pos_vir_061_int_rev... - (IZS) delle Regioni Lazio e Toscana

BIOTECNOLOGIE pag 1 di 22
POS VIR 061 INT rev. 4 del 02/02/2009
ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI (OGM):
SOIA ROUNDUP READY/LECTINA
ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI (OGM):
SOIA ROUNDUP READY/LECTINA
Redatto:
U.Marchesi
_____________________________________________________
Verificato Responsabile Struttura Semplice:
I.Ciabatti
_____________________________________________________
Verificato RQ:
M.Guarducci
_____________________________________________________
Approvato Responsabile di Struttura Complessa:
D.amaddeo
_____________________________________________________

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ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI (OGM):
SOIA ROUNDUP READY/LECTINA
1. Scopo
Lo scopo della presente procedura è quello di descrivere le responsabilità e le modalità
operative per la rilevazione e determinazione quantitativa di soia Roundup Ready (evento di
trasformazione GTS 40/3/2) rispetto alla soia totale, in matrici agro-alimentari, mediante PCR
“real time”.
2. Campo di applicazione
La presente procedura viene applicata a DNA estratto da matrici agro-alimentari contenenti,
costituite o derivate da soia.
Il campo di misura è compreso all’interno del range definito dai punti estremi di calibrazione,
ossia tra lo 0,1% ed il 5% (o 10%). Come indicato nel UNI EN ISO 21570: 2006 (Annex C,
paragrafo C.1.7), il metodo è in grado di determinare un contenuto di soia Roundup Ready
pari all’1%, se la percentuale dell’ingrediente soia nella matrice in esame supera il 5%.
omissis Qualora il DNA di soia venga rimosso o altamente degradato durante il processo
produttivo della matrice alimentare, il metodo non fornisce risultati affidabili.
3. Definizioni ed abbreviazioni
- OGM (Organismi Geneticamente Modificati): organismi il cui materiale genetico è stato
modificato in modo diverso da quanto si verifica in natura con l’accoppiamento e/o la
ricombinazione genetica naturale.
- PCR (Polymerase Chain Reaction): reazione enzimatica in vitro, catalizzata da DNA
polimerasi DNA dipendenti, che determina l’amplificazione del DNA bersaglio.
- qPCR: PCR quantitativa
- Real Time PCR: tipologia di PCR in cui il sistema di rilevazione, avvalendosi di sonde
marcate con fluorocromi specifiche per il prodotto di amplificazione, consente di seguire
ciclo dopo ciclo l’andamento della reazione.
- Primer: oligonucleotide, che riconosce una sequenza specifica del DNA bersaglio,
utilizzato per innescare la reazione di PCR.
- Probe o sonda: oligonucleotide marcato che riconosce una sequenza specifica del DNA
bersaglio rivelandone la presenza.
- DNA bersaglio endogeno: tratto di DNA caratteristico della specie vegetale analizzata,
presente in un numero di copie costante e conservato nelle diverse varietà appartenenti a
quella specie.
- DNA bersaglio ricombinante o transgenico: tratto di DNA caratteristico della
modificazione genetica oggetto della prova
- Ct o ciclo soglia: ciclo al di sopra del quale la fluorescenza misurata supera un valore
soglia e si distingue dal rumore di fondo.
- NTC (no template control): controllo negativo di PCR
- LOD (limit of detection): limite di rivelazione
- LOQ (limit of quantitation): limite di quantificazione
- bp (base pairs): coppie di basi

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4. Riferimenti
DO VIR Documento Organizzativo
PG QUA 005 Gestione dei documenti
PG VIR 001 Ricevimento, analisi, conservazione e smaltimento di campioni ufficiali prelevati
per la ricerca di organismi geneticamente modificati (OGM)
PG VIR 003 Gestione delle aree e delle attività per l’esecuzione dei protocolli di PCR
POS VIR 015 SUP Estrazione di DNA con la metodica CTAB precipitante
POS VIR 016 SUP Estrazione di DNA con Dneasy Plant Maxi Kit
POS VIR 052 SUP Estrazione di DNA con la metodica CTAB
POS VIR 053 SUP Estrazione di DNA con Dneasy Plant Mini Kit
IGR VIR 001 Istruzioni gestione reagenti
UNI EN ISO 21570: 2006 Prodotti alimentari - Metodi di Analisi per la ricerca di organismi
geneticamente modificati e di prodotti derivati - Metodi quantitativi basati sull'analisi
dell'acido nucleico (Annex C, paragrafo C.1.7)
Definition of Minimum Performance Requirements for Analytical Methods of GMO Testing -
European Network of GMO Laboratories (ENGL) Version 13-10-2008 (http://gmocrl.jrc.ec.europa.eu/doc/Min_Perf_Requir_Analyt_methods_131008.pdf)
“The fitness for purpose of analitical methods”, EURACHEM Guide, 1998.
Westgard J.O. (2003) Ann. Clin. Biochem., 40, 593-611.
J. N. Miller, J. C. Miller “Statistics and chemometrics for analytical chemistry”, 2000, Pearson
Ed., Harlow (GB).
A. Foti, C. Gianino “Elementi di analisi dei dati sperimentali”, 1999, Liguori Ed., Napoli.
J. R. Taylor “Introduzione all’analisi degli errori”, 2000, II ed., Zanichelli Ed., Bologna
“Guida all’espressione dell’incertezza di misura”, UNI CEI ENV 13005, luglio 2000.
“Guida per la valutazione e la espressione dell’incertezza nelle misurazioni”, DT-0002 Sinal.
“Avvertenze per la valutazione dell’incertezza nel campo dell’analisi chimica”, DT-0002/3
Sinal.
“Quantifying uncertainty in analytical measurement”, EURACHEM/CITAC Guide,
QUAM:2000.P1.
ABI PRISM 7700 SDS User’s Manual, User Bullettin #2, dicembre 1997.
Hubner P., Waiblinger H.U., Pietsch K., Brodmann P. (2001) J. AOAC Int. 84 (6), 1855-1864
Brodmann P.D., Ilg E.C., Berthoud H., Herrmann A. (2002) J. AOAC Int. 85 (3), 646-653
Schwarz G., Baumler S., Block A., Felsenstein F.G., Wenzel G. (2004) Nucleic Acid
Research 32 (3), e24, 1-7
Wiseman G. (2002) Journal of AOAC International, 85 (3), 792-796.
UNI EN ISO 24276 :2006 Prodotti alimentari - Metodi di Analisi per la ricerca di organismi
geneticamente modificati e di prodotti derivati - Requisiti generali e definizioni
5. Moduli allegati
Modulo POS VIR 061 INT/1: foglio di lavoro per Organismi Geneticamente Modificati
(OGM): Soia Roundup Ready/Lectina.
6. Principio

