> fissazione<br />
variabili preanalitiche<br />
• Primo obiettivo <strong>di</strong> standar<strong>di</strong>zzazione<br />
• Fissare imme<strong>di</strong>atamente il campione<br />
• Un Un ritardo ritardo determina determina degradazione<br />
degradazione<br />
proteolitica con <strong>di</strong>ffusione dell’antigene<br />
e ridotta o assente immunocolorazione<br />
• Evitare una fissazione prolungata<br />
• Tempi non superiori alle 24 ore<br />
• Con<strong>di</strong>zionano l’immunoreattività tissutale
Tempi e modalità <strong>di</strong> fissazione<br />
variabili preanalitiche<br />
Ritardo della fissazione<br />
Er
Procedure <strong>di</strong> ripristino dell’antigenicità<br />
I processi a cui sono sottoposti i tessuti o le<br />
cellule dal momento del prelievo<br />
all’effettuazione della reazione <strong>di</strong> IIC possono<br />
danneggiare l’antigenicità rendendo:<br />
• Inaccessibile l’Ag all’Ac<br />
• Mo<strong>di</strong>ficando parzialmente l’antigenicità<br />
• Mo<strong>di</strong>ficandola in modo irreversibile
Ripristino dell’antigenicità<br />
La reattività immunologica può<br />
essere ripristinata rompendo<br />
questi legami crociati o con un<br />
Enzimatico<br />
trattamento<br />
Alte temperature
Trattamento enzimatico<br />
Gli enzimi proteolitici rompono i legami<br />
aldei<strong>di</strong>ci rendendo i siti antigenici <strong>di</strong>sponibili<br />
per il relativo Ac. Quelli maggiormente<br />
utilizzati sono:<br />
• Pepsina<br />
• Proteasi XXIV<br />
• Tripsina<br />
• Proteinasi K
Trattamento enzimatico<br />
L’incubazione con uno <strong>di</strong> questi enzimi può<br />
avvenire a temperatura ambiente o a 37°C<br />
per un periodo <strong>di</strong> tempo variabile (5-30’) e<br />
<strong>di</strong>pende:<br />
• concentrazione<br />
• durata della fissazione<br />
• spessore della sezione<br />
• tipo <strong>di</strong> enzima
Ripristino dell’antigenicità<br />
A partire dagli anni 90 l’uso del<br />
calore ha largamente sostituito i<br />
meto<strong>di</strong> enzimatici. Le alte<br />
temperature sono in grado <strong>di</strong><br />
ristabilire l’originale struttura<br />
proteica dopo che questa è stata<br />
mo<strong>di</strong>ficata dalla fissazione in<br />
formalina
Meto<strong>di</strong> <strong>di</strong> recupero<br />
dell’antigenicità<br />
• Come effettuare lo smascheramento<br />
Recupero a caldo<br />
• Forno a microonde<br />
• Pentola a pressione<br />
• Bagno termostatato<br />
• Autoclave
Efficienza dei meto<strong>di</strong> <strong>di</strong><br />
recupero dell’ antigenicità<br />
Fattori che con<strong>di</strong>zionano lo smascheramento<br />
antigenico in mezzo liquido<br />
Tempo <strong>di</strong> riscaldamento<br />
T (°C) x t (min.)<br />
pH<br />
-Ag in<strong>di</strong>fferenti al pH della soluzione<br />
-Ag buoni risultati a pH acido<br />
-Ag buoni risultati a pH basico
Smascheramento<br />
Intensità <strong>di</strong> colorazione aumenta aumentando i tempi<br />
Recettore per estrogeni<br />
10’
Smascheramento<br />
Recettore estrogeni<br />
20’<br />
’
Smascheramento<br />
Recettore per estrogeni<br />
30’
Efficienza dei meto<strong>di</strong> <strong>di</strong> recupero<br />
• Tempo/Temperatura<br />
dell’antigenicità<br />
• A parità <strong>di</strong> trattamento il tempo e la temperatura<br />
alla quale le sezioni vengono sottoposte giocano un<br />
