Chimere e coltura in vitro - gruppove.net

Zigote Embrione
Sistema aperto
Sistema chiuso
TESSUTI DIFFERENZIATI
TESSUTI MERISTEMATICI

L’ulteriore sviluppo dell’embrione in pianta adulta
è assicurato dalla proliferazione dei tessuti
meristematici
NON SI REALIZZA IN PRATICA LA SEPARAZIONE
FRA LINEA SOMATICA E LINEA GERMINALE
Fase vegetativa Cambiamento di fase Fase riproduttiva

Lo sviluppo è una continua ripetizione di identici processi ciclici
Organismi ad ontogenesi ricorrente
Totipotenza cellulare
In teoria, la serie di divisioni equazionali cui lo
zigote va incontro nel formare la pianta adulta
produce cellule con identico patrimonio
nucleare… TUTTAVIA ……
DISTURBI DEL CICLO MITOTICO
MODIFICAZIONI DEL
NUMERO E STRUTTURA
DEI CROMOSOMI O
STRUTTURA DEI GENI
TESSUTI E/O ORGANI
MESCOLANZA DI
CELLULE A DIVERSO
PATRIMONIO
NUCLEARE (CHIMERE)

CHIMERE
CHIMERE NUCLEARI
citologiche
genetiche
CHIMERE CITOPLASMATICHE
TOTIPOTENZA Ruolo fondamentale delle mutazioni somatiche
negli organismi vegetali
COSTITUZIONE CHIMERICA DEI TESSUTI DIFFERENZIATI
Chimere da innesto
Endoreduplicazione (G 1 – G 2) Politenia
Aneuploidia Aneusomatia
Mutazioni cromosomiche
Mutazioni geniche nucleari e citoplasmatiche
arancio Bizzarria (1640) arancio amaro/cedro
Cytisus adami (1825) Cytisus purpureus/C. laburnum
Sono la conseguenza dello sviluppo di apici chimerici (cellule delle due specie)

CHIMERE GENETICHE E CITOLOGICHE PERICLINALI
Utili in studi ontogenetici per tracciare la distribuzione dei vari tessuti nella
pianta adulta a partire dagli apici
CHIMERA PERICLINALE:
DIVERSA COSTITUZIONE
GENETICA DEGLI STRATI
TUNICA: divisioni anticline (pareti perpendicolari)
CORPUS: divisioni con pareti a varia inclinazione
Le analisi di molte chimere periclinali hanno
fornito informazioni sull’ontogenesi dei tessuti
Strato L 1 (epidermidi)
Strato L 2 (tessuto
sporigeno)
DA UNA CHIMERA PERICLINALE SI POSSONO INOLTRE OTTENERE
SPONTANEAMENTE O CON AZIONI SPERIMENTALI (Radiazioni)
RIMANEGGIAMENTI DEGLI STRATI A PRODURRE NUOVE CHIMERE

RISTRUTTURAZIONE DELLE CHIMERE (riarrangiamento degli strati)
Poinsettia (a partire dalla varietà rosa Ecke’s pink nuovi apici)
Chimere in patata e in piante a propagazione vegetativa
Ristrutturazione delle chimere con radiazioni ionizzanti
Garofano “white sim” (BRR)
seme
Raggi x
Fiori bianchi screziati
di rosso
Garofani William sim (rossi)
Nelle specie a propagazione vegetativa la presenza di cellule
chimeriche è la norma e non un eccezione. Questa costituzione
genetica va considerata quando si parla di cloni di materiale
propagato vegetativamente

Le ristrutturazioni sono la conseguenza:
Reduplicazioni
Perforazioni
Traslocazioni

Le traslocazioni prevedono una
perforazione ed una
reduplicazione seguite da una
estensione degli strati della tunica
in seguito a divisioni anticline
Passaggio da una chimera BBR
ad una chimera BRB
CITOCHIMERE
Chimere in cui le differenze genetiche fra le
cellule e/o strati riguardano il numero
cromosomico
Per studi ontogenetici sono risultate importanti anche le chimere citologiche
(numeri cromosomici diversi nei diversi strati: es: diplo-tetra-diploidi L1 (2n) –
L2 (4n) – L3 (2n) Analisi microscopica della costituzione citologica dei
tessuti