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Il DNA estratto e purificato dal campione da sottoporre a prova è amplificato enzimaticamente
e rilevato mediante l’impiego, in parallelo, di una coppia di primer ed una sonda specifici per
il DNA bersaglio endogeno caratteristico della soia (regione del gene lectina), e di un’altra
coppia di primer ed un’altra sonda specifici per il DNA bersaglio ricombinante caratteristico
della modificazione genetica ricercata. L’amplificazione del DNA bersaglio endogeno genera
un amplificato di 81 bp, mentre quella del bersaglio ricombinante genera un amplificato di 83
bp. L’eventuale comparsa di amplificati viene seguita attraverso un sistema di rivelazione in
fluorescenza integrato allo stesso apparato di amplificazione. Vengono utilizzate sonde
marcate con due fluorocromi, cosiddetti “reporter” (legato al 5’ della sonda) e “quencher”
(legato al 3’); in assenza di amplificazione, il reporter irradiato trasferisce energia al quencher
e viene osservata la fluorescenza solo di quest’ultimo; a seguito di amplificazione, l’attività 5’
esonucleasica della polimerasi rimuove il reporter dalla sonda con conseguente emissione di
fluorescenza specifica del reporter. Tale fluorescenza aumenta in modo direttamente
proporzionale alla velocità di amplificazione. La fluorescenza misurata viene normalizzata
rispetto ad un fluorocromo di riferimento passivo (ROX) presente nella miscela di reazione.
Le determinazioni quantitative derivano dal raffronto tra le curve di amplificazione del
campione e le curve di amplificazione di materiali di riferimento certificati.
7. Apparecchiature, materiali, reagenti omissis, materiali di riferimento e dispositivi di
protezione individuale
7.1 Apparecchiature
Omissis
ABI Prism 7900HT Sequence Detection System and SDS Enterprise Database
ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System
Cappa a flusso laminare verticale sterile
Congelatore -20°C ± 5
Frigorifero +4°C ± 2
Microcentrifuga
Pipette monocanale volumi da 2 a 1000 µl
Produttore di ghiaccio
Vortex
7.2 Materiali
Bicchieri di plastica
Forbici
Ghiaccio
Griglia per microprovette
Micropiastre ottiche di reazione da 96 pozzetti MicroAmp o microprovette ottiche MicroAmp
Pinzette
Provette tipo Eppendorf da 1,5 ml
Provette tipo Eppendorf da 2,0 ml

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Puntali con filtro volumi da 2 a 1000 µl
Secchielli per ghiaccio
Soluzione decontaminante (IPR VIR 081)
Soluzione disinfettante etanolo al 70% (IPR VIR 050)
Strumento per l’installazione dei tappi MicroAmp
Supporto della griglia per microprovette o della micropiastra
Supporti speciali per provette da 1,5 ml
Tappi ottici MicroAmp o pellicola ottica adesiva
7.3 Reagenti
Master Mix PCR Lectina (IPR VIR 125)
Master Mix PCR Soia Roundup Ready (IPR VIR 126)
H 2 O grado reagente sterile (IPR VIR 096)
7.4 Materiali di riferimento
Soia Roundup Ready set 0,1, 0,5, 1, 2, 5 (o 10)% GM
7.5 Dispositivi di protezione individuale
Guanti in lattice o vinile senza polvere
Camice
8. Responsabilità
Il Responsabile di Struttura ed il Responsabile della Prova hanno la responsabilità di garantire
e verificare la corretta applicazione della presente procedura. Le responsabilità relative alla
preparazione dei reagenti, all’esecuzione del metodo di prova, alla lettura ed alla verifica dei
risultati sono riportate sui moduli PG QUA 005/12: Tabella responsabilità personale a tempo
indeterminato (TRPI) e Modulo PG QUA 005/13: Tabella responsabilità personale a tempo
determinato, collaboratori e consulenti (TRPD).
9. Modalità operative
9.1 Norme di igiene e sicurezza
Per l’esecuzione della presente procedura si rimanda a quanto disposto dalla PG VIR 003
specificando che tali disposizioni, vista l’innocuità della prova per l’operatore, sono
esclusivamente a tutela dell’esito della prova stessa.
9.2 Preparazione dei campioni, dei controlli e dei calibratori
Da eseguire nell’area di prova 220 omissis o 221A, sotto cappa a flusso laminare verticale
sterile.

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Dai campioni/controlli/calibratori, estrarre e purificare il DNA secondo una delle seguenti
procedure di supporto: POS VIR 052 SUP, POS VIR 053 SUP, POS VIR 015 SUP oppure
POS VIR 016 SUP. Se possibile, quantificare il DNA ottenuto mediante lettura
spettrofotometrica. Se possibile, eseguire una monitor run lectina sul DNA estratto, come
descritto nella POS VIR 017 INT.
Omissis
Per l’esecuzione della prova quantitativa omissis usare:
• come calibratori, 100 ng di DNA estratto da ciascun componente del set di soia
Roundup Ready 0.1, 0.5, 1, 2, 5 (o 10)% GM, di cui lo 0,1% viene anche utilizzato
come riferimento nella carta di controllo
• come controllo negativo, il controllo negativo PCR (H 2 O a grado reagente sterile)
Omissis
9.3 Prova quantitativa
La prova quantitativa viene effettuata su 4 replicati sia per i calibratori (materiali di
riferimento), sia per i campioni ed il controllo negativo. I materiali di riferimento vengono
sottoposti a prova alla concentrazione di 20 ng/µl, i campioni alla concentrazione determinata
in base ai risultati della monitor run lectina.
Durante l’esecuzione della prova quantitativa, compilare le seguenti pagine del foglio di
lavoro POS VIR 061 INT/1:
• pag.1- elenco campioni e controlli (file excel “POS VIR 061 INT qPCR.macro”)
• pag.2- allestimento piastra
Omissis
• pag.3- esiti qPCR (file excel “POS VIR 061 INT qPCR.macro”)
• pag.4- calcolo Ct LOD e Ct LOQ RR (file excel “POS VIR 061 INT qPCR.macro”)
Accendere omissis l’ABI Prism 7900HT Sequence Detection System and SDS Enterprise
Database o l’ ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System almeno 30’ prima della prova
per far scaldare il laser all’interno dello strumento.
Impostare l’apparecchio (come descritto dal manuale d’uso dello strumento) per l’analisi da
effettuare omissis. Selezionare VIC come fluorocromo reporter per la metà della piastra
sottoposta ad amplificazione del gene endogeno, FAM come fluorocromo reporter per la metà
della piastra sottoposta ad amplificazione del transgene, TAMRA come fluorocromo
“quencher” e ROX come fluorocromo di riferimento passivo. Definire quindi la collocazione
di materiali di riferimento, controlli e/o campioni nella micropiastra di reazione da 96 pozzetti
in cui avverranno le reazioni e riportare il tutto a pagina 2b del modello POS VIR 061 INT/1
dove vi è una rappresentazione schematica della suddetta micropiastra di reazione.
Sotto cappa a flusso laminare verticale sterile nell’area di prova 220, 202 o 221A predisporre
il seguente materiale:
• Tre supporti speciali per provette da 1,5 ml.
• Provette da 1,5 ml autoclavate.
• Due bicchieri di plastica inseriti uno nell’altro e contenenti qualche ml di soluzione
decontaminante, dove sono eliminati i puntali dopo l’uso.