ruolo fondamentale per il raggiungimento <strong>di</strong> un<br />
risultato ottimale<br />
• Casi con reattività debole o incerta possono<br />
<strong>di</strong>ventare chiaramente positivi se esposti al calore<br />
per un periodo più lungo<br />
• Viceversa casi sicuramente negativi restano tali<br />
anche dopo esposizione prolungata al calore
Meto<strong>di</strong> <strong>di</strong> recupero<br />
dell’antigenicità<br />
• Soluzioni utilizzate<br />
• Tampone citrato 0.01 M pH6<br />
• Tampone EDTA pH 8-9<br />
• Tampone glicina<br />
• Acqua <strong>di</strong>stillata
SPARAFFINARE<br />
REIDRATARE<br />
FASI DELLA COLORAZIONE IIC<br />
PRETRATTAMENTO<br />
INIBIZIONE<br />
Ac I°<br />
Ac II°<br />
ABC-ENZIMA<br />
CROMOGENO<br />
CONTRASTO<br />
MONTAGGIO<br />
OSSERVAZIONE
Interpretazione dei<br />
risultati<br />
Una delle maggiori <strong>di</strong>fficoltà<br />
dell’immunoistochimica sta nell’interpretazione<br />
dei risultati. La presenza <strong>di</strong> deposizione <strong>di</strong><br />
substrato cromogeno in corrispondenza <strong>di</strong> una<br />
cellula o <strong>di</strong> un tessuto, spesso, dovrebbe<br />
significare che in quella sede è avvenuta una<br />
reazione tra l’anticorpo e l’antigene tissutale.<br />
Questo è vero nella maggior parte dei casi,<br />
tuttavia altri eventi definiti artefatti, possono<br />
essere responsabili della colorazione
Interpretazione dei<br />
risultati<br />
Le cause più comuni <strong>di</strong> colorazioni dovute<br />
ad artefatti sono:<br />
•Presenza Presenza <strong>di</strong> perossidasi o fosfatasi (già presenti nel<br />
tessuto ) non adeguatamente inibite.<br />
•Cross Cross-reattività reattività dell’anticorpo I° I con un antigene<br />
<strong>di</strong>verso da quello in stu<strong>di</strong>o.<br />
•Legame Legame aspecifico dell’anticorpo alla cellula o tessuto<br />
(attraverso il frammento Fc o per carica elettrica)<br />
•Inadeguata Inadeguata fissazione del tessuto. Scarsa fissazione<br />
provoca un eccesso <strong>di</strong> “fondo “; eccesso <strong>di</strong> fissazione<br />
provoca una ridotta sensibilità
Pattern <strong>di</strong> colorazione<br />
Esistono alcune strategie che possono aiutare a<br />
<strong>di</strong>stinguere una colorazione immunoistochimica<br />
specifica da una non specicifica o legata ad<br />
artefatti L’interpretazione dei risultati in IIC deve<br />
tenere conto del tipo <strong>di</strong> positività attesa per un<br />
determinato Ab che può essere <strong>di</strong> quattro tipi:<br />
• Nucleare<br />
• Citoplasmatica<br />
• Di membrana<br />
• Extracellulare
Pattern <strong>di</strong> colorazione<br />
• NUCLEARE<br />
• CITOPLASMATICO<br />
• DI MEMBRANA
Campi <strong>di</strong> applicazione<br />
L’approccio <strong>di</strong>agnostico<br />
immunoistochimico deve essere<br />
condotto con razionalità<br />
scegliendo, sia il tipo <strong>di</strong> materiale<br />
più idoneo, sia gli anticorpi da<br />
utilizzare, secondo un algoritmo<br />
appropriato
Campi <strong>di</strong> applicazione<br />
Si definisce algoritmo<br />
immunoistochimico la successione<br />
logica nella selezione <strong>degli</strong> anticorpi da<br />
utilizzare al fine <strong>di</strong> giungere alla<br />
<strong>di</strong>agnosi.<br />
Esiste un algoritmo primario che<br />
consiste nell’utilizzo <strong>di</strong> un pannello <strong>di</strong><br />