Materiali vegetali da trattare con mutageni
Generazione M 0: i) semi
ii) organi a propagazione vegetativa
iii) gameti
Generazione M 1
Trattamento mutageno
Mutazioni generalmente
recessive
SEMI E ORGANI A PROPAGAZIONE
VEGETATIVA – MERISTEMI (MULTICELLULARI)
MUTAZIONE EVENTO
CELLULARE
Dopo trattamento mutageno
Chimera a mosaico

E’ nella generazione M 2
che noi possiamo
evidenziare la chimera
CHIMERA A MOSAICO
CHIMERA SETTORIALE
Per mettere in evidenza le mutazioni
recessive indispensabile
l’autofecondazione della
generazione M 1 ed ottenere la
generazione M 2
Continuo sviluppo dell’apice
Le singole cellule mutate
divengono progenitrici di linee
cellulari che vanno ad occupare
un settore
i) L’ampiezza del settore mutato dipenderà dal
numero di iniziali
ii) La trasmissibilità della mutazione alla
generazione successiva dipenderà dalla posizione
nell’apice delle cellule mutate

Generazione M 0: genotipo AA (materiale trattato)
Generazione M 1: genotipo Aa
Generazione M 2: AA + 2Aa + aa (fenotipo mutante)
Se gli organi riproduttivi derivano da una sola cellula iniziale
La segregazione in M 2 = 3:1
Se le cellule iniziali degli organi riproduttivi sono DUE:
Una mutata una normale
Generazione M 2
Cellula normale segregazione 4:0
Cellula mutata segregazione 3:1
Se le cellule iniziali degli organi riproduttivi sono TRE
di cui solo una mutata:
Generazione M 2: segregazione 11:1
Se le cellule iniziali degli organi riproduttivi sono QUATTRO
di cui solo una mutata:
Generazione M 2: segregazione 15:1
7:1

L’analisi delle chimere a mosaico e settoriali consente studi sui processi di sviluppo
i) Determinazione del numero di iniziali di un organo
ii) quali cellule dell’apice partecipano alla formazione di un organo
Il numero di iniziali
dipende dall’ordine
ontogenetico (grado
di differenziazione)
del primordio
Metodo Topografico
Consiste nel seminare la
spiga non sgranata, in
modo da localizzare le
plantule mutate nella loro
posizione spaziale nella
spiga e conseguentemente
nell’apice che ha originato
la spiga

Studi ontogenetici si possono basare anche sull’induzione di
condizioni genetiche a effetto visibile in M 1
In questo caso il materiale M 0 sarà eterozigote (Aa) per geni che
controllano la pigmentazione, la forma delle foglie, fusto, fiori o frutti
(marcatori istogenetici)
L’ampiezza del settore indicherà il numero di cellule iniziali
Specie a propagazione vegetativa si prestano per questi studi essendo presenti
varietà eterozigoti per geni controllanti il colore del fiore dei frutti e delle foglie

Meccanismi modificano l’ampiezza del settore mutato
Selezione diplontica e aplontica
- Le cellule mutate possono avere una vitalità più bassa delle
cellule normali
Deficit di recessivi
Ristrutturazione degli apici per morte cellulare
- Le cellule degli altri strati possono sostituire cellule troppo
danneggiate
COME SI PUO’ OVVIARE AL PROBLEMA DEL CHIMERISMO NEL
TRATTAMENTO MUTAGENO
i)Trattamento degli zigoti (difficile conoscere il preciso momento della fecondazione)
ii)Trattamento dei gametofiti maschili
- spettro diverso delle mutazioni rispetto al trattamento di cellule somatiche
- solo gameti con mutazioni non troppo deleterie sono in grado di fecondare
l’ovocellula (filtro aplontico)

