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Il SAC, sistema di controllo nella<br />
divisione cellulare<br />
IFOM per la scuola<br />
Lo Studente Ricercatore 2011<br />
<strong>Villani</strong> Yuri<br />
Liceo Scientifico Tecnologico Chimico-Biologico<br />
IIS A. Maserati - Voghera(PV)<br />
Gruppo: Biologia cellulare computazionale<br />
Tutor: Luca Mariani, Elena Chiroli
La scelta del lievito per lo studio<br />
Perché scegliere il lievito?<br />
Sceglierlo ha diversi vantaggi:<br />
1) Ciclo cellulare molto veloce;<br />
2) Facilità di mantenimento;<br />
3) Dimensioni molto ridotte, quindi<br />
colture poco ingombranti;<br />
4) Genoma conosciuto;<br />
5) Facilità nel bioingegnerizzarlo;<br />
6) Nessun problema etico. Tratto da: www.atlantebotanica.unito.it
Il ciclo cellulare<br />
Tratto da: www.torinoscienza.it<br />
Il ciclo cellulare comprende<br />
tutta la vita di una cellula.<br />
Alcuni passaggi sono critici<br />
per il successo della<br />
divisione. Il primo è la<br />
duplicazione del DNA in<br />
fase S(ci è utile per le<br />
analisi al FACS perché in<br />
base alla quantità di DNA<br />
capiamo qual è la fase<br />
cellulare, il secondo è la<br />
connessione microtubulicentromero<br />
in fase G2.
Un po' di teoria: la mitosi<br />
La mitosi è il processo che<br />
permette alla cellula singola la<br />
divisione in due cellule figlie. È<br />
una fase delicata perché qui<br />
avviene la separazione dei<br />
cromatidi fratelli, con un'alta<br />
probabilità di incorrere in errori<br />
che potrebbero portare a<br />
mutazioni nel corredo genetico.<br />
Processo schematizzato<br />
della mitosi<br />
Tratto e modificato da<br />
www.camperperlascienza.ibc.cnr.it
Prima e dopo il punto critico:<br />
Tratto da: www.bassilo.it<br />
metafase e anafase<br />
Nella metafase avviene il<br />
collegamento tra i<br />
microtubuli e i centromeri.<br />
Centrosoma<br />
In anafase, i centrosomi creano<br />
una tensione sui microtubuli che<br />
fa separare e migrare nei<br />
rispettivi poli i cromatidi fratelli.<br />
T<br />
Tratto da:www.bassilo.it
Cos'è il SAC?<br />
Il SAC(Spindle Assembly Checkpoint) è un meccanismo<br />
che permette alla cellula di arrestare la divisione prima<br />
dell'anafase in caso di anomalie nella struttura del fuso<br />
mitotico o, in assenza di errori, fino a che tutti i microtubuli<br />
si sono uniti correttamente ai centromeri.<br />
Tratto da:<br />
www.mcb.harvard.edu
Perché avviene l'arresto?<br />
L'arresto in metafase<br />
avviene nel caso in cui<br />
un microtubulo non è<br />
correttamente legato al<br />
centromero.<br />
In mancanza dell'arresto,<br />
durante la migrazione dei<br />
cromatidi verso i poli, il<br />
microtubulo opposto a<br />
quello non collegato<br />
trainerebbe due cromatidi<br />
al posto di uno.<br />
Tratto e modificato da: www.fulviobaldanza.it
Come avviene l'arresto?<br />
La mancata connessione<br />
dei microtubuli con i<br />
centromeri, induce la<br />
formazione di un<br />
complesso con Mad2<br />
scatenando una cascata di<br />
eventi che portano alla<br />
inibizione della separasi e<br />
al blocco del fuso mitotico<br />
impedendo così la<br />
divisione dei cromatidi in<br />
modo errato.<br />
Tratto da: www.nationwidechildrens.org
In laboratorio<br />
Ricreare il SAC in laboratorio ci permette di<br />
studiarlo.<br />
Come attivarlo?<br />
2 metodi principali:<br />
Sovraespressione della proteina Mad2<br />
grazie ad una inserzione Gal-Mad2.<br />
Distruggendo fisicamente il fuso mitotico<br />
con il nocodazolo.<br />
Noi utilizzeremo la sovraespressione di<br />
Mad2.
Inserzione Gal-Mad2<br />
Il gene Gal-Mad2 viene inserito per<br />
trasformazione all'interno del corredo<br />
genetico del lievito. Permette alla<br />
cellula, in presenza di galattosio(Gal),<br />
una produzione di Mad2 circa 20<br />
volte quella naturale. Si possono fare<br />
più inserzioni(Gal-Mad2 1x, 2x, 3x,<br />
cioè 20, 40, 60 volte l'endogeno).
Primo passo: la coltura<br />
Si prepara una coltura<br />
con il ceppo che ci<br />
interessa e dopo il rilascio<br />
da alpha-factor(un<br />
ormone che ci permette di<br />
avere le cellule tutte alla<br />
stessa fase del ciclo)si<br />
tratta con sostanze<br />
diverse in base allo studio<br />
da fare e si prendono<br />
campioni ad intervalli<br />
regolari.<br />
Cellule ciclanti, prima del<br />
trattamento con alpha-factor.
Ceppo Gal-Mad2 in galattosio<br />
Dopo il rilascio, nella<br />
coltura si aggiunge<br />
del galattosio.<br />
Questo zucchero<br />
attiva il promotore<br />
Gal-Mad2 che<br />
sovraesprime la<br />
produzione della<br />
proteina Mad2<br />
causando l'arresto.<br />
Cellule bloccate in metafase,<br />
si può dedurre dalla<br />
grandezza delle gemme.
Il FACS<br />
Il FACS è uno strumento che permette la<br />
misurazione della quantità di DNA in una cellula.<br />
Come? I campioni prelevati vanno trattati con<br />
ioduro propidio che si lega al DNA. Il propidio<br />
emana una fluorescenza letta dal FACS. In base<br />
alla quantità di fluorescenza rilevata si capisce<br />
se la cellula è in fase G1 oppure in fase G2. Se<br />
tutte le cellule di un campione sono in fase G2<br />
vuol dire che siamo riusciti a creare un blocco<br />
efficace.
Leggere i dati del FACS<br />
Il FACS invia<br />
al computer<br />
collegato dei<br />
grafici che sta<br />
al ricercatore<br />
interpretare.<br />
N° di<br />
cellule<br />
Quantità di DNA rilevata; fase<br />
G1 o fase G2. Se va oltre si è<br />
in presenza di cellule lisate,<br />
cioè distrutte.
Risultati dell'esperimento<br />
Nel caso di 3 inserzioni di<br />
Gal-Mad2 il blocco dura per<br />
oltre 7 ore.
In ultimo ma non meno importante<br />
Ma alla fine, cosa serve conoscere il SAC<br />
alla ricerca sul cancro? Conoscere in modo<br />
perfetto il checkpoint, ci farebbe capire<br />
come alcune cellule possano proliferare in<br />
modo anomalo, quindi cercare soluzioni più<br />
mirate in una eventuale nuova terapia.