anticorpi che consente <strong>di</strong> identificare<br />
la neoplasia
Campi <strong>di</strong> applicazione<br />
Le positività riscontrate con<br />
l’algoritmo primario consentono<br />
<strong>di</strong> applicare un algoritmo<br />
secondario al fine <strong>di</strong> classificare<br />
adeguatamente la neoplasia.<br />
Raramente si rende necessario<br />
l’utilizzo <strong>di</strong> un ulteriore<br />
algoritmo
Campi <strong>di</strong> applicazione “IHC”<br />
• Marcatori <strong>di</strong> <strong>di</strong>fferenziazione<br />
• “Colorazione speciale”<br />
• Marcatori <strong>di</strong> neoplasia<br />
• Marcatori <strong>di</strong> agenti infettivi<br />
• Fattori prognostici
Marcatori <strong>di</strong><br />
<strong>di</strong>fferenziazione<br />
• Natura Natura della della popolazione popolazione cellulare cellulare<br />
• Linfomi B/T<br />
• Epiteliale vs. mesenchimale<br />
• DD melanoma amelanotico<br />
• Mesotelioma vs adenocarcinoma
Marcatori <strong>di</strong><br />
<strong>di</strong>fferenziazione<br />
• Sottoclassificazione linfomi<br />
• Sottoclassificazione neoplasie<br />
mesenchimali<br />
• Differenziazione endocrina
Colorazione speciale<br />
• In<strong>di</strong>viduazione tipi cellulari<br />
specifici: cellule<br />
sustentacolari, cellule<br />
follicolari dendritiche ecc ecc.
CD21 - cellule FD
Marcatori prognostici<br />
• Ag regolatori del ciclo<br />
cellulare (Mib (Mib-1, 1, cicline)<br />
• Recettori ormonali (Er, Pr)<br />
• Prodotti <strong>di</strong> oncogeni e geni<br />
oncosoppressori (Erb (Erb-B2, B2, Myc)<br />
• Ag legati all’invasività (E (E-caderina) caderina)
Marcatori immunoistochimici<br />
<strong>di</strong> riconosciuta vali<strong>di</strong>tà clinica<br />
• ER, PR<br />
• Proliferazione – Ki67<br />
• HER HER-2<br />
• KIT<br />
• EGFR
CARCINOMA DELLA MAMMELLA<br />
Fattori prognostici/pre<strong>di</strong>ttivi<br />
Il carcinoma della mammella, viene<br />
caratterizzato con lo stu<strong>di</strong>o <strong>di</strong>:<br />
Parametri morfologici<br />
Grandezza del tumore,istotipo,infiltrazione,<br />
grado <strong>di</strong> <strong>di</strong>fferenziazione, presenza o meno<br />
<strong>di</strong> linfono<strong>di</strong> metastatici<br />
Parametri biologici (non puramente morfologici)<br />
• Attività proliferativa (MIB1)<br />
• Assetto ormonale (ER,PR)<br />
• Prodotti <strong>di</strong> oncogeni (HER2)
Carcinoma della mammella<br />
Fattori pronostici<br />
Per caratterizzare i parametri biologici<br />
si impiegano meto<strong>di</strong>che:<br />
<strong>Immunoistochimica</strong> che permettono<br />
<strong>di</strong> evidenziare sostanze <strong>di</strong> natura<br />
proteica presenti nei tessuti<br />
Ibridazione in situ (FISH e<br />
CISH) identificazione <strong>di</strong> una sequenza<br />
<strong>di</strong> acido nucleico in tessuti o cellule
Marcatori prognostici/pre<strong>di</strong>ttivi<br />
• Vali<strong>di</strong>tà clinica<br />
Estrogeni-Progesterone<br />
Mib1 Mib1<br />
Cerb-2<br />
Queste indagini sono svolte su tutte<br />
le neoplasie perché complementari non<br />
solo all’interpretazione istopatologica<br />
ma anche per le relative implicazioni<br />
terapeutiche
Scelta <strong>degli</strong> anticorpi<br />
Estrogeni
Scelta <strong>degli</strong> anticorpi<br />
Progesterone
Scelta <strong>degli</strong> anticorpi<br />
KI67 (Mib1)<br />