SPECIE AUTOGAME (omozigoti)
SPECIE ALLOGAME (eterozigoti) (linee inbred)
SPECIE A PROPAGAZIONE VEGETATIVA
mutazioni spontanee gemmarie
le mutazioni indotte in queste specie ha trovato larga utilizzazione in
quanto l’ibridazione intra- e inter-specifica richiede un lavoro molto
lungo
Materiale utilizzato nella mutagenesi in specie a propagazione vegetativa:
tuberi, stoloni, rizomi, bulbi, talee, apici meristematici
TRATTAMENTO MUTAGENO
SPECIE A PROPAGAZIONE VEGETATIVA
PERCHE’?
i) GEMME ETEROZIGOTI
MUTAZIONI (GEMMARIE)
GIA’ VISIBILI in M 1
ii) RISTRUTTURAZIONI DELL’APICE CHIMERICO, un tessuto
profondo mutato partecipa alla formazione di un germoglio

chimere
settoriali
omoistonte
normale
(selvatico)
Omoistonte
mutante
Mutazioni gemmarie: Malvasia
rosa su un ceppo di Malvasia di
Candia Aromatica (acino bianco)
chimera
mericlinale
chimera
periclinale

Eterozigosità e chimerismo sono due aspetti genetici comuni nella
piante a propagazione vegetativa
Nelle specie a propagazione
vegetativa come la vite sarà
indispensabile con
opportune operazioni di
potatura, selezione e
moltiplicazione (anche in
vitro) ottenere gemme, e di
conseguenza cloni,
omoistonti per la mutazione
(completamente mutati)

Considerazioni generali
1) Tenere presente il sistema riproduttivo
2) In generale la mutagenesi andrebbe utilizzata quando si vuole migliorare una
varietà per qualche determinata caratteristica senza alterare
profondamente il genotipo.
3) Avere in mente un ideotipo.
4) I materiali ottenuti a seguito del trattamento mutageno possono essere
selezionati direttamente per costituire nuove varietà.
5) I materiali ottenuti possono essere incrociati con linee già esistenti allo
scopo di introdurre in queste caratteri insorti con il trattamento mutageno.
6) Necessario non usare dosi o concentrazioni troppo alte del mutageno per non
indurre più mutazioni nella stessa cellula e indurre soprattutto mutazioni
geniche.
7) Legge delle serie omologhe -ideotipo (Vavilov, 1922)

Totipotenza
L’accrescimento illimitato nelle piante è determinato dall’attività
mitotica di cellule localizzate agli apici: caulinare e radicale
Alla base del
meccanismo di
omeostasi, che
assicura il giusto
bilanciamento tra
cellule meristematiche
in via di
differenziazione e
cellule che devono
rimanere pluripotenti,
esiste l'interazione
molecolare dei prodotti
del gene WUSCHEL
(WUS) e di quelli dei
geni CLAVATA (CLV).

Altri geni, quali SHOOTMERISTEMLESS (STM) e CUP-SHAPED
COTYLEDON (CUC) sono coinvolti nella formazione dell’apice meristematico
caulinare (SAM) in maniera indipendente dal sistema WUS-CLV
L'attività del gene ASYMMETRIC LEAVES1 (AS1)
(arancio in B), che codifica per un fattore di
trascrizione di tipo MYB-ARP reprime l'espressione di
geni KNOX di classe 1 (KNAT1, KNAT2 e KNAT6) (in
violetto in B) e ciò consente alle cellule di differenziare
L’inizio della formazione
dei primordi fogliari si
accompagna a segnali
ormonali (auxina) e ad
una diminuzione
dell’espressione dei geni
"KNOTTED-like
homeobox" (KNOX),
mentre l’espressione dei
geni regolatori di tipo
MYB, omologhi a
PHANTASTICA, marcano
i primi stadi dello sviluppo
delle fogliare.
(stati di determinazione) Ma le cellule vegetali differenziate possono modificare il
loro destino Riacquisire La TOTIPOTENZA

Planaria
I processi di sviluppo delle piante
sono molto flessibili se comparati a
quelli attivi in animali
neoblasti
Transdifferenziazione
Tuttavia, negli animali la sola
cellula in grado di produrre un
organismo completo è lo zigote
Axolotl
Al contrario nelle piante lo zigote non è la sola cellula
capace di sviluppare un embrione

…. Così come cellule differenziate possono iniziare lo sviluppo
di meristemi avventizi e/o embrioni avventizi ….
COMPETENZA ALL’ORGANOGENESI AVVENTIZIA
Lo stato di competenza organogenetica sembra essere associato
all’espressione di geni che codificano per proteine coinvolte nella
trasduzione del segnale legato alle citochinine (CKI1 e CRE1) e
nella ripresa del ciclo cellulare (CDC2a e CycD-3) ad esempio cicline
Successivamente l’ attivazione ectopica di specifici geni regolatori dei
meristemi caulinari quali, WUS, STM (KNOX di classe I) e CLV1 è un
evento molecolare chiave per lo stato di determinazione allo sviluppo di
meristemi avventizi.
Il processo sembra attivato da ormoni: citochinine
Tali risultati sono avvalorati dal fenotipo delle piante sovraesprimenti
geni KNOX di classe I e/o il gene IPT di Agrabacterium tumefaciens.