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Durante l’esecuzione della prima fase di seguito descritta, mantenere i campioni di DNA in
esame in ghiaccio.
Prima fase
Da eseguire nell’area di prova 205 sotto cappa a flusso laminare verticale sterile.
Preparare due miscele di reazione, una utilizzata per l’amplificazione del DNA bersaglio
endogeno, l’altra per l’amplificazione del DNA bersaglio ricombinante. Nella seguente tabella
la prima delle due miscele di reazione viene definita miscela di tipo A mentre la seconda viene
definita miscela di tipo B.
Tipo di
determinazione
qPCR
soia Roundup Ready
Tipo di
miscela di
reazione
A
B
Denominazione della miscela di
reazione
Master Mix PCR Lectina
Master Mix PCR Soia Roundup
Ready
IPR di
riferimento
IPR VIR 125
IPR VIR 126
Omissis
Considerando che, per una singola reazione, il volume finale è 25 µl di cui 5 sono costituiti
dalla sospensione di DNA da analizzare, ed applicando un fattore di correzione del 15%,
calcolare il volume di ognuna delle due miscele di reazione (MR tot. A e MR tot. B) mediante
la seguente formula:
volume MR tot. A = volume MR tot. B = 92 µl × n° campioni
Tali volumi sono in ogni caso già segnalati automaticamente a pagina 1 del foglio di lavoro,
una volta compilati i campi destinati alla descrizione dei calibratori e dei campioni.
Preparare in provette tipo eppendorf le due miscele di reazione, sulla base dei calcoli
effettuati, compilando per ognuna la scheda preparazione miscele di RT/PCR (SPMR)
riportata nella IGR VIR 001.
Trasferire le provette contenenti le miscele di reazione MR tot. A e MR tot. B nell’area di
prova 220, 202 o 221A.
Seconda fase
Da eseguire nell’area di prova 220, 202 o 221A sotto cappa a flusso laminare verticale sterile.
Prendere due dei tre supporti speciali preparati in precedenza e disporre in ognuno di essi un
numero di provette da 1,5 ml pari al numero di materiali di riferimento + campioni + controlli
da esaminare.
Distribuire in ogni provetta del primo supporto speciale (supporto A) una quantità di MR tot.
A pari a 82,8 µl.

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Distribuire in ogni provetta del secondo supporto speciale (supporto B) una quantità di MR
tot. B pari a 82,8 µl.
Prelevare dal ghiaccio le provette contenenti le sospensioni di DNA dei materiali di
riferimento, dei campioni da analizzare e dei controlli e trasferirle sul terzo supporto speciale
(supporto C).
Disporre in parallelo i tre supporti (A, B e C) e trasferire da ogni provetta del supporto C alle
corrispondenti provette dei supporti A e B, un quantitativo di sospensione di DNA pari a 20,7
µl. In questo modo, ogni provetta dei supporti A e B conterrà un volume di miscela di
reazione completa di DNA stampo pari a 103,5 µl.
Riporre le provette del supporto C in ghiaccio.
Disporre, sempre sotto cappa, il supporto con la micropiastra ottica di reazione, la pellicola
ottica adesiva, oppure la bustina contenente i tappi ottici MicroAmp, le pinzette e lo strumento
per l’installazione dei tappi.
Dopo circa 10 secondi di agitazione vigorosa al vortex, trasferire dalle provette dei supporti A
e B 25 µl di miscela di reazione completa di DNA stampo nei pozzetti della micropiastra
secondo lo schema precedentemente definito e riportato a pagina 2b del POS VIR 061 INT/1.
Sigillare i pozzetti della piastra con la pellicola ottica adesiva o con i tappi ottici utilizzando
l’estremità a rotella dello strumento per l’installazione dei tappi per ribadire la chiusura dei
pozzetti.
Estrarre la micropiastra di reazione dal supporto e trasferirla nell’area di prova in cui è
installato lo strumento da utilizzare per l’esecuzione della prova (omissis ABI Prism 7900HT
Sequence Detection System and SDS Enterprise Database o l’ ABI Prism 7900HT Fast Real-
Time PCR System).
Terza fase
Da eseguire nell’area di prova in cui è installato lo strumento da utilizzare per l’esecuzione
della prova (omissis ABI Prism 7900HT Sequence Detection System and SDS Enterprise
Database o ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System).
Disporre la micropiastra di reazione nell’apposito vano dello strumento e procedere
all’avviamento della reazione come descritto dal manuale d’uso dello strumento.
Per tutte le determinazioni il protocollo di amplificazione è così costituito:
Step
Stage
T
(°C)
Tempo
(sec.)
Acquisizione
1
Attivazione UNG (Uracil-Nglicosilasi)
2
Denaturazione e attivazione
della polimerasi
3a Denaturazione 95°C 15’’ NO
3b Annealing e sintesi 60°C 60’’ SI
n.
cicli
50°C 120’ NO 1x
95°C 600’’ NO 1x
50x

