Biofisica: la complessità della vita e la semplicitÃ

Biofisica: la
complessità della
vita e la
semplicità della
fisica
Velia Minicozzi

Dal genoma:
… ACU UUC CGU AAC…
Alla sequenza proteica:
… THR PHE ARG ASN…
DNA
amino
acidi
Studio di biosistemi
con metodologie…
amino
acidi
THR
PHE
ARG
ASN
stato
unfolded
...sperimentali
folding
intermedio
Anello di
sincrotrone
stato
nativo
Risonanza Magnetica
Nucleare
Struttura e funzione della proteina
Risonanza
Paramagnetica
Elettronica
Spettroscopia
LASER

Dal genoma:
… ACU UUC CGU AAC…
Alla sequenza proteica:
… THR PHE ARG ASN…
DNA
amino
acidi
Studio di biosistemi
con metodologie…
amino
acidi
THR
PHE
ARG
ASN
stato
unfolded
...numerico/teoriche
folding
intermedio
stato
nativo
Struttura e funzione della proteina

Dal genoma:
… ACU UUC CGU AAC…
Alla sequenza proteica:
… THR PHE ARG ASN…
DNA
amino
acidi
Applicazione di
tecniche biofisiche a
problemi…
amino
acidi
THR
PHE
ARG
ASN
stato
unfolded
…di fisica
medica
folding
intermedio
stato
nativo
Struttura e funzione della proteina
TERA – Fondazione per Adroterapia Oncologica
La Fondazione TERA ha come scopo lo sviluppo,
in Italia e all'estero, delle tecniche di
radioterapia basate sull'uso di particelle
adroniche e, più in generale, delle applicazioni
della fisica e dell'informatica alla medicina e alla
biologia.

Corso di Laurea in Fisica
Laurea Triennale (180 cfu)
Laurea Magistrale (120 cfu)
Laurea Magistrale in Fisica
indirizzo
Fisica dei Biosistemi
tre sotto-indirizzi
Teorico-Numerico, Sperimentale, Medico
Per informazioni riguardanti i curricula in Fisica dei Sistemi
Biologici e le modalità di accesso alla Laurea Magistrale provenendo
da altri curricola di Scienze, potete telefonare o spedire una email
alla Prof.ssa Silvia Morante: Tel. 06 72594554, email:
silvia.morante@roma2.infn.it

Problema
medico
Problema
biologico
“Strumento”
fisico
“Strumento”
matematico
Modello di funzionamento
Conoscenza
Azione
terapeutica

Proteine
• Proteina = polimero lineare composto di aminoacidi legati tramite
un legame peptidico
1. Sequenza aminoacidica
2. struttura locale della catena
aminoacidica
3. Struttura 3D della molecola
4. Distribuzione spaziale di subunità
differenti non legate da legami
covalenti

Folding & Misfolding
•Il folding delle proteine dipende
dalla loro struttura primaria ma
anche da altre caratteristiche
(pH, membranes, metal ions)
• Errori nel folding delle
proteine sono alla base di
malattie dette Protein
Conformational Disorders
(PCD)
β-sheet ⊥ fibril
axis
• In molte PCD le proteine
misfolded sono ricche in
struttura β e formano aggregati

PCDs
Sono state osservate circa
20 PCD
•Molte di loro colpiscono
il Sistema
Nervoso
Centrale
Clinical Syndrome
Alzheimer’s Disease
Spongiform encephalopathies
Parkinson’s disease
Type II diabetes
Thyroid carcinoma
Atrial amyloidosis
Amyotrophic lateral sclerosis
Huntington disease
Primary systemic amyloidosis
Secondary systemic amyloidosis
Senile systemic amyloidosis
Familial amyloidotic polyneuropathy I
Familial amyloidotic polyneuropathy II
Familial Mediterranean fever
Hemodialysis-related amyloidosis
Finnish hereditary systemic amyloidosis
Lysozyme systemic amyloidosis
Insulin-related amyloidosis
Fibril Subunit
Aβ-peptide
Prion protein
α-synuclein
Amylin
Procalcitonin
Atrial natriuretic factor
Superoxide dismutase
Glutamine
Ig light chains
Serum amyloid A
Transthyretin (wild tipe)
Transthyretin (mutant)
Apolipoprotein A1
Serum amyloid A
β2-microglobulin
Gelsolin (mutant)
Lisozime
Insulin