COMPETENZA ALL’EMBRIOGENESI SOMATICA
Embriogenesi zigotica
Apomittica
Somatica (in vitro, in vivo)
E’ probabile che il controllo genetico dei primi stadi di embriogenesi
zigotica, apomittica, o indotta in vitro, sia fondamentalmente analogo.
Ciò risulta evidente se si considera che l’attività dei geni PICKLE
(PKL), LEAFY COTYLEDON1 (LEC1), LEC1-LIKE (L1L), LEC2 e
FUSCA3 (FUS3) è richiesta durante le fasi di morfogenesi e
maturazione dell’embrione zigotico ma al contempo, la loro sovraespressione
in cellule differenziate può essere sufficiente per indurre
la formazione di embrioni somatici.
Analogamente la trascrizione di SOMATIC EMBRYOGENESIS
RECEPTOR-LIKE KINASE 1 (SERK1), un gene marcatore delle
cellule embriogeniche che codifica per un recettore chinasico si attiva
non soltanto nell’embriogenesi zigotica ed in quella somatica, ma
anche nella nucella della specie apomittica Poa pratensis.

I diversi processi di embriogenesi
nelle piante condividono un controllo
ormonale basato su tre classi
principali: auxina, acido abscissico
(ABA) e gibberelline (GAs).
auxine
I geni della famiglia PIN-FORMED
(PIN), che codificano per proteine
di trasporto in uscita dell’auxina,
svolgono un ruolo chiave
determinando la polarità del flusso
ormonale nelle cellule
dell’embrione in formazione
La realizzazione di domini cellulari
con distribuzione asimmetrica
dell’auxina è importante durante
l’iniziazione in vivo di primordi e in
vitro nei processi di iniziazione dell’
embriogenesi somatica

acido abscissico (ABA) e gibberelline (GA)
Intervengono nel controllo fisiologico dell’embriogenesi soprattutto nella fase
di maturazione dell’embrione e di germinazione del seme.
Nell’embriogenesi zigotica è attiva una regolazione a feed-back positivo:
l’ABA ha un effetto positivo sulla sintesi delle sostanze di riserva attraverso
l’attivazione di LEC1 e FUS3 mentre la trascrizione di FUS3 stimola la sintesi
di ABA.
E’ stato ipotizzato che i rapporti reciproci di ABA e GA siano importanti anche
nella fase di morfogenesi dell’embrione e, addirittura, nell’induzione di un
nuovo destino cellulare (competenza embriogenica) grazie ad un
meccanismo di regolazione che include i geni LEC.

ABA

Molti studi hanno chiarito aspetti fondamentali della regolazione delle ultime fasi
dell’embriogenesi somatica, ma il quadro complessivo dei meccanismi
molecolari, cellulari e biochimici che sono alla base dell’omeostasi delle cellule
pluripotenti e del cambiamento del destino cellulare è tuttora incompleto.
La semplice espressione ectopica di alcuni fattori di trascrizione [ad es. LEC1,
LEC2, BABY BOOM (BBM), WUSCHEL (WUS) e AGOMOUS-LIKE15 (AGL15)]
può determinare l’induzione di embrioni somatici in tessuti differenziati
La sovraespressione di WUS appare reprimere l’attività di LEC1, mentre
AGL15, che è attivato dall’espressione ectopica di LEC2, è in grado a sua volta
di regolare SERK1.
Tuttavia, l’espressione dei geni LEC1, LEC2, BBM, WUS e AGL15 nella cellula
uovo o nello zigote non è ancora stata dimostrata e rimane tuttora da valutare
se l’espressione ectopica di questi geni possa causare qualche tipo di stress
ed attivare una risposta tale da indurre indirettamente un cambiamento del
destino cellulare