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Al termine dell’amplificazione procedere all’analisi, dopo aver preventivamente salvato la
corsa, come di seguito descritto.
Lettura ed analisi dei risultati
La lettura dei risultati viene effettuata, dall’operatore opportunamente addestrato, attraverso
l’analisi dei dati immagazzinati ed elaborati dallo strumento (come descritto dal manuale
d’uso dello strumento).
• Impostare la linea di soglia: Impostare la modalità logaritmica per la
rappresentazione delle curve di amplificazione relative al sistema FAM. Impostare la
linea di soglia nella zona dove i diversi profili di amplificazione risultano paralleli,
cioè nella fase esponenziale di PCR. omissis Passare alla modalità lineare e verificare
che la linea di soglia precedentemente impostata si trovi nella fase geometrica di
amplificazione. Ripetere la procedura per VIC.
• Impostare la linea di base: Nella modalità lineare di rappresentazione delle curve di
amplificazione relative al sistema FAM, impostare la linea di base 3 cicli prima del
ciclo in corrispondenza del quale la linea di soglia incrocia la prima curva di
amplificazione (ad es. se il Ct più piccolo è 25, impostare la linea di base a 22).
omissis Ripetere la procedura per VIC.
• Esportare i dati in un file txt.
• Copiare tutto il testo contenuto nel file txt ed incollarlo nel foglio “pasted data”
del file Excel denominato POS VIR 061 INT qPCR.macro.
• Analizzare i risultati:
o Verificare che il controllo negativo presenti un Ct ≥ 40 sia per il sistema VIC
che per FAM. In caso contrario la prova quantitativa deve essere ripetuta.
o Costruire una retta di taratura, Ct FAM contro logaritmo del numero di copie
del bersaglio transgenico, con i relativi valori dei cinque materiali di
riferimento certificati, tenendo conto che il numero di copie del bersaglio
transgenico nella quantità di DNA (100 ng) dei materiali di riferimento soia
Roundup Ready 0.1, 0.5, 1, 2 e 5 (o 10)% GM sottoposta a prova è pari
rispettivamente a circa 41, 205, 410, 820 e 2050 (o 4100). Verificare che il
coefficiente R 2 della retta di taratura sia ≥ 0,98, in caso contrario provare a
costruire una retta di taratura con quattro punti anziché cinque e verificare
nuovamente il valore di R 2 . Se anche la retta di taratura costruita con quattro
punti presenta un valore di R 2 < 0,98, ripetere la prova quantitativa,
eventualmente dopo avere effettuato una nuova estrazione di DNA dai
materiali di riferimento.
o Verificare che il coefficiente angolare della retta di taratura sia compreso, in
valore assoluto, tra 3,0 e 3,7. Anche in questo caso, se questo requisito non è
soddisfatto, provare a costruire un’altra retta di taratura con quattro punti,
anziché cinque, e verificare il relativo valore del coefficiente angolare. Se
anche la retta di taratura costruita con quattro punti presenta un valore del
coefficiente angolare, in valore assoluto, esterno all’intervallo 3,0 – 3,7,
ripetere la prova quantitativa, eventualmente dopo avere effettuato una nuova
estrazione di DNA dai materiali di riferimento.

BIOTECNOLOGIE pag 10 di 22
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o Inserire nella carta di controllo (file excel POS VIR 061 INT carta controllo) il
risultato ottenuto per il campione di controllo e verificare che rispetti i requisiti
descritti al paragrafo 11.3
o Dalla retta di taratura estrapolare o interpolare i valori di Ct FAM
corrispondenti al LOD ed al LOQ per il sistema di amplificazione del bersaglio
transgenico e confrontare con essi i Ct FAM ottenuti per ciascun campione.
o Per i campioni che presentano un Ct transgenico superiore al Ct transgenico
corrispondente al LOD o al LOQ, l’esito viene espresso con la rispettiva
dicitura riportata nel paragrafo “Espressione dei risultati”(esiti 1 e 2).
o Per i campioni che presentano un Ct transgenico inferiore al Ct transgenico
corrispondente al LOQ, si procede come segue:
Calcolare, per ciascun campione/materiale di riferimento esaminato, la
differenza tra i Ct medi (∆Ct) ottenuti nel sistema di amplificazione del
bersaglio endogeno (VIC) e nel sistema di amplificazione del bersaglio
ricombinante (FAM) .
Costruire una retta di taratura, ∆Ct contro logaritmo della percentuale di
soia Roundup Ready, con i relativi valori dei cinque materiali di
riferimento certificati.
Verificare che il coefficiente R 2 sia ≥ 0,98, in caso contrario provare a
costruire una retta di taratura con quattro punti anziché cinque e
verificare nuovamente il valore di R 2 . Se anche la retta di taratura
costruita con quattro punti presenta un valore di R 2 < 0,98, ripetere la
prova quantitativa, eventualmente dopo avere effettuato una nuova
estrazione di DNA dai materiali di riferimento.
Verificare che il coefficiente angolare della retta di taratura sia
compreso, in valore assoluto, tra 3,0 e 3,7. Anche in questo caso, se
questo requisito non è soddisfatto, provare a costruire un’altra retta di
taratura con quattro punti, anziché cinque, e verificare il relativo valore
del coefficiente angolare. Se anche la retta di taratura costruita con
quattro punti presenta un valore del coefficiente angolare, in valore
assoluto, esterno all’intervallo 3,0 – 3,7, ripetere la prova quantitativa,
eventualmente dopo avere effettuato una nuova estrazione di DNA dai
materiali di riferimento.
Sulla retta di taratura interpolare o estrapolare, per ciascun campione, il
valore della concentrazione di soia Roundup Ready dai valori dei ∆Ct
sperimentali ed esprimere il risultato come indicato nel paragrafo
“Espressione dei risultati”(esito 3).
In ogni caso, tutti i valori medi calcolati, saranno considerati accettabili
solo con una deviazione standard relativa (RSD) non superiore a 1,5%.
Riportare il valore percentuale ottenuto per il materiale di riferimento 0,1% GM (campione di
controllo) sulla carta di controllo (file excel “POS VIR 061 INT carta controllo”) e valutare il
risultato secondo i criteri descritti nel paragrafo 11.3.
Per l’esecuzione delle operazioni necessarie all’analisi dei risultati, l’operatore,
opportunamente addestrato, potrà avvalersi di un apposito foglio di calcolo excel denominato

