Report di validazione del metodo Real Time PCR per il rilevamento ...

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Centro di Referenza Nazionale per la Ricerca di OGMReport di validazione mais MON810Elenco dei partecipanti e strumentazione utilizzataTabella 1: Partecipanti e strumentazione utilizzataAPPA BolzanoARPA Emilia RomagnaARPA Friuli Venezia GiuliaDipartimento Provinciale di PordenoneARPA Friuli Venezia GiuliaDipartimento di TriesteARPA PiemonteARPA Valle d'AostaARPA VenetoASL 10 - FirenzeASL della Provincia di CremonaICycler iQ (BioRad)iCycler (BioRad)iCycler (BioRad)ICycler (BioRad)(BioRad)ICycler IQ5 (BioRad)ABI Prism 7000 (Applied Biosystems)ICycler (BioRad)Gene Amp 5700 SDS (Applied Biosystems)ENSE ABI SDS 7000IZS Abruzzo e MoliseIZS Lazio e ToscanaABI Prism 7900HT Fast Real Time PCR System(Applied Biosystems)ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems)IZS Lombardia e Emilia RomagnaIZS MezzogiornoIZS Piemonte Liguria e Valle d'AostaIZS SardegnaIZS SiciliaIZS Umbria e MarcheIZS VenezieABI Prism 7700 (Applied Biosystems)ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems)ABI Prism 7700 (Applied Biosystems)ABI Prism 7700 (Applied Biosystems)ABI Prism 7700 (Applied Biosystems)ABI Prism 7700 (Applied Biosystems)ABI Prism 7700 (Applied Biosystems)*Uno dei laboratori ha utilizzato il termoblocco a 384 pozzetti.Pagina 4 di 14
Centro di Referenza Nazionale per la Ricerca di OGMReport di validazione mais MON810MaterialiMateriali forniti ai laboratoriStandard: per la calibrazione dello strumento sono stati forniti una aliquota delvolume di 180 µl del plasmide ERM ® -AD413 e una aliquota di 6 ml del rispettivoBuffer di diluizione (TE).Campioni incogniti di DNA: 20 campioni incogniti di DNA marcati da C1 a C20 allaconcentrazione di 20 ng/µl (80 µl).I campioni distribuiti sono stati estratti da:- farine di mais certificate per il contenuto relativo in peso (w/w) di maisMON810 (IRMM), il livello MON810 10 g/kg (1%) è certificato anche per ilcontenuto in un numero di copie di genoma aploide (g.c./g.c.);- un mangime misto non contenente OGM.Tabella 2: Materiali utilizzati per la preparazionedei campioni C1-C20MON810MON810MON810MON810Contenuto e codice deicampioni1,00 ± 0,26 g/kgERM ® -BF413b5,0 ± 0,4 g/kgERM ® -BF413c10,0 ± 0,5 g/kg0,57 ± 0,17 % g.c./g.c.ERM ® -BF413d50,0 ± 1,1 g/kgERM ® -BF413fEtichetta campionidistribuitiC5, C9, C11, C16C1, C4, C14, C18C2, C8, C13, C19C7, C10, C15, C20non OGM Mangime misto C3, C6, C12, C17Reagenti- 2X TaqMan® PCR Universal Master Mix [5 ml]- HMG For (MaiJ-F2) primer (20 pmol/μl) [80 µl]- HMG Rev (mhmg-rev) primer (20 pmol/μl) [80 µl]- HMG (Mhmg) Probe (5 pmol/μl) [200 µl]- MON For (Mail-F1) Primer (20 pmol/μl) [80 µl]- MON Rev (Mail-R1) Primer (20 pmol/μl) [80 µl]- MON (Mail-S2) Probe (5 pmol/μl) [200 µl]- Acqua grado reagente sterile [10 ml]Tabella 3: Sequenza Primer e Probe utilizzatiNome primer Sequenza 5’-3’HMG For TTg gAC TAg AAA TCT CgT gCT gAHMG Rev gCT ACA TAg ggA gCC TTg TCC THMG Probe FAM-CAA TCC ACA CAA ACg CAC gCg TA-TAMRAMON For TCg AAg gAC gAA ggA CTC TAA CgTMON Rev gCC ACC TTC CTT TTC CAC TAT CTTMON Probe FAM-AAC ATC CTT TgC CAT TgC CCA gC-TAMRAPagina 5 di 14
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