MECCANISMI EPIGENETICI E TOTIPOTENZA
La capacità di una cellula vegetale di riacquisire totipotenza è
espressione del fatto che il differenziamento cellulare non implica la
perdita dell'informazione contenuta nell'intero patrimonio genetico.
CELLULA
DIFFERENZIATA
generale revisione del profilo di espressione
cambiamento della struttura cromatinica
1) Variazioni nei rapporti eucromatina/eterocromatina
2) Metilazione del DNA
CELLULA
EMBRIOGENICA
Il ruolo fondamentale della struttura cromatinica nell’acquisizione della
totipotenza è avvalorata dalla caratterizzazione del mutante pickle
PICKLE codifica per la subunità di un complesso “Chromodomain
Helicase DNA-binding protein 3" (CHD3) che induce la repressione di geni
inducibili mediante deacetilazione istonica

Alcuni risultati suggeriscono un ruolo chiave delle proteine polycomb
(PcG) nella riprogrammazione dell’espressione genica che sottende al
cambiamento del destino cellulare
PcG Silenziamento genico
Mutazioni a carico di PcG:
Struttura cromatina
Metilazione istonica
- mutanti che esprimono ectopicamente geni KNOX
- mutanti caratterizzati dallo sviluppo di endospermi (fie) e
del seme (fis) in assenza di fertilizzazione
Ciò dimostra che in condizioni normali, un meccanismo di controllo
basato sulla struttura della cromatina reprime il programma
embrionale fino al compimento della fertilizzazione
La natura molecolare della totipotenza rimane un mistero. Un
obbiettivo affascinante è comprendere la natura dei segnali che
rimuovono il controllo epigenetico della differenziazione cellulare

Colture in vitro: Variabilità genetica
1939 White, Gutheret, Nobencourt CRESCITA ILLIMITATA IN VITRO
APICI CAULINARI CLONAZIONE DI PIANTE IN VITRO
Tessuti differenziati
somatici ed aploidi
Organogenesi
avventizia
Uniformità genetica
i) conservazione, materiali di alto valore
ii) micropropagazione virus esente
Coltivati in vitro in presenza di ormoni
Callo
Rigenerazione
Embriogenesi
avventizia (somatica,
andro- gino-genetica)

Applicazioni tecniche di coltura in vitro
1) Micropropagazione
2) Ottenimento di ibridi somatici mediante fusione di protoplasti
3) Recupero di embrioni di ibridi interspecifici o intergenerici
4) Ottenimento di linee aploidi via androgenesi e ginogenesi
5) Selezione di linee cellulari resistenti a stress biotici ed abiotici
6) Selezione di linee cellulari per la produzione di metaboliti
secondari
7) Sfruttamento della variabilità genetica indotta dalla coltura in vitro
per l’ottenimento di mutanti
8) Trasformazione genetica

Variabilità genetica
1) CONDIZIONI GENETICHE IN VIVO (variabilità in vivo)
2) VARIABILITA’ GENETICA INDOTTA DURANTE LA FORMAZIONE E
SVILUPPO DEL CALLO
3) VARIABILITA’ GENETICA NELLE PIANTE RIGENERATE
1) CONDIZIONI GENETICHE IN VIVO
GIMNOSPERME e 20% ANGIOSPERME (APIACEAE , ASTERACEAE)
Le cellule differenziano nello stato diploide con la quantità nucleare di DNA 2C
(Fase G1) G2 (2C)
G1 S
(2C-4C)
(4C)
M
(2C)
(2C)
STRETTO CONTROLLO DELLA SEQUENZA SINTESI DNA MITOSI
MA 80% ANGIOSPERME ENDOREDUPLICAZIONI DURANTE IL
PROCESSO DI DIFFERENZIAZIONE (8C, 16C, 32C, 64C)

