Report di validazione del metodo Real Time PCR per il rilevamento ...

More documents

Recommendations

Info

Centro di Referenza Nazionale per la Ricerca di OGMReport di validazione mais MON810IndiceIntroduzione.......................................................................................................................... 3Elenco dei partecipanti e strumentazione utilizzata....................................................... 4Materiali ................................................................................................................................5Materiali forniti ai laboratori..............................................................................................5Materiali e strumenti forniti dai laboratori partecipanti ..............................................6Disegno sperimentale........................................................................................................... 7Risultati ................................................................................................................................. 8Anomalie riportate................................................................................................................8Efficienza e linearità ........................................................................................................... 9Valutazione grafica dei dati dei laboratori ..................................................................... 10Risultati della validazione................................................................................................. 13Conclusioni .......................................................................................................................... 13Bibliografia.......................................................................................................................... 14ALLEGATI:ALLEGATO A: "Certificate of analysis ERM®-AD413"ALLEGATO B: "Definition of Minimum Performance Requirements for AnalyticalMethods of GMO Testing European Network of GMO Laboratories (ENGL)"Pagina 2 di 14
Centro di Referenza Nazionale per la Ricerca di OGMReport di validazione mais MON810IntroduzioneIl Centro di Referenza Nazionale per la Ricerca di OGM (CROGM), in qualità dilaboratorio nazionale di riferimento secondo il Regolamento (CE) 882/2004, haorganizzato uno studio collaborativo per la validazione di un metodo diquantificazione dell'evento di trasformazione mais MON810 rispetto all'ingredientemais.Lo studio ha coinvolto 19 laboratori nazionali deputati al controllo ufficiale di OGMnel settore agro-alimentare ed è stato svolto nel periodo Maggio-Giugno 2008.Ai laboratori è stato fornito un protocollo dettagliato da seguire per l'esecuzione delmetodo.Il protocollo utilizzato è derivato dall’allegato alla norma ISO 21570:2005,“Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modifiedorganisms and derived products - Quantitative nucleic acid based methods”[1] e larelativa validazione è stata valutata dal Community Reference Laboratory for GMFood and Feed (CRL-GMFF) il 10/03/2006 [2].Allo scopo di migliorare la praticabilità del metodo, sono state introdotte piccolemodifiche rispetto al metodo pubblicato sul sito web del CRL-GMFF:- entrambe le miscele di reazione, per il bersaglio endogeno e per quellotransgenico, impiegano una master mix precostituita che consente unamaggiore armonizzazione del sistema e una maggiore rapidità di esecuzionedella prova;- come calibratore è stato utilizzato il plasmide ERM ® -AD413 prodotto ecertificato dall'IRMM e preparato dai partecipanti secondo le indicazionifornite nel certificato allegato al materiale di riferimento [Allegato A].L'impiego di un calibratore certificato in numero di copie ha il vantaggio diconsentire il calcolo della percentuale di MON810 nei campioni incogniti comerapporto di numero di copie genomiche ottenute direttamente dalla curva dicalibrazione; viceversa con i calibratori certificati in peso il numero di copiegenomiche dei calibratori deve essere calcolato dividendo la quantità in peso delDNA estratto per il valore 1C medio pubblicato in letteratura per il genoma del mais[3].Il rilevamento di MON810 avviene attraverso l'amplificazione di un frammento di 92bp corrispondente alla regione di giunzione tra il costrutto GM e il DNA genomico.L’amplicone comprende una regione del promotore 35S derivato dal CaMV e unaporzione del genoma della pianta.Per la determinazione del contenuto totale di DNA di mais viene amplificata unasequenza di 79 bp, del gene della proteina high mobility group (hmg), caratteristicadi Zea mays.Il contenuto relativo è ottenuto attraverso il rapporto tra il numero di copie digenoma aploide (1C) determinato per l’evento MON810 (MON-00810-6) ed il numerototale di copie genomiche aploidi di DNA di mais.Lo studio collaborativo e la valutazione dei relativi risultati sono stati effettuatisecondo le seguenti linee guida internazionali:- ISO 5725:1994 [4];- Definition of Minimum Performance Requirements for Analytical Methods ofGMO Testing European Network of GMO Laboratories (ENGL). Version 25-01-2005 [Allegato B].Pagina 3 di 14
Page 1: ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTA
Page 5 and 6: Centro di Referenza Nazionale per l

Report di validazione del metodo Real Time PCR per il rilevamento ...

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?