Emoglobinopatie strutturali - Andrea Mosca

Analisi Biochimico-Cliniche
(F42038)
Emoglobinopatie strutturali
aa 2008/2009
EMOGLOBINOPATIE
STRUTTURALI
Le emoglobinopatie strutturali (varianti emoglobiniche)
sono difetti di origine genetica dell’emoglobina,
caratterizzati dalla variazione della struttura primaria
della molecola.
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EMOGLOBINOPATIE: BASI MOLECOLARI
1) Mutazione puntiforme:
sinonima UAA -> CAA Leu
missense GUG -> GAG Glu -> Val Hb S
non-sense UAU -> UAA Tyr -> Stop Hb McKees Rock
2) Mutazione puntiforme doppia:
2 eventi genetici: β 6 Glu -> Lys
β95 Lys -> Glu Hb Arlington Park
3) Delezione di una o più triplette:
β 6 Glu -> 0 Hb Leyden
4) Mutazioni frameshift: Hb Takoma +11 aa
5) Crossing over ineguale, non omologo: Hb Lepore
Varianti emoglobiniche più comuni
• Identificate circa 900 varianti diverse.
-Hb S [β6Glu->Val]: Africa (regioni orientali: 40%),
Arabia, India,
bacino Mediterraneo (Sicilia).
-Hb C [β6Glu->Lys]: Africa (regioni occidentali: 20 %).
-Hb E [β26Glu->Lys]: Sud-Est Asiatico (15-30 %).
-Hb D Punjab [β121Glu->Gln]: India Nord-Ovest.
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Ivaldi

Drepanocitosi
(anemia falciforme)
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CLASSIFICAZIONE FUNZIONALE DELLE
EMOGLOBINOPATIE (1/2)
-------------------------------------------------------------------------------------------------
Anormalità Luogo Sintomatol. Esempio
funzionale sostituzione
-------------------------------------------------------------------------------------------------
1) Nessuna Sup. esterna Nessuna Hb G Philadelphia
α68 Asn ->Lys
2) Aggregazione Sup. esterna Anemia emol. Hb S
ridotta solub. (omozigote) β6 Glu ->Val
3) Instabilità Eme/ Anemia emol. Hb Bristol
ridotta solub. contatti subun. β67 Val ->Asp
4) Met Hb His prox./dis. Cianosi Hb M Hyde Park
β92 His -> Tyr
CLASSIFICAZIONE FUNZIONALE DELLE
EMOGLOBINOPATIE (2/2)
-------------------------------------------------------------------------------------------------
Anormalità Luogo Sintomatol. Esempio
funzionale sostituzione
-------------------------------------------------------------------------------------------------
5) Aumentata Contatto α1β2 Eritrocitosi Hb Chesapeake
affinità O2 C-terminale β α92 Arg -> Leu
6) Diminuita Eme/α1β2 affinità O2 9
Cianosi Hb Kansas
β102 Asn ->Thr
7) Ridotta produz. Mutazione Fenotipo Hb Constant
catene α C-terminale α talassemico Spring (α+31)
8) Ridotta prod. Ibrido di fusione Fenotipo Hb Lepore
catene β β talassemico
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1
Il valore della p 50 (pressione
parziale di O 2 nel sangue alla
quale la Hb è saturata al 50%)
esprime la misura dell’affinità
per l’O 2. Normalmente è di circa
27 mmHg.
1. Hb normale
2. Hb aumentata affinità per O 2
p 50 diminuita
curva spostata a sinistra
3. Hb dimunuita affinità per O 2
p 50 aumentata,
curva spostata a destra
Metodiche per la caratterizzazione delle
emoglobinopatie strutturali
• Esami di primo livello:
- Elettroforesi: - acetato di cellulosa
-agar citrato
- HPLC - pattern, Hb A 2, Hb F
- Test per Hb S: - test di solubilità
- test di falcizzazione
- Test Hb instabili: - precipitazione con isopropanolo
- denaturazione al calore
- colorazione corpi di Heinz con BCB
- Derivati emoglobinici (Met Hb)
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Elettroforesi dell’emoglobina
• Supporto: acetato di cellulosa, gel di agarosio
• Condizioni: tampone Tris-EDTA-borato, pH 8.2 - 8.6
350 V, 30 min
• Campione: lisato eritrocitario
caricamento catodico
• Principio: a pH 8.4 le Hb sono cariche negativamente e
migrano verso l’anodo con diverse velocità in
funzione della loro carica netta.
• Colorazione: rosso ponceau, blu coomassie
Elettroforesi su acetato di cellulosa pH 8.4
+ A0 F A2 -
F
J Paris
S
*: anidrasi carbonica
Agenogi
C
*
*
Soggetto normale
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Portatore di Hb Agenogi [β90Glu->Lys]
Portatore di Hb S [β6Glu->Val]
Controllo con Hb C [β6Glu->Lys], Hb S e Hb F
Portatore di Hb J Paris[α12Ala->Asp]
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HPLC dell’emoglobina
• Principio: scambio ionico, le Hb vengono separate in base alla
loro carica elettrica.
• Colonna: contiene una fase stazionaria a scambio cationico (cioè
con gruppi carichi negativamente).
• Campione: lisato eritrocitario. Le diverse Hb (cariche +) presenti
nel campione vengono adsorbite sulla fase stazionaria.
• Eluizione: vengono utilizzati tamponi a pH e forza ionica
crescenti che determinano il distacco selettivo delle
varie frazioni emoglobiniche in rapporto alla loro
carica netta.
• Rivelatore: assorbanza 415 nm
Separazione HPLC (a scambio cationico) di lisato eritrocitario proveniente da
soggetto portatore eterozigote di Hb S [β6Glu Val]. Detector:415 nm
(A 1c=3.4 %; F=0.5 %; A 0=50.9 %; A 2=4.0 %; S=38.5 %).
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Separazione HPLC (a scambio cationico) di lisato eritrocitario proveniente da
soggetto portatore eterozigote di Hb J [α50His Asp]. Detector 415 nm
(A1c=1.7 %; J=25.4 %; A0=60.9 %; A2=1.8 %;):
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HbA
Test di solubilita’ per la HbS
HbS

TEST DI FALCIZZAZIONE
(37 °C overnight)
Soggetto doppio eterozigote per
Hb S e Hb C
Soggetto normale
Test di stabilità al calore per Hb instabili
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• Esami di secondo livello:
- Isoelettrofocalizzazione
- Separazione globine
- Determinazione affinità per O 2
• Esami di terzo livello:
- Studi strutturali sulla proteina
- Studi sul DNA
• Esami complementari:
- Anamnesi (personale, familiare)
- Emocromo, reticolociti
- Bilirubina
- Sideremia, TIBC, Ft, Zn-PP
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