Report di validazione del metodo Real Time PCR per il rilevamento ...

ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALEDELLE REGIONI LAZIO E TOSCANA(D.L.vo 30.06.1993 n. 270)SEDE CENTRALE - Via Appia Nuova, 1411 - 00178 Roma/CapannelleTel. (06) 79099.1 (centralino) - Fax (06) 79340724www.izslt.itBIOTECNOLOGIECentro di Referenza Nazionale per la Ricerca di OGMTel. 06 79099450- 447 Fax. 06 79099450e-mail: crogm@izslt.itReport di validazione del metodoReal Time PCR per il rilevamento e laquantificazione del mais MON810(MON-00810-6)Roma, 25/07/2008

Centro di Referenza Nazionale per la Ricerca di OGMReport di validazione mais MON810IndiceIntroduzione.......................................................................................................................... 3Elenco dei partecipanti e strumentazione utilizzata....................................................... 4Materiali ................................................................................................................................5Materiali forniti ai laboratori..............................................................................................5Materiali e strumenti forniti dai laboratori partecipanti ..............................................6Disegno sperimentale........................................................................................................... 7Risultati ................................................................................................................................. 8Anomalie riportate................................................................................................................8Efficienza e linearità ........................................................................................................... 9Valutazione grafica dei dati dei laboratori ..................................................................... 10Risultati della validazione................................................................................................. 13Conclusioni .......................................................................................................................... 13Bibliografia.......................................................................................................................... 14ALLEGATI:ALLEGATO A: "Certificate of analysis ERM®-AD413"ALLEGATO B: "Definition of Minimum Performance Requirements for AnalyticalMethods of GMO Testing European Network of GMO Laboratories (ENGL)"Pagina 2 di 14

Centro di Referenza Nazionale per la Ricerca di OGMReport di validazione mais MON810IntroduzioneIl Centro di Referenza Nazionale per la Ricerca di OGM (CROGM), in qualità dilaboratorio nazionale di riferimento secondo il Regolamento (CE) 882/2004, haorganizzato uno studio collaborativo per la validazione di un metodo diquantificazione dell'evento di trasformazione mais MON810 rispetto all'ingredientemais.Lo studio ha coinvolto 19 laboratori nazionali deputati al controllo ufficiale di OGMnel settore agro-alimentare ed è stato svolto nel periodo Maggio-Giugno 2008.Ai laboratori è stato fornito un protocollo dettagliato da seguire per l'esecuzione delmetodo.Il protocollo utilizzato è derivato dall’allegato alla norma ISO 21570:2005,“Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modifiedorganisms and derived products - Quantitative nucleic acid based methods”[1] e larelativa validazione è stata valutata dal Community Reference Laboratory for GMFood and Feed (CRL-GMFF) il 10/03/2006 [2].Allo scopo di migliorare la praticabilità del metodo, sono state introdotte piccolemodifiche rispetto al metodo pubblicato sul sito web del CRL-GMFF:- entrambe le miscele di reazione, per il bersaglio endogeno e per quellotransgenico, impiegano una master mix precostituita che consente unamaggiore armonizzazione del sistema e una maggiore rapidità di esecuzionedella prova;- come calibratore è stato utilizzato il plasmide ERM ® -AD413 prodotto ecertificato dall'IRMM e preparato dai partecipanti secondo le indicazionifornite nel certificato allegato al materiale di riferimento [Allegato A].L'impiego di un calibratore certificato in numero di copie ha il vantaggio diconsentire il calcolo della percentuale di MON810 nei campioni incogniti comerapporto di numero di copie genomiche ottenute direttamente dalla curva dicalibrazione; viceversa con i calibratori certificati in peso il numero di copiegenomiche dei calibratori deve essere calcolato dividendo la quantità in peso delDNA estratto per il valore 1C medio pubblicato in letteratura per il genoma del mais[3].Il rilevamento di MON810 avviene attraverso l'amplificazione di un frammento di 92bp corrispondente alla regione di giunzione tra il costrutto GM e il DNA genomico.L’amplicone comprende una regione del promotore 35S derivato dal CaMV e unaporzione del genoma della pianta.Per la determinazione del contenuto totale di DNA di mais viene amplificata unasequenza di 79 bp, del gene della proteina high mobility group (hmg), caratteristicadi Zea mays.Il contenuto relativo è ottenuto attraverso il rapporto tra il numero di copie digenoma aploide (1C) determinato per l’evento MON810 (MON-00810-6) ed il numerototale di copie genomiche aploidi di DNA di mais.Lo studio collaborativo e la valutazione dei relativi risultati sono stati effettuatisecondo le seguenti linee guida internazionali:- ISO 5725:1994 [4];- Definition of Minimum Performance Requirements for Analytical Methods ofGMO Testing European Network of GMO Laboratories (ENGL). Version 25-01-2005 [Allegato B].Pagina 3 di 14

Centro di Referenza Nazionale per la Ricerca di OGMReport di validazione mais MON810Elenco dei partecipanti e strumentazione utilizzataTabella 1: Partecipanti e strumentazione utilizzataAPPA BolzanoARPA Emilia RomagnaARPA Friuli Venezia GiuliaDipartimento Provinciale di PordenoneARPA Friuli Venezia GiuliaDipartimento di TriesteARPA PiemonteARPA Valle d'AostaARPA VenetoASL 10 - FirenzeASL della Provincia di CremonaICycler iQ (BioRad)iCycler (BioRad)iCycler (BioRad)ICycler (BioRad)(BioRad)ICycler IQ5 (BioRad)ABI Prism 7000 (Applied Biosystems)ICycler (BioRad)Gene Amp 5700 SDS (Applied Biosystems)ENSE ABI SDS 7000IZS Abruzzo e MoliseIZS Lazio e ToscanaABI Prism 7900HT Fast Real Time PCR System(Applied Biosystems)ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems)IZS Lombardia e Emilia RomagnaIZS MezzogiornoIZS Piemonte Liguria e Valle d'AostaIZS SardegnaIZS SiciliaIZS Umbria e MarcheIZS VenezieABI Prism 7700 (Applied Biosystems)ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems)ABI Prism 7700 (Applied Biosystems)ABI Prism 7700 (Applied Biosystems)ABI Prism 7700 (Applied Biosystems)ABI Prism 7700 (Applied Biosystems)ABI Prism 7700 (Applied Biosystems)*Uno dei laboratori ha utilizzato il termoblocco a 384 pozzetti.Pagina 4 di 14

Centro di Referenza Nazionale per la Ricerca di OGMReport di validazione mais MON810MaterialiMateriali forniti ai laboratoriStandard: per la calibrazione dello strumento sono stati forniti una aliquota delvolume di 180 µl del plasmide ERM ® -AD413 e una aliquota di 6 ml del rispettivoBuffer di diluizione (TE).Campioni incogniti di DNA: 20 campioni incogniti di DNA marcati da C1 a C20 allaconcentrazione di 20 ng/µl (80 µl).I campioni distribuiti sono stati estratti da:- farine di mais certificate per il contenuto relativo in peso (w/w) di maisMON810 (IRMM), il livello MON810 10 g/kg (1%) è certificato anche per ilcontenuto in un numero di copie di genoma aploide (g.c./g.c.);- un mangime misto non contenente OGM.Tabella 2: Materiali utilizzati per la preparazionedei campioni C1-C20MON810MON810MON810MON810Contenuto e codice deicampioni1,00 ± 0,26 g/kgERM ® -BF413b5,0 ± 0,4 g/kgERM ® -BF413c10,0 ± 0,5 g/kg0,57 ± 0,17 % g.c./g.c.ERM ® -BF413d50,0 ± 1,1 g/kgERM ® -BF413fEtichetta campionidistribuitiC5, C9, C11, C16C1, C4, C14, C18C2, C8, C13, C19C7, C10, C15, C20non OGM Mangime misto C3, C6, C12, C17Reagenti- 2X TaqMan® PCR Universal Master Mix [5 ml]- HMG For (MaiJ-F2) primer (20 pmol/μl) [80 µl]- HMG Rev (mhmg-rev) primer (20 pmol/μl) [80 µl]- HMG (Mhmg) Probe (5 pmol/μl) [200 µl]- MON For (Mail-F1) Primer (20 pmol/μl) [80 µl]- MON Rev (Mail-R1) Primer (20 pmol/μl) [80 µl]- MON (Mail-S2) Probe (5 pmol/μl) [200 µl]- Acqua grado reagente sterile [10 ml]Tabella 3: Sequenza Primer e Probe utilizzatiNome primer Sequenza 5’-3’HMG For TTg gAC TAg AAA TCT CgT gCT gAHMG Rev gCT ACA TAg ggA gCC TTg TCC THMG Probe FAM-CAA TCC ACA CAA ACg CAC gCg TA-TAMRAMON For TCg AAg gAC gAA ggA CTC TAA CgTMON Rev gCC ACC TTC CTT TTC CAC TAT CTTMON Probe FAM-AAC ATC CTT TgC CAT TgC CCA gC-TAMRAPagina 5 di 14

Centro di Referenza Nazionale per la Ricerca di OGMReport di validazione mais MON810Materiali e strumenti forniti dai laboratori partecipanti- MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plates- Optical caps or Optical adhesion covers- Micropipette- Supporti per provette- Provette tipo Eppendorf DNAse free da 1,5 ml- Provette tipo Eppendorf DNAse free da 2 ml- Strumento per Real Time PCR e software di analisi- Microcentrifuga- VortexerPagina 6 di 14

Centro di Referenza Nazionale per la Ricerca di OGMReport di validazione mais MON810Disegno sperimentaleCiascun laboratorio ha provveduto alla preparazione di due piastre di PCR (piastra Ae piastra B) in ciascuna delle quali sono state allestite due reazioni, una per ilsistema evento specifico MON810 e l'altra per il sistema endogeno HMG.Ogni partecipante ha provveduto all'allestimento delle diluizioni del plasmide ERM ® -AD413 secondo le indicazioni del protocollo di validazione, derivate dal certificatodi analisi [Allegato A] e riportate di seguito nella tabella 4.Sono stati caricati i livelli di concentrazione del plasmide come indicato dalcertificato e i campioni da C1 a C10 e da C11 a C20 rispettivamente per le piastre Ae B.Tutti i campioni sono stati analizzati in tre repliche di PCR per il sistema MON810 eHMG.Il calcolo del contenuto relativo è stato eseguito utilizzando un foglio di calcoloexcel fornito dal Centro di Referenza.Tabella 4: Preparazione dei calibratoriETConc. InizialeCp/µlConc. FinaleCp/µlFattore didiluizioneVol DNAµlVol BufferµlS1 2 x 10 6 5 x 10 5 4 50 150S2 E 5 x 10 5 10 5 5 50 200S3 E 10 5 2 x 10 4 5 50 200S4 T 2 x 10 4 10 4 2 100 100S5 E T 10 4 2000 5 50 200S6 E 2000 1000 2 100 100S7 E T 1000 200 5 50 200S8 T 200 20 10 50 450S9 T 20 5 4 50 150*E= Endogeno HMG; T= Transgenico MON810Pagina 7 di 14

Centro di Referenza Nazionale per la Ricerca di OGMReport di validazione mais MON810RisultatiTabella 5: Risultati0,10% 0,50% 1,00% 5,00%mangimeLab. n. C05 C09 C11 C16 C01 C04 C14 C18 C02 C08 C13 C19 C07 C10 C15 C20 C03 C06 C12 C171 0,04 0,04 0,08 0,05 0,24 0,19 0,28 0,26 0,51 0,44 0,61 0,56 2,86 2,80 3,24 2,87 0,00 0,00 0,00 0,002 0,06 0,05 0,10 0,06 0,33 0,33 0,37 0,33 0,59 0,57 0,75 0,61 2,63 2,26 3,42 2,73 0,00 0,00 0,00 0,003 0,16 0,15 0,10 0,13 0,45 0,40 0,40 0,37 0,83 0,77 0,66 0,95 3,20 4,48 4,06 4,37 0,00 0,00 0,00 0,004 0,09 0,06 0,07 0,08 0,39 0,37 0,32 0,32 0,78 0,51 0,66 0,82 3,57 2,45 3,32 3,96 0,00 0,00 0,00 0,005 0,10 0,12 0,10 0,08 0,43 0,41 0,39 0,40 0,87 0,80 0,94 0,77 4,23 4,13 4,09 3,94 0,00 0,00 0,00 0,006 0,10 0,12 0,09 0,10 0,35 0,36 0,36 0,40 0,74 0,66 0,74 0,85 2,64 3,57 3,21 3,76 0,00 0,00 0,00 0,007 0,12 0,12 0,10 0,10 0,33 0,42 0,42 0,41 0,75 0,72 0,70 0,90 3,33 3,72 3,86 3,66 0,00 0,00 0,00 0,008 0,10 0,08 0,09 0,08 0,34 0,35 0,35 0,35 0,66 0,65 0,70 0,67 3,40 3,25 3,20 3,17 0,00 0,00 0,00 0,009 0,05 0,05 0,07 0,05 0,24 0,27 0,34 0,24 0,61 0,50 0,85 0,54 3,62 2,82 3,38 2,98 0,00 0,00 0,00 0,0010 0,05 0,04 0,05 0,04 0,23 0,16 0,22 0,20 0,35 0,36 0,38 0,32 1,45 1,65 1,65 1,57 0,00 0,00 0,00 0,0011 0,06 0,07 0,06 0,06 0,33 0,27 0,24 0,27 0,53 0,54 0,57 0,55 2,45 2,63 2,55 2,75 0,00 0,00 0,00 0,0012 0,06 0,06 0,07 0,06 0,26 0,25 0,23 0,24 0,56 0,48 0,57 0,47 2,72 2,79 2,67 2,70 0,00 0,00 0,00 0,0013 0,05 0,04 0,07 0,07 0,29 0,21 0,30 0,25 0,52 0,44 0,94 0,47 3,19 2,79 4,27 3,66 0,00 0,00 0,00 0,0014 0,06 0,04 0,03 0,03 0,25 0,29 0,19 0,17 0,50 0,45 0,45 0,28 3,44 2,53 2,01 2,15 0,00 0,00 0,00 0,0015 0,07 0,10 0,10 0,07 0,33 0,31 0,29 0,32 0,69 0,62 0,63 0,69 3,32 3,35 3,00 3,27 0,00 0,00 0,00 0,0016 0,07 0,07 0,06 0,07 0,33 0,39 0,37 0,47 0,61 0,92 0,67 1,00 3,97 4,35 4,04 3,62 0,00 0,00 0,00 0,0017 0,07 0,08 0,07 0,04 0,21 0,27 0,20 0,36 0,54 0,57 0,48 0,47 3,76 4,78 2,77 3,71 0,56* 0,00 0,00 0,0018 0,09 0,08 0,06 0,07 0,41 0,38 0,27 0,29 0,80 0,75 0,54 0,59 3,06 3,11 2,74 2,96 0,00 0,00 0,00 0,0019 0,00 0,00 0,07 0,07 0,32 0,31 0,43 0,41 0,64 0,64 0,66 0,63 2,66 2,51 3,89 2,52 0,00 0,00 0,00 0,00* dato non considerato nelle analisi successiveAnomalie riportate- Il laboratorio 1 ha eliminato il punto di calibrazione S9 per il sistema diquantificazione MON810 per la piastra A;- Il laboratorio 7 ha eseguito le prove con un volume di reazione pari a 20 µlinvece di 25 µl mantenendo le medesime concentrazioni dei reagenti;- Il laboratorio 14 ha eseguito l'export dei dati con una sola cifra decimale;- Il laboratorio 19 ha eliminato un replicato di PCR del punto di calibrazione S9per il sistema di quantificazione MON810 in entrambe le piastre (A e B) e haeliminato il punto S5 della calibrazione del sistema HMG in entrambe lepiastre (A e B).Pagina 8 di 14

Centro di Referenza Nazionale per la Ricerca di OGMReport di validazione mais MON810Efficienza e linearitàTabella 6: Valori di slope, efficienza e R 2 per i sistemi MON810 e HMGMON810Slope Efficienza (%) R 2Lab. n. A B A B A B1 -3,432 -3,709 95,6 86,0 0,996 0,9852 -3,546 -3,592 91,4 89,8 0,996 0,9903 -3,665 -3,562 87,4 90,9 0,993 0,9964 -3,636 -3,586 88,4 90,0 0,977 0,9995 -3,766 -3,596 84,3 89,7 0,999 0,9966 -3,591 -3,618 89,9 89,0 0,983 0,9997 -3,544 -3,633 91,5 88,5 0,997 0,9988 -3,51 -3,418 92,7 96,1 0,999 0,9959 -3,525 -3,667 92,2 87,4 0,997 0,99510 -3,497 -3,527 93,2 92,1 0,990 0,99011 -3,634 -3,57 88,4 90,6 0,988 0,98812 -3,489 -3,526 93,5 92,1 0,997 0,99513 -3,351 -3,391 98,8 97,2 0,993 0,98914 -3,544 -3,248 91,5 103,2 0,998 0,99815 -3,558 -3,593 91,0 89,8 0,998 0,99816 -3,409 -3,403 96,5 96,7 0,993 0,99717 -3,644 -3,52 88,1 92,3 0,983 0,96918 -3,655 -3,385 87,8 97,4 0,990 0,99519 -3,695 -3,851 86,5 81,8 0,995 0,995Media Media Media-3,555 91,3 0,993HMGSlope Efficienza (%) R 2Lab. n. A B A B A B1 -3,375 -3,413 97,8 96,3 0,999 0,9992 -3,494 -3,644 93,3 88,1 0,992 0,9933 -3,408 -3,407 96,5 96,6 0,999 0,9974 -3,314 -3,269 100,3 102,3 0,993 0,9955 -3,77 -3,648 84,2 88,0 0,999 0,9996 -3,314 -3,385 100,3 97,4 0,999 0,9997 -3,485 -3,479 93,6 93,8 0,999 1,0008 -3,444 -3,482 95,1 93,7 0,999 0,9999 -3,43 -3,334 95,7 99,5 0,996 0,99910 -3,444 -3,365 95,1 98,2 0,997 0,99911 -3,464 -3,471 94,4 94,1 0,999 0,99912 -3,421 -3,316 96,0 100,2 0,999 0,99913 -3,373 -3,326 97,9 99,8 1,000 0,99914 -3,465 -3,356 94,4 98,6 0,995 0,99015 -3,427 -3,451 95,8 94,9 0,999 1,00016 -3,389 -3,269 97,3 102,3 0,996 0,99717 -3,604 -3,598 89,4 89,6 0,996 0,99818 -3,394 -3,382 97,1 97,6 0,998 0,99519 -3,429 -3,476 95,7 93,9 0,996 0,996Media Media Media-3,435 95,7 0,997Per tutti i metodi è possibile osservare una buona corrispondenza tra il modello diregressione calcolato e la distribuzione dei dati. In particolare il valore di R 2 èsempre maggiore o uguale al valore limite di accettabilità fissato a 0,98 [AllegatoB]. E' quindi possibile osservare una buona linearità di risposta nell’intervallo dinumero di copie:- HMG: [1000; 5x10 5 ];- MON810: [25; 5x10 4 ];Per quanto riguarda l’efficienza di reazione ricordiamo che il valore delcoefficiente angolare (slope) della retta di calibrazione è direttamente correlatocon l’efficienza in particolare:⎡⎛E (%) = ⎢⎜10⎢⎜⎣⎝1−slope⎞ ⎤⎟ −1⎥× 100⎟⎠ ⎥⎦Il valore di slope medio, e quindi l'efficienza di reazione, è considerato accettabilenel caso in cui sia compreso nell'intervallo [-3,1;-3,6] [Allegato B] corrispondente avalori di efficienza compresi tra 110% e 87%. I valori di slope per i sistemi diquantificazione di MON810 e HMG sono rispettivamente pari a -3,555 (efficienza:91,3%) e -3,435 (efficienza: 95,7%) e sono quindi in accordo con i limiti diaccettabilità.Pagina 9 di 14

Centro di Referenza Nazionale per la Ricerca di OGMReport di validazione mais MON810Valutazione grafica dei dati dei laboratoriLe statistiche h e k di Mandel, oltre che valutare la variabilità del metodo dimisurazione, sono anche utili ai fini dell'individuazione di eventuali anomalieattribuibili a singoli laboratori [4]. In particolare la statistica h è un test per laverifica della coerenza interlaboratorio (between-laboratory consistency teststatistic) mentre k verifica la coerenza dei dati ottenuti dal laboratorio(within-laboratory consistency test statistic) [4 ].h3,0002,0001,000h0,000-1,000-2,000-3,0001 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19LaboratoriFig. 1: Rappresentazione della statistica h. Le linee tratteggiaterappresentano i livelli di significatività del 1% (19 laboratori: ± 2,37) e del5% (19 laboratori: ± 1,88)k3,0002,5002,000k1,5001,0000,5000,0001 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19LaboratoriFig. 2: Rappresentazione della statistica k. Le linee tratteggiate rappresentanoi livelli di significatività del 1% (19 laboratori e 4 campioni: 1,89) e del 5% (19laboratori e 4 campioni: 1,59)Pagina 10 di 14

Centro di Referenza Nazionale per la Ricerca di OGMReport di validazione mais MON810Il grafico dei valori di h mostra che i laboratori 3 e 10 presentano valoririspettivamente più alti e più bassi rispetto a quelli ottenuti dagli altri laboratori.Detti risultati comunque superano i valori di accettabilità con un livello disignificatività dell'1% solo su uno dei livelli di concentrazione, pertanto si è ritenutodi non escludere nessuno dei laboratori.Nel grafico dei valori k i laboratori 13 e 19 presentano una variabilità ampia tra irisultati delle prove replicate, ma solo su un livello di concentrazione (per illaboratorio 13 il livello 1%, per il laboratorio 19 il livello 0,1%), pertanto non è statoritenuto opportuno escludere i due laboratori complessivamente.Dall'osservazione dei dati grezzi non sono state osservate anomalie particolari per illaboratorio 13, mentre per il laboratorio 19 si è osservata la mancata rilevazione disegnale di amplificazione per due dei quattro replicati del livello 0,1% in una delledue piastre.Dall'analisi dei dati grezzi del laboratorio 19 sono stati osservati valori di Ct assoluti,per tutti i campioni e standard, più alti rispetto a quelli forniti dagli altripartecipanti. Nei grafici delle figure 3 e 4 sono riportati i valori di Ct medi per gliestremi delle curve di calibrazione per ciascun laboratorio.Da questi grafici è possibile osservare che il laboratorio 19 presenta valori di Ctmediamente molto più alti.MON810 Ct S4 - S9S4 piastra A S4 piastra B S9 piastra A S9 piastra B45,0040,0035,00Ct30,0025,0020,000 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20LaboratorioFig. 3: Valori di Ct del sistema MON810 per le concentrazioni S4 (5x10 4 copie) eS9 (25 copie) della curva di calibrazionePagina 11 di 14

Centro di Referenza Nazionale per la Ricerca di OGMReport di validazione mais MON810HMG Ct S2 - S7S2 piastra A S2 piastra B S7 piastra A S7 piastra B40,0035,0030,00Ct25,0020,0015,000 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20LaboratoriFig. 4: Valori di Ct del sistema HMG per le concentrazioni S2 (5x10 5 copie) e S9(10 3 copie) della curva di calibrazioneLo "spostamento" della curva di calibrazione e dei campioni a Ct più alti potrebbeaver determinato un aumento del LOD per il laboratorio in oggetto e quindi unamaggiore variabilità sui bassi livelli di concentrazione. In effetti il test di Cochraneffettuato sul livello 0,1% ha evidenziato i dati forniti dal laboratorio 19 comeoutlier, richiedendone quindi l'eliminazione (vedi tabella 7).Complessivamente i laboratori hanno fornito dati coerenti sia a livello intra cheinterlaboratorio e pertanto nessuno di essi è stato escluso dalle analisi successive.Pagina 12 di 14

Centro di Referenza Nazionale per la Ricerca di OGMReport di validazione mais MON810Risultati della validazioneTabella 7: Risultati validazioneFarina mistanon GMCampioni5,00% w/w 10,10% w/w 1 0,50% w/w 1 0,57%1,00% w/w 1g.c./g.c. 2Numero laboratori 19 19 19 19 19Numero di campioni per laboratorio 4 4 4 4 4Numero di outliers / 1 / / /Motivo dell'esclusione / 1 C 3 / / /Valore medio 0,00 0,08 0,32 0,63 3,17Deviazione standard di ripetibilità / 0,01 0,04 0,11 0,43Dev. standard reltiva di ripetibilità (RSD r %)Limite accettabilità: 25%/ 19 13 17 14Deviazione standard di riproducibilità / 0,03 0,08 0,16 0,72Dev. standard relativa di riproducibilità, RSD R %Limite accettabilità: liv.

Centro di Referenza Nazionale per la Ricerca di OGMReport di validazione mais MON810Bibliografia1. ISO 21570:2005, “Foodstuffs - Methods of analysis for the detection ofgenetically modified organisms and derived products - Quantitative nucleicacid based methods”2. CRL assessment on the validation of an event specific method for the relativequantitation of maize line MON810 DNA using real-time PCR as carried out byFederal Institute for Risk Assessment (BfR); (2006); http://gmo-crl.jrc.it3. Certificate of analysis ERM®-AD413; www.irmm.jrc.be4. Arumuganathan, K., Earle, E.D. (1991). Nuclear content of some importantplant species. Plant Mol Biol Reporter 9, 208-218.5. UNI ISO 5725 "Accuratezza (esattezza e precisione) dei risultati e dei metodidi misurazione." Norma italiana, Agosto 20046. Definition of Minimum Performance Requirements for Analytical Methods ofGMO Testing European Network of GMO Laboratories (ENGL). Version 25-01-2005; http://gmo-crl.jrc.itRedatto da:Francesco Gatto, Annalisa Paternò, Michela BoncagniVerificato da:Ilaria Maria Ciabatti e Ugo MarchesiApprovato da:Demetrio AmaddeoPagina 14 di 14