Malattie da Prioni:
Encefalopatia spongiforme trasmissibile (TSE)
Un gruppo di malattie trasmesse (?) da una proteina (il
prione)
BSE (mucca pazza)
Scrapie
Malattia di Creutzfeldt-Jacob (CJD)
Prove istologiche (post(
mortem)
nel cervello: vacuoli
circondati
da depositi di placche

Alzheimer
Malattia neurologica progressiva
debilitante che porta a perdita
irreversibile di memoria ed altre
capacità, fino alla completa
dipendenza da assistenza. Tempo
di sviluppo: circa 8 anni dopo la
diagnosi.
Diagnosi per mezzo di test
neuropsicologici
Prove istologiche
(post mortem) nel
cervello: depositi di
placche amiloidi (in
vivo con PET)

tem fotomicrografia di una sezione istologica del tessuto del ce
• Malattia di Alzheimer
• Encefalopatie spongiforme Trasmissibile (TSEs):
nell’uomo: malattia di Creutzfeldt-Jakob
sporadica
familiare
iatrogenica
variante
nella pecora: Scrapie
nei bovini: Encefalopatia Bovina Spongiforme
• Malattia di Parkinson; Demenza con corpi Lewy
• Sclerosi amiotrofica laterale
• Malattia di Huntington
agnosi in vivo con Tomografia da emissione di positroni (PET)

Cosa hanno in comune?
Formazione di fibrille amiloidi che costituiscono il centro
del deposito
100 nm
Le fibrille si formano per aggregazione di peptidi o
proteine che vivono spesso un’esistenza da Dr. Jekyll - Mr.
Hyde (PrP, APP, α-sinucleina) nel processo folding -
misfolding.
Un ruolo importante, come “pozione“
magica” o
come “antidoto”,“
è forse giocato da metalli come

proteine diverse che formano fibrille
non hanno omologie né strutturali né chimiche
ma
utte le fibrille da amiloidi presentano notevoli somiglianze
proprietà istologiche
morfologia
Scale bar: 100 nm
fibrille che legano congo-dye
strutture cross-beta
β-foglietti: ⊥ asse
della fibrilla

Human body: ~7 x 10 27 atoms
99% : C, H, O and N;
87%: are either H or O;
but 41 different elements
Estimated Atomic Composition of a lean 70-kg Male Human Body
Element Sym # Atoms Element Sym # Atoms Element Sym # Atoms
Hydrogen H 1 4.22 x 10 27 Rubidium Rb 37 2.2 x 10 21 Zirconium Zr 40 2 x 10 19
Oxygen O 8 1.61 x 10 27 Strontium Sr 38 2.2 x 10 21 Cobalt Co 27 2 x 10 19
Carbon C 6 8.03 x 10 26 Bromine Br 35 2 x 10 21 Cesium Cs 55 7 x 10 18
Nitrogen N 7 3.9 x 10 25 Aluminum Al 13 1 x 10 21 Mercury Hg 80 6 x 10 18
Calcium Ca 20 1.6 x 10 25 Copper Cu 29 7 x 10 20 Arsenic As 33 6 x 10 18
Phosphorus P 15 9.6 x 10 24 Lead Pb 82 3 x 10 20 Chromium Cr 24 6 x 10 18
Sulfur S 16 2.6 x 10 24 Cadmium Cd 48 3 x 10 20 Molybdenum Mo 42 3 x 10 18
Sodium Na 11 2.5 x 10 24 Boron B 5 2 x 10 20 Selenium Se 34 3 x 10 18
Potassium K 19 2.2 x 10 24 Manganese Mn 25 1 x 10 20 Beryllium Be 4 3 x 10 18
Chlorine Cl 17 1.6 x 10 24 Nickel Ni 28 1 x 10 20 Vanadium V 23 8 x 10 17
Magnesium Mg 12 4.7 x 10 23 Lithium Li 3 1 x 10 20 Uranium U 92 2 x 10 17
Silicium Si 14 3.9 x 10 23 Barium Ba 56 8 x 10 19 Radium Ra 88 8 x 10 10
Fluorine F 9 8.3 x 10 22 Iodine I 53 5 x 10 19
Iron Fe 26 4.5 x 10 22 Tin Sn 50 4 x 10 19
Zinc Zn 30 2.1 x 10 22 Gold Au 79 2 x 10 19 TOTAL 6.71x10 27
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
1 H He
1 2
2 Li Be B C N O F Ne
3 4 5 6 7 8 9 10
3 Na Mg Al Si P S Cl Ar
11 12 13 14 15 16 17 18
4 K Ca Sc Ti V Cr Mn Fe Co Ni Cu Zn Ga Ge As Se Br Kr
19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36
5 Rb Sr Y Zr Nb Mo Tc Ru Rh Pd Ag Cd In Sn Sb Te I Xe
37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54
6 Cs Ba * Hf Ta W Re Os Ir Pt Au Hg Tl Pb Bi Po At Rn
55 56 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86
7 Fr Ra ** Rf Db Sg Bh Hs Mt Uun Uuu Uub
87 88 104 105 106 107 108 109 110 111 112
* La Ce Pr Nd Pm Sm Eu Gd Tb Dy Ho Er Tm Yb Lu
57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71
** Ac Th Pa U Np Pu Am Cm Bk Cf Es Fm Md No Lr
89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103
Element Groups (Families)
Alkali Earth Alkaline Earth Transition Metals
Rare Earth Other Metals Metalloids
Non-Metals Halogens Noble Gases