Valutazione dell’attività proliferativa<br />
delle cellule neoplastiche e normali.<br />
Si utilizza un Ac monoclonale ki67 (clone<br />
MIB1) che riconosce un antigene<br />
nucleare presente in tutte le fasi<br />
attive del ciclo cellulare
Mib1<br />
Scelta <strong>degli</strong> anticorpi
C-erb-B2<br />
Scelta <strong>degli</strong> anticorpi<br />
L’anticorpo reagisce con l’oncoproteina<br />
C-erb-B2 su tessuti fissati in formalina<br />
e inclusi in paraffina.<br />
La colorazione è localizzata nelle<br />
membrane cellulari delle cellule<br />
neoplastiche
Her-2<br />
Kit standar<strong>di</strong>zzati<br />
Devono essere<br />
eseguiti accuratamente
Valutazione dello stato <strong>di</strong><br />
HER2/neu<br />
Attualmente sono <strong>di</strong>sponibili numerosi sistemi per<br />
valutare lo stato <strong>di</strong> HER2/neu (Southern Blot, Dot<br />
Blot, PCR quantitativa).<br />
I più frequentemente utilizzati sono la<br />
<strong>di</strong>mostrazione dell’iperespressione <strong>di</strong> HER2<br />
me<strong>di</strong>ante indagine immunoistochimica (IHC) e<br />
dell’amplificazione me<strong>di</strong>ante ibridazione in situ<br />
fluorescente (FISH).
Carcinoma della mammella:<br />
valutazione dello stato <strong>di</strong> HER-2/Neu<br />
Her 2/neu/c-erbB-2 appartiene alla famiglia<br />
dei recettori per i fattori <strong>di</strong> crescita.<br />
E’ un componente della via <strong>di</strong> trasduzione del<br />
segnale coinvolto nella crescita cellulare.<br />
La sua localizzazione extra-cellulare lo rende<br />
un possibile bersaglio farmacologico.
Valutazione dello stato <strong>di</strong><br />
HER2/neu<br />
I campioni con intensa positività per Her-2<br />
(IHC 3+) sono elegibili per la terapia con<br />
Herceptin.<br />
I campioni IHC 2+ devono essere ritestati<br />
con altro metodo, preferibilmente con<br />
indagine FISH.<br />
I campioni sono inizialmente testati<br />
me<strong>di</strong>ante IHC.
HER2/NEU EXPRESSION<br />
IHC - HercepTest<br />
2+ 3+
Vysis (PathVysion) - Dakocytomation<br />
HER-2/DNA probes<br />
Permettono <strong>di</strong> valutare l’ amplificazione del gene<br />
HER-2 me<strong>di</strong>ante FISH.<br />
Entrambe le meto<strong>di</strong>che prevedono l’utilizzo <strong>di</strong> due<br />
sonde a DNA marcate con sostanze fluorescenti:<br />
HER-2 che identifica l’ intero gene HER-2 marcato<br />
con Spectrum Orange®<br />
CEP 17 è marcato con Spectrum Green® e si<br />
ibri<strong>di</strong>zza con il DNA alfa-satellite localizzato in<br />
corrispondenza del centromero del cromosoma 17<br />
(17p11.1-q11.1)
HER-2/NEU - FISH
HER2/NEU AMPLIFICATION<br />
Low Level High Level
Problemi metodologici<br />
• Tecniche <strong>di</strong> smascheramento<br />
antigenico<br />
• Cloni utilizzati<br />
• Sensibilità dei sistemi <strong>di</strong><br />
rivelazione<br />
• Scoring methods<br />
• Controlli <strong>di</strong> qualità
Marcatori <strong>di</strong> neoplasia<br />
• bcl bcl-2 2 - linfomi follicolari vs<br />
iperplasia follicolare<br />
• Ciclina D1 - linfoma mantellare<br />
• p53<br />
• p80 - ALCL
Marcatori <strong>di</strong> neoplasia<br />
Bcl2
Marcatori <strong>di</strong> <strong>di</strong>fferenziazione<br />
• Determinazione della sede primitiva<br />
<strong>di</strong> una neoplasia metastatica<br />
– Profilo cheratine<br />
– Marcatori melanocitari<br />
– TTF1 ecc...
