Lezione Peste Europe.. - (IZS) delle Regioni Lazio e Toscana

Corso
IZS Lazio e Toscana – Sede centrale di Roma
Aula Zavagli
18, 19, 28 ottobre 2011
PATOLOGIA APISTICA:
PREVENZIONE, DIAGNOSI E CONTROLLO
LA PESTE EUROPEA DELLE API
(EUROPEAN FOUL BROOD-EFB)
Tecniche per la diagnosi di laboratorio
19 ottobre 2011
Dott.ssa Marcella Milito

La Peste europea
è’ una malattia delle api di origine batterica
che di solito colpisce la covata non opercolata
nel periodo primaverile-estivo
L’andamento della malattia è in genere benigno
con tendenza alla guarigione spontanea
A volte però, se la famiglia è debole,
l’andamento porta alla morte della famiglia

PESTE EUROPEA
Il telaino emana odore aspro, acido, putrido, a volte nessun odore

PESTE EUROPEA
• Le larve assumono cibo contaminato: il batterio si riproduce nell’intestino
impedendo l’assunzione di altro cibo
• La maggior parte delle larve muore nei primi 4 giorni di vita, ancora prima che
le celle siano opercolate, assumendo una colorazione giallastra, bruna e
divenendo scaglie sul fondo della cella

Le api spazzine rimuovono le scaglie e si infettano
propagando il batterio ad altre larve
I batteri si possono depositare sul fondo delle celle e rimanere vitali per anni

PESTE EUROPEA
E’ causata da un cocco Gram positivo, il Melissococcus plutonius, immobile e
spesso associato ad altri batteri che ne accentuano i sintomi:
Paenibacillus alvei, Enterococcus faecalis, Bacterium eurydice, Bacillus laterosporus

PESTE EUROPEA
DIAGNOSI DI LABORATORIO DI PESTE EUROPEA

KIT RAPIDO PER LA DIAGNOSI
(IMMUNOMIGRAZIONE)

E’ un esame rapido
che permette già in campo
di verificare la presenza dell’infezione batterica
nella famiglia di api osservata

Ricerca Melissococcus plutonius: esame immunomigrazione
la larva viene posta all’interno di un tampone di estrazione fornito nel kit,
poi si miscela e qualche goccia viene posta su di un apposito supporto

.
L’immunomigrazione si basa sul seguente principio:
un anticorpo marcato è fissato su un supporto sul quale si fa reagire una goccia di
sospensione del campione in esame
(larva disciolta in un apposito tampone buffer fornito nella confezione).

Se l’antigene batterico è presente si fissa all’anticorpo marcato e lo trascina con
sé lungo il supporto fino a incontrare un anticorpo secondario che fissa il
complesso rivelatore.
In caso di positività compare quindi una banda scura visibile ad occhio nudo.
La banda dovrà essere sempre accompagnata dalla presenza di una seconda
banda che è quella del controllo positivo.
Senza la comparsa della banda positiva il test non è valido.

Test positivo:
comparsa di due bande
Test negativo:
comparsa della sola banda di controllo

Osservazione microscopica del contenuto intestinale:
Si prepara una sospensione acquosa del contenuto intestinale da larve malate
(possibilmente prima della morte)
Il contenuto intestinale, in caso di malattia,
appare di colore bianco gesso a causa della presenza di ammassi batterici
Si pone su un vetrino, si asciuga, si fissa e si colora con il Gram.

Il quadro microbiologico tipico presenta numerose forme cocciche, lanceolate, Gram positive,
disposte singolarmente o raggruppate in ammassi, a coppie o in corte catene;
si possono osservare anche alcune forme a bastoncino Gram negative e con le estremità
squadrate (Bacterium eurydice) o Gram positive (Paenibacillus alvei, Enterocococcus faecalis,
Bacillus laterosporus)
• Immagini tratte dall’articolo:Pietro Arculeo, Anna Maria Di Noto, Santo Caracappa Istituto Zooprofilattico Sperimentale della
Sicilia-Palermo Ricerca presentata al First European Conference of Apidology (EurBee) Udine 19-23 settembre 2004

Melissococcus plutonius:
cocchi Gram positivi isolati (0,5x1,0 micrometri)
, a coppia o in corte catene

ESAME COLTURALE

Richiede tre o quattro giorni per lo sviluppo delle colonie batteriche .
Si striscia sul terreno di coltura
una sospensione omogeneizzata di 10 ml di soluzione fisiologica sterile
con 5 larve intere (giallastre, contorte)
(oppure la sospensione acquosa del contenuto intestinale)
Il terreno di coltura usato è l’AGAR BAILEY,
selettivo per il Melissococcus plutonius

AGAR BAILEY
a base di estratto di lievito, cisteina, glucosio,
amido, KH2PO4, agar e acqua distillata

Il Melissococcus plutonius è
anaerobio o microaerofilo (con 5-10% di CO2 sempre richiesto)
La coltura va incubata in giara per anaerobiosi, a 37°C per tre o quattro giorni

Melissococcus plutonius:
colonie su terreno di coltura Agar Baley
dopo incubazione

Le colonie del Melissococcus plutonius sono piccole e biancastre,
con un diametro di circa 1 mm

PESTE EUROPEA
All’esame microscopico con la colorazione di Gram le colonie
saranno costituite da
cocchi Gram positivi lanceolati a coppia o in corte catene

Si può effettuare, oltre la colorazione di Gram, anche la
colorazione con nigrosina al 5%:
I corpi batterici appariranno piccoli e bianchi, lanceolati

La semina su Agar Bailey può anche essere effettuata in terreno liquido e cioè per inclusione.
Ciò allo scopo di ottenere un’analisi quantitativa.
Si è stimato che un conteggio di oltre 100.000 unità formanti colonie per millilitro sia presente
nei casi di infezione conclamata con sintomi clinici
(Centro svizzero di ricerche apicole, 2007)

ESAMI DI BIOLOGIA MOLECOLARE

Esame in PCR
La tecnica di biologia molecolare denominata PCR (Polimerase Chain Reaction)
è basata sull’amplificazione in laboratorio di una caratteristica
sequenza del DNA batterico.
Viene spesso usata con successo come prova di conferma nei casi di positività al
kit rapido di immunomigrazione o all’esame colturale

L’esame con PCR prevede un’estrazione del DNA batterico
e la successiva amplificazione con coppie di primers
che riconoscono esclusivamente Melissococcus plutonius
Gli amplificati vengono poi sottoposti a corsa elettroforetica in gel di agarosio.
Le dimensioni dei prodotti di PCR sono poi confrontate
con i pesi molecolari opportuni

Grazie per l’attenzione