I reni
Dove vanno i metalli
Fe: livello medio accumulato nel corpo: 3÷4 gr
Zn: livello medio accumulato nel corpo: 1.5 ÷2.5 gr
Cu: livello medio accumulato nel corpo : 50÷120 mg
(la maggior parte nel fegato)
0.5% del totale del peso ricevono il 25% del flusso di sang
⇓
Concentrano le sostanze di scarto inclusi i metalli
Fegato
Funzione primaria: rimuovere gli agenti tossici
⇓
è carico di enzimi che distruggono composti
chimici estranei
⇓
è il primo organo ad essere esposto a metalli
tossici

Polmoni
I metalli entrano per inalazione
⇓
Tutto il sangue passa per i polmoni molte volte al giorn
⇓
Le sostanze tossiche hanno molte opportunità di
entrare nel flusso sanguigno
Sistema Nervoso Centrale
Molti metalli tossici possono attraversare
la barriera emato-encefalica
⇓
Le cellule nervose non possono rigenerarsi
una volta danneggiate
Gli ioni metallici possono danneggiare le cellule cerebrali
direttamente
disturbando l’equilibrio elettrochimico
promuovendo il mis-folding

Come può essere d’aiuto la
Fisica nella soluzione di tali
problemi?
Fisica Sperimentale

Spettroscopia
spectrum (apparenza, immagine) + σκοπεω (osservo)
Radiazione ElettroMagnetica (EM)
(luce visibile, radiazione UltraVioletta e Infrarossa, MicroOnde,
RadioFrequenza, raggi X, ...)
Composizione, struttura e proprietà della
materia
EM ⇔ materia
⇓
scambio di energia
assorbimento ⇒ atomi e molecole “eccitati” ⇒
l’energia EM è trasferita al moto (rotazionale,
vibrazionale, elettronico, …) di atomi e molecole
atomi e molecole “eccitate” tornano nello stato
fondamentale ⇒ emissione energia EM

TIPI di SPETTROSCOPIA
Tipo di
Processo

I raggi X
Conrad Wilhelm Röntgen 1845
-1923
Fisico
8 Novembre 1895 - Scoperta dei
raggi X
1901 - Premio Nobel per la Fisica
“in riconoscimento dello straordinario
servizio reso per la scoperta delle
importanti radiazioni che in seguito
presero il suo nome”

La prima radiografia medica eseguita da
Röntgen il 22 dicembre 1895 alla mano
sinistra della moglie Anna Berthe. È visibile
anche l'anello (Hand mit Ringen)

Sorgenti di luce
Le sorgenti di luce (www.lightsources.org) sono
sorgenti di radiazione eccezionalmente intensa,
fortemente focalizzata di raggi X e radiazione
ultravioletta, e infrarossa, basate sugli
acceleratori di particelle che rendono possibile
sia la ricerca di base in campi quali la fisica e la
biologia sia la ricerca applicata.

Guardare l’invisibile
(Credit: Argonne National Laboratory)
Il successo dei tentativi di rendere visibile l’invisibile dipende,
tra le altre cose, da come la luce di determinata lunghezza
d’onda e di sufficiente intensità possa essere concentrata su un
campione.
E’ come guidare di notte è necessaria un’illuminazione
intensa davanti all’auto

Luce di Sincrotrone
Nelle sorgenti di luce si sfrutta il fatto che
quando particelle cariche vengono
accelerate, emettono luce (irradiano).
Se gli elettroni vengono accelerati avanti e
indietro in un antenna a frequenze di kHz o
MHz, essi irradiano nella parte dello spettro
elettromagnetico delle onde radio o TV.
Se gli elettroni sono costretti a muoversi su
percorsi circolari e vengono accelerati verso
l’interno della curva, essi irradiano e noi
chiamiamo quella radiazione: luce, o
radiazione, di sincrotrone.
La luce deve anche essere collimata con specchi parabolici, che
accrescono ciò che si chiama brillanza. Questo è precisamente ciò
che fa una sorgente di luce di sincrotrone: produce un alto flusso
e lo concentra in un raggio molto sottile, come richiesto dalla
maggior parte delle applicazioni di raggiX.