TESSUTI: CELLULE DIPLOIDI
CELLULE ENDOREDUPLICATE
CELLULE ENDOREDUPLICATE
2C 4C 8C
8C 2n diplocromosomi
POLISOMATIA
16C 2n quadruplocromosomi
Se entrano in mitosi POLIPLOIDIA
ALCUNE CELLULE DIFFERENZIATE ANEUPLOIDI
TESSUTI: CELLULE DIPLOIDI
CELLULE ANEUPLOIDI
ANEUSOMATIA
NEI TESSUTI DIFFERENZIATI SONO PRESENTI ANCHE CELLULE CON:
Mutazioni cromosomiche
Mutazioni geniche (nucleari e citoplasmatiche)
IN CONCLUSIONE: UN TESSUTO, UN ORGANO, UNA PIANTA SONO
MOSAICI GENETICI CHIMERE

PROCESSI NUCLEARI DURANTE LA CALLOGENESI
Variabiltà indotta
TESSUTI IN VITRO STIMOLI ORMONALI
1) MITOSI
2) ENDOREDUPLICAZIONE SEGUITA DA MITOSI
3) FRAMMENTAZIONE NUCLEARE SEGUITA DA MITOSI
1a) Mitosi da cellule diploidi calli diploidi
1b) Mitosi da cellule endoreduplicate (ER) calli poliploidi
1c) Mitosi da cellule ER e diploidi calli mixoploidi
1d) Mitosi da cellule diploidi e aneuplodi calli aneusomatici
2) ER SEGUITA DA MITOSI
stimolata soprattutto da trattamenti ormonali
in specie prone all’ER (Nicotiana, Datura)

3) FRAMMENTAZIONE NUCLEARE (AMITOSI) SEGUITA DA MITOSI
MITOSI
INFLUENZATA
NOTEVOLMENTE DAI
RAPPORTI ORMONALI:
ALTI RAPPORTI
AUXINE/ CITOCHININE
CALLI CON CELLULE A NUMERI
CROMOSOMICI MOLTI SQUILIBRATI
(anche aploidi)
PROGRESSIVA SELEZIONE
MITOTICA NEL CALLO A
Tuttavia: le cellule con frammenti
FAVORIRE LE CELLULE
nucleari entrano in mitosi con difficoltà
DIPLOIDI
DURANTE LE FASI DI CALLOGENESI, SPECIALMENTE SE MOLTO
PROTRATTA LE CELLULE IN DIVISIONE VANNO INCONTRO AD UN
ULTERIORE VARIAZIONE GENETICA CHE DIPENDE:
Caratteristiche del materiale di partenza
Condizioni di coltura (ormoni)

ULTERIORI MECCANISMI CHE INDUCONO VARIABILITA’ GENETICA
1) ABORTI DI FUSO MITOTICO POLI- E ANEUSOMATIA
2) FUSIONE DI NUCLEI POLIPLOIDIA
3) CROMOSOMI RITARDATARI ANEUPLOIDIA
4) FUSI MULTIPOLARI ANEUPLOIDIA
5) MUTAZIONI CROMOSOMICHE (dicentrici, anelli)
6) REPLICAZIONE TARDIVA DI REGIONI ETEROCROMATICHE
7) MUTAZIONI GENICHE
8) CROSSING OVER MITOTICI
9) ATTIVAZIONE DI ELEMENTI MOBILI TRASPONIBILI
VARIABILITA’ GENETICA NELLE PIANTE RIGENERATE
a) Organogenesi avventizia
b) Embriogenesi avventizia
Origine multicellulare (chimerismo)
Origine unicellulare (mutanti solidi)

NON TUTTA LA VARIABILITA’ GENERATA DALLA COLTURA IN VITRO E’
RECUPERABILE
Variabilità
T0 Espianto
Fasi della rigenerazione
Da cellule meno
danneggiate
Le piante rigenerate (R 1) Autofecondazione Generazione R 2
Nella generazione R 2 si evidenzia il
controllo genetico di eventuali
mutazioni indotte e/o recuperate
Variabilità genetica
recuperata
Considerando l’origine pluricellulare
dei germogli avventizi (chimerismo)
DEFICIT di RECESSIVI in R 2

IBRIDAZIONE SESSUALE
interspecifica
intergenerica
IBRIDAZIONE SOMATICA
Incompatibilità pre-zigotica
Incompatibilità post-zigotica
FUSIONE DI PROTOPLASTI, CELLULE
PRIVATE DI PARETE ISOLATE DA DUE
SPECIE DISTINTE
1) Isolamento soluzioni enzimatiche
2) Fusione (eterocarionte)
3) Isolamento eterocarionti
4) Riformazione della parete mitosi
5) Callogenesi e rigenerazione delle piante ibride
embryo rescue
Dicarion
Sincarion
6) Caratterizzazione genetico molecolare delle piante ibride

