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Utilizzo del SAS per l’analisi di dati genetici e agronomici nel mondo vegetale
Claudia Paoletti, Gianni Bellocchi, Gianni Fila
Istituto Sperimentale Colture Industriali
Introduzione
L’importanza dell’analisi statistica per
l’elaborazione di dati biologico-agronomici è
dimostrata dalla crescente gamma di metodi
di analisi utilizzata negli ultimi decenni.
Sebbene la statistica si sia sviluppata
per soddisfare i bisogni della ricerca
scientifica, le sue metodologie hanno
influenzato l’evoluzione delle diverse
discipline a cui è stata applicata e, in
particolare, la filosofia delle scienze
biologiche. A questo proposito si possono
fornire due esempi:
- Il primo riguarda l’Analisi della
Varianza (ANOVA) che ha permesso, tramite
appropriati disegni sperimentali, di testare
separatamente gli effetti ambientali e genetici.
Questa possibilità ha rivoluzionato l’efficacia
della sperimentazione biologica, poiché i
problemi statistici legati all’interazione
genotipo-ambiente emergono in tutti i settori
della ricerca in cui diversi trattamenti
vengono messi a confronto in esperimenti
ripetuti nel tempo e/o nello spazio.
- Il secondo esempio riguarda le
tecniche di Analisi Multivariata, che hanno
permesso di analizzare più variabili
simultaneamente, tenendo conto delle
reciproche interazioni.
Un problema legato alla complessità e
alla natura delle sperimentazioni biologicoagrarie,
è la difficoltà che si incontra nel
raccogliere set bilanciati di dati appropriati
per l’elaborazione con metodi classici
dell’Analisi della Varianza. I Generalized
Linear Models disponibili in SAS (procedura
GLM) hanno permesso l’analisi di dati
sbilanciati, sia con varianze eterogenee che
con errori non normali o correlati alle medie.
In questa presentazione sono presi ad
esempio due lavori che mostrano
l’applicazione di alcuni strumenti SAS per la
risoluzione di problemi tipici delle ricerche
biologico-agrarie. Si fa particolare
riferimento alle procedure GLM,
VARCOMP, e PRINCOMP disponibili in
SASstat.
Esempio 1
Effetti della luce sulla variabilità genetica
di Impatiens capensis
(Paoletti e Holsinger, 1999)
Il problema:
La presenza di sistemi riproduttivi
“misti” nelle piante (inincrocio +
fecondazione incrociata) è influenzata dalle
condizioni ambientali di crescita. Per
esempio, la luce influenza la distanza di
dispersione del polline di Impatiens capensis.
Di conseguenza ci si aspetta che il grado di
variabilità genetica delle popolazioni sia
funzione delle condizioni ambientali e, nel
caso specifico, della luminosità ricevuta.
Scopo del progetto:
Misurare la quantità e la distribuzione
della variabilità genetica presente per 15
caratteri (vegetativi e riproduttivi) a 3 stadi di
crescita, in 6 popolazioni naturali provenienti
da 3 ambienti di luminosità: 1. ombreggiata,
2. parzialmente ombreggiata, 3. aperta. Le
misurazioni sono state fatte su piante
cresciute in condizioni controllate, da seme
proveniente da 20 individui campionati
casualmente in ciascuna popolazione. Scopo:
eliminare possibili fonti di variazione al di
fuori della componente genetica.
Analisi Univariata:
Analisi Statistica
Per stimare la quantità e la
distribuzione della variabilità genetica è stata
applicata una Analisi Gerarchica della
Varianza (procedura GLM) a due fattori
casuali (popolazione, famiglie entro
popolazione) ai 12 caratteri che

soddisfacevano gli assunti dell’ANOVA
(Tabella 1).
L’Analisi delle Componenti della
Varianza (procedura VARCOMP, opzione
REML) è stata utilizzata per determinare la
proporzione di variabilità attribuibile a
differenze tra famiglie entro ciascuna
popolazione.
Analisi Multivariata:
L’eventuale presenza di
multicollinearità fra le variabili è stata
verificata utilizzando l’Analisi delle
Componenti Principali, procedura
PRINCOMP (Tabella 2 e Tabella 3). Sulle 3
Componenti significative è stata fatta una
ANOVA a due fattori casuali (popolazione,
famiglie entro popolazione) per testare
eventuali differenze tra le popolazioni sulla
base dei gruppi di caratteri identificati dalle
Componenti Principali.
Risultati:
• È presente variabilità genetica fra
famiglie, all’interno delle popolazioni, per
tutti i caratteri esaminati.
• È presente variabilità genetica fra
popolazioni solo per caratteri vegetativi.
• Popolazioni cresciute in condizioni
luminose simili, non sono più simili fra
loro rispetto a popolazioni provenienti da
condizioni luminose diverse.
• La proporzione di variabilità attribuibile a
differenze fra famiglie varia in modo
indipendente dalla quantità di luce
ricevuta dalle popolazioni.
Esempio 2
Influenza del genotipo su alcuni caratteri
produttivi in lino da fibra
(Fila et al., 1999)
Il problema:
Le produzioni di fibra e di seme in lino
(Linum usitatissimum) sono influenzate da
fattori genetici e ambientali. Per la produzione
di lino da fibra si mira a steli lunghi e sottili,
ottenibili con opportuni genotipi e una
adeguata tecnica colturale come, per esempio,
una alta densità di semina. D’altra parte,
questa limita la produzione di seme, che
comunque è importante per recuperare parte
dei costi colturali.
Scopo del progetto:
Per verificare le differenze fra genotipi
e la loro stabilità nel tempo, quattro cultivar di
lino di origine russa (1: A-29; 2: Alexim; 3:
Novotopsky; 4: Torzhoksky-4) sono state
coltivate in pieno campo per 3 anni
consecutivi (disegno sperimentale non
bilanciato completamente randomizzato),
durante i quali sono stati misurati caratteri
legati a: 1. produzione di fibra (altezza finale e
altezza della prima inserzione); 2. precocità di
sviluppo (altezza della pianta in aprile) e 3.
produzione di seme (sostanza secca).
Analisi Univariata:
Analisi Statistica
Le differenze tra genotipi e tra anni e la
significatività delle interazioni genotipo-anno
per ciascun carattere sono state testate per
mezzo dell’Analisi della Varianza (procedura
GML, opzione SS3) a modello misto: fattore
fisso = genotipo, fattore casuale = anno
(Tabella 1). Sono stati eseguiti test di
confronto tra le medie (LSD, Duncan, SNK,
Tukey, REGWQ) per i caratteri per cui la
fonte fissa di variazione è risultata
significativa nell’ANOVA (Tabella 2).
Analisi Multivariata:
Per stimare l’effetto delle due fonti di
variazione, genotipo e anno, su tutti i caratteri
contemporaneamente è stata utilizzata
l’Analisi Multivariata della Varianza,
MANOVA nella procedura GLM (Tabella 3).
Questo metodo ha fornito una valutazione
integrata della risposta complessiva della
pianta.
Risultati:
• I caratteri legati alla fibra e alla precocità
risultano variabili nel tempo.

• I caratteri legati alla fibra dipendono
significativamente dal genotipo adottato.
• La risposta integrata ha mostrato
variabilità nel tempo.
• L’effetto genotipo non è chiaramente
messo in evidenza su base multivariata.
Conclusioni
• La flessibilità della procedura GLM, che
permette di calibrare i modelli
dell’ANOVA alle esigenze sperimentali,
ci ha permesso di valutare le differenze
fra genotipi nello spazio e nel tempo in
diversi sistemi biologici.
• Il confronto tra medie e l’Analisi delle
Componenti della Varianza permettono di
analizzare ulteriormente i risultati
dell’ANOVA identificando i gruppi di
genotipi statisticamente uguali, e
stimando la percentuale di variabilità dei
caratteri attribuibile alle diverse fonti di
variazione utilizzate nei modelli scelti.
• Le tecniche di Analisi Multivariata ci
hanno permesso di 1. valutare la risposta
integrata delle piante considerando
simultaneamente tutti i caratteri, e 2. di
identificare eventuali gruppi di
correlazione fra i caratteri misurati.
Bibliografia
Fila G., Maestrini C., Fontana F., Govoni F.
1999. Evaluating fibre flax varieties in
the Po Valley, Northern Italy. Proc. 6 th
Symposium on Renewable Resources
and 4 th European Symposium on
Industrial Crops, 23-25 March,
Germany, 219-224.
Paoletti C., Holsinger K. E. 1999. Spatial
patterns of polygenic variation in
Impatiens capensis, a species with an
environmentally controlled mixed
mating system. J. Evol. Biol., 12: 689-
696.

Esempio 1 – Impatiens capensis
Tabella 1: Analisi Gerarchica della Varianza a due fattori su 12 caratteri
È indicata la significatività del rapporto F
Fonte di Variazione
Carattere
Popolazione Famiglia
(Pop.)
20 giorni dalla semina
Altezza cotiledone hh hhh
Lunghezza 1° foglia N.S. hhh
30 giorni dalla semina
Altezza N.S. hhh
Larghezza fusto N.S. hhh
Numero foglie N.S. hhh
Larghezza foglia max. N.S. hhh
60 giorni dalla semina
Altezza hh hhh
Larghezza fusto hh hhh
Larghezza foglia max. hhh hhh
Lunghezza foglia max. hhh hhh
Numero fiori N.S. hhh
Numero rami N.S. hhh
h = 0.01< p < 0.05;hh = 0.001 < p < 0.01;hhh = p < 0.001
Esempio 1 – Impatiens capensis
Tabella 2: Analisi delle Componenti Principali
Sono mostrati i risultati solo per le Componenti con autovalore superiore a 1
PC1 PC2 PC3
Autovalore 7.16 2.35 1.26
% Varianza spiegata 0.48 0.16 0.08
% Varianza totale 0.48 0.64 0.72

Esempio 1 – Impatiens capensis
Tabella 3: Analisi delle Componenti Principali
Peso dei caratteri sulle prime 3 Componenti Principali
Peso dei Caratteri
PC1 PC2 PC3
20 giorni dalla semina
Altezza 0.28 -0.26 -0.36
Altezza cotiledone 0.22 -0.28 -0.48
Lunghezza prima foglia 0.33 -0.14 0.09
Larghezza prima foglia 0.33 -0.16 0.12
30 giorni dalla semina
Altezza 0.29 -0.23 -0.17
Larghezza fusto 0.30 -0.16 0.04
Numero foglie 0.28 -0.05 0.17
Lunghezza foglia più grande 0.32 0.07 0.02
Larghezza foglia più grande 0.31 0.11 0.05
60 giorni dalla semina
Altezza 0.24 0.26 0.20
Numero rami 0.19 0.10 0.30
Numero fiori 0.10 -0.11 0.46
Lunghezza foglia più grande 0.15 0.50 -0.29
Larghezza foglia più grande 0.16 0.49 -0.29
Larghezza fusto 0.22 0.37 0.08
Il peso maggiore di ciascun carattere sulle prime 3 Componenti è indicato in grassetto.
Esempio 2 – Lino
Tabella 1: Analisi della Varianza a due fattori
È indicata la significatività del rapporto F
Carattere
Fonte di Variazione
Genotipo Anno Gen*Anno
Altezza finale hhh hhh N.S.
Altezza inserzione h hhh N.S.
Altezza aprile N.S. hhh N.S.
Sost. Secca seme N.S. N.S. hh
h = 0.01< p < 0.05;hh = 0.001 < p < 0.01;hhh = p < 0.001

Esempio 2 – Lino
Tabella 2: Test di confronto tra medie dei genotipi
A lettere uguali corrispondono medie statisticamente uguali
Altezza finale
Genotipo
Test usato
LSD Duncan SNK REGWQ Tukey
3 A A A A A
4 A A A A A
1 B B B B B
2 B B B B B
Altezza prima inserzione
Genotipo
Test usato
LSD Duncan SNK REGWQ Tukey
3 A A A A A
4 AB A A A A
1 BC AB AB AB AB
2 C B B B B
Esempio 2 – Lino
Tabella 3: Analisi Multivariata della Varianza a due fattori per 4 caratteri
È indicata la significatività del rapporto F
Test utilizzato
Fonte di Variazione
Wilks’
Lambda
Pillai’s
Trace
Hotelling-Lawley
Trace
Roy’s Greatest
Root
Genotipo h N.S. hh hhh
Anno hh hh hh hhh
Genotipo*Anno N.S. h h hhh
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Claudia Paoletti, Gianni Bellocchi, Gianni Fila
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