BIOTECNOLOGIE pag 11 di 22
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“POS VIR 061 qPCR.macro” la cui affidabilità sarà verificata come descritto nel paragrafo
9.4.
9.4 Verifica fogli di calcolo
Con cadenza semestrale l’affidabilità dei fogli di calcolo excel utilizzati nella presente
procedura viene verificata mediante l’analisi di una corsa test standard ad esito noto
denominata omissis “POS VIR qPCR test” omissis. Tutta la documentazione relativa a tali
verifiche è conservata nell’area di lavoro 200 in un apposito raccoglitore denominato “OGM -
Verifica dei fogli di calcolo”.
10. Espressione dei risultati
Esito
1 Ct lectina inferiore al Ct lectina corrispondente al
rispettivo LOD, ma Ct transgenico superiore al Ct
transgenico corrispondente al rispettivo LOD
2 Ct lectina e Ct transgenico inferiori ai Ct corrispondenti ai
rispettivi LOD, ma uno o entrambi i Ct superiore/i al Ct
corrispondente al rispettivo LOQ
3 Ct lectina e Ct transgenico inferiori ai Ct corrispondenti ai
rispettivi LOQ
Espressione del risultato
ORGANISMI
GENETICAMENTE
MODIFICATI (OGM): SOIA
ROUNDUP READY /
LECTINA: non rilevata soia
RR
ORGANISMI
GENETICAMENTE
MODIFICATI (OGM): SOIA
ROUNDUP READY /
LECTINA: soia RR non
quantificabile
ORGANISMI
GENETICAMENTE
MODIFICATI (OGM): SOIA
ROUNDUP READY /
LECTINA: soia RR X % (tra
X min % e X max %) espressa
come incertezza estesa con
fattore di copertura 2,26
relativo a 9 gradi di libertà ad
un livello di confidenza del
95%.
Nel caso 1 omissis deve essere indicato il LOD omissis.
Nel caso 2 deve essere indicato il LOQ.
Nel caso 3, le concentrazioni di soia Roundup Ready estrapolate al di sotto o al di sopra della
curva di calibrazione vengono espresse rispettivamente come < 0.1% e > 5 (o 10)%.
Nel caso 3, le caratteristiche dell’incertezza di misura, quali il fattore di copertura utilizzato, il
corrispondente livello di probabilità ed il numero dei gradi di libertà effettivi (formula di
Welch-Satterhwaite) potranno essere riportate in nota in calce al rapporto di prova.

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ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI (OGM):
SOIA ROUNDUP READY/LECTINA
11. Validazione del metodo e stima dell’incertezza di misura
11.1 Validazione
I calcoli relativi alle fasi descritte in questo paragrafo sono riportati nel modulo Foglio di
lavoro per la validazione/verifica della capacità del laboratorio nell’applicazione dei metodi e
stima dell’incertezza di misura (VMSI POS VIR 061 INT)
Determinazione del LOD (limite di rivelazione)
Per la determinazione del LOD non è possibile utilizzare il metodo IUPAC basato sul segnale
del bianco + 3σ (Codex Alimentarius Commission CX/MAS 01/4; Eurachem guide: The
fitness for purpose of Analytical Methods), in quanto, relativamente alle prove per la
determinazione di OGM, non risulta disponibile un bianco con uno scarto tipo diverso da
zero.
Si procede invece seguendo le linee guida UNI EN ISO 24276:2006 Foodstuffs – Nucleic
acid based methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and
derived products – general requirements and definition, cioè determinando il più basso
livello di analita (DNA bersaglio della reazione di PCR real time) in corrispondenza del
quale lo scarto tipo relativo di ripetibilità (RSD r ) è ≤ 33%. Nel nostro caso vengono
utilizzati dati di ripetibilità intermedia (Eurachem Guide, 1998).
Si opera come segue:
• Il DNA di soia RR (DNA bersaglio) estratto da materiali di riferimento viene diluito in
acqua o in DNA di mais (DNA non bersaglio)
• Ciascuna diluizione viene esaminata in PCR real time per il sistema endogeno (lectina)
e per quello transgenico (soia RR), in un numero di replicati maggiore o uguale a 5
• Dai Ct medi ottenuti per ciascun gruppo di replicati si costruisce una retta di taratura
Ct contro log (n° copie genomiche):
Ct = a log(numero di copie genomiche) + b
dove a è la pendenza e b l’intercetta della retta di taratura.
• Dalla retta di taratura si ricava, per ciascun replicato, il numero di copie genomiche
corrispondente al valore del Ct
• Dal numero di copie genomiche di ciascun replicato si calcola il valor medio per
gruppo di replicati ed il corrispondente scarto tipo; quindi si calcola lo scarto tipo
relativo di ripetibilità (RSD r ):
x m = Σ x i /n
i
i
σ = [Σ (x i – x m ) 2 /(n - 1)] 0.5
RSD r = σ/x m × 100
dove
x m = numero di copie genomiche medio