FUSIONE DEI PROTOPLASTI
1) METODI CHIMICI PEG, Ca 2+ , elevato pH
2) METODI FISICI ELETTROPORAZIONE
METODI CHIMICI
Il PEG è altamente idrosolubile con carica leggermente negativa, che gli
consente di unirsi con i gruppi carichi positivamente delle membrane cellulari
Il PEG agisce come ponte molecolare fra due protoplasti
La fusione avviene durante il lavaggio
Ridistribuzione delle cariche elettriche
Sulla superficie delle membrane
FUSIONE

I PROTOPLASTI SONO IMMERSI IN UNA
SOLUZIONE CON DUE ELETTRODI CHE
GENERANO UN CAMPO ELETTRICO A
CORRENTE ALTERNATA
IMPULSI DI CORRENTE CONTINUA AD
ALTO VOLTAGGIO
METODI FISICI
Allineamento dei protoplasti
(dielettroforesi)
Rottura nella membrana nei
punti di contatto
Ponti citoplasmatici
FUSIONE
Dopo 24-48 ore RICOSTRUZIONE
PARETE
DIVISIONI MITOTICHE CALLO RIGENERAZIONE ANFIDIPLOIDE
Riconoscimento protoplasti ibridi
-Separazione meccanica (sedimentazione, micromanipolatori)
-Caratteristiche morfologiche
-Complementazione genica

1) IBRIDI SOMATICI SIMMETRICI (coinvolge i due nuclei e citoplasmi parentali)
individui poliploidi instabili a livello genomico
Incompatibilità somatica
2) IBRIDI SOMATICI ASIMMETRICI
quando una delle due specie, considerata ricevente, viene arricchita
soltanto di una parte del genoma dell’altra specie (donatrice)
RAGGI X
SPECIE DONATRICE (citoplasti) + SPECIE RICEVENTE (miniprotoplasti)
IBRIDI CITOPLASMATICI (CI-IBRIDI)
Trasferimento di geni localizzati nel genoma plastidiale e/o mitocondriale
- Resistenza ad erbicidi
- Maschiosterilità
I protoplasti sono utilizzati in esperimenti di trasformazione genetica

APLOIDI IN VIVO PARTENOGENOSI DA OVOCELLULE APLOIDI NON
FECONDATE o DA SINERGIDI (aploide-diploide)
APLOIDI IN VITRO antere
polline
ovuli
1964 Guha e Maheshwari in Datura inoxia
ANDROGENESI
DIRETTA
INDIRETTA
ANDROGENESI
GINOGENESI
Fattori fondamentali ai fini dell’androgenesi:
-genotipo
-stadio di sviluppo delle antere
Embrioni aploidi
Germogli o embrioni aploidi
Il processo di differenziazione gametofitica può essere deviato
verso quello sporofitico esclusivamente in corrispondenza di un
preciso stadio di sviluppo del granello pollinico (tetrade o
uninucleato)

In molte specie è stata
osservata la presenza
di forme atipiche di
granuli pollinici non in
grado di germinare
Mitosi del nucleo
vegetativo
Sviluppo di tipo
sporofitico
Aploidi in vitro

L’androgenesi puo essere
diretta o indiretta
Nel caso di rigenerazione
indiretta il callo va spesso
incontro a fenomeni di
diploidizzazione

IMPORTANZA DEGLI APLOIDI IN GENETICA
1) studi di dosaggio genico
2) riconoscimento immediato delle mutazioni
3) omozigosi (trattamento con colchicina) – linee inbred
4) produzione di linee pure in specie autoincompatibili
5) studi filogenetici
L’androgenesi è stata ampiamente utilizzata anche in specie arboree dove
l’ottenimento di linee omozigoti è difficilmente perseguibile
Costituzione di piante aploidi
e diaploidi
-Studio del controllo genetico
di alcuni caratteri
-Ottenimento di portainnesti
uniformi da seme ibrido
-Sfruttamento del materiale in
esperimenti di mutagenesi