Applicazioni microbiologiche<br />
• Identificazione <strong>di</strong> virus<br />
• Identificazione <strong>di</strong> batteri<br />
HPV<br />
Helicobacter Pylori
.<br />
HPV e carcinoma della cervice<br />
Tra gli agenti virali un<br />
posto <strong>di</strong> rilievo è assegnato<br />
allo Human Papilloma Virus<br />
(HPV)<br />
Numerosi stu<strong>di</strong><br />
epidemiologici hanno<br />
<strong>di</strong>mostrato un innegabile<br />
legame tra infezione da<br />
HPV e sviluppo del<br />
carcinoma della cervice<br />
uterina
HPV e oncogenesi cervicale<br />
•Sono stati identificati 100 genotipi <strong>di</strong> cui<br />
40 presentano tropismo per il tratto anogenitale<br />
•Vengono sud<strong>di</strong>visi in tre categorie che ne<br />
identificano il <strong>di</strong>verso potenziale oncogeno<br />
Alto rischio (16, 18 )<br />
Rischio interme<strong>di</strong>o (31,33,35,51,58)<br />
Basso rischio (6, 11, 34,42,61,68)
Colorazione IIC per HPV
Ibridazione in situ<br />
• Ibridazione in situ
HPV 16-18<br />
ISH
PCR<br />
1) Estrazione del DNA<br />
• Le sezioni raccolte in un tubo sterile sono state<br />
sparaffinate, reidratate e incubate per tutta la<br />
notte con proteinasi K a 37°C<br />
• Inattivazione della proteinasi K a 95°C per 30’<br />
2) Reazione <strong>di</strong> PCR<br />
Preparare una miscela <strong>di</strong> amplificazione<br />
contenente: H 2O, dNTP, MgCl 2, Taq-polimerase<br />
templato
PCR<br />
La PCR avviene<br />
attraverso una serie <strong>di</strong><br />
cicli composti da tre<br />
fasi:<br />
Denaturazione<br />
Denaturazione<br />
Annealing Annealing<br />
Allungamento<br />
Termociclatore computerizzato<br />
opportunamente programmato
PCR<br />
P.M. Contr- Contr+ - + + +<br />
Elettroforesi su gel <strong>di</strong> agarosio
Ibridazione inversa<br />
Tipizzazione genotipica <strong>di</strong> HPV
Campi <strong>di</strong> applicazione<br />
Possibilità <strong>di</strong> in<strong>di</strong>viduare i ceppi coinvolti<br />
Possibilità <strong>di</strong> in<strong>di</strong>viduare lesioni latenti o<br />
preneoplastiche<br />
Utilità nello screening preventivo
Principali Ac utilizzati nella <strong>di</strong>agnostica<br />
delle patologie neoplastiche<br />
CITOCHERATINE<br />
• Famiglia <strong>di</strong> proteine che costituiscono<br />
la maggior parte dei filamenti interme<strong>di</strong><br />
del citoscheletro delle cellule epiteliali.<br />
• In base al peso molecolare che varia<br />
da 40 a 67 kD sono numerate da 1 a 20<br />
• La loro evidenziazione in una cellula<br />
normale o neoplastica depone quin<strong>di</strong> per<br />
una origine epiteliale
Principali Ac utilizzati nella <strong>di</strong>agnostica<br />
delle patologie neoplastiche<br />
CITOCHERATINE<br />
• Sono espresse in modo caratteristico nei<br />
<strong>di</strong>versi tipi <strong>di</strong> epiteli normali e/o neoplastici<br />
Es: CK7 + ADK polmone CK20 - ADK polmone<br />
-ADK colon + ADK colon<br />