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x i = numero di copie genomiche per il replicato i
n = numero di replicati
σ = scarto tipo
RSD r = scarto tipo relativo di ripetibilità o coefficiente di variazione
• Tramite un modello di regressione si cerca la migliore funzione (coefficiente di
regressione R 2 ≥ 0,94) che descriva la relazione tra le RSD r ricavate e il numero di
copie genomiche.
• Mediante interpolazione dalla curva ottenuta, si determina il valore del numero di
copie corrispondente ad una RSD r pari al 33%
• La procedura viene ripetuta integralmente almeno un’altra volta.
• Il LOD viene calcolato come media dei valori ottenuti.
Come riportato nel VMSI POS VIR 061 INT, il LOD risulta pari a 20 copie genomiche (2C)
per il sistema lectina, e pari a 15 copie genomiche (2C) per il sistema Roundup Ready.
Determinazione del LOQ (limite di quantificazione)
Per la determinazione del LOQ non è possibile utilizzare il metodo IUPAC basato sul segnale
del bianco + 5σ (ο 6σ ο 10σ) (Codex Alimentarius Commission CX/MAS 01/4; Eurachem
guide: The fitness for purpose of Analytical Methods), in quanto, relativamente alle prove per
la determinazione di OGM, non risulta disponibile un bianco con uno scarto tipo diverso da
zero.
Si procede invece seguendo le linee guida Definition of Minimum Performance Requirements
for Analytical Methods of GMO Testing - European Network of GMO Laboratories (ENGL),
cioè determinando il più basso livello di analita (DNA bersaglio della reazione di PCR
real time) in corrispondenza del quale lo scarto tipo relativo di ripetibilità (RSD r ) è ≤ al
25%. Nel nostro caso vengono utilizzati dati di ripetibilità intermedia (Eurachem Guide,
1998).
• Si opera come descritto per la determinazione del LOD, determinando però il valore
del numero di copie corrispondente ad una RSD r pari al 25%.
Come riportato nel VMSI POS VIR 061 INT, il LOQ risulta pari a 38 copie genomiche (2C)
per il sistema lectina, e pari a 28 copie genomiche (2C) per il sistema Roundup Ready.
Precisione
La precisione viene valutata in condizioni di ripetibilità intermedia (prove effettuate nello
stesso laboratorio da operatori diversi in momenti diversi) su materiali di riferimento e/o su
campioni. Ogni materiale di riferimento/campione viene estratto in almeno due sessioni
differenti; ciascun estratto viene esaminato in almeno 3 sessioni di PCR; si calcola il valor
medio della percentuale di OGM e lo scarto tipo; quindi si determina lo scarto tipo relativo:
σ = [Σ (x i – x m ) 2 /(n - 1)] 0.5
i

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RSD r = σ/x m × 100
dove
x m = percentuale di OGM media
x i = percentuale di OGM ottenuta nella sessione di prova i
n = numero di sessioni di prova
σ = scarto tipo
RSD r = scarto tipo relativo di ripetibilità o coefficiente di variazione
Esattezza
L’esattezza viene valutata mediante prove interlaboratorio effettuate con metodi analitici
differenti su campioni a cui viene attribuito un valore di consenso sulla base dei risultati
forniti dai singoli partecipanti. Ai risultati forniti da ciascun laboratorio viene assegnato uno
“z score” pari a:
⎪z⎪ = x - X
σ
dove:
x è il risultato fornito dal laboratorio;
X è il valore di consenso
σ è lo scarto tipo, che può essere calcolato come stima della effettiva variazione riscontrata
nella relativa prova interlaboratorio, oppure sulla base di dati relativi ad un numero di prove
precedenti.
Considerato che:
• ⎪z⎪≤ 2; risultato soddisfacente; si verifica nel 95% circa dei risultati prodotti da un
sistema affidabile.
• 2 < ⎪z⎪≤ 3; risultato discutibile; si verifica nel 5% circa dei risultati prodotti da un
sistema affidabile.
• ⎪z⎪> 3; risultato insoddisfacente; si verifica nello 0,27% circa dei risultati prodotti da
un sistema affidabile.
l’esattezza si può esprimere nel modo seguente:
n° prove con esito soddisfacente
n° prove totali
Specificità
La specificità non è stata determinata presso i nostri laboratori su materiali di riferimento, in
quanto gli stessi materiali di riferimento certificati IRMM (Institute for Reference Material

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and Measurement) sono attualmente dichiarati 0% solo nominalmente, cioè non escludono la
presenza accidentale e tecnicamente inevitabile di soia RR.
La specificità è stata valutata come descritto nell’annex C del UNI EN ISO 21570:2005,
paragrafo C.1.2.3:
mediante una ricerca di omologia di primer e sonde nei database
GenBank/EMBL/DDBJ con il programma BLASTN 2.2.3.
per via sperimentale su materiali di riferimento certificati (IRMM-410), non più
disponibili, contenenti soia Roundup Ready a concentrazioni comprese tra 0 e 5% e su
matrici alimentari commerciali costituite o contenenti farina di soia o proteine di soia.
Linearità
La linearità di risposta viene valutata per:
• la relazione tra il ∆Ct ed il log(% di transgenico rispetto all’endogeno)
• la relazione tra il Ct ed il log(numero di copie del bersaglio), separatamente per il
sistema di amplificazione del bersaglio endogeno e per quello del bersaglio
transgenico.
Nel primo caso viene esaminato il coefficiente R 2 di un numero (>10) di curve di taratura
ottenute da materiali di riferimento certificati a percentuali di soia RR comprese tra 0,1% e
5%.
Nel secondo caso per ciascun sistema (endogeno e transgenico) vengono effettuate diluizioni
di DNA bersaglio in H 2 O o in DNA di mais (o altro DNA non bersaglio), utilizzando materiali
di riferimento a diverse percentuali di soia RR e verificando la linearità di risposta, attraverso
l’esame del coefficiente R 2 , per l’endogeno (lectina) tra circa 41000 e 0 copie genomiche, per
il transgenico (soia RR) tra circa 2050 e 0 copie genomiche.
Un valore di R 2 ≥ 0,98 viene considerato molto soddisfacente.
Robustezza
In considerazione della complessità del metodo e dei numerosi fattori fisico-chimici che
influiscono sull’esito della prova, la robustezza non può essere valutata mediante l’analisi
degli effetti della variazione deliberata di ciascuno di questi fattori.
La robustezza viene, invece, valutata mediante confronto, attraverso il test t di Student, di
gruppi di prove effettuate sugli stessi campioni da operatori diversi in momenti diversi. Al
fine di utilizzare, per l’esecuzione delle prove, una strumentazione differente dall’ABI Prism
7700, con cui sono state effettuate le prove di validazione, è sufficiente eseguire un confronto,
attraverso un test t di Student, di gruppi di prove effettuate sugli stessi campioni con le diverse
strumentazioni.
11.2 Stima dell’incertezza di misura
L’equazione che descrive l’andamento esponenziale di amplificazione/duplicazione in PCR è:
(a) K n =K 0 ×(1+ E x ) n K 0 = numero iniziale di molecole di DNA bersaglio
K n = numero di molecole di DNA bersaglio al ciclo n
E x = efficienza di amplificazione (compresa tra 0 e 1)