ELETTRA

DAFNE

ESRF - Grenoble

Una sorgente di luce di sincrotrone comprende (1)
pistola di elettroni, (2) un acceleratore lineare, (3) un
sincrotrone supplementare, (4) un anello, (5) le linee e
(6) le stazioni sperimentali. (Courtesy: Australian
Synchrotron, Illustrator: Michael Payne)

Cos’è il Free Electron Laser?
Il FEL è un nuovo tipo di sorgente di luce con brillanza che può
arrivare ad essere fino ad un miliardo di volte maggiore di
quella della luce di sincrotrone.

Cristallografia

Ricostruzione 3D del cervello di un topo transgenico,
studio dell’Alzheimer, Krucker et al. (SCRIPPS, UZh,
ETHZ, PSI). (Courtesy: Swiss Light Source/PSI)

Emoglobina
L'emoglobina è stata soggetto di innumerevoli lavori.
Il primo che riuscì a cristallizzarla ed a determinarne la
struttura con la cristallografia a raggi X fu Max Perutz
nel 1959.

Spettroscopia di Assorbimento
dei raggi X (XAS)
La radiazione di sincrotrone esce tangenzialmente
dall’anello e raggiunge le postazioni di misura
Nelle postazioni di misura:
• la radiazione è inviata da elementi ottici al monocromatore
• il monocromatore seleziona la lunghezza d’onda opportuna
• la radiazione è inviata sul campione

Spettro XAS da un atomo isolato (gas mono-atomico rarefatto)
funzione d’onda elettronica
E 0
Il coefficiente di assorbimento, µ, decresce monotonamente con l’energia del fotone incidente, hν.
Quando hν = E 0
= energia di foto-ionizzazione di un elettrone interno dell’atomo assorbitore
(energia di soglia*), µ cresce rapidamente. Quindi decresce monotonamente dopo soglia.
*soglia K: ionizzazione degli elettroni più interni.

Spettro XAS di una molecola diatomica
interferenza
In un sistema multi-atomico µ non decresce monotonamente dopo la soglia, ma ha
un andamento oscillante.
•L’assorbitore (punto rosso) emette un’onda sferica uscente (l’elettrone ionizzato, foto-elettrone).
•Il diffusore (punto verde) agisce come un centro di diffusione, e l’onda retro-diffusa
interferisce (in fase o fuori-fase) con quella uscente.

Spettroscopia di Assorbimento
dei raggi X (XAS)
µ(E)
E
Spettro XAS Spettro di un XAS atomo di una isolato molecola (e.g. gas biatomica monoatomico)

Alzheimer, metalli e luce di
sincrotrone
APP
Grovigli
Neurofibrilla
ri
α-
secretase
Neurone
Placche
Amiloidi
APP
P3
17 40-
42
γ-secretase
β-secretase
Aβ
1 40-42

Peptide Abeta

Peptide Aβ A – Esperimenti XAS
- Peptidi Aβ sintetici comprati da AnaSpec
- Vari frammenti di peptidi Aβ sospesi nel buffer NEMO, pH=7
Aβ 1-16
H 3
N + -DAEFRHDSGYEVHHQK-COO -
Aβ 1-28
H 3
N + -DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK-COO -
Aβ 5-23
H 3
N + -RHDSGYEVHHQKLVFFAED-COOH 3
N +
Aβ 17-40
H 3
N + -LVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV-COO -
- Cu 2+ e Zn 2+ da CuSO 4
e ZnCl 2
Aβ 1-40
H 3
N + -DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV-COO -
- 2 campioni di controllo: Cu-buffer, Zn-buffer

EXAFS Analysis
Cu 2+ /Zn 2+ -Aβ 17-40 = Cu 2+ / Zn 2+ in solution
Cu 2+ -(Aβ 1-16 , Aβ 1-28 ) = Cu 2+ -Aβ 1-40
Cu 2+ -Aβ 5-23 ≠ Cu 2+ -Aβ 1-40
Zn 2+ -(Aβ 1-16 , Aβ 1-28 , Aβ 5-23 ) = Zn 2+ -Aβ 1-40
Zn-Aβ
1−16
Zn-Aβ
1−40
Zn-Aβ
17−40
Cu-Aβ
1−16
Cu-Aβ
1−40
Cu-Aβ
17−40
Zn-Aβ
1−28
Zn-Aβ
5−23
Cu-Aβ
1−28
Cu-Aβ
5−23
4
0
-4
-8
4
0
-4
-8
4 6 8 10
k(Å) -1
4 6 8 10
k(Å) -1

(Cu-Aβ) 1-16
Coordinated Residue N r ± ∆r (Å)
σ 2 DW ± ∆σ 2 DW (Å2 )
(Cu-Aβ) 1-16
His 3 1.95 ± 0.01 0.002 ± 0.001
Tyr 1 2.06 ± 0.01 0.002 ± 0.001
O 1 1.95 ± 0.01 0.002 ± 0.001
∆E f
= -10.6 ± 0.7 eV; R= 28 %
Data
Fit
|FT|
Data
Fit
Cu-Aβ 1-16
k(Å -1 )
4
0
-4
-8
4 6 8 10
0 1 2 3 4 r(Å) 5

(Cu-Aβ) 5-23
Coordinated Residue N r ± ∆r (Å)
σ 2 DW ± ∆σ 2 DW (Å2 )
(Cu-Aβ) 5-23
His 2 1.99 ± 0.01 0.003 ± 0.001
Tyr 1 2.06 ± 0.01 0.003 ± 0.001
N-terminus 1 1.99 ± 0.01 0.003 ± 0.001
O 1 2.27 ± 0.01 0.003± 0.001
Data
Fit
|FT|
∆E f
= -13.8 ± 0.4 eV; R= 40 %
Data
Fit
4
0
-4
-8
4 6 8 10
k(Å -1 ) 0 1 2 3 4 r(Å) 5

(Zn-Aβ) 1-16
Coordinated Residue N r ± ∆r (Å)
σ 2 DW ± ∆σ 2 DW (Å2 )
(Zn-Aβ) 1-16
His 2 1.96 ± 0.01 0.003 ± 0.001
His 2 2.00 ± 0.01 0.003 ± 0.001
O 1 2.00 ± 0.01 0.003± 0.001
∆E f
= -6.5 ± 0.2 eV; R= 23 %
Data
Fit
|FT|
Data
Fit
Zn-Aβ 1-16
k(Å -1 ) 0 1 2 3 4 5
4
0
-4
-8
4 6 8 10
r(Å)

Risultati
• Cu e Zn mostrano differenti siti di legame
• Il sito di legame per I metalli è in entrambi i casi entro i primi
16 residui aminoacidici
• Cu mostra una coordinazione intra-peptide
• Zn mostra una coordinazione inter-peptide

Quali altre tecniche fisico-
matematiche possono essere
d’aiuto nella soluzione di tali
problemi?
Fisica Teorica e Computazionale

Biofisica Computazionale
Meccanica Classica
F = ma
eccanica Quantistica

Supercomputer

JUGENE - Hardware Characteristics
72 racks (9x8) - 73728 nodes (294912 cores)
Overall peak performance: 1 Petaflops
Main memory: 144 TB
Compute Card/Processor:
Power PC 450, 32-bit, 850 MHz, 4-way SMP
Peak performance: 13.6 GFlops
Networks:
Three-dimensonal torus (compute nodes),
bandwidth per link: 425 MB/s (total: 5.1 GB/s), hardware
latency: 100ns - 800ns

Processori
Cell è il nome di una tipologia di processori sviluppati da IBM in
cooperazione con Sony e Toshiba.
La famiglia di processori Cell è sviluppata per permetterne un
utilizzo quasi universale.
Si tratta di CPU progettate per utilizzare la computazione
parallela e Sony li utilizza anche per la console PlayStation 3.

Modello per dinamica
molecolare

Filmino

Filmino

Simulazione del processo di legame di un inibitore ad
un enzima

Legame del repressore Lac al DNA

p://biophys.roma2.infn.it/BiophysicsGroup.htm
GRAZIE!
Francesc
o
Stellato
Alessandr
o
Maiorana
Stefania
Alleva
Velia
Minicozz
i
Giancarlo
Rossi
Silvia
Morante