• In IIC vengono utilizzati Ac <strong>di</strong>retti contro le<br />
singole CK o cocktail <strong>di</strong> Ac variamente allestiti<br />
per identificare CK a basso/me<strong>di</strong>o/alto peso<br />
molecolare
Principali Ac utilizzati nella <strong>di</strong>agnostica<br />
delle patologie neoplastiche<br />
CITOCHERATINE
Principali Ac utilizzati nella<br />
<strong>di</strong>agnostica delle patologie<br />
S-100<br />
• L’anticorpo reagisce con una<br />
proteina presente in numerose linee<br />
cellulari (cellule muscolari striate e<br />
car<strong>di</strong>ache, melanociti, elementi gliali)<br />
• E’ positiva nei mioepiteli ma non è<br />
un marcatore specifico
Principali Ac utilizzati nella<br />
<strong>di</strong>agnostica delle patologie<br />
S-100
Principali Ac utilizzati nella<br />
<strong>di</strong>agnostica delle patologie mammarie<br />
Actina del muscolo liscio<br />
• E’ un componente del sistema contrattile<br />
cellulare; è espressa dalle cellule mioepiteliali<br />
ma anche dai miofibroblasti stromali<br />
• L’Ac <strong>di</strong>retto contro l’actina identifica quin<strong>di</strong><br />
tutti gli elementi normali o neoplastici che<br />
presentano una struttura contrattile <strong>di</strong> tipo<br />
muscolare
Principali Ac utilizzati nella<br />
<strong>di</strong>agnostica delle patologie mammarie<br />
•Actina del muscolo liscio<br />
Sono stati identificati sei tipi <strong>di</strong> actina a<br />
seconda del tessuto muscolare <strong>di</strong> origine<br />
riconosciuti da Ac <strong>di</strong>fferenti<br />
-alfa actina muscolo liscio<br />
-alfa actina muscolo scheletrico e car<strong>di</strong>aco<br />
-alfa actina muscolo liscio, mioepiteli,<br />
miofibroblasti
Principali Ac utilizzati nella<br />
<strong>di</strong>agnostica delle patologie<br />
•Actina del muscolo liscio
Principali Ac utilizzati nella<br />
<strong>di</strong>agnostica delle patologie mammarie<br />
Calponina<br />
• E’ una proteina che regola la contrazione<br />
delle cellule muscolari lisce<br />
• E’ un marcatore molto sensibile delle cellule<br />
mioepiteliali. Mostra moderata crossreattività<br />
con i miofibroblasti<br />
• Positività citoplasmatica
Principali Ac utilizzati nella<br />
<strong>di</strong>agnostica delle patologie mammarie<br />
Calponina
Principali Ac utilizzati nella<br />
<strong>di</strong>agnostica delle patologie mammarie<br />
• E-Caderina<br />
• Le caderine sono una famiglia <strong>di</strong> proteine <strong>di</strong><br />
adesione cellulare. Formano complessi con le<br />
proteine citoplasmatiche chiamate<br />
catenine.Questi complessi insieme con altri<br />
componenti del citoscheletro,tra cui l’actina,<br />
sono parte essenziale del sistema <strong>di</strong> adesione<br />
intercellulare e quin<strong>di</strong> coinvolti nella invasività<br />
delle cellule tumorali
Principali Ac utilizzati nella<br />
<strong>di</strong>agnostica delle patologie mammarie<br />
• E-Caderina
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