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Assumendo che l’efficienza di amplificazione sia massima e pressoché costante durante la
piena fase esponenziale (User Bullettin #2: ABI PRISM 7700 SDS) e che il numero di cicli
considerato sia il Ct, ovvero coincida con il punto soglia in corrispondenza del quale il segnale
di fluorescenza associato agli eventi di replicazione supera significativamente il rumore di
fondo, si può passare alla semplificazione:
K CT =K 0 ×2 Ct
Il procedimento di quantificazione impiegato è di tipo relativo, in esso i sistemi di
amplificazione (coppie di primers, probes e fluorocromi associati) e le connesse curve
esponenziali sono due ed indipendenti, riferiti rispettivamente l’uno al bersaglio endogeno
(En), rivelato dal fluorocromo VIC, l’altro al bersaglio transgenico (Tr), rivelato dal
fluorocromo FAM.
Tr Ct = Tr 0 ×(1+ E Tr ) Ct,Tr
En Ct = En 0 ×(1+ E En ) Ct,En
Assumendo che l’efficienza di amplificazione sia massima e pressoché costante durante la
piena fase esponenziale per entrambi i sistemi si ha che:
e si ottiene:
E Tr = E En = 1
(b 1 ) Tr Ct = Tr 0 ×2 Ct,Tr (b 2 ) En Ct = En 0 ×2 Ct,En
Si vuole trovare a questo punto una relazione funzionale tra il rapporto delle concentrazioni
iniziali di transgenico ed endogeno e la differenza (∆Ct) tra i rispettivi valori di cicli soglia,
Ct Tr e Ct En :
⎛ Tr0
(c ) Ct Tr - Ct En = ƒ ⎟ ⎞
⎜
⎝ En0
⎠
Dalla combinazione delle equazioni (b 1,2 ) e (c) si ha:
Tr Ct /En Ct = (Tr 0 ×2 Ct,Tr )/(En 0 ×2 Ct,En (Ct,Tr –Ct,En)
) = (Tr 0 /En 0 ) ×2 =
(Tr 0 /En 0 ) ×2 (∆Ct)
Passando poi dal logaritmo in base 2
al logaritmo in base dieci, risulta:
∆Ct = log 2 (Tr Ct /En Ct ) - log 2 (Tr 0 /En 0 )
∆Ct = log 2 10 × log 10 (Tr Ct /En Ct ) - log 2 10 × log 10 (Tr 0 /En 0 );

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(d) ∆Ct = 3.32 × log 10 (Tr Ct /En Ct ) - 3.32 × log 10 (Tr 0 /En 0 )
che si può anche leggere nella forma:
y = b + ax
Proprio su questa equazione, ovvero sulla relazione lineare tra il ∆Ct ed il logaritmo in base
dieci della percentuale di DNA transgenico nel campione, si fonda il principio di
quantificazione impiegato in PCR Real Time e, per tale motivo, in ogni “corsa” vengono
sottoposti alle medesime condizioni di analisi 5 materiali di riferimento a differente contenuto
di soia Roundup Ready: RR 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 5%. Con essi si costruisce la curva di
taratura che servirà alla determinazione della percentuale incognita di soia RR nei campioni.
Nel valutare l’incertezza associata alla misurazione della percentuale di DNA transgenico, si è
scelto di considerare:
- i contributi relativi alle grandezze misurate Ct FAM e Ct VIC : la differenza dei valori medi
di Ct FAM e Ct VIC conduce ai ∆Ct, le y della nostra relazione, a cui è possibile associare
un’incertezza tipo di ripetibilità data come:
σ ∆Ct
=
⎛σct
⎜
⎝
Tr
m
2
⎞
⎟
⎠
⎛ σct
+ ⎜
⎝ m
En
2
⎞
⎟
⎠
con m = numero di replicati, identico per il sistema endogeno e per quello transgenico;
- i contributi legati all’utilizzo di un modello di regressione lineare per la curva di
taratura.
Sono state invece reputate trascurabili altre fonti di incertezza connesse con il sistema, come:
- le fonti legate alla purezza ed all’incertezza dei materiali di riferimento impiegati per
costruire la retta di taratura (Wiseman, 2002);
- le fonti relative ai processi di preparazione della miscela di reazione e di trasferimento
nella micropiastra di reazione;
- le fonti connesse con la determinazione spettrofotometrica del contenuto di DNA
sottoposto ad analisi e con eventuali processi di diluizione del DNA, in considerazione
del fatto che il sistema di quantificazione impiegato non è di tipo assoluto bensì
relativo, per cui tale fonte d’incertezza non dovrebbe risultare rilevante a meno di
problemi di inibizione da eccesso di bersaglio (che comunque dovrebbero aver luogo

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ben oltre la concentrazione di DNA normalmente impiegata e che sono evidenziabili
nella “monitor run”) o, viceversa, di una sua insufficiente presenza, eventualità da cui
ci si pone al riparo operando determinazioni solo dopo aver verificato il rispetto dei
limiti di quantificazione e di rivelazione del sistema Roundup Ready/Lectina.
Assumendo perciò, come anticipato, che la vera relazione funzionale tra le due variabili, ∆Ct e
log 10 (Tr 0 /En 0 ), sia una retta:
y = b+ax
e che gli errori sperimentali presenti sulla variabile y siano molto più grandi di quelli presenti
sulla variabile x, la stima ai minimi quadrati di a e b si ricava minimizzando la somma dei
quadrati dei residui:
∑[ ( )] 2
∂ y i − ax i +b
∂a
∑[ ( )] 2
∂ y i − ax i +b
∂b
= 0
= 0
La soluzione di queste equazioni fornisce la stima dei parametri della relazione lineare:
x
a =
∑( i −x )( y i −y )
∑( x i − x ) 2
∑ −x ∑ x i y i
x i − x
b = y x i 2
∑ ( ) 2
Alla valutazione dei parametri di regressione è associato un particolare livello di
indeterminazione legato alla presenza dell’errore sperimentale; tale incertezza produce un
intervallo di confidenza per ciascun parametro stimato dal modello, la cui ampiezza è in
relazione con il grado di indeterminazione scelto e con la qualità del modello adottato. Si
considerino quindi le deviazioni standard di a e b ottenute dalla legge di propagazione degli
errori:
σ a
σ b
=
=
n
∑
i=
1
n
∑
i=
1
2
⎛
a
⎞
⎜ ∂ ⎟
⎜ ∂ y
⎟
⎝ i ⎠
2
σ i
2
⎛
b
⎞
⎜ ∂ ⎟
⎜ ∂ y
⎟
⎝ i ⎠
2
σ i
2
Sostituendo σ
i
con σ 2 max∆Ct, cioè con il quadrato del più grande degli errori standard
associati a ciascun punto della curva di taratura, si ottiene:

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σ a
=
2
σ max
∆Ct
n
∑
i=
1
2
⎛ ⎞
⎜ ∂a
⎟
⎜ ∂ ⎟
⎝ yi
⎠
n ⎛ ⎞
2 ⎜ ∂b
⎟
σ = ∆
b σ max
Ct∑⎜
⎟
i=
1 ∂
⎝ yi
⎠
Posto che le variazioni delle osservazioni rispetto alla retta di regressione appartengano tutte
alla medesima distribuzione normale, gli intervalli di confidenza al 95% relativi alle stime di a
e b saranno:
2
b ± ∆b ≡ b ± t·σ b ;
a ± ∆a ≡ a ± t·σ a
in cui t è il valore relativo al 95% (livello di rischio accettato del 5%) di una distribuzione t di
Student con n-2 gradi di libertà (n = punti della retta di regressione).
L’errore commesso su y, ossia su ∆Ct, come visto prima è:
σ ∆Ct
=
⎛σct
⎜
⎝
Tr
m
2
⎞
⎟
⎠
⎛ σct
+ ⎜
⎝ m
En
2
⎞
⎟
⎠
Nel fissare l’intervallo di confidenza per ∆Ct, che conduce all’errore massimo ∆y, occorre
considerare che il numero dei gradi di libertà (n l ), di cui tenere conto nella scelta della
costante per la quale moltiplicare σ ∆Ct , è dato da:
n l = (m En + m Tr ) – 2
ove con m En ed m Tr si intende il numero di misurazioni fatte per Ct En e Ct Tr da cui si è ottenuto
il valore di ∆Ct in esame.
Qualora la retta di regressione sia impiegata allo scopo di determinare un valore x * , se è noto
in quanto misurato il valore y * (come nel caso in questione in cui si conoscono i valori di ∆C t
), si parla di regressione inversa ed x * può essere calcolata come
x
*
=
*
( y − b)
Conseguentemente l’errore massimo su x * , ∆x * , si ricava applicando la legge di propagazione
degli errori assoluti massimi a priori nelle misure indirette (Elementi di analisi dei dati
sperimentali, Foti & Giannino, p.98) ottenendo:
a

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*
∆ x =
∂x
× ∆y
∂y
*
∂x
+ × ∆b
∂b
∂x
+ × ∆a
∂a
=
=
1
× ∆y
a
*
+
1
× ∆b
a
+
*
( y − b)
× ∆a
2
a
=
1
a
( ∆y
*
+ ∆b
+
*
y − b
a
× ∆a)
* 1 *
*
(e) ∆ x = ( ∆y
+ ∆b
+ ∆a
× x )
a
Infine, una volta calcolato ∆x * , il logaritmo della percentuale di bersaglio transgenico
contenuto nel campione sottoposto ad esame sarà compreso, con il 95% di confidenza,
nell’intervallo:
x * ± ∆x * = log(%) ± ∆log(%)
Procedendo quindi all’estrazione dei logaritmi si avrà:
x * + ∆x * = log(%) Max ⇒
% Max = 10^
(x* + ∆x*)
11.3 Carta di controllo
x * - ∆x * = log(%) Min ⇒ % Min = 10^
(x* - ∆x*)
Allo scopo di verificare costantemente lo stato di controllo statistico della prova quantitativa
si costruisce una carta di controllo di Shewhart (Miller et al) nel seguente modo.
Si prepara, quindi, un grafico di tipo cartesiano, recante in ascisse il numero progressivo delle
prove effettuate, ed in ordinate il valore percentuale ottenuto nelle prove.
A partire dai valori ottenuti, in almeno 20 prove, dal materiale di riferimento RR 0.1%
(campione di controllo), si calcola la media (x m = Σ x i /n) e lo scarto tipo (σ = [Σ (x i – x m ) 2 /(n
- 1)] 0.5 ).
Nel grafico si evidenziano:
• la media calcolata x m
• le soglie, inferiore e superiore, di attenzione (x m ± 2σ)
• le soglie, inferiore e superiore, di allarme (x m ± 3σ)
Al termine di ogni prova quantitativa si assegna un numero d’ordine alla prova e si introduce
nel grafico il valore percentuale ottenuto per il materiale di riferimento RR 0.1% (campione di

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controllo). La collocazione di tale valore percentuale rispetto ai valori soglia evidenziati nel
grafico consente di stabilire se il sistema di quantificazione è sotto controllo statistico,
attraverso un percorso interpretativo fondato sulle cosiddette “regole di Westgard” (Westgard,
2003).
Il seguente diagramma di flusso descrive sommariamente le tappe di questo percorso.
Controllo
dati
1 2s
NO
Sotto controllo: prova accettata
SI
NO
NO NO NO
1 3s 2 2s 4 1s 10 x
SI SI SI SI
Fuori controllo: prova rifiutata
Dove:
1 2s = il valore ottenuto dal campione di controllo è superiore alla “soglia di attenzione
superiore” o inferiore alla “soglia di attenzione inferiore”.
1 3s = il valore ottenuto dal campione di controllo è superiore alla “soglia di allarme superiore”
o inferiore alla “soglia di allarme inferiore”.
2 2s = il valore ottenuto dal campione di controllo è superiore alla “soglia di attenzione
superiore” o inferiore alla “soglia di attenzione inferiore” e l’evento si è già verificato
nella prova precedente.
4 1s = il valore ottenuto dal campione di controllo risulta, per quattro prove consecutive, o
superiore alla media più 1σ o inferiore alla media meno 1σ.
10 x = il valore ottenuto dal campione di controllo risulta, per dieci prove consecutive, o
sempre superiore alla media o sempre inferiore alla media.
La prova rifiutata viene ripetuta alle medesime condizioni.
Se il problema persiste, sarà necessario controllare uno o più dei seguenti fattori:
• DNA di riferimento
• Taratura delle pipette
• Fogli di calcolo, sia in fase di allestimento sia in fase di analisi della prova

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• Fogli di lavoro relativi all’intera prova
Nel caso in cui tali misure risultino insufficienti, si richiede l’intervento esterno di un tecnico
specializzato per il controllo omissis dell’ABI Prism 7900HT Sequence Detection System and
SDS Enterprise Database o